CN102417900B - 一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 - Google Patents
一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102417900B CN102417900B CN2011103650972A CN201110365097A CN102417900B CN 102417900 B CN102417900 B CN 102417900B CN 2011103650972 A CN2011103650972 A CN 2011103650972A CN 201110365097 A CN201110365097 A CN 201110365097A CN 102417900 B CN102417900 B CN 102417900B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- atc
- racemase
- protein
- seq
- enzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种ATC消旋酶和编码基因序列及其重组表达蛋白质的制备及应用。本发明所提供的来源于假单胞菌(保藏号CGMCC No.5315)的ATC消旋酶是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失或添加具有与SEQIDNo.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。编码基因序列是序列表中SEQ ID No.2的核苷酸序列。本发明将来源于假单胞菌ATC消旋酶基因克隆并表达制备重组酶,可用于生物法将DL-ATC催化拆分成L-ATC,生成的L-ATC作为底物,可用于酶法生产L-半胱氨酸。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及来源于假单胞菌的一种ATC消旋酶的编码基因,以及重组蛋白质的表达与应用。
背景技术
ATC消旋酶(ATC racemase)是一种催化拆分DL-ATC(DL-2-氨基Δ2-噻唑啉-4-羧酸,DL-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid)生成L-ATC(L-2-氨基Δ2-噻唑啉-4-羧酸,L-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid)的酶。L-ATC可作为底物,经过以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine,L-SCC)或N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine,L-NCC)为中间产物的转化途径,生成终产物L-半胱氨酸,所以ATC消旋酶也是参与酶法转化DL-ATC生产L-半胱氨酸的重要成员之一,具体过程参见附图1。
L-半胱氨酸(L-cysteine)是组成蛋白质的20种氨基酸之一,是一种α氨基酸,它的存在可以保持蛋白质的稳定性,同一条或不同多肽链两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-S-S-)连接,使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L-半胱氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途,日益受到重视。目前L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解后还原法、化学合成法、发酵法和酶法合成法等。微生物为酶源,采用酶法制备氨基酸的技术有了快速的发展。微生物酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特别是近年来,以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸,有了显著的进步。目前,有3种微生物酶法转化合成L-半胱氨酸的工艺路线:(1)以3-氯-L-丙氨酸为前体物的L-半胱氨酸酶法合成;(2)以O-乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成L-半胱氨酸;(3)以DL-ATC为前体物的酶法生产L-半胱氨酸。
DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。对以DL-ATC为前体酶法合成L-半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1979年,日本学者Sano提出了完成该转化过程的两种假设:一种是以L-SCC为中间产物的转化途径;另一种是以L-NCC为中间产物的转化途径。
Sano在研究嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌AJ3854菌株时,以不能利用D-ATC但可利用L-ATC合成L-半胱氨酸的菌株Pseudomonas desmolytica AJ3872为对照菌株,二者细胞悬液中均加入DL-ATC为底物进行酶促反应,结果发现AJ3872细胞对DL-ATC利用率不超过50%,而AJ3854细胞对DL-ATC的转化率却达到90%以上,由此证明了AJ3854细胞中有ATC消旋酶的存在,可催化从D-ATC到L-ATC的消旋化反应。
目前,有关酶法合成L-半胱氨酸相关酶系的报道不多。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的ATC消旋酶及其编码基因,获得活力较高的重组蛋白质,并且这种ATC消旋酶可应用于酶法拆分DL-ATC进一步酶法生产L-半胱氨酸。
本发明申请人从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101,于2011年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏号CGMCC No.5315,经验证它进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径,涉及ATC-消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶3个酶的协同催化作用。
本发明提供的ATC消旋酶,来源于假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101,是序列表中SEQID No.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、替代或添加且具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列是由248个氨基酸残基组成的蛋白质。
本发明所提供的ATC消旋酶的编码基因,是下列核苷酸序列之一:
序列表中SEQ ID No.2的DNA序列,由744个碱基组成;
编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。
含本发明基因的表达载体及细胞体系均属于本发明的保护范围。所述的细胞体系为原核细胞体系。
本发明重组ATC消旋酶蛋白可以通过以下方法获得:培养含有ATC消旋酶表达载体的宿主菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcA,该细胞体系为原核细胞体系,在所规定的蛋白质表达条件下,获得表达产物ATC消旋酶。
本发明的ATC消旋酶及其编码基因可在酶法拆分DL-ATC及进一步微生物酶法生产L-半胱氨酸中应用。
本发明的有益效果:
本发明从一株假单胞菌中成功地克隆到一个新的ATC消旋酶基因并进行了表达/重组酶的制备和转化等研究,本发明涉及的ATC消旋酶的氨基酸序列通过GenBank Blast发现,与来自Pseudomonas sp.Strain BS的atcA(GenBank:BAD15357.1)的同源性为85%,它们的核苷酸序列同源性为83%。利用高效表达ATC消旋酶的大肠杆菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcA,催化拆分DL-ATC生成L-ATC,催化效率高,发酵成本低,且反应液中成分单一,后续分离纯化方便,生成的L-TAC可作为酶法生产L-半胱氨酸的底物,因此本发明在L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。
附图说明
图1:是酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径示意图;
图2:是Pseudomonas sp.QR-101的ATC消旋酶与数据库中已知序列ATC消旋酶(GenBank:BAD15357.1)的核苷酸序列比对。
图3:是重组质粒pET-21a(+)/atcA的图谱。
图4:是基因工程菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcA的酶切鉴定图。其中:泳道M:DNA Marker 15000;泳道1:EcoR I单酶切质粒pET-21a(+)-atcA(+);泳道2:EcoR I和Hind III双酶切质粒pET-21a(+)-atcA(+);泳道3:EcoR I和Hind III双酶切质粒pET-21a(+);泳道4:以Pseudomonas sp.QR-101的基因组DNA为模板的PCR产物;以质粒pET-21a(+)-atcA为模板的PCR产物。
图5:是基因工程菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcA表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中,泳道1:Pseudomonas sp.QR-101;泳道2:基因工程菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcA;泳道3:E.coli BL21/pET-21a(+)。
图6:重组ATC消旋酶活性的验证,其中A为不添加任何酶的D,L-ATC对照组,B为添加L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶组,C为添加重组ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶组,D为只添加重组ATC消旋酶组。
具体实施方式
实施例1
ATC消旋酶的克隆及一级结构特征
本发明人从假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101中提取基因组DNA,然后用HindIII酶切基因组DNA,用胶回收试剂盒从1.2%的琼脂糖凝胶上分别回收2-9kb的Hind III酶切片段,将回收的酶切片段连接在经相同酶切处理的pUC18载体上,转入E.coli JM109中,在涂有X-gal和IPTG的平板上进行蓝白初筛。
将含有插入片段的重组白色单菌落,分别挑入每孔含50μL LB培养基,37℃过夜培养后,加入100μL0.6%D,L-ATC作为底物,同时加入L-ATC水解酶(其基因序列见序列表SEQ ID No.3)和L-NCC酰胺水解酶(其基因序列见序列表SEQ ID No.4)各0.5U,于35℃振荡30min,分别加入150μL酸性茚三酮试剂(称取250mg茚三酮,溶于6mL乙酸和4mL浓盐酸的混合液中)进行显色反应,以不加培养液的空白作为对照。
通过微孔板复筛较高活性的重组子,并抽提质粒,然后进行DNA序列测定,结果显示阳性重组子PU025中含有插入片段为4539bp,在其中位于335-1078bp间有一个完整的读码框,为744bp(SEQ ID No.2),G+C含量为60.48%,编码248aa,其计算分子量为26.22kD。将该DNA序列通过GenBank Blast发现,与来自Pseudomonas sp.Strain BS的atcA(GenBank:BAD15357.1)的同源性为85%,它们的核苷酸序列同源性为83%。因此,本发明的ATC消旋酶基因序列不同于现有文献报道的类似酶的序列,它是一个新基因。
实施例2
大肠杆菌基因工程菌的构建及重组ATC消旋酶的表达
根据测序结果,按照该蛋白质编码基因的两末端序列设计引物P1和P2,其中上游P1:5’-CCG GAA TTC ATG AAG CAT CAT CAG ACG GGC AT-3’含有EcoR I酶切位点;下游引物P2:5’-CCC AAG CTT CTA GCC CAA CAG TTT TCC CAG GC-3’含有HindIII酶切位点。
以菌株Pseudomonas sp.QR-101的基因组为模板,按如下PCR程序进行DNA扩增:
94℃变性1min,66℃复性1min,72℃延伸1min,扩增反应进行30个循环。
PCR扩增产物经EcoR I和HindIII双酶切后,连接到经相同酶切后的载体pET-21a(+),构建重组子pET21-a(+)/atcA。
获得的重组子pET-21a(+)/atcA采用CaCl2法转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3),经鉴定后获得BL21(pET-21a(+)/atcA)工程菌。
将BL21(pET-21a(+)/atcA)工程菌于37℃活化过夜,按1∶100转接到100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中,37℃培养至对数生长期;加入终浓度为1mM的IPTG,37℃继续培养3h;4℃,6,000r/min离心10min,收集菌体,加入0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)悬浮洗涤后,6,000r/min离心10min,收集菌体,重复洗涤一次,加入磷酸钾缓冲液制成酶源细胞悬液。
实施例3重组ATC消旋酶活性的验证
取实施例2中的酶源细胞悬液,调整终浓度至20g/L,于5mL反应管中,依次加入3mL 0.5%的底物DL-ATC和1.5mL的混合酶液,其中,各组中混合酶液的成分如表1示。
表一混合酶液的成分
35℃水浴2h,各个反应液冷冻干燥,然后溶解于300μL异丙醇中,采用高效液相色谱方法测定其中D-ATC和L-ATC的含量。
高效液相色谱采用CHIRALPAK IC柱(0.46cm ID.×25cm L)(Daicel chiraltechnologies CO.,LTD.,Shanghai,CHINA),该液相条件为:紫外检测器SPD-10A,检测波长是220nm,流动相为正己烷-异丙醇(85∶15),含0.2%三氟乙酸和0.1%二乙胺,室温条件下分析,进样量为10μL。
结果如图6所示,D-ATC和L-ATC的保留时间分别为11.0min和18.5min。在不添加任何酶的对照组中,D-ATC和L-ATC的含量各占约50%,且随着反应时间延长,浓度不变(图6A).当反应液中同时加入L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶时,因为L-ATC作为底物能被L-ATC水解酶作用,生成的中间产物L-NCC又在L-NCC酰胺水解酶的作用下生成L-半胱氨酸,所以,最终反应液中L-ATC的浓度下降至12%,但由于没有ATC消旋酶的作用,因此D-ATC的浓度不变(图6B)。当反应液中同时加入重组ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶酶源细胞时(C组),在L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶的作用下,L-ATC被转化生成L-半胱氨酸,随着L-ATC的浓度下降,打破了L-ATC与D-ATC各占50%的比例,因此在ATC消旋酶的作用下,随着L-ATC的消耗,D-ATC也被消旋生成L-ATC,最终反应液中L-ATC和D-ATC的浓度都下降,二者比例仍为1∶1(图6C)。但是,在只加入ATC消旋酶的D组中,二者的消旋反应处于动态平衡,且L-ATC没有被转化消耗,因此D-ATC不被催化生成L-ATC,L-ATC和D-ATC的浓度均未发生变化(图6D)。综上可以说明,当L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶作用于L-ATC生成L-半胱氨酸时,由于L-ATC被消耗,重组的ATC消旋酶发挥活性,可催化消旋D-ATC生成L-ATC,生成的L-ATC继而被继续催化最终生成L-半胱氨酸。因此,重组表达的ATC消旋酶可用于微生物酶法转化生产L-半胱氨酸,有效提高DL-ATC的利用率。
实施例4以重组大肠杆菌的发酵菌体为ATC消旋酶酶源,转化DL-ATC生产L-半胱氨酸
①反应体系组成:
底物:10g/L的DL-ATC
反应温度:35℃
PH:8.0
ATC消旋酶酶源:4g/L
L-ATC水解酶:1000U/L
L-NCC酰胺水解酶:1000U/L
②转化率:
在上述条件下,反应体积为3L,35℃反应2h后,底物转化率约为81%。
Claims (6)
1.一种ATC消旋酶,其特征在于,是序列表中SEQ ID No.1氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述的ATC消旋酶的编码基因,其特征在于,是编码序列表中的SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.一种含有权利要求2所述基因的细胞体系。
5.根据权利要求4所述的细胞体系,其特征在于,所述的细胞体系为原核细胞系统。
6.权利要求1所述的ATC消旋酶在微生物酶法生产L-半胱氨酸中的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011103650972A CN102417900B (zh) | 2011-11-17 | 2011-11-17 | 一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011103650972A CN102417900B (zh) | 2011-11-17 | 2011-11-17 | 一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102417900A CN102417900A (zh) | 2012-04-18 |
CN102417900B true CN102417900B (zh) | 2013-04-03 |
Family
ID=45942544
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011103650972A Expired - Fee Related CN102417900B (zh) | 2011-11-17 | 2011-11-17 | 一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102417900B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105200088B (zh) * | 2015-10-08 | 2019-06-25 | 湖北工业大学 | 一种酶法转化dl-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸合成l-半胱氨酸的方法 |
CN105177076B (zh) * | 2015-10-08 | 2019-06-25 | 湖北工业大学 | 一种固定化酶转化dl-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸合成l-半胱氨酸的方法 |
CN106676157A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-05-17 | 南华大学 | 军团菌菌体制备氨基酸构型转换试剂的应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101054597A (zh) * | 2007-02-09 | 2007-10-17 | 南开大学 | 一种微生物转化生产胱氨酸的方法 |
-
2011
- 2011-11-17 CN CN2011103650972A patent/CN102417900B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101054597A (zh) * | 2007-02-09 | 2007-10-17 | 南开大学 | 一种微生物转化生产胱氨酸的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
Cloning,expression,and identification of genes involved in the conversion of DL-2-amino-Delta2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine via S-carbamyl-L-cysteine pathway in Pseudomonas sp. TS1138;Yu Y et al.;《Biosci Biotechnol Biochem》;20060930;第70卷(第9期);第2262-2267页 * |
Yu Y et al..Cloning,expression,and identification of genes involved in the conversion of DL-2-amino-Delta2-thiazoline-4-carboxylic acid to L-cysteine via S-carbamyl-L-cysteine pathway in Pseudomonas sp. TS1138.《Biosci Biotechnol Biochem》.2006,第70卷(第9期),第2262-2267页. |
假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸;吴敏等;《氨基酸和生物资源》;20090331;第31卷(第1期);第58-63页 * |
吴敏等.假单胞菌酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸.《氨基酸和生物资源》.2009,第31卷(第1期),第58-63页. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102417900A (zh) | 2012-04-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102286441B (zh) | 一种低温酯酶及其编码基因与应用 | |
KR20090005052A (ko) | 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 효소적 제조 방법 | |
CN106497895B (zh) | 亮氨酸脱氢酶突变体、编码基因、载体、工程菌及其应用 | |
CN109439601B (zh) | 一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法 | |
CN103468624B (zh) | 一种用于高效生产海藻糖的基因工程菌 | |
CN103361326B (zh) | 一种耐热性提高的偏甘油酯脂肪酶突变体及突变质粒、重组菌株和制备方法 | |
CN105368766B (zh) | 一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法 | |
CN104531629A (zh) | 一种提高aa-2g转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 | |
CN102417900B (zh) | 一种atc消旋酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 | |
CN105255771A (zh) | 一种产胶原蛋白酶的琥珀葡萄球菌及其应用 | |
CN104561076A (zh) | 一种高产l-丝氨酸重组谷氨酸棒杆菌的构建及其发酵方法 | |
CN112251428B (zh) | 一种谷氨酸脱羧酶突变体及其在生产γ-氨基丁酸中的应用 | |
CN108977401A (zh) | 采用木质纤维素培养微藻的方法 | |
CN105907692A (zh) | 一种高产l-赖氨酸的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法 | |
CN108441525A (zh) | 一种赖氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌及其构建方法 | |
CN106164252A (zh) | 用于琥珀酸产生的改进微生物 | |
CN100392075C (zh) | 谷氨酰胺合成酶及其专用表达工程菌与应用 | |
CN109182319A (zh) | 一种苏氨酸脱氨酶突变体及其制备方法和应用 | |
CN104762306B (zh) | 一种海洋酯酶及其编码基因e32与应用 | |
CN114350630A (zh) | L-泛解酸内酯脱氢酶、突变体及其应用 | |
JP3586684B1 (ja) | バリダマイシンをバリエナミンおよびバリダミンに変換する新規微生物 | |
CN107119003A (zh) | 一种利用葡聚糖合成3‑羟基丙酸的重组菌及其构建方法和应用 | |
CN109161570B (zh) | 一种提高发酵产n-乙酰神经氨酸的方法及发酵液 | |
CN102409033B (zh) | 一种l-ncc酰胺水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 | |
CN105950595A (zh) | (-)-γ-内酰胺酶、基因、突变体、载体及其制备与应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130403 Termination date: 20211117 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |