JP6742891B2 - Nα−アシル−L−アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
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Description
〔1〕以下(A)〜(C):
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;
の存在下において、アミノ酸もしくはその塩およびカルボン酸もしくはその塩を反応させて、Nα−アシル−L−アミノ酸を生成することを含み、
アミノ酸が、グリシン、または置換されていてもよい直鎖アルキル基を側鎖として有する中性または塩基性L−α−アミノ酸である、Nα−アシル−L−アミノ酸の製造方法。
〔2〕前記置換されていてもよい直鎖アルキル基が、以下:
(1)C1〜C3アルキル;
(2)ヒドロキシル;
(3)C1〜C3アルキルオキシ;
(4)スルファニル;
(5)C1〜C3アルキルスルファニル;
(6)グアニジノ;
(7)アミノ;
(8)C1〜C3アルキルでモノ置換もしくはジ置換されたアミノ;
(9)アミド;
(10)前記(1)〜(9)の置換基からなる群より選ばれる1〜3個の置換基で置換されていてもよいアリール;および
(11)前記(1)〜(9)の置換基からなる群より選ばれる1〜3個の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
からなる群より選ばれる1〜3個の置換基で置換されていてもよいC1〜C6直鎖アルキル基である、〔1〕の方法。
〔3〕前記中性または塩基性L−α−アミノ酸が、L−フェニルアラニン、L−アラニン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−リジン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−アスパラギン、L−グルタミン、L−アルギニン、L−セリン、L−スレオニン、L−バリン、L−トリプトファン、L−チロシン、およびL−テアニンからなる群より選ばれる、〔2〕の方法。
〔4〕カルボン酸が、炭素原子数5以上のカルボン酸である、〔1〕〜〔3〕のいずれかの方法。
〔5〕カルボン酸が、ラウリン酸、またはステアリン酸である、〔4〕の方法。
〔6〕前記タンパク質が精製酵素である、〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法。
〔7〕前記タンパク質の存在下における反応が、前記タンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行われる、〔1〕〜〔5〕のいずれかの方法。
〔8〕前記微生物が、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、〔7〕の方法。
〔9〕前記微生物が腸内細菌科に属する細菌である、〔8〕の方法。
〔10〕前記細菌がエシェリヒア・コリである、〔9〕の方法。
〔11〕以下(A)〜(C)からなる群より選ばれるタンパク質:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;
〔12〕以下(a)〜(c)からなる群より選ばれるポリヌクレオチド:
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を示すヌクレオチド配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(c)配列番号1のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド;ならびに
(d)(a)〜(c)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
〔13〕〔11〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む発現ベクター。
〔14〕〔11〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物。
〔15〕〔11〕のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物を用いて、前記タンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
本発明の方法で用いられる本発明のタンパク質、ポリヌクレオチド、発現ベクター、微生物、およびタンパク質の製造方法は、かかる合成の実施に有用である。
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質。
アミノ酸は、グリシン、または置換されていてもよい直鎖アルキル基を側鎖として有する中性または塩基性L−α−アミノ酸である。
(a)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列と90%以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含み、かつNα−アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
(c)配列番号1もしくは3のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつNα−アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;ならびに
(d)(a)〜(c)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
i)Argをコードする4種のコドン(AGG、AGA、CGG、およびCGA)からなる群より選ばれる少なくとも1種のコドンの、Argをコードする別のコドン(CGU、またはCGC)への変更;
ii)Glyをコードする1種のコドン(GGA)の、別のコドン(GGG、GGU、またはGGC)への変更;
iii)Ileをコードする1種のコドン(AUA)の、別のコドン(AUU、またはAUC)への変更;
iv)Leuをコードする1種のコドン(CUA)の、別のコドン(UUG、UUA、CUG、CUU、またはCUC)への変更;ならびに
v)Proをコードする1種のコドン(CCC)の、別のコドン(CCG、CCA、またはCCU)への変更。
本発明の縮重変異体がRNAの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「U」が利用されるべきであるが、本発明の縮重変異体がDNAの場合、ヌクレオチド残基「U」の代わりに「T」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、1〜400個、1〜300個、1〜200個、または1〜100個である。
(1)C1〜C3アルキル;
(2)ヒドロキシル;
(3)C1〜C3アルキルオキシ;
(4)スルファニル;
(5)C1〜C3アルキルスルファニル;
(6)グアニジノ;
(7)アミノ;
(8)C1〜C3アルキルでモノ置換もしくはジ置換されたアミノ;
(9)アミド;
(10)前記(1)〜(9)の置換基からなる群より選ばれる1〜3個(好ましくは1または2個)の置換基で置換されていてもよいアリール;および
(11)前記(1)〜(9)の置換基からなる群より選ばれる1〜3個の置換基(好ましくは1または2個)で置換されていてもよいヘテロアリール。
Nα−ラウロイル−L−フェニルアラニン(以下Lau−Phe)を単一炭素源とした培地を用いて集積培養を行うことにより、アシラーゼ活性菌を自然界より単離・取得した。
移動相A:0.1% リン酸
移動相B:アセトニトリル
A/B:20/80
流速:0.6mL/min
カラム温度:40℃
検出:UV 210nm
移動相A:0.1% リン酸
移動相B:アセトニトリル
A/B:10/90
流速:0.6mL/min
カラム温度:40℃
検出:UV 210nm
Burkholderia sp.LP5_18B株の可溶性画分(CFE)からアシラーゼの精製を以下の通りに行った。アシラーゼ活性は、Lau−Pheを基質とした分解反応を以下の条件で実施し算出した。
移動相A:0.1% リン酸
移動相B:アセトニトリル
A/B:90/10
流速:0.6mL/min
カラム温度:40℃
検出:UV 254nm
Burkholderia sp.LP5_18B株を、8L(800mL/2Lバッフル付フラスコ、10個)の酵素生産培地(10g/L yeast extract,10g/L polypeptone,3g/L K2HPO4,1g/L KH2PO4,5g/L 硫酸アンモニウム,1g/L グルコース,0.1g/L 硫酸マグネシウム7水和物)で30°C、18時間の振とう培養を行った。得られた菌体を20mM Tris−HCl(pH8.0)に懸濁し超音波破砕、遠心し上清をCFEとした。
20−40%の硫安分画を行い、得られた沈殿を20mM Tris−HCl(pH8.0)に懸濁し20mM Tris−HCl(pH8.0)を用いて透析後、フィルターでろ過した。
上記サンプルをQ sepharose HP 26/10カラムに供し、2CVの20mM Tris−HCl(pH8.0)で洗浄した後、NaClのグラジエントにより溶出した(0−100mM,20CV)。Lau−Phe分解活性を有する画分を回収した。
上記サンプルに硫安が900mM含まれるよう調製し、Resource 15 Phe 6mLカラムに供した。2CVの20mM Tris−HCl(pH8.0),900mM 硫安で洗浄した後、硫安のグラジエントにより溶出した(900−400mM,20CV)。Lau−Phe分解活性を有する画分を回収し、20mM Tris−HCl(pH8.0)とAmicon Ultra−15 filter(10kDa)を用いて濃縮とバッファー交換を行った。
上記サンプルをMono Q 5/50 GLカラムに供し、2CVの20mM Tris−HCl(pH8.0)で洗浄した後、NaClのグラジエントにより溶出した(0−20mM,80CV)。Lau−Phe分解活性を有する画分を回収し、20mM Tris−HCl(pH8.0)とAmicon Ultra−15 filter(10kDa)を用いて濃縮とバッファー交換を行った。
実施例2で得られた精製サンプルを用いたアシルアミノ酸合成を行った。合成反応は以下の条件で実施した。
カラム:COSMOSIL 2.5C18−MS−II Packed Column(2.0x100mm,Nacalai tesque)
移動相A:0.1% ギ酸アンモニウム
移動相B:アセトニトリル
A/B:50/50
流速:0.3mL/min
カラム温度:40℃
イオン化法:ESI−ネガティブ
実施例2で得られた精製サンプルをトリプシンで処理し、LC−MS/MS分析(nanoACQUITY UPLC system and SYNAPT G2−Si Mass Spectrometry,Waters)に供した。その結果、PPPAPAKPVLF(配列番号5)、SPLDMLTFTED(配列番号6)、VETAADWGTYLLVHAYTPE(配列番号7)(L:LまたはI,K:KまたはQ)の配列が得られた。これらの配列を用いてBLAST検索を行ったところ、Burkholderia sp. JPY251由来hydrolase(WP_026228646)と相同性を示したため、当該遺伝子(1323 bp)の周辺ヌクレオチド配列を参考にし、ORFの50bp上流および200bp下流にプライマーを設計した。これらのプライマーBspJPY_up50_F(5’−ccgtattagtgccgacctgtcgcgccgcgg−3’(配列番号8))とBspJPY_down200_R(5’−cgcgtgcacgtggtcgtgacgcagcggatg−3’(配列番号9))およびBurkholderia sp.LP5_18B株ゲノムDNAを用いてPCR増幅を行った。
25 cycles 98℃、10 sec
63℃、10 sec
68℃、90 sec
1 cycle 68℃、90 sec
4℃
実施例4で構築したプラスミドpET22−BuAcyをE.coli BL21(DE3)に導入し、形質転換体を100mg/Lのアンピシリンを含むOvernight Express Instant TB Medium (メルク) 4mLに接種し、30℃で16時間の振とう培養を行った。
Claims (15)
- 以下(A)〜(C):
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜40個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;
の存在下において、アミノ酸もしくはその塩およびカルボン酸もしくはその塩を反応させて、Nα−アシル−L−アミノ酸を生成することを含み、
アミノ酸が、グリシン、または置換されていてもよい直鎖アルキル基を側鎖として有する中性または塩基性L−α−アミノ酸である、Nα−アシル−L−アミノ酸の製造方法。 - 前記置換されていてもよい直鎖アルキル基が、以下:
(1)C1〜C3アルキル;
(2)ヒドロキシル;
(3)C1〜C3アルキルオキシ;
(4)スルファニル;
(5)C1〜C3アルキルスルファニル;
(6)グアニジノ;
(7)アミノ;
(8)C1〜C3アルキルでモノ置換もしくはジ置換されたアミノ;
(9)アミド;
(10)前記(1)〜(9)の置換基からなる群より選ばれる1〜3個の置換基で置換されていてもよいアリール;および
(11)前記(1)〜(9)の置換基からなる群より選ばれる1〜3個の置換基で置換されていてもよいヘテロアリール;
からなる群より選ばれる1〜3個の置換基で置換されていてもよいC1〜C6直鎖アルキル基である、請求項1記載の方法。 - 前記中性または塩基性L−α−アミノ酸が、L−フェニルアラニン、L−アラニン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−リジン、L−ロイシン、L−メチオニン、L−アスパラギン、L−グルタミン、L−アルギニン、L−セリン、L−スレオニン、L−バリン、L−トリプトファン、L−チロシン、およびL−テアニンからなる群より選ばれる、請求項2記載の方法。
- カルボン酸が、炭素原子数5以上のカルボン酸である、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
- カルボン酸が、ラウリン酸、またはステアリン酸である、請求項4記載の方法。
- 前記タンパク質が精製酵素である、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記タンパク質の存在下における反応が、前記タンパク質を産生する微生物またはその処理液を用いて行われる、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 前記微生物が、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む、請求項7記載の方法。
- 前記微生物が腸内細菌科に属する細菌である、請求項8記載の方法。
- 前記細菌がエシェリヒア・コリである、請求項9記載の方法。
- 以下(A)〜(C)からなる群より選ばれるタンパク質:
(A)配列番号2のアミノ酸配列を含むタンパク質;
(B)配列番号2のアミノ酸配列において、1〜40個のアミノ酸残基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質;または
(C)配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を示すアミノ酸配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質。 - 以下(a)〜(c)からなる群より選ばれるポリヌクレオチド:
(a)配列番号1のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)配列番号1のヌクレオチド配列と90%以上の同一性を示すヌクレオチド配列を含み、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(c)配列番号1のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、Nα−アシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド;ならびに
(d)(a)〜(c)からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。 - 請求項11記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む発現ベクター。
- 請求項11記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物。
- 請求項11記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種発現単位を含む微生物を用いて、前記タンパク質を生成することを含む、タンパク質の製造方法。
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