CN102409033A - 一种l-ncc酰胺水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 - Google Patents

一种l-ncc酰胺水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-NCC酰胺水解酶)的基因序列及其重组表达蛋白质的制备及应用。本发明所提供的来源于假单胞菌（保藏号CGMCCNo.5315）的L-NCC酰胺水解酶是序列表中SEQIDNo.1的氨基酸残基序列或将SEQIDNo.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失或添加具有与SEQIDNo.1相同活性的由SEQIDNo.1衍生的蛋白质。本发明将来源于假单胞菌L-NCC酰胺水解酶基因克隆并表达制备重组酶，可用于生物法水解N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)获得L-半胱氨酸，所以可以用于酶法生产L-半胱氨酸。

Description

一种L-NCC酰胺水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及来源于假单胞菌的一种L-NCC酰胺水解酶的编码基因，以及重组蛋白质的表达与应用。 
背景技术
N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(N-carbomyl-L-cysteine amidohydrolase)，即L-NCC酰胺水解酶，是一种催化N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine，L-NCC)水解生成L-半胱氨酸的酶。因为ATC消旋酶催化拆分DL-ATC生成L-ATC；L-ATC水解酶水解ATC噻唑环中C-S单键，生成中间产物L-NCC；再经L-NCC酰胺水解酶催化生成终产物L-半胱氨酸，所以L-NCC酰胺水解酶是参与酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的重要成员之一，具体过程参见附图1。 
L-半胱氨酸(L-cysteine)是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是一种α氨基酸，它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-S-S-)连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L-半胱氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途，日益受到重视。目前L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解后还原法、化学合成法、发酵法和酶法合成法等。近年来，以微生物为酶源，采用酶法制备氨基酸的技术有了快速的发展。微生物酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特别是近年来，以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸，有了显著的进步。目前，有3种微生物酶法转化合成L-半胱氨酸的工艺路线：(1)以3-氯-L-丙氨酸为前体物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以O-乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以DL-ATC为前体物的酶法生产L-半胱氨酸。 
DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。对DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1979年，日本学者Sano提出了完成该转化过程的两种假设：一种是以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine，L-SCC)为中间产物的S-代途径；另一种是以L-NCC为中间产物的N-代途径，反应过程和酶系如附图1所示。其中以L-NCC为中间产物的转化途径最初于1998年由Tamura报道。该学者对L-半胱氨酸合成菌株假单胞菌ON-4a和恶臭假单胞菌AJ3865进行研究，诱导实验发现，如果分别以DL-ATC、L-NCC和L-SCC为诱导物进行细胞培养，诱导后的细胞加入不同的底物进行酶活测定，仅DL-ATC诱导后的细胞具有L-ATC水解酶活性；而且各种细胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而无L-SCC酰胺水解酶活性，而且各种细胞均不能够利用N-氨甲酰-D-半胱氨酸、L-SCC和S-氨甲酰-D-半胱氨酸为底物进行酶促反应生成L-半胱氨酸。Tamura还对中间产物进行了纯化，纯化后的产物经过红外光谱扫描、质谱分析、核磁共振分析和元素分析，结果与标准的L-NCC完全相同，因此证明了这两株菌进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢 途径。 
目前，有关酶法合成L-半胱氨酸相关酶系的报道不多。 
发明内容
本发明的目的是提供一种新的L-NCC酰胺水解酶及其编码基因，获得活力较高的重组酶，并且这种L-NCC酰胺水解酶可在酶法制备L-半胱氨酸中应用。 
本发明从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101，于2011年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.5315。该菌株进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径，涉及ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶等3个酶的协同催化作用。 
本发明提供的L-NCC酰胺水解酶，来源于假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101，是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代或添加且具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。 
序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列是由420个氨基酸残基组成的蛋白质。 
本发明所提供的L-NCC酰胺水解酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一： 
(1)是序列表SEQ ID No.2的核苷酸序列，由1260个碱基组成； 
(2)编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。 
本发明同时提供了含本发明基因(SEQ ID No.2)的表达载体及细胞体系。所述的细胞体系为原核细胞系统。 
本发明重组L-NCC酰胺水解酶蛋白质可以通过以下方法获得：培养含有L-NCC酰胺水解酶表达载体的宿主菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcC，该细胞体系为原核细胞体系，在所规定的蛋白质表达条件下，获得表达产物L-NCC酰胺水解酶。 
本发明的L-NCC酰胺水解酶及其编码基因可在微生物酶法生产L-半胱氨酸中应用。 
本发明的有益效果： 
本发明从一株假单胞菌中成功地克隆到一个新的L-NCC酰胺水解酶基因并进行了表达、重组酶的制备和转化等研究，本发明涉及的L-NCC酰胺水解酶的氨基酸序列通过GenBank Blast发现，与来自Pseudomonas sp.Strain BS的atcC(GenBank：BAD15360.1)的同源性为88％，它们的核苷酸序列同源性为83％。利用高效表达L-NCC酰胺水解酶的大肠杆菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcC，水解L-NCC生产L-半胱氨酸，催化效率高，发酵成本低，且反应液中成分单一，后续分离纯化方便，因此本发明在L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。 
附图说明
图1：是酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的S-代和N-代途径示意图； 
图2：是Pseudomonas sp.QR-101的L-NCC酰胺水解酶与数据库中已知序列L-NCC酰胺水解酶(GenBank：BAD15360.1)的核苷酸序列比对，其中，A是基因序列的1-640bp，B是基因序列的641-1260bp； 
图3：是重组质粒pET21-a(+)/atcC的图谱； 
图4：是基因工程菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcC的酶切鉴定图； 
图5：是基因工程菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcC表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1：Pseudomonas sp.QR-101；泳道2：基因工程菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcC；泳道3：E.coli BL21/pET-21a(+)。 
图6：是酶催化L-NCC生成L-半胱氨酸的薄层层析图谱。其中，第1道：L-NCC标准品；第2道：L-半胱氨酸标准品；第3道：酶催化反应液。 
具体实施方式
实施例1 
L-NCC酰胺水解酶的酶活测定方法 
(1)原理：采用酸性茚三酮法。L-NCC酰胺水解酶分解L-NCC生成L-半胱氨酸，L-半胱氨酸在煮沸的条件下与酸性茚三酮试剂生成红色物质，在560nm下有最大吸收，其颜色深浅与L-半胱氨酸的量成正比。 
(2)方法：准确在1％的L-NCC的溶液中加入6％的K2HPO4至pH值7.5配成底物终浓度为0.75％的溶液，然后取1mL的底物溶液，加入0.5mL酶液，于37℃水浴中反应10min。 
反应液中L-半胱氨酸含量测定采用酸性茚三酮法，取反应液0.2mL，加入0.2mL冰醋酸，再加入0.2mL酸性茚三酮试剂(称取250mg茚三酮，溶于6mL乙酸和4mL浓盐酸的混合液中)，于沸水浴中反应10min，然后立即在冷水中冷却，最后加入2.4mL工业酒精，总体积3mL，放置10min后于560nm下比色，以不加酶液的反应液作空白对照。 
L-半胱氨酸测定标准曲线的建立：精确配制1mmol/L L-半胱氨酸标准溶液，分别用蒸馏水稀释至以下浓度：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mmol/L。分别取0.2mL不同稀释度的溶液加入0.2mL冰醋酸，再加入0.2mL酸性茚三酮试剂，于沸水浴中反应10min，然后立即在冷水中冷却，最后加入2.4mL工业酒精，总体积3mL，放置10min后于560nm下比色，以L-半胱氨酸的浓度为横坐标、以A560nm为纵坐标绘制标准曲线。 
酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟生成1微摩尔L-半胱氨酸产物所需的酶量定为一个酶活力单位。 
实施例2 
L-NCC酰胺水解酶的克隆及一级结构特征 
本发明人从假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101中提取基因组DNA，然后用HindIII酶切基因组DNA，用胶回收试剂盒从1.2％的琼脂糖凝胶上分别回收2-9kb的HindIII酶切片段，将回收的酶切片段连接在经相同酶切处理的Puc18载体上，转入E.coli JM109中，在涂有X-gal和IPTG的平板上进行蓝白初筛。 
将上述含有插入片段的重组白色单菌落，分别挑入每孔含50μL LB培养基(蛋白胨：10g/L，酵母粉：5g/L，氯化钠：10g/L)，37℃过夜培养后，加入100μL 0.75％L-NCC作为底物，35℃振荡30min，分别加入酸性茚三酮试剂进行显色反应。 
通过微孔板复筛较高活性的重组子，并抽提质粒，然后进行DNA序列测定，结果显示阳性重组子PU113中含有插入片段为2630bp，在其中位于748-2007bp间有一个完整的读码框，为1260bp(SEQ ID NO2)，G+C含量为62.78％，编码420aa，其计算分子量为44.41kD。将该DNA序列通过GenBank Blast发现，与来自Pseudomonas sp.Strain BS的atcC(GenBank：BAD15360.1)的同源性为88％，它们的核苷酸序列同源性为83％。因此，本发明的L-NCC酰胺水解酶基因序列不同于现有文献报道的类似酶的序列，它是一个新基因。 
实施例3 
大肠杆菌基因工程菌的构建及重组L-NCC酰胺水解酶的表达 
根据实施例2测序结果，按照该蛋白质编码基因的两末端序列设计引物P1和P2，其中上游P1：5’-CCG GAA TTC ATG AGT GGA GTC AAC AGC ATG AA-3’含有EcoRI酶切位点；下游引物P2：5’-CCC AAG CTT TCA GCC GGT GCG GCT GTC CGC CA-3’含有HindIII酶切位点。 
以菌株Pseudomonas sp.QR-101的基因组为模板，按如下PCR程序进行DNA扩增： 
94℃变性1min，66℃复性1min，72℃延伸1min，扩增反应进行30个循环。 
PCR扩增产物经EcoR I和HindIII双酶切后，连接到经相同酶切后的载体pET21a(+)，构建重组子pET-21a(+)/atcC。 
获得的重组子pET-21a(+)/atcC采用CaCl2法转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，经鉴定后获得BL21(pET-21a(+)/atcC)工程菌。 
将BL21(pET-21a(+)/atcC)工程菌于37℃活化过夜，按1∶100转接到100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期；加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续培养3h；4℃，6,000r/min离心10min，收集菌体，加入0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)悬浮洗涤后，6,000r/min离心10min，收集菌体，重复洗涤一次，加入磷酸钾缓冲液制成酶源细胞悬液，采用实施例1的方法测定相应的酶活力，大肠杆菌基因工程菌酶源细胞的酶活可达1500U/g。 
取100g/L的酶源细胞悬液20mL，加入6.25g/L的L-NCC底物溶液80mL混合，在 35℃下进行催化反应2h，反应完毕后的反应液经三氯乙酸去除蛋白后进行薄层层析(展层液配比为：异丙醇∶浓氨水＝1∶1)，与标准品进行对照，结果见图6。从图中可以看出，在第3道，酶催化L-NCC后的产物为L-半胱氨酸(图中所示还有少部分底物L-NCC未转化成产物L-半胱氨酸)。 
实施例4 
以重组大肠杆菌的发酵菌体为酶源细胞，转化L-NCC生产L-半胱氨酸 
L-NCC是酶法转化DL-ATC(或L-ATC)合成L-半胱氨酸过程的中间产物。L-ATC水解酶能够催化水解L-ATC生成L-NCC，L-NCC再经L-NCC酰胺水解酶催化生成终产物L-半胱氨酸，L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料工业。 
①酶反应体系组成： 
底物：5g/L的L-NCC 
反应温度：35℃ 
PH：8.0 
酶源细胞(实施例3制备)：3g/L 
②酶的转化率： 
酶量为3g/L，底物L-NCC的浓度为5g/L，反应体系为3L，35℃反应2h后，在上述酶反应的条件下，底物转化率约为90％。 

Claims (6)

1.一种L-NCC酰胺水解酶，是序列表SEQ ID No.1中氨基酸残基序列或将SEQ IDNo.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代或添加且具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ IDNo.1衍生的蛋白质。
2.一种权利要求1所述的L-NCC酰胺水解酶的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：
1)是序列表SEQ ID No.2的核苷酸序列；
2)编码序列表中的SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.一种含有权利要求2所述基因的细胞体系。
5.根据权利要求4所述基因的细胞体系，其特征在于，所述的细胞体系为原核细胞系统。
6.权利要求1所述的L-NCC酰胺水解酶在微生物酶法生产L-半胱氨酸中的应用。
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