CN108277190A

CN108277190A - 一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法

Info

Publication number: CN108277190A
Application number: CN201810048337.8A
Authority: CN
Inventors: 王淼; 刘龙; 王秀婷; 堵国成; 李江华; 陈坚
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-01-18
Filing date: 2018-01-18
Publication date: 2018-07-13

Abstract

本发明公开了一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法，属于酶工程技术领域。本发明成功实现了L‑氨基酸脱氨酶，L‑乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌株的构建。全细胞转化L‑苯丙氨酸可生产30g/L苯乳酸，转化率为100％。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成苯乳酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α‑酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产苯乳酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

Description

一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法

技术领域

本发明涉及一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(phenyllactic acid,PLA)，又称β-苯基乳酸、3-苯基乳酸，即2-羟基-3-苯基丙酸，是一种广泛存在于自然界中的小分子天然有机酸。苯乳酸有两种对映异构体，即L-苯乳酸和 D-苯乳酸。苯乳酸是一种天然抑菌物质，最初是在干酪中发现的，也存在于天然蜂蜜中，对多种病原性微生物具有抑制作用，革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌等，但是对人和动物细胞无毒。

相比常见的化学防腐剂，苯乳酸不仅安全无毒，而且对真菌具有广谱抑制作用，且抑菌活性强于常见的化学防腐剂；相比其他生物防腐剂，苯乳酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真核微生物均有抑制作用。此外，苯乳酸溶解度高，在水中更易溶解和扩散，故能在各种食品体系中均匀扩散；稳定性强，熔点为121-125℃，对酸和热都比较稳定

目前苯乳酸合成主要有化学法和生物法两种，生物法分为酶法和发酵法。在苯乳酸生物合成过程中，苯丙氨酸通过转氨基作用生成苯丙酮酸，苯丙酮酸进一步还原为苯乳酸，此过程需要辅酶NADH的参与。

全细胞转化相比分离酶具有如下优势：全细胞生物催化剂更容易制备，成本低；比分离酶更稳定，不易受环境温度、pH等因素影响，使用方便；转化过程中不产生有毒害产品，不产生其他副产物。有望实现低能耗、高效率、高纯度、无污染的工业化苯乳酸生产。

现有技术中，已有全细胞转化苯丙酮酸生成苯乳酸的方法，为转化L-苯丙氨酸生产苯乳酸奠定了基础。然而，苯丙酮酸价格昂贵，市场价格为苯丙氨酸的600倍(L-苯丙氨酸价格为130元/kg，苯丙酮酸钠价格为80元/g)，不适合工业化生产，因此，价格便宜的苯丙氨酸更具备作为底物生产苯乳酸的工业化应用潜力。

发明内容

为实现以苯丙氨酸为底物工业化生产苯乳酸，本发明的第一个目的是提供一种以L-苯丙氨酸为底物生产苯乳酸的基因工程菌，该基因工程菌共表达L-氨基酸脱氨酶、乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸脱氨酶(L-AAD)为L-氨基酸脱氨酶突变体 (D165K/F263M/L336M)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶的含有SEQ ID NO,2所示的氨基酸序列；所述甲酸脱氢酶含有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述乳酸脱氢酶来源于Lactobacillus sp.CGMCC9967，已公开于公开号为104560800A的专利申请文件中。

在本发明的一种实施方式中，所述甲酸脱氢酶来源于奇异变形杆菌(proteusmirabilis)。

在本发明的一种实施方式中，编码所述L-氨基酸脱氨酶的基因如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述乳酸脱氢酶的基因如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述甲酸脱氢酶的基因如SEQ ID NO.6所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pRSF-Duet-1为载体。

本发明的第二个目的是提供一种以苯丙氨酸为底物生产L-苯乳酸方法，是以所述基因工程菌为全细胞催化剂，直接转化L-苯丙氨酸生产苯乳酸，从而解决了工业化苯乳酸生产高成本、低得率、污染严重的问题。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以5-25g菌体/1-30g苯丙氨酸的添加量进行全细胞转化；所述菌体按细胞干重计。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以30g/L浓度的苯丙氨酸为底物，加入25gDCW /L底物的细胞，反应12h。

在本发明的一种实施方式中，全细胞催化剂是在培养基后培养获得的菌液或离心获得的菌体细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基包括LB培养基、TB培养基。

本发明还提供所述基因工程菌在制备食品、药品方面的应用。

本发明的有益效果：本发明成功实现了L-氨基酸脱氨酶，L-乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶共表达菌株的构建。在12h内，25g DCW/L全细胞催化剂可以将30g/L L-苯丙氨酸转化为30g/L 苯乳酸，转化率为100％。此全细胞转化体系的建立，解决了化学法合成苯乳酸的步骤繁琐、得率低、污染环境等问题及酶法转化生产α-酮戊二酸的转化率低的问题，实现了无污染、高产率、一步法生产苯乳酸，为后续工业化生产奠定了一定的理论基础。

具体实施方式

材料与方法

种子培养基：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，自来水定容至100mL。

发酵培养基：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100mL灭菌的17mmol/LKH₂PO₄和72mmol/LK₂HPO₄的溶液。

苯乳酸测定：采用反相HPLC分析PLA含量，具体方法为：色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C18(150mm×4.6mm×5μm，美国安捷伦)，流动相成分:0.5g·L^-1三氟乙酸/水(A)和0.5g·L^-1三氟乙酸/甲醇(B)混合液。梯度洗脱程序为：0-20min 10％-100％B；20-25min保持100％B； 25-30min100％-10％B柱温：30℃，检测波长为210nm，流速1mL·min^-1，保留时间9.5min。

实例1L-氨基酸脱氨酶突变体D165K/F263M/L336M基因的克隆

以实验室保藏质粒PET20b-(l-aad)(D165K/F263M/L336M)为模板克隆l-aad基因。用BamHI和HindIII酶切PCR产物，并进一步插入到载体pRSF-Duet-1的MCS-1位点上，构建重组质粒pRSF-aad。

实施例2共线性分析和系统生物学选择乳酸脱氢酶

使用已知的乳酸脱氢酶活性较高的基因，分别为来自Bacillus coagulans NL01的BcLDH，来自Bacillus coagulans SDM的L-nLDH和D-nLDHfrom以及来自Lactobacillussp.SK007 的LaLDH。利用BLASTP 2.2.28+，在GenBank中的非冗余蛋白数据库搜索同源序列。用 H-CD-HIT(CD-HIT suite)将检索结果分组，有三个等级：90％、60％、40％相似性。利用 NCBI taxonomy数据库，重建taxonomy trees。四种酶的序列进行PSI-BLAST后，得到序列 PSI-BLAST结果，使用GCView分析Synteny。最终挑选出十种不同来源，具有一定序列差异的乳酸脱氢酶基因进行下一步实验。

表1.不同来源的乳酸脱氢酶

实施例3L-氨基酸脱氨酶基因和L-乳酸脱氢酶基因共表达质粒的构建

根据实施例2筛选出10个ldh基因后，根据基因库中的基因序列对密码子进行优化。然后，由瑞迪生物技术有限公司(中国上海)合成，分别在正向和反向添加两个限制性位点NdeI 和XhoI。PCR扩增ldh基因。将所得产物插入到质粒pRSF-aad MS2位点上，得到的重组质粒命名为pRSF-aad-ldh，并进一步转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。将所得的10株重组菌株，在25℃条件下，添加0.4mM IPTG进行诱导表达10h。诱导结束后，将发酵液离心收集细胞，以苯丙酮酸为底物重悬细胞进行全细胞转化，根据PLA产量筛选出最优ldh基因。结果表明(表2)，重组菌株BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh₁₀)产苯乳酸能力最强，因此，选择ldh₁₀作为后续研究。

表2表达不同基因后的重组菌产苯乳酸的效果

实施例4三酶共表达菌株构建

以实施例3中获得的最终重组质粒pRSF-aad-ldh₁₀和实验室构建并保藏的重组质粒 PET-fdh为模板，分别扩增L-乳酸脱氢酶基因(ldh₁₀)和甲酸脱氢酶基因(fdh)片段后，采用融合PCR的方法将ldh₁₀和fdh两段基因连在一起并进行全长扩增。其中ldh₁₀基因后添加终止密码子及rbs基因以保证两个基因分开表达。PCR扩增产物纯化、酶切(NdeI、XhoI)后，插入到载体pRSF-aad上，构建质粒pRSF-aad-ldh₁₀-fdh。并进一步转化到大肠杆菌BL21(DE3) 中。

实施例5全细胞催化剂的制备及全细胞转化过程

实施例3的重组菌株E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh₁₀-fdh)接种LB培养基(卡那霉素50mg/L)，37℃，220rpm过夜培养。发酵在250ml摇瓶中进行，4％接种量到20mLTB培养基中，搅拌转速和温度分别为220rpm、37℃，当OD₆₀₀达到0.6，加入0.4mM IPTG诱导表达。25℃诱导10h后，4,000rpm低温离心10min，收集菌体，用20mM PB(pH 7.0)缓冲液洗两遍菌体，获得全细胞催化剂，转化体系为：苯丙氨酸终浓度为30g/L，全细胞催化剂25g DCW/L，共底物甲酸铵11.5g/L，葡萄糖15g/L反应在20mM PB缓冲液(pH 7.0)中进行，37℃，220rpm转化12h。

结果显示，重组菌株E.coli BL21(DE3)(pRSF-aad-ldh₁₀-fdh)，全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的转化率为100％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种全细胞转化苯丙氨酸生产苯乳酸的方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 473

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly

1 5 10 15

Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly

20 25 30

Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln

35 40 45

Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile

50 55 60

Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Met Ser Val

65 70 75 80

Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala

85 90 95

Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu

100 105 110

His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly

115 120 125

Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp

130 135 140

Glu Lys Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu

145 150 155 160

Ala Ala Gly Phe Asp Thr Pro Leu Asn Thr Arg Ile Ile Lys Gly Glu

165 170 175

Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala

180 185 190

Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro

195 200 205

Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn

210 215 220

Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val

225 230 235 240

Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly

245 250 255

Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Met Gly Ile Asp Ile Pro

260 265 270

Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Val Ser Gly Val Pro Gly

275 280 285

Ala Pro Arg Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu

290 295 300

Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser

305 310 315 320

Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Lys Phe Met His Leu Leu

325 330 335

Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Ile Gly Glu Asp Leu Phe

340 345 350

Asn Ser Phe Lys Met Pro Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro

355 360 365

Phe Glu Gln Phe Arg Val Ala Thr Ala Thr Gln Asn Thr Gln His Leu

370 375 380

Asp Ala Val Phe Gln Arg Met Lys Thr Glu Phe Pro Val Phe Glu Lys

385 390 395 400

Ser Glu Val Val Glu Arg Trp Gly Ala Val Val Ser Pro Thr Phe Asp

405 410 415

Glu Leu Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile

420 425 430

Asn Thr Ala Thr Val Trp Gly Met Thr Glu Gly Pro Ala Ala Gly Glu

435 440 445

Val Thr Ala Asp Ile Val Met Gly Lys Lys Pro Val Ile Asp Pro Thr

450 455 460

Pro Phe Ser Leu Asp Arg Phe Lys Lys

465 470

<210> 2

<211> 312

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Met Lys Ile Leu Asn Ser Phe Ser Leu Lys Pro Glu Gln Arg Gln

1 5 10 15

Thr Leu Glu Ala Ala Gly His Thr Val Ile Asp Ala Asp Lys Leu Asp

20 25 30

Asp Ala Thr Ala Gln Gln Ile Asp Val Val Tyr Gly Trp Asn Ala Ala

35 40 45

Ala Thr Arg Val Asn Phe Asp Arg Leu Gln Phe Val Gln Ala Met Ser

50 55 60

Ala Gly Val Asp Tyr Leu Pro Leu Ala Glu Leu Ala Lys His His Val

65 70 75 80

Leu Leu Ala Asn Thr Ser Gly Ile His Ala Glu Pro Ile Ala Glu Tyr

85 90 95

Val Leu Gly Ala Leu Phe Thr Ile Ser Arg Gly Ile Leu Pro Ala Ile

100 105 110

Arg Ala Asp Arg Asp Met Trp Thr Leu Arg Gln Glu Arg Pro Pro Met

115 120 125

Thr Leu Leu Lys Gly Lys Thr Ala Val Ile Phe Gly Thr Gly His Ile

130 135 140

Gly Ser Thr Ile Ala Thr Lys Leu Gln Ala Leu Gly Leu His Thr Ile

145 150 155 160

Gly Val Ser Ala His Gly Arg Pro Ala Ala Gly Phe Asp Gln Val Met

165 170 175

Thr Asp Val Ala Thr His Glu Ala Ala Gly Arg Ala Asp Val Val Ile

180 185 190

Asn Ala Leu Pro Leu Thr Pro Asp Thr Lys His Phe Tyr Asp Glu Ala

195 200 205

Phe Phe Ala Ala Ala Ser Lys Gln Pro Leu Phe Ile Asn Ile Gly Arg

210 215 220

Gly Pro Ser Val Asp Met Ala Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Asn Lys

225 230 235 240

Gln Ile Ser Ala Ala Ala Leu Asp Val Val Asp Pro Glu Pro Leu Pro

245 250 255

Gln Asp Ser Pro Leu Trp Gly Met Thr Asn Val Leu Leu Thr Pro His

260 265 270

Ile Ser Gly Thr Val Pro Gln Leu Arg Asp Lys Val Phe Lys Ile Phe

275 280 285

Asn Asp Asn Leu Lys Thr Leu Ile Ser Ser Gly Gln Leu Ala Ser His

290 295 300

Gln Val Asp Leu Thr Arg Gly Tyr

305 310

<210> 3

<211> 364

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp

1 5 10 15

Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Cys Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn

20 25 30

Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu

35 40 45

Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile

50 55 60

Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp

65 70 75 80

Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp

85 90 95

His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val

100 105 110

Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val

115 120 125

Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln

130 135 140

Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr

145 150 155 160

Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly

165 170 175

Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu

180 185 190

Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly

195 200 205

Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile

210 215 220

Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn

225 230 235 240

Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr

245 250 255

Ala Arg Gly Ala Ile Cys Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu

260 265 270

Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro

275 280 285

Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala

290 295 300

Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln

305 310 315 320

Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr

325 330 335

Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu

340 345 350

Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys

355 360

<210> 4

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60

ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatctaga 120

gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180

ggtgccggta ttcaggggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240

actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300

attagttacc aaacatcacc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360

cgtggcatga atgagaaaat tggtgcagat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420

gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480

gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540

cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600

gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660

atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720

gtgagtgaga aaggggcgat taaaacttct caagttgtac tcgccggggg tatctggtca 780

cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840

caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900

catttccgcg agcaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960

atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020

ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080

tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140

acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200

tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260

atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320

accgaaggcc cagcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380

attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaag 1419

<210> 5

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatgaaga ttctgaattc gttctcgtta aagccagaac agcgccaaac gcttgaggca 60

gcgggtcaca ctgtcatcga cgctgacaag ctggacgatg ccactgccca acagatcgac 120

gtggtctatg gatggaacgc tgctgctacg cgcgttaact ttgaccgcct tcagttcgtt 180

caggccatga gtgccggggt tgattacctt cctctggcgg agttggcaaa acaccatgtt 240

cttttggcga acacttctgg tattcatgcc gaaccgatcg cggaatacgt cttaggtgcg 300

ctgttcacga tcagccgcgg catcttaccg gctattcgtg ccgaccgtga tatgtggact 360

ttacgtcaag aacgtccgcc gatgactctt ctgaagggaa aaacggctgt gatttttggt 420

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<210> 6

<211> 1095

<212> DNA

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ggtgacgtgt ggttcccgca accggcaccg aaagatcatc cgtggcgtga catgcgcaac 900

aaatatggcg ccggtaatgc aatgaccccg cactacagcg gtaccacgct ggatgcccag 960

acccgctatg cagaaggcac gaaaaacatt ctggaaagct ttttcaccgg taaattcgat 1020

taccgtccgc aagacatcat tctgctgaat ggcgaatatg tgacgaaagc gtacggtaaa 1080

cacgataaaa aataa 1095

Claims

1.一种基因工程菌，其特征在于，共表达L-氨基酸脱氨酶、乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，能够以L-苯丙氨酸为底物生产苯乳酸。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以细菌或真菌细胞为宿主。

3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，所述大肠杆菌包括E.coli BL21(DE3)、E.coli JM109、E.coli DH5α或E.coli TOP10。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，乳酸脱氢酶来源于Lactobacillussp.CGMCC 9967；甲酸脱氢酶来源于奇异变形杆菌(proteus mirabilis)。

5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，以pRSF-Duet-1为载体。

6.一种以苯丙氨酸为底物生产L-苯乳酸方法，其特征在于，以权利要求1～5任一所述的基因工程菌为全细胞催化剂，转化L-苯丙氨酸生产苯乳酸。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以5-25g菌体/1-30g苯丙氨酸的添加量进行全细胞转化。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，全细胞催化剂以菌液或菌体细胞的形式添加。

9.根据权利要求6～8任一所述的方法，其特征在于，转化体系中还含有甲酸铵和葡萄糖。

10.权利要求1～5任一所述的基因工程菌在制备食品、药品方面的应用。