CN113481223A - 一种重组酰胺水解酶基因及其应用 - Google Patents

一种重组酰胺水解酶基因及其应用 Download PDF

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曾惠羚
任杰
何廷刚
艾勇
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Abstract

本发明提供了一种重组酰胺水解酶基因及其应用，所述重组酰胺水解酶基因包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明还提供了一种重组载体、一种重组细胞、一种重组酰胺水解酶的制备方法及其制备得到的重组酰胺水解酶。本发明所述重组酰胺水解酶基因在受体细胞中的表达效率高，为酰胺水解酶的工厂化生产提供了条件；所述酰胺水解酶的制备纯化方法简单高效，所得酰胺水解酶具有良好的催化活性及稳定性，具有应用于生产实际中的价值。

Description

一种重组酰胺水解酶基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种重组酰胺水解酶基因及其应用。
背景技术
酰胺水解酶亦称酰基转移酶、酰化氨基酸水解酶，是水解N-酰基-L有机酸与氨基酸的酶，亦可以催化脱氢肽的水解。存在于动物组织、真菌和细菌中，在机体内发挥重要作用，与人体的多种代谢活动密切相关。
日本研究人员Takakura Y和Y.Asano发现Burkholderia sp LP5 18B可以代谢产生酰胺水解酶(EC3.5.1.14)，同时并将其运用于氨基酸表面活性剂的合成和水解的催化研究中，发现其对月桂酰苯丙氨酸、月桂酰丙氨酸、月桂酰赖氨酸、月桂酰缬氨酸等具有很好的水解催化效果，而对月桂酰精氨酸和月桂酰缬氨酸具有很好的合成催化效果，后续他们将此基因序列进行重组，将其转化入BL21 DE3感受态细胞中，筛选重组克隆后进行诱导，通过SDS-PAGE检测发现没有特异性的蛋白表达。
目前，缺少可以应用于工业化生产的酰胺水解酶的制备方法。因此，如何提供一种可以大规模生产酰胺水解酶的方法，操作简便，生产效率高，已成为亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种重组酰胺水解酶基因及其应用，通过对酰胺水解酶的编码基因进行优化，再配合ArcticExpress DE3感受态细胞，实现了酰胺水解酶的高效、特异性表达。
为达此目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种重组酰胺水解酶基因，所述重组酰胺水解酶基因包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：
atgctgtctctggttctgccgggtatcggtcacgctcagaccacccagccgccgccggctccggctaaaccggttctgttcaccaacttccgtctgttcgacggtaaatcttctgctctgcgtgacggtctgtacatggttgttgaaggtaacaccatctctcagatcggtcagggtcagccggcttcttctgaaggtaaaaccgttgttgactgcggtggtaaagttatcatgccgggtctgatcgacatgcactggcactctctgctggctgctctgccgatccaggttatcctgcaggctgacatcgctttcgttcacctggctgcttctgctgaagctgaacgtaccctgatgcgtggtttcaccaccatccgtgacgctggtggtccgtctttcgctctgaaacaggctatcgactctggtatgatctctggtccgcgtatctacccgtctggtgctatgatcaccaccaccggtggtcacggtgacttccgttctctggctgaactgccgcgtacctctaaccaggtttctcaggctgaacgtgacggtgctaacgctatcgctgacaccgctgacgaagttcgtatgcgtgttcgtgaacagttcatccagggtgctacccagatcaaaatggttggttgcggtggtgtttctaccccgcgttctccgctggacatgctgaccttcaccgaagaccagatgcgtgctgctgttgaaaccgctgctgactggggtacctacatcctggttcacgcttacaccccggaatctatccagcgttctgttgctgctggtgttcagtgcgttgaacacggtcacctgatggacgacaaaaccgctgctctgatggctaaacacggtacctggctgtctacccagccgttcgtttctgaagaagacgttgctccgctgtctggtccgtctcgtgaaaaattcctggaagttaccgctggtaccgacaacacctacaaactggctcgtaaacacggtctgaaagttgctttcggtaccgacctgatcttctctcagaccctggctacccgtcagggtaaaatgctgacccacctgaaacgttggtacaccgctgctgaagctctgaacatggctaccggtgctaacggtcagctgctggctatgtctggtcaccgtaacccgtacccgcgtaaactgggtgttctggaagaaggtgcttacgctgacctgctgctgatcgacggtaacccgctggacaacctggacctgatcgctaacccggaacagaacctgcgtatcgttatgaaagacggtaaattctacaaaaacaccctgaaagctcaccatcatcaccaccattaa。
本发明中，对酰胺水解酶的编码基因进行了优化，提高了其在受体细胞中的表达效率，蛋白的合成效率更高，特异性也更好，为相关的科学研究创造了条件。
第二方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第一方面所述的重组酰胺水解酶基因。
优选地，所述重组载体为含有第一方面所述的重组酰胺水解酶基因的重组pET-21a载体。
第三方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第一方面所述的重组酰胺水解酶基因。
优选地，所述重组细胞含有第二方面所述的重组载体。
优选地，所述重组细胞为含有第二方面所述的重组载体的大肠杆菌细胞。
优选地，所述大肠杆菌细胞包括ArcticExpress DE3。
第四方面，本发明提供了一种重组酰胺水解酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
构建第二方面所述的重组载体，转化到受体细胞中，筛选阳性克隆；
鉴定正确的阳性克隆扩大培养，诱导蛋白表达，收集菌体并进行提取、纯化，得到所述重组酰胺水解酶。
优选地，所述受体细胞包括ArcticExpress DE3。
本发明中，通过研究发现，ArcticExpress DE3与所述重组酰胺水解酶基因的适配性最好，重组载体在其内的表达效率最高，蛋白表达的特异性也更好，杂蛋白较少，为后续重组蛋白的提取及纯化提供了便利；通过上述方法制备得到的重组酰胺水解酶的活性更好，催化效率更高。
优选地，所述扩大培养后菌液的OD600值为0.6～0.8，例如可以是0.6、0.65、0.7、0.75或0.8等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述诱导通过添加IPTG进行，所述IPTG的终浓度为0.1～1mM，例如可以是0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM或1mM等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述诱导的温度为20～30℃，例如可以是20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述诱导的时间为13～18h，例如可以是13h、14h、15h、16h、17h或18h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述纯化通过蛋白纯化仪进行。
优选地，所述纯化后还包括对蛋白进行定量的步骤。
作为优选技术方案，本发明所述重组酰胺水解酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将第一方面所述的重组酰胺水解酶基因连入pET-21a载体，构建第二方面所述的重组载体；
(2)所述重组载体转化到ArcticExpress DE3细胞中，筛选阳性克隆；
(3)鉴定正确的阳性克隆扩大培养至菌液的OD600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，在20～30℃下处理13～18h，诱导蛋白表达；
(4)收集菌体并进行提取，通过SDS-PAGE电泳进行检测，使用蛋白纯化仪纯化后，对蛋白进行定量，得到所述重组酰胺水解酶。
第五方面，本发明提供了一种重组酰胺水解酶，所述酰胺水解酶通过第四方面所述的重组酰胺水解酶的制备方法制备得到。
第六方面，本发明提供了第四方面所述的重组酰胺水解酶的制备方法和/或第五方面所述的重组酰胺水解酶在催化氨基酸表面活性剂合成或分解中的应用。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对酰胺水解酶的编码基因进行优化，配合ArcticExpress DE3细胞，可以提高酰胺水解酶在受体细胞中的表达效率；制备得到的酰胺水解酶具有良好的催化活性，可以催化氨基酸表面活性剂分解产生相应的脂肪酸和氨基酸，也可以催化氨基酸和脂肪酸合成氨基酸表面活性剂；且所述酰胺水解酶具有良好的稳定性，为相关产品的工业化生产创造了条件；制备方法简单高效，科学合理，具有应用于生产实际中的价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中重组载体的质粒图谱；
图2A为本发明实施例4中重组OverExpress C43 DE3细胞的SDS-PAGE电泳的结果图片(图中，泳道M-标准分子量蛋白，泳道1-细胞上清液，泳道2-空白对照，泳道3-沉淀)；
图2B为本发明实施例4中重组ER2566HE细胞和重组BL21 DE3细胞的SDS-PAGE电泳的结果图片(图中，泳道M-标准分子量蛋白，泳道1-重组ER2566HE细胞的沉淀，泳道2-重组BL21 DE3细胞的沉淀，泳道3-空白对照，泳道4-重组ER2566HE细胞的上清液，泳道5-重组BL21 DE3细胞的上清液)；
图2C为本发明实施例4中重组ArcticExpress DE3细胞的SDS-PAGE电泳的结果图片(图中，泳道M-标准分子量蛋白，泳道1-沉淀，泳道2-空白对照，泳道3-细胞上清液)；
图3为本发明实施例5中纯化后的重组酰胺水解酶的SDS-PAGE电泳的结果图片(图中，泳道Marker-标准分子量蛋白，泳道1-粗酶提取液，泳道2-滤穿液，泳道3-未脱盐蛋白；泳道4-脱盐蛋白)；
图4为本发明实施例5中纯化后的酰胺水解酶HPLC的结果图片；
图5为本发明实施例5中纯化后的酰胺水解酶的浓度与峰面积的标准曲线图片。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
材料：
pET-21a载体由金斯瑞生物科技公司合成；
ArcticExpress DE3感受态细胞、OverExpress C43 DE3细胞感受态细胞、ER2566HE感受态细胞和BL21 DE3感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司；
柱子ZORBAX 300SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6×250mm 5-Micron购自岛津；
月桂酸和Imidazole购自阿拉丁；
精氨酸和甘氨酸购自BBI Life Sciences；
N-月桂酰谷氨酸钠购自克拉玛尔；
N-月桂酰甘氨酸购自东京化成工业株式会社TCI。
实施例1
本实施例提供一种重组酰胺水解酶基因，所述重组酰胺水解酶基因包括SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列。
SEQ ID No.1：
atgctgtctctggttctgccgggtatcggtcacgctcagaccacccagccgccgccggctccggctaaaccggttctgttcaccaacttccgtctgttcgacggtaaatcttctgctctgcgtgacggtctgtacatggttgttgaaggtaacaccatctctcagatcggtcagggtcagccggcttcttctgaaggtaaaaccgttgttgactgcggtggtaaagttatcatgccgggtctgatcgacatgcactggcactctctgctggctgctctgccgatccaggttatcctgcaggctgacatcgctttcgttcacctggctgcttctgctgaagctgaacgtaccctgatgcgtggtttcaccaccatccgtgacgctggtggtccgtctttcgctctgaaacaggctatcgactctggtatgatctctggtccgcgtatctacccgtctggtgctatgatcaccaccaccggtggtcacggtgacttccgttctctggctgaactgccgcgtacctctaaccaggtttctcaggctgaacgtgacggtgctaacgctatcgctgacaccgctgacgaagttcgtatgcgtgttcgtgaacagttcatccagggtgctacccagatcaaaatggttggttgcggtggtgtttctaccccgcgttctccgctggacatgctgaccttcaccgaagaccagatgcgtgctgctgttgaaaccgctgctgactggggtacctacatcctggttcacgcttacaccccggaatctatccagcgttctgttgctgctggtgttcagtgcgttgaacacggtcacctgatggacgacaaaaccgctgctctgatggctaaacacggtacctggctgtctacccagccgttcgtttctgaagaagacgttgctccgctgtctggtccgtctcgtgaaaaattcctggaagttaccgctggtaccgacaacacctacaaactggctcgtaaacacggtctgaaagttgctttcggtaccgacctgatcttctctcagaccctggctacccgtcagggtaaaatgctgacccacctgaaacgttggtacaccgctgctgaagctctgaacatggctaccggtgctaacggtcagctgctggctatgtctggtcaccgtaacccgtacccgcgtaaactgggtgttctggaagaaggtgcttacgctgacctgctgctgatcgacggtaacccgctggacaacctggacctgatcgctaacccggaacagaacctgcgtatcgttatgaaagacggtaaattctacaaaaacaccctgaaagctcaccatcatcaccaccattaa。
本发明通过对酰胺水解酶的编码基因进行优化，提高了其在受体细胞中的表达效率，有利于后续的蛋白提取及纯化工作。
实施例2
本实施例提供一种重组载体，重组载体为含有实施例1中的重组酰胺水解酶基因的重组pET-21a载体。
金斯瑞合成重组酰胺水解酶基因片段后，与pET-21a载体连接，得到所述重组pET-21a载体。
所述重组载体的质粒图谱如图1所示。
实施例3
本实施例提供一种重组细胞，所示重组细胞为含有实施例2中的重组载体的感受态细胞。
所述重组细胞通过如下方法进行制备：
(1)将ArcticExpress DE3、OverExpress C43 DE3、ER2566HE和BL21 DE3感受态细胞置于冰上融化，加入重组载体，轻柔混和，冰浴25min；
(2)42℃热激45s后，冰浴2min；
(3)向管中加入700μL不含抗生素的LB培养基，在37℃、200rpm下震荡培养60min；
(4)培养后的菌液涂布于含0.1g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基表面，倒置于培养箱中培养14h；
(5)平板中的长出的单菌落即为阳性克隆，经过鉴定筛选后得到所述的重组细胞。
实施例4
本实施例使用实施例3中的重组ArcticExpress DE3细胞、重组OverExpress C43DE3细胞、重组ER2566HE细胞和重组BL21 DE3细胞，提取重组酰胺水解酶，方法如下：
(1)向250mL的三角瓶中加入50mL含终浓度为0.1g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，将所述重组细胞接种至培养基中扩大培养，至菌液的OD600值为0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG，在25℃下培养15h，诱导蛋白表达；
(2)12000rpm离心1min收集菌体，弃上清，使用2mL 50mmol Tris-HCl(pH 6.4)溶液重悬，转移至5mL离心管中，使用超声细胞破碎仪冰浴破碎(探头6，破碎3min，运行2s停4s)，
(3)12000rpm离心1min，上清液即为含酰胺水解酶的粗酶提取液。分别取上清液和沉淀，加入10μL上样液，沸水浴煮10min，进行SDS-PAGE电泳检测。
电泳图片如图2A、图2B和图2C所示。由图2A～图2C可知，重组OverExpress C43DE3细胞、重组ER2566HE细胞和重组BL21 DE3细胞表达的重组酰胺水解酶大多为包涵体，在沉淀中的含量较多，而上清液中则较少，且存在大量的杂蛋白，不利于后续蛋白的纯化，重组蛋白形成包涵体后也会影响酶的活性；而重组ArcticExpress DE3细胞表达的重组酰胺水解酶则在上清液中表达量较多，酶活更高，且杂蛋白较少，方便后续的纯化。
因此，重组ArcticExpress DE3细胞更适合用于重组酰胺水解酶的制备中，后续实验使用的重组酰胺水解酶均通过重组ArcticExpress DE3细胞制备得到。
实施例5
本实施例对实施例4提取的重组酰胺水解酶进行纯化，并进行定量，方法如下：
收集酰胺水解酶的粗酶提取液，通过对带有6个HIS标签有效的NI填料柱，使用AKTA蛋白纯化仪对其进行纯化，具体步骤如下：
a样品处理
取180mL粗酶提取液在12000rpm下离心5min，弃上清，加入18mL 50mM PBS(pH7.4)，重悬，并进行细胞破碎，12000rpm离心30min，取上清，过0.45μm水膜，冰浴待用。
b流动相准备
按照如下配方配置流动相溶液：
清洗液：Tris 50mM、NaCl 300mM以及Imidazole 30mM，用HCl调节pH为7.8，配置后的溶液过0.45μm水膜。
洗脱液：Tris 50mM、NaCl 300mM以及300mM，用HCl调节pH为7.8，配置后的溶液过0.45μm水膜。
纯水：过0.45μm水膜。
脱盐缓冲液：Tris 50mM，用HCl调节pH为7.8，配置后的溶液过0.45μm水膜。
20％乙醇：配置后的溶液过0.45μm水膜。
c蛋白纯化
使用AKTA蛋白纯化仪对其进行纯化。
纯化后的重组酰胺水解酶的SDS-PAGE电泳图片如图3所示。图中，泳道1为粗酶提取液，可以看出有清晰目的蛋白表达，说明诱导表达方法有效；泳道2为样品吸附在柱子上后流下来的滤穿液，可以看出滤穿液中无目的蛋白，证明重组蛋白与柱子的结合能力较好；泳道3为未脱盐蛋白，泳道4为脱盐蛋白，可以看出，泳道3、4有明显目的蛋白且无杂蛋白，说明蛋白纯化方法有效。
综上，纯化后的蛋白提取液中无杂蛋白存在，蛋白大小也与预期相符，证明蛋白纯化成功，可用于后续的实验中。
通过HPLC检测对酰胺水解酶进行定量，HPLC检测条件如下：
进样量：20μL；流速：1mL/min；
A相：含0.1％三氟乙酸水溶液；B相：含0.1％三氟乙酸的乙腈，0min；
A相90％，B相10％，15min；
A相30％，B相70％，15.01min；
A相10％，B相90％，20min；
A相10％，B相90％，20.01min；
A相90％，B相10％，25min结束。
DVD检测器在280nm处检测。
柱子：ZORBAX 300SB-C18 Stable Bond Analytical 4.6×250mm 5-Micron。
HPLC结果如图4所示。
再根据蛋白的浓度与其峰面积做标准曲线，如图5所示。
由图可知，重组酰胺水解酶可以利用HPLC进行检测，浓度与峰面积的线性曲线方程为：y＝17.048x-347.14。
实施例6
本实施例使用实施例5中的纯化后的酰胺水解酶，催化N-月桂酰甘氨酸水解，并对催化产物进行检测，方法如下：
底物：N-月桂酰甘氨酸；
缓冲溶液：20mM Tris-HCl，pH 9.0。
取10.3mg底物加入离心管中，加入1mL缓冲溶液，再加入100μL酰胺水解酶，37℃反应4h；
取100μL反应液，加入400μL缓冲溶液、500μL的甲醇，混匀，过滤，用HPLC进行检测。
HPLC检测条件如下：
进样量：20μL；流速1mL/min；
A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：0.1％三氟乙酸-甲醇溶液，0min；
A相25％，B相75％，3min；
A相10％，B相90％，9min；
A相10％，B相90％，9.01min；
A相25％，B相75％，13min结束。
DVD检测器在210nm下检测。
柱子：C18 5μm 4.6×150mm。
反应后测试得知，酰胺水解酶催化N-月桂酰甘氨酸分解成月桂酸的浓度为：5.92mg/mL。
实施例7
本实施例使用实施例5中的纯化后的酰胺水解酶，催化N-月桂酰谷氨酸钠水解，并对催化产物进行检测，方法如下：
底物：N-月桂酰谷氨酸钠；
缓冲溶液：20mM Tris-HCl，pH 9.0。
取14.0mg底物加入离心管中，加入1mL缓冲溶液，再加入100μL酰胺水解酶，37℃反应4h；
取100μL反应液，加入400μL缓冲溶液，500μL的甲醇，混匀，过滤，用HPLC进行检测。
HPLC检测条件与实施例6相同。
反应后测试得知，酰胺水解酶催化N-月桂酰谷氨酸钠分解成月桂酸的浓度为：2.08mg/mL。
实施例8
本实施例使用实施例5中的纯化后的酰胺水解酶，催化月桂酰甘氨酸合成，并对合成产物进行检测，方法如下：
底物：甘氨酸溶液67.5mg/mL、月桂酸；
缓冲溶液：20mM Tris-HCl，pH 9.0。
取8mg月桂酸加入离心管中，加入甘氨酸溶液900μL、100μL酰胺水解酶，37℃反应17h；
取250μL反应液，加入750μL的甲醇，混匀，离心，取上清过滤，用HPLC进行检测。
HPLC检测条件与实施例6相同。
反应后测试得知，酰胺水解酶催化月桂酸和甘氨酸合成月桂酰甘氨酸的浓度为：0.74mg/mL。
实施例9
本实施例使用实施例5中的纯化后的酰胺水解酶，催化月桂酰精氨酸合成，并对合成产物进行检测，方法如下：
底物：精氨酸溶液40mg/mL、月桂酸；
缓冲溶液：20mM Tris-HCl，pH 9.0。
取8mg月桂酸加入离心管中，加入精氨酸溶液900μL、100μL酰胺水解酶，37℃反应17h；
取250μL反应液，加入750μL的甲醇，混匀，离心，取上清过滤，用HPLC进行检测。
HPLC检测条件与实施例6相同。
反应后测试得知，酰胺水解酶催化月桂酸和精氨酸合成月桂酰精氨酸的浓度为：2.77mg/mL。
综上所述，本发明通过对酰胺水解酶的编码基因进行优化，提高了其在ArcticExpress DE3细胞中的表达效率，为其大规模生产创造了条件；制备得到的酰胺水解酶具有良好的催化活性及稳定性，可以催化氨基酸表面活性剂分解产生相应的脂肪酸和氨基酸，也可以催化氨基酸和脂肪酸合成氨基酸表面活性剂，效率很高，应用前景广阔。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 广东省禾基生物科技有限公司
<120> 一种重组酰胺水解酶基因及其应用
<130> 2021
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1341
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgctgtctc tggttctgcc gggtatcggt cacgctcaga ccacccagcc gccgccggct 60
ccggctaaac cggttctgtt caccaacttc cgtctgttcg acggtaaatc ttctgctctg 120
cgtgacggtc tgtacatggt tgttgaaggt aacaccatct ctcagatcgg tcagggtcag 180
ccggcttctt ctgaaggtaa aaccgttgtt gactgcggtg gtaaagttat catgccgggt 240
ctgatcgaca tgcactggca ctctctgctg gctgctctgc cgatccaggt tatcctgcag 300
gctgacatcg ctttcgttca cctggctgct tctgctgaag ctgaacgtac cctgatgcgt 360
ggtttcacca ccatccgtga cgctggtggt ccgtctttcg ctctgaaaca ggctatcgac 420
tctggtatga tctctggtcc gcgtatctac ccgtctggtg ctatgatcac caccaccggt 480
ggtcacggtg acttccgttc tctggctgaa ctgccgcgta cctctaacca ggtttctcag 540
gctgaacgtg acggtgctaa cgctatcgct gacaccgctg acgaagttcg tatgcgtgtt 600
cgtgaacagt tcatccaggg tgctacccag atcaaaatgg ttggttgcgg tggtgtttct 660
accccgcgtt ctccgctgga catgctgacc ttcaccgaag accagatgcg tgctgctgtt 720
gaaaccgctg ctgactgggg tacctacatc ctggttcacg cttacacccc ggaatctatc 780
cagcgttctg ttgctgctgg tgttcagtgc gttgaacacg gtcacctgat ggacgacaaa 840
accgctgctc tgatggctaa acacggtacc tggctgtcta cccagccgtt cgtttctgaa 900
gaagacgttg ctccgctgtc tggtccgtct cgtgaaaaat tcctggaagt taccgctggt 960
accgacaaca cctacaaact ggctcgtaaa cacggtctga aagttgcttt cggtaccgac 1020
ctgatcttct ctcagaccct ggctacccgt cagggtaaaa tgctgaccca cctgaaacgt 1080
tggtacaccg ctgctgaagc tctgaacatg gctaccggtg ctaacggtca gctgctggct 1140
atgtctggtc accgtaaccc gtacccgcgt aaactgggtg ttctggaaga aggtgcttac 1200
gctgacctgc tgctgatcga cggtaacccg ctggacaacc tggacctgat cgctaacccg 1260
gaacagaacc tgcgtatcgt tatgaaagac ggtaaattct acaaaaacac cctgaaagct 1320
caccatcatc accaccatta a 1341

Claims (10)

1.一种重组酰胺水解酶基因，其特征在于，所述重组酰胺水解酶基因包括SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1所述的重组酰胺水解酶基因；
优选地，所述重组载体为含有权利要求1所述的重组酰胺水解酶基因的重组pET-21a载体。
3.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1所述的重组酰胺水解酶基因；
优选地，所述重组细胞含有权利要求2所述的重组载体；
优选地，所述重组细胞为含有权利要求2所述的重组载体的大肠杆菌细胞；
优选地，所述大肠杆菌细胞包括ArcticExpress DE3。
4.一种重组酰胺水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
构建权利要求2所述的重组载体，转化到受体细胞中，筛选阳性克隆；
鉴定正确的阳性克隆扩大培养，诱导蛋白表达，收集菌体并进行提取、纯化，得到所述重组酰胺水解酶。
5.根据权利要求4所述的重组酰胺水解酶的制备方法，其特征在于，所述受体细胞包括ArcticExpress DE3；
优选地，所述扩大培养后菌液的OD600值为0.6～0.8。
6.根据权利要求4或5所述的重组酰胺水解酶的制备方法，其特征在于，所述诱导通过添加IPTG进行，所述IPTG的终浓度为0.1～1mM；
优选地，所述诱导的温度为20～30℃；
优选地，所述诱导的时间为13～18h。
7.根据权利要求4～6任一项所述的重组酰胺水解酶的制备方法，其特征在于，所述纯化通过蛋白纯化仪进行；
优选地，所述纯化后还包括对蛋白进行定量的步骤。
8.根据权利要求4～7任一项所述的重组酰胺水解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将权利要求1所述的重组酰胺水解酶基因连入pET-21a载体，构建权利要求2所述的重组载体；
(2)所述重组载体转化到ArcticExpress DE3细胞中，筛选阳性克隆；
(3)鉴定正确的阳性克隆扩大培养至菌液的OD600值为0.6～0.8，加入终浓度为0.1～1mM的IPTG，在20～30℃下处理13～18h，诱导蛋白表达；
(4)收集菌体并进行提取，通过SDS-PAGE电泳进行检测，使用蛋白纯化仪纯化后，对蛋白进行定量，得到所述重组酰胺水解酶。
9.一种重组酰胺水解酶，其特征在于，所述酰胺水解酶通过权利要求4～8任一项所述的重组酰胺水解酶的制备方法制备得到。
10.权利要求4～8任一项所述的重组酰胺水解酶的制备方法和/或权利要求9所述的重组酰胺水解酶在催化氨基酸表面活性剂合成或分解中的应用。
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