CN104862264B - 一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转化生产α‑苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。本发明成功实现了大肠杆菌内aspC、tyrB和ilvE基因的敲除，从而阻断了细胞对产物PPA的降解，进一步提高了胞外转化L‑苯丙氨酸的产量，PPA的产量可达3.9g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，属于生物技术领域。
背景技术
α-苯丙酮酸(PPA)有很多应用，可用来合成抗肿瘤药物的杂环化合物，可作为抗氧化剂及促进伤口愈合。是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物中间体。PPA还可用于制备苯乳酸，苯乳酸可作为抗菌物质。目前PPA生产主要是化学合成法，主要包括：乙酰氨基肉桂酸水解法、乙内酰脲与苯甲醛合成法和海因法。这些方法均需经过多步反应，对反应条件有较高要求，例如高压、高温等，产品得率低，对后期分离纯化加大了难度，易产生有毒有害产物。酶和全细胞生物催化剂越来越多的用于工业化生产。
L-氨基酸脱氨酶(EC1.4.3.2)催化L-氨基酸氧化脱氨基，生成相应α-酮酸和氨，多为黄素蛋白，二聚体结构。L-氨基酸脱氨酶主要存在于蛇毒和昆虫毒素中，在细菌、真菌、藻类中也存在。Proteus mirabilis KCTC2566有两种L-氨基酸脱氨酶，一种具有广泛的底物特异性，能够催化脂肪族和芳香族L-氨基酸，尤其对L-苯丙氨酸具有较高催化活性；另一种具有底物限制性，只对碱性氨基酸具有催化活性，尤其是L-组氨酸。大部分细菌L-氨基酸脱氨酶是胞外分泌型，但是P.mirabilis中两种L-氨基酸脱氨酶都是膜蛋白。
全细胞转化相比分离酶具有如下优势：易制备，成本低；更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；无污染，副产物少。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化PPA生产。之前的研究中我们已经成功构建了大肠杆菌全细胞催化剂，表达来源于P.mirabilis KCTC2566的脱氨酶基因，PPA的产量为3.3g/L。本发明旨在进一步提高PPA产量。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，解除了菌株本身对PPA的降解，从而提高胞外转化L-苯丙氨酸的效率。
所述重组菌是将重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的aspC(编码天冬氨酸转氨酶，GeneID 8182318)、tyrB(编码芳香族氨基酸转氨酶，GeneID 8179723)和ilvE(编码异亮氨酸转氨酶，GeneID 8182196)基因敲除，从而阻断胞内PPA的分解途径。
所述重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的构建方法参见发明名称为“一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法”，申请号为201310392427.6的专利申请。
所述aspC、tyrB和ilvE基因敲除方法：PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上下游约1000bp及抗性标记片段约1000bp，通过融合PCR制备打靶片段。将打靶片段转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株，再用温敏型质粒消去抗性。
本发明还提供一种应用所述重组菌全细胞转化生产α-苯丙酮酸的方法，将L-苯丙氨酸4-6g/L、全细胞催化剂1.2-1.5g/L，在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h。
所述全细胞催化剂的获得，是将含有L-氨基酸脱氨酶突变体的重组大肠杆菌按1-2％接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD600达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体即得。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液(2.31g的KH2PO4和12.54g的K2HPO4溶于水中，终体积为100mL，高压灭菌)。
在本发明的一种实施方式中，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4-5g/L，全细胞催化剂1.2-1.5g/L，反应在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中进行，37℃，200rpm转化6-10h。
本发明的有益效果：本发明成功实现了大肠杆菌内aspC、tyrB和ilvE基因的敲除，从而阻断了细胞对产物的降解，进一步提高了胞外转化L-苯丙氨酸的产量，PPA的产量可达3.9g/L。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成PPA的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产PPA的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产PPA，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。
具体实施方式
材料与方法
种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，自来水定容至100mL。
发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/L KH2PO4和72mmol/LK2HPO4的溶液。
PPA含量测定：将转化体系进行离心，弃上清，离心向细胞中加入100μL L-苯丙氨酸(100mM)，30min后，离心，取上清100μL，加入3mL三氯化铁，分光光度计测定640nm的吸光度。
表1 PCR所用引物
注：下划线标示的核苷酸代表融合PCR的同源序列。
实施例1 aspC、tyrB和ilvE基因的敲除
此前，我们通过大肠杆菌表达L-氨基酸脱氨酶基因，得到一株重组表达L-氨基酸脱氨酶的重组大肠杆菌，此重组大肠杆菌可用于全细胞转化L-苯丙氨酸生产PPA，参见发明名称为“一种全细胞转化高效生产α-苯丙酮酸的方法”，申请号为201310392427.6的专利申请，以此重组大肠杆菌基因组DNA为模板，以aspC-Left-S和aspC-Left-A、tyrB-Left-S和tyrB-Left-A、ilvE-Left-S和ilvE-Left-A为引物，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上游约1000bp，以aspC-Right-S和aspC-Right-A、tyrB-Right-S和tyrB-Right-A、ilvE-Right-S和ilvE-Right-A为引物，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因下游约1000bp。
以pKD13为模板，以aspC-Middle-S和aspC-Middle-A、tyrB-Middle-S和tyrB-Middle-A、ilvE-Middle-S和ilvE-Middle-A为引物，扩增抗性标记片段约1000bp。将各待敲除基因上下游片段及抗性标记片段分别进行融合PCR。融合PCR片段转化大肠杆菌，同源重组，卡纳抗性筛选转化子。温敏型质粒pCP20转化阳性转化子，消除卡纳抗性。通过42℃培养12h，丢失温敏型质粒pCP20。逐个敲除各个基因，从而得到了敲除aspC、tyrB和ilvE基因的菌株。
实施例2 全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程
实施例1中的敲除aspC、tyrB和ilvE后的重组大肠杆菌接种种子培养基(含氨苄青霉素10mg/L)，37℃，200rpm过夜培养。发酵在3LNBS发酵罐中进行，1％接种量到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD600达到0.6，加入0.4mMIPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达。诱导5h后，8,000rpm低温离心10min，收集菌体，用20mMTris-HCl(pH 8.0)缓冲液洗两遍菌体。全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4g/L，全细胞催化剂1.2g/L，反应在20mM Tris-HCl(pH 8.0)中进行，37℃，200rpm转化24h。
野生型、基因单敲除、基因两两敲除、三个基因同时敲除的菌株，全细胞转化PPA产量见表1。其中敲除aspC、tyrB和ilvE三个基因后的重组大肠杆菌，其PPA的产量可达3.9g/L；未敲除aspC、tyrB和ilvE的重组大肠杆菌，其PPA的产量为3.3g/L。
表1
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (5)
1.一种转化生产α-苯丙酮酸效率提高的重组菌，其特征在于，是将重组表达了L-氨基酸脱氨酶基因的大肠杆菌的编码天冬氨酸转氨酶的基因aspC、编码芳香族氨基酸转氨酶的基因tyrB和编码异亮氨酸转氨酶的基因ilvE进行敲除，解除了菌株本身对PPA的降解，所述aspC的序列如GeneID8182318所示，tyrB的序列如GeneID 8179723所示，ilvE的序列如GeneID 8182196所示。
2.一种构建权利要求1所述重组菌的方法，其特征在于，PCR扩增aspC、tyrB和ilvE基因上、下游各1000bp的核苷酸及抗性标记片段，通过融合PCR制备打靶片段，将打靶片段转化大肠杆菌感受态细胞，抗生素筛选发生同源重组的菌株，再消去抗性。
3.一种应用权利要求1所述重组菌全细胞转化生产α-苯丙酮酸的方法，其特征在于，将L-苯丙氨酸4-6g/L、全细胞催化剂1.2-1.5g/L，在pH 8.0的20mM Tris-HCl中，于36-37℃、200-220rpm转化6-10h，所述全细胞催化剂的获得，是将权利要求1所述的重组菌按1-2％接种量接种到1.8L发酵培养基中，搅拌转速、通气量和温度分别为400rpm、1.0vvm和28℃，当OD600达到0.6-0.8，加入0.4mM IPTG诱导L-氨基酸脱氨酶表达，诱导5h后，8,000rpm低温离心10-15min，收集菌体，用20mM Tris-HCl pH 8.0缓冲液洗两遍菌体即得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL，各组分溶解后高压灭菌，冷却到60-80℃，再加100mL灭菌的17mmol/LKH2PO4和72mmol/L K2HPO4的溶液。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，全细胞转化体系为：L-苯丙氨酸4-5g/L，全细胞催化剂1.2-1.5g/L，反应在pH 8.0的20mM Tris-HCl中进行，37℃，200rpm转化6-10h。
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