CN105200088B - 一种酶法转化dl-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸合成l-半胱氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酶法转化DL‑2‑氨基‑△2‑噻唑啉‑4‑羧酸合成L‑半胱氨酸的方法。本发明通过海藻酸钙包埋法将经过透膜处理的基因工程菌固定得到固定化细胞，其能够转化DL‑ATC生成L‑半胱氨酸。所述基因工程菌为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达DL‑ATC消旋酶/L‑ATC水解酶融合蛋白和氮一氨甲酰‑L‑半胱氨酸水解酶的大肠杆菌；通过将SEQ ID NO.2和5所示序列分别构建到表达载体上，再转化到敲除tnaA及malY基因的大肠杆菌中得到该工程菌。本发明的固定化细胞转化DL‑ATC为L‑半胱氨酸的效率高达93%，具有转化率高、生产成本低等优点，在L‑半胱氨酸的合成中具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酶法转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸 (DL-ATC)合成L-半胱氨酸的方法。
背景技术
L-半胱氨酸是组成蛋白质的20多种氨基酸中唯一具有还原性基团巯基(-SH)的氨基酸，具有重要的生理功能。目前已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。我国是L-半胱氨酸生产大国，占全球总产量的80％，产品不仅占领了国内市场，而且大量出口到世界各地。目前，国内生产L-半胱氨酸主要是依靠人或动物的毛发中的角蛋白经酸水解提取L-胱氨酸后，再经过电解还原制得L-半胱氨酸。该方法收率低，能耗高，水解过程产生大量刺激性气体，废液处理困难，对环境污染严重。近年来，随着L-半胱氨酸生产技术的发展，国际上逐步以微生物转化法取代了毛发水解制备L-半胱氨酸。微生物转化法中以DL-ATC酶法转化最具优势。DL-ATC酶法转化是利用微生物细胞内所含有的转化酶系(包括DL-ATC消旋酶、L-ATC 水解酶、硫-氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶、氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶)将DL-ATC生物转化为L-半胱氨酸。这个方法是1977年日本Sano等人提出的，他们从土壤中筛选到的假单胞菌 (Pseudomonas sp.)可将DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)生物转化为L-半胱氨酸。此法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少、产物均一、易提取等优点，很适宜合成用发酵法生产比较困难的氨基酸。
虽然国际上微生物酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸这一技术已有较为成熟的应用，但由于存在菌体使用寿命不长(由于L-ATC水解酶在生理温度的热稳定性不高，易变性，其半衰期很短)，酶促反应途径中的酶均为诱导酶，对底物响应时间长，野生菌株中酶量不足、活力相对较低等使得整套工艺的连续生产能力被大大限制，生产成本居高不下，一般该法只用于医用级高纯度L-半胱氨酸的产生。特别是野生菌中存在半胱氨酸的分解代谢途径，转化过程中积累的L-半胱氨酸被分解，释放出大量的的H2S气体，严重影响了产率。而目前由于对菌株基因组信息的缺乏以及一些未知的原因，对野生假单胞菌的基因工程改造工作难度很大，一直进展不前。
由此可见，创立一套高效、高产率的微生物酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的新方法就显得十分重要。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术存在的利用野生型假单胞菌法转化DL-2-氨基-△2-噻唑啉-4-羧酸(DL-ATC)合成L-半胱氨酸工艺中遇到的技术问题，提供一种更为高效的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)基因工程菌细胞膜的透膜处理
将经诱导表达后的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌先后用正己烷和二甲苯进行透膜处理，离心收集透膜处理的菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤后备用。其中，用于转化 DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由 DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白AtcAB和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的大肠杆菌；
所述的融合蛋白AtcAB的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
(2)固定化细胞的制备
通过海藻酸钙包埋法将步骤(1)所获得的经透膜处理的基因工程菌固定得到固定化细胞。
(3)固定化细胞转化DL-ATC生成L-半胱氨酸
将步骤(2)得到的固定化细胞加入到含有反应物DL-ATC、KH2PO4、山梨醇的体系中进行反应得到L-半胱氨酸。
步骤(1)中所述的大肠杆菌为染色体上整合有受λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的大肠杆菌，如BL21(DE3)、JM109(DE3)等中的任意一株，这些菌株可从Novagen、Promega等生物技术公司购买。该类菌株有利于在T7启动子控制下的外源基因的表达。
步骤(1)中所述的半胱氨酸脱巯基酶基因为tnaA和malY基因，其优选通过Red重组系统进行敲除。根据Genbank公布的大肠杆菌基因组序列，设计引物对tnaA及malY基因进行敲除。以pKD4质粒为模板，用所设计的引物通过PCR(聚合酶链式反应)扩增带有卡那霉素抗性基因的同源重组片段。将pKD46质粒导入大肠杆菌中，诱导产生同源重组所需的酶后，收获菌体并制备电转化感受态细胞；将50-200μL的感受态细胞与10-20ng的同源重组片段混合后加入电击杯中(于Bio-Rad公司购买)，通过电穿孔仪(于Bio-Rad公司购买)电击，电压设置1700-2500V。将电击液用800μL SOC培养基稀释，然后通过卡那霉素抗性平板筛选重组子，然后设计引物，PCR验证敲除的正确性。然后培养重组大肠杆菌并制备感受态细胞，转化pCP20质粒，通过温度诱导表达FLP内切酶将抗性基因从基因组上切除掉。
敲除基因tnaA及malY所用的引物分别为：
tnaAup：
5’-ATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGCATTCGTGTTATTGAGCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，
tnaAdown：
5’-TTAAACTTCTTTAAGTTTTGCGGTGAAGTGACGCAATACTTTCGGTTCGTACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’；
malYup：
5’-ATGTTCGATTTTTCAAAGGTCGTGGATCGTCATGGCACATGGTGTACACAGTGGGAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，
malYdown：
5’-TCCAGCCACACCTTTTTCCAGTTTCGAACGTGGGCAGCCGGCATTGAGACGGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’。
验证上述tnaA及malY基因敲除所用的引物分别为：
tnaAtestup：5’-TTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3’，
tnaAtestdown：5’-AGGATGTAGGGTAAGAGAGTGG-3’；
malYtestup：5’-TCGGGCAATTGGCGTAGTAC-3’，
malYtestdown：5’-GCAATTGGGTTAACGAACAG-3’。
上述质粒pKD4含有两边为FRT位点的卡那霉素抗性基因，是Red重组系统中的常规质粒，其可在市场上随意购买得到。质粒pKD46(oriR101repA101ts ParaB-gam-bet-exoAmp) 是温度敏感型质粒，能在阿拉伯糖的诱导下表达同源重组需要的三个λ噬菌体重组酶Gam、 Bet和Exo，其是Red重组系统中提供重组酶的质粒，可在市场上随意购买得到。质粒pCP20 为温度敏感型质粒，热诱导后表达FLP重组酶，能识别FRT位点并促进重组的发生，其亦可在市场上随意购买得到。所述质粒pKD46、pKD4及pCP20的构建及应用见下述文献：1.DatsenkoKA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12 using PCR products.Pro Natl Acad Sci USA 2000,97:6640-6645；2.Red重组技术研究进展，中国生物工程杂志，2006,26(1)：81-86；3.Red重组系统及在微生物基因敲除中的应用，遗传， 2003,25(5)：628-632。
步骤(1)中的DL-ATC消旋酶、L-ATC水解酶和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的编码基因均来源于假单胞菌Pseudomonas sp.BS株，这些编码基因的序列均经过密码子优化。编码由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，编码氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选的，步骤(1)中所述的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌通过包括如下步骤的方法构建得到：
a.将序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段通过NdeI、EcoRI酶切位点连接到复制子为 f1的pET-28a(+)载体上构建得到表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白的表达载体(pET-atcAB)。所述表达载体pET-28a(+)为Novagen公司产品，可随意从市场购买。
b.将序列如SEQ ID NO.6所示的DNA片段通过EcoRI、NcoI酶切位点连接到复制子为 p15A的pACYC184载体上构建得到氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶表达载体(pAC-atcC)。所述载体pACYC184为New England Biolabs公司产品，亦可随意从市场购买。
c.将上述两种因具有不同的复制子从而具备相容性的表达载体共同转入敲除半胱氨酸脱巯基酶基因的大肠杆菌中，即得到用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌。
步骤(1)中所述的基因工程菌的干重与正己烷的体积比优选为1mg:5-40μL，基因工程菌的干重与二甲苯的体积比优选为1mg:10-50μL。
步骤(1)中所述的透膜处理的条件优选为30℃透膜处理5-40min。
优选的，步骤(2)为：将所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到15g/L的海藻酸钠溶液中混合均匀，使得菌体(细胞干重)浓度为5-20mg/mL，将混合液逐滴滴入到20g/L的氯化钙溶液中得到固定化细胞。再将固定化细胞放置在20g/L的氯化钙溶液中，4℃过夜。固定化细胞再用无菌水洗涤后，置于4℃备用。
步骤(3)中的反应体系优选为：固定化细胞浓度为50-300g/L，反应物DL-ATC浓度为 5-20g/L，KH2PO4浓度为0.5-2g/L，山梨醇浓度为10-200g/L，pH为6-8。
步骤(3)中所述的反应的条件优选为：反应温度为28-37℃，搅拌转速为100-200转/分钟，反应时间为2-6h。
转化反应完成后，通过过滤即可把固定化细胞回收，回收的固定化细胞用KH2PO4浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、pH为7.5的洗涤缓冲液洗涤后，可再次用其建立上述反应体系转化DL-ATC生成L-半胱氨酸。
一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌，为上述敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌。
一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的固定化细胞，通过海藻酸钙包埋法将用于转化 DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌固定得到。
L-半胱氨酸是大肠杆菌中的重要氨基酸，其分解代谢主要由半胱氨酸脱巯基酶完成，其催化的反应为HSCH2CH(NH2)COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S+NH3。野生型大肠杆菌细胞内有多种半胱氨酸脱巯基酶基因，本发明通过敲除其起主要降解作用的脱巯基酶基因tnaA及malY，使得L-半胱氨酸不被其分解利用，从而在大肠杆菌细胞内积累下来。
酶转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径中有三个关键性的酶：催化DL-ATC形成L-ATC的DL-ATC消旋酶；催化L-ATC水解形成氮一氨甲酰-L-半胱氨酸的L-ATC水解酶；催化形成L-半胱氨酸的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶；这三个酶仅存在于某些假单胞菌体内；本发明将编码这三个关键性的酶的基因同时克隆到已敲除半胱氨酸脱巯基酶基因的大肠杆菌中进行过量表达，即在大肠杆菌中实现以DL-ATC为底物，转化合成L-半胱氨酸。
由于大肠杆菌细胞膜对底物DL-ATC存在通透性障碍，使得DL-ATC较难进入细胞与上述三个关键酶发生酶促反应，导致DL-ATC的转化率受限。本发明采用多种有机溶剂对大肠杆菌基因工程菌细胞进行复合透膜处理，提高了基因工程菌对底物DL-ATC及产物L-半胱氨酸的通透性，从而有效提高了基因工程菌的转化效率。
本发明通过对大肠杆菌染色体DNA进行定点基因敲除，有效抑制了菌体内L-半胱氨酸脱巯基酶的活性，同时巧妙地将来自于假单胞菌的生物转化基因经密码子优化后通过融合基因等形式导入经基因定点敲除的大肠杆菌中，成功获得了能转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌。同时进一步通过对基因工程菌进行复合透膜处理及细胞固定化，在强化工程菌吸收底物及外排产物L-半胱氨酸的能力的同时亦提高了其操作稳定性。转化实验结果表明，固定化的基因工程菌可高效的转化DL-ATC合成L-半胱氨酸，其转化率达到93％以上；转化稳定性实验表明，固定化的菌体能较好的保持催化活力，间歇操作第10批次转化反应的转化率仍达到了第一批次转化率的80％左右。本发明为实现L-半胱氨酸的工业化生产奠定了基础。
和现有的利用假单胞菌转化DL-ATC制备L-半胱氨酸的传统方法相比，本发明具有如下优点和效果：
(1)利用大肠杆菌基因组背景清晰的优势，敲除了其起主导作用的L-半胱氨酸水解酶基因，使得转化产物可以在细胞中积累；而目前假单胞菌遗传背景不清，敲除相关基因的工作至今未有任何进展。
(2)将转化途径中的关键酶基因atcA与atcB基因进行密码子优化后，利用刚性连接肽将此二基因进行首尾相连而构建融合表达载体，进行融合蛋白的表达，融合蛋白具有两种酶活力，且稳定性高。
(2)利用密码子优化的技术，通过两种复制相容性质粒载体，利用两种不同的启动子(T7 启动子及Tac启动子)对DL-ATC消旋酶、L-ATC水解酶融合蛋白及氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶基因进行共表达，消除了启动子的竞争因素造成的基因表达不均衡，实现了二基因的高效共表达(表达量分别为细胞总蛋白的10％及15％)，从而实现了高效转化；而野生假单胞菌中相关酶均为诱导酶，需要DL-ATC的诱导，其响应速度慢，转化率低。
(3)用两种有机溶剂对基因工程菌进行了有效的透膜处理，提高了DL-ATC的渗透能力与产物的外排能力，进一步提高了转化率。
(4)利用细胞固定化技术，提高了基因工程菌的操作稳定性。
将本发明应用到L-半胱氨酸的工业化生产中，可极大的提高生产效率与降低生产成本，其具有重要的工业应用价值。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1大肠杆菌JM109(DE3)L-半胱氨酸脱巯基酶基因tnaA的敲除
1、材料
菌种：大肠杆菌JM109(DE3)，购自Promega公司。
质粒：质粒pKD4、pKD46、pCP20均购自武汉淼灵生物科技有限公司。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
卡那霉素抗性平板：含有20mg/L卡那霉素、1.5％琼脂粉的LB固体培养基。
SOC培养基：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl20.203g， MgSO4 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。
2、方法
(1)tnaA基因同源重组片段的克隆
利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的大肠杆菌tnaA基因(Genebank登录号为：K00032.1)的序列设计引物：
tnaAup：
5’-ATGGAAAACTTTAAACATCTCCCTGAACCGTTCCGCATTCGTGTTATTGAGCAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，
tnaAdown：
5’-TTAAACTTCTTTAAGTTTTGCGGTGAAGTGACGCAATACTTTCGGTTCGTACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’。
以pKD4质粒为模板，用引物tnaAup、tnaAdown通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性基因的tnaA基因同源重组片段。
PCR反应体系为：10×缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 4μL，10mmol/L四种dNTP混合液1μL，上下游引物(引物浓度为20μmol/L)各2μL，TaqDNA聚合酶1μL；模板DNA 1μL，加水补至50μL。
PCR反应条件为：97℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸120s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
回收纯化浓缩PCR产物即得到tnaA基因同源重组片段。
(2)电转化感受态细胞的制备
1)通过CaCl2法将pKD46质粒转化入大肠杆菌JM109(DE3)菌株中，获得阳性转化子。
2)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌JM109(DE3)，转入LB培养基中，同时加入0.2％的阿拉伯糖，培养OD600至0.5。
3)冰浴15min，离心收集菌体，然后用10％的甘油洗涤三次。
4)加入10％的甘油，分装感受态细胞。
(3)电转化，筛选重组子
1)往100μL带有pKD46质粒的JM109(DE3)感受态细胞中加入10ng tnaA基因同源重组片段，混匀后转到电击杯中(于Bio-Rad公司购买)。通过电穿孔仪(于Bio-Rad公司购买)电击，电压2.5Kv。
2)往电击液中加入900μL SOC培养基，37℃、150转/min培养1h。
3)涂布卡那霉素抗性平板，挑取重组子。进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实tnaA基因已被卡那霉素抗性基因替换。所用PCR引物如下：
tnaAtestup：5’-TTAGTAAATGATGGTGCTTGC-3’，
tnaAtestdown：5’-AGGATGTAGGGTAAGAGAGTGG-3’。
4)PLP位点专一重组
将pCP20转入tnaA基因被卡那霉素抗性基因替换的克隆中，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单克隆即为卡那霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的目的菌株。利用检测引物tnaAtestup和tnaAtestdown进行PCR检测。通过PCR产物测序鉴定正确的菌株即为敲除tnaA基因的大肠杆菌工程菌株JM109(DE3)ΔtnaA。
实施例2大肠杆菌JM109(DE3)ΔtnaA L-半胱氨酸脱巯基酶基因malY的敲除
1、材料
菌种：大肠杆菌工程菌株JM109(DE3)ΔtnaA，其相关特性见实施例1。
质粒：质粒pKD4、pKD46、pCP20均购自武汉淼灵生物科技有限公司。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
卡那霉素抗性平板：含有20mg/L卡那霉素、1.5％琼脂粉的LB固体培养基。
SOC培养基：蛋白胨2g/L，酵母粉0.5g/L，NaCl 0.0585g/L，KCl 0.0186g/L，MgCl20.203g， MgSO4 0.246g/L，葡萄糖20mmol/L。
2、方法
(1)malY基因同源重组片段的克隆
利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的大肠杆菌malY基因(Genbank登录号为：M60722.1)的序列设计引物：
malYup：
5’-ATGTTCGATTTTTCAAAGGTCGTGGATCGTCATGGCACATGGTGTACACAGTGGGAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’，
malYdown：
5’-TCCAGCCACACCTTTTTCCAGTTTCGAACGTGGGCAGCCGGCATTGAGACGGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’。
以pKD4质粒为模板，用引物malYup、malYdown通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性基因的malY基因同源重组片段。
PCR反应体系如下：10×缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 4μL，10mmol/L四种dNTP混合液1μL，上下游引物(引物浓度为20μmol/L)各2μL，TaqDNA聚合酶1μL；模板DNA 1μL，加水补至50μL。
PCR反应条件为：97℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min，4℃保存。
回收纯化浓缩PCR产物即得到malY基因同源重组片段。
(2)电转化感受态细胞的制备
1)通过CaCl2法将pKD46质粒转化入大肠杆菌JM109(DE3)ΔtnaA菌株中，获得阳性转化子。
2)挑取带有pKD46质粒的大肠杆菌JM109(DE3)ΔtnaA，转入LB培养基中，同时加入0.2％的阿拉伯糖，培养OD600至0.5。
3)冰浴15min，离心收集菌体，然后用10％的甘油洗涤三次。
4)加入10％的甘油，分装感受态细胞。
(3)电转化，筛选重组子
1)往100μL带有pKD46质粒的JM109(DE3)ΔtnaA感受态细胞中加入8ng malY基因同源重组片段，混匀后转到电击杯中。通过电穿孔仪电击，电压2.5Kv。
2)往电击液中加入900μL SOC培养基，37℃、150转/min培养1h。
3)涂布卡那霉素抗性平板，挑取重组子。进行PCR检测，通过PCR产物测序进一步证实malY基因已被卡那霉素抗性基因替换。所用PCR引物如下：
malYtestup:5’-TCGGGCAATTGGCGTAGTAC-3’，
malYtestdown:5’-GCAATTGGGTTAACGAACAG-3’。
4)PLP位点专一重组
将pCP20转入malY基因被卡那霉素抗性基因替换的克隆中，30℃培养8h，后提高至42℃过夜，热诱导FLP重组酶表达，质粒也逐渐丢失。利用接种环蘸取菌液在无抗性培养基上划线，将长出的单克隆同时转入无抗性平板和卡那霉素抗性平板上培养，在无抗性平板上生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的单克隆即为卡那霉素抗性基因已被FLP重组酶删除的目的菌株。利用检测引物malYtestup和malYtestdown进行PCR检测。通过PCR产物测序鉴定正确的菌株即为敲除malY基因的大肠杆菌工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY。
实施例3转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的代谢途径的构建
1、材料
菌种：大肠杆菌工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY，其相关特性见实施例2。
质粒：质粒pET-28a(+)购自Novagen公司，质粒pACYC184购自New EnglandBiolabs 公司。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
DL-ATC消旋酶基因atcA、L-ATC水解酶基因atcB、氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶基因 atcC均源于假单胞菌Pseudomonas sp.BS株。
卡那霉素+四环素双抗平板：含有1.5％琼脂、20mg/L卡那霉素、10mg/L四环素的LB固体培养基。
2、方法
(1)atcAB表达载体的构建
将来源于假单胞菌Pseudomonas sp.BS株基因组的DL-ATC消旋酶基因(atcA)(GenBank 登录号为：BAD15357)与L-ATC水解酶基因(atcB)(其序列信息存在于一段GenBank登录号为AB176845的一段大小为10Kb的DNA序列内)进行密码子优化，在优化后的两基因序列中间添加一段编码刚性连接肽的序列，形成atcA/atcB的融合表达框，该融合表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；该融合表达框编码的蛋白质命名为AtcAB，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。在该融合表达框的5’端及3’端分别引入酶切位点NdeI及EcoRI后化学合成如 SEQ ID NO.3所示的全基因序列，将此序列命名为opt-atcAB。opt-atcAB的合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段opt-atcAB连于载体pUC57上。将含有 opt-atcAB片段的载体pUC57用NdeI及EcoRI进行双酶切后回收目的片段，备用。同时采用 NdeI及EcoRI对载体pET-28a(+)进行双酶切，并将经双酶切后获得的opt-atcAB基因连入 pET-28a(+)载体中，转化大肠杆菌TOP10，构建pET-atcAB表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误，提取质粒备用。pET-atcAB载体可表达重组DL-ATC消旋酶/L-ATC水解酶融合蛋白(AtcAB)。
(2)atcC表达载体的构建
将来源于假单胞菌Pseudomonas sp.BS株基因组中的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶基因 (atcC)(其序列信息存在于一段GenBank登录号为AB176845的一段大小为10Kb的DNA 序列内)进行密码子优化，优化后的基因序列如SEQ ID NO.5所示；该段基因序列编码的蛋白质命名为AtcC，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。在优化后的基因的5’端加入Tac启动子及SD序列后形成基因表达盒，再在该表达盒的5’端及3’端分别引入酶切位点EcoRI及NcoI 后化学合成如SEQ ID NO.6所示的全基因序列，将此序列命名为opt-atcC。opt-atcC的合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交货时人工合成的基因片段opt-atcC连于载体pUC57上。将含有opt-atcC片段的载体pUC57用EcoRI及NcoI进行双酶切后回收目的片段，备用。同时采用EcoRI及NcoI对复制子为p15A的载体pACYC184进行双酶切，并将经双酶切后获得的opt-atcC基因连入pACYC184载体中，转化大肠杆菌TOP10，构建pAC-atcC表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体构建无误，提取质粒备用。pAC-atcC载体可表达重组氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶(AtcC)。
(3)JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY感受态细胞的制备
1)挑取LB平板上的工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY，培养过夜。
2)将培养过夜的工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY按照1％(V/V)的接种量转入装有 50mL LB的300mL的三角瓶中培养，OD600至0.4左右时停止培养，置冰上20min，4℃、4000g 离心10min。弃上清，加入冰冷的100mM的CaCl2溶液悬浮，冰上静置30min。离心浓缩，获得感受态细胞，放于-70℃保存。
(4)pET-atcAB+pAC-atcC表达载体的共转化
1)将50ng的表达载体pET-atcAB与60ng的表达载体pAC-atcC共转入100μL步骤(3)所制备的JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY感受态细胞中，混匀，置冰上30min，42℃热激90s，冰上静置2min。
2)加入900μL的LB培养基，37℃、100转/min培养1h。
3)涂布卡那霉素+四环素双抗平板，培养过夜，挑取单菌落培养后提取质粒，经酶切验证，获得基因工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY+atcAB+atcC。
实施例4基因工程菌JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY+atcAB+atcC的表达
1、材料
菌种：工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY+atcAB+atcC，其详细特性见实施例3。
LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L。
卡那霉素+四环素双抗培养基：含有20mg/L卡那霉素、10mg/L四环素的LB培养基。
2、方法
用接种环挑取平板上的工程菌株JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY+atcAB+atcC接入装有50mL卡那霉素+四环素双抗培养基的300mL三角瓶中，于37℃、220转/min培养12h以获得种子液。将种子液按照1％的接种量接入到装有50mL卡那霉素+四环素双抗培养基的300mL三角瓶中，于37℃、220转/min培养。培养至12h，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为1mM。发酵4h后离心收集菌体，超声破碎后分别收集超声上清及沉淀，进行SDS-PAGE 鉴定。结果发现，AtcAB、AtcC两种目标蛋白均在细胞内得到了可溶性共表达，激光薄层扫描显示其表达量分别为细胞总蛋白的10％及15％。鉴定成功表达后，计算菌体的干重。菌体干重的测量原理如下：测定菌体样品在600nm处的吸光度，然后根据菌体吸光度与细胞干重的标准曲线将样品吸光度转换为相应的干重质量。
实施例5基因工程菌JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY+atcAB+atcC细胞膜的透膜处理
取100mg(干重)实施例4所获得的经表达后的菌体，加入1000μL正己烷，30℃处理20min，8000rpm离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液(2.9g/L磷酸氢二钠，0.295g/L磷酸二氢钠，2g/L氯化钠，pH 7.3)洗涤一次后，8000rpm离心收集菌体，再加入2500μL二甲苯，30℃透膜处理20min，8000rpm离心收集菌体，用上述磷酸盐缓冲液洗涤后，收集备用。
实施例6基因工程菌JM109(DE3)ΔtnaAΔmalY+atcAB+atcC的固定化
将实施例5所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到10mL浓度为15g/L的海藻酸钠溶液中混合均匀，使得菌体浓度为10mg/mL。将混合液用6号针头注射器逐滴滴入到20g/L的氯化钙溶液中得到固定化细胞。将固定化细胞放置在20g/L的氯化钙溶液中，4℃过夜。用无菌水洗涤3次，置于4℃备用。
实施例7固定化细胞的催化转化反应
建立体积为1L的转化反应体系，转化反应体系及反应条件如下：体系中含有实施例6 中得到的固定化细胞150g，反应物DL-ATC 15g，KH2PO41.5g，山梨醇100g，转化反应体系pH为7.5；反应温度为30℃，搅拌转速为150转/分钟，反应时间为3h。
反应完成后，取反应液检测L-半胱氨酸的含量，具体的检测方法见参考文献：Gaitonde, M.K.,A spectrophotometric method for the direct determination ofcysteine in the presence of other naturally occurring aminoacids.Biochemistry Journal,1967,104,627-633.根据产物L-半胱氨酸与底物DL-ATC的分子摩尔比，计算转化率。在此反应条件下，DL-ATC转化为L-半胱氨酸的转化率达93％以上。
转化反应完成后，通过过滤即可把固定化细胞回收，回收的固定化细胞用KH2PO4浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、pH为7.5的洗涤缓冲液洗涤3次后，再次用其建立上述转化反应体系，进行转化反应。如此反复循环，实现海藻酸钠固定化基因工程大肠杆菌细胞多次转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。在此条件下，固定化细胞使用十个周期时，反应体系的转化率仍在80％以上。各个周期的转化率如下表：
| 使用周期 | 转化率(％) |
| 1 | 93.2 |
| 2 | 92.1 |
| 3 | 90.3 |
| 4 | 89.5 |
| 5 | 88.5 |
| 6 | 84.7 |
| 7 | 83.2 |
| 8 | 81.7 |
| 9 | 80.9 |
| 10 | 80.4 |
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)基因工程菌细胞膜的透膜处理
将经诱导表达后的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌先后用正己烷和二甲苯进行透化处理，离心收集透膜处理的菌体，用磷酸盐缓冲液洗涤后备用；其中，用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌；
所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
(2)固定化细胞的制备
通过海藻酸钙包埋法将步骤(1)所获得的经透膜处理的基因工程菌固定得到固定化细胞；
(3)固定化细胞转化DL-ATC生成L-半胱氨酸
将步骤(2)得到的固定化细胞加入到含有DL-ATC、KH2PO4、山梨醇的体系中进行反应得到L-半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的大肠杆菌为染色体上整合有受λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子控制的T7噬菌体RNA聚合酶基因的大肠杆菌；所述的半胱氨酸脱巯基酶基因为tnaA和malY基因。
3.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：编码步骤(1)中所述的融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码步骤(1)中所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
4.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌通过包括如下步骤的方法构建得到：
a.将序列如SEQ ID NO.3所示的DNA片段通过NdeI、EcoRI连接到pET-28a(+)载体上构建得到ATC消旋酶表达载体；
b.将序列如SEQ ID NO.6所示的DNA片段通过EcoRI、NcoI连接到pACYC184载体上构建得到L-ATC水解酶和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶表达载体；
c.将上述两种表达载体共同转入敲除半胱氨酸脱巯基酶基因的大肠杆菌中，即得到用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌。
5.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的基因工程菌的干重与正己烷的体积比为1mg:5-40μL，基因工程菌的干重与二甲苯的体积比为1mg:10-50μL；所述的透膜处理的条件为30℃透化透膜5-40min。
6.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步骤(2)为：将所获得的经透膜处理的基因工程菌加入到15g/L的海藻酸钠溶液中混合均匀，使得菌体浓度为5-20mg/mL，将混合液滴入到20g/L的氯化钙溶液中得到固定化细胞凝胶珠；再将固定化细胞凝胶珠放置在20g/L的氯化钙溶液中，4℃过夜；固定化细胞再用无菌水洗涤后，置于4℃备用。
7.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：
步骤(3)中的反应体系为：固定化细胞浓度为50-300g/L，DL-ATC浓度为5-20g/L，KH2PO4浓度为0.5-2g/L，山梨醇浓度为10-200g/L，pH为6-8；步骤(3)中所述的反应的条件为：反应温度为28-37℃，搅拌转速为100-200转/分钟，反应时间为2-6h。
8.根据权利要求1所述的酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的方法，其特征在于：步骤(3)反应完成后通过过滤回收固定化细胞，再用KH2PO4浓度为2g/L、山梨醇浓度为200g/L、pH为7.5的洗涤缓冲液洗涤固定化细胞后重复用于步骤(3)。
9.一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的基因工程菌，其特征在于：为敲除半胱氨酸脱巯基酶基因且能异源共表达由DL-ATC消旋酶、刚性连接肽和L-ATC水解酶所组成的融合蛋白和氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶的大肠杆菌；所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.1所示；所述的氮一氨甲酰-L-半胱氨酸水解酶AtcC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
10.一种用于转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的固定化细胞，其特征在于：通过海藻酸钙包埋法将权利要求9所述的基因工程菌固定得到。
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| 假单胞菌F-12转化合成半胱氨酸的发酵优化及基因工程菌构建;赵婧楠;《国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》;20150515;B018-61 * |
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