CN109055330B

CN109055330B - 一种重组fad合成酶、编码基因、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN109055330B
Application number: CN201810703933.5A
Authority: CN
Inventors: 余志良; 音建华; 裘娟萍; 潘俏俏
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2018-06-30
Filing date: 2018-06-30
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2038-06-30
Also published as: CN109055330A

Abstract

本发明提供了一种过量表达FAD合成酶的基因工程菌其应用。所述的工程菌是将FAD合成酶的编码基因导入大肠埃希氏杆菌构建获得的。利用重组大肠杆菌表达FAD合成酶，经蛋白纯化后，可进行体外FAD合成；该FAD合成酶温度适用性较广，在20℃到50℃都能起作用；运用FAD合成酶体外合成FAD，初步研究发现每毫克FAD合成酶每分钟最高可转化合成3.271μM的FAD。与现有方法相比，本发明合成FAD的方法具有产物浓度高、杂质少，容易纯化及其工艺要求简单、环境友好等优点。

Description

一种重组FAD合成酶、编码基因、工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的合成方法，特别涉及FAD合成酶基因fads、编码蛋白、载体、工程菌及其应用。

背景技术

核黄素，即维生素B2，在生物体内主要以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)的形式存在，并作为黄素酶类的辅酶参与细胞中传递氢的相关代谢，是生命活动过程中必不可少的一种维生素。FAD为核黄素在体内磷酸化后的活性物质，在体内作为黄素辅酶参与体内生物氧化过程，也可参与碳水化合物、蛋白质和脂肪的代谢，维持正常的视觉功能。FAD的溶解度比核黄素更高，故利用率更高，给药量仅为核黄素的1/100～1/10，并可供肌肉注射。此外，FAD还可激活维生素B6，维持红细胞的完整性。哺乳动物不能从头合成FAD，需要从外源摄取核黄素。当体内FAD缺乏时，机体的生物氧化过程受到影响，正常的代谢发生障碍，即可出现典型的维生素B2缺乏症状，不仅影响糖代谢，也会影响脂肪代谢，改变血浆与组织中磷脂的浓度，并且能阻断摄入的维生素B6与叶酸转变为它们的辅酶衍生物。

目前，FAD可以通过化学法合成。化学合成法形式多样，方法的不同主要在于活化方式的不一样，如以黄素单核苷酸钠和5’-腺苷磷酸(5’-AMP)为原料，对二甲苯碳化二亚胺(DPTC)为催化剂，或三苯基磷和二-(2-吡啶基)二硫化物组成的复合试剂或N，N’-亚硫酰-双-2-甲基咪唑为缩合剂合成黄素腺嘌呤二核苷酸二钠盐。化学法合成成本高、工艺要求严苛、专一性不强，既不利于产品的分离纯化，又会导致严重的环境污染。

广泛存在于微生物中的FAD合成酶能以ATP和核黄素或FMN为底物合成FAD，因此，FAD合成酶能被用来生物法制备FAD。1973年，Sakai等人利用腺苷脱氨酶缺陷的藤黄八叠球菌突变体来发酵生产FAD，外源添加FMN和腺苷至培养基的条件下，发酵5天后FAD的最大产量达到0.7g/L(Sakai T,Watanabe T,Chibata I(1973)Selection of microorganismproducing flavin-adenine dinucleotide from FMN and adenine(AMP)and productionof flavin-adenine dinucleotide by Sarcina lutea.Agric Biol Chem,37:849-856)。1995年，Hagihara等人将来源于产氨短杆菌ATCC6872的FAD合成酶基因克隆至另一株Mn²⁺敏感且5'-核苷酸酶活力低的产氨短杆菌中，所获的重组细胞能有效地将外源FMN和ATP合成为FAD。以160mg/mL重组细胞为酶源，转化45小时后产生1.2g/L的FAD(Hagihara T,FujioT,Aisaka K(1995)Cloning of FAD synthetase gene from Corynobacteriumammoniagenes and its application to FAD and FMN production.Appl MicrobiolBiotechnol,42:724-729)。2014年，Valentyna等人将汉逊德巴利酵母中FAD合成酶基因FAD1整合到光滑假丝酵母染色体上，发酵40小时后生成451mg/L的FAD(Yatsyshyn VY,Fedorovych DV,Sibirny AA(2014)Metabolic and bioprocess engineering of theyeast Candida famata for FAD production.J Ind Microbiol Biotechnol,41:823-835)。相比较于化学合成法，生物发酵法制备FAD具有成本低、工艺要求简单、环境友好等优点，但发酵法存在反应复杂、产量低、周期长、易染菌等缺点。

酶法合成已被广泛应用于化工、医药等领域的重要产品的生产，具有操作简单、专一性强、转化时间短、收率高、产物易纯化等优点。目前，越来越多的国内外研究人员关注FAD合成酶的异源表达及FAD体外酶法合成技术的开发。

假丝酵母(Candida famata)又称黄素酵母，是一种黄素类物质(包括FAD)高产菌。大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，是外源基因高效表达的首选体系。将假丝酵母的FAD合成酶基因在大肠杆菌中异源表达，所获酶体外催化底物FMN和ATP进行FAD合成，具有较好的技术优势和应用前景。

发明内容

本发明为了克服微生物发酵法制备FAD耗时长、产物纯度低、易染菌等问题，提供无名假丝酵母FAD合成酶基因和编码蛋白及提供一种高产FAD合成酶、制备FAD的方法。

为达到本发明目的，采用的技术方案是：

本发明提供一种重组FAD合成酶，所述重组FAD合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示(编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)。

本发明还提供一种所述重组FAD合成酶的编码基因，FAD合成酶的编码基因源自埃希氏菌属、酵母菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、分歧杆菌属和古菌属中的一种，优选无名假丝酵母(Candida famata)，更优选所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，以及所述重组FAD合成酶的编码基因构建的重组载体和重组基因工程菌。

进一步，本发明所述重组基因工程菌按如下方法制备：(1)将重组FAD合成酶的编码基因克隆至外源基因表达质粒上，获得重组质粒；所述外源基因表达质粒为下列之一：①pET系列，②pUC系列，③pGEM系列，④pBluescript系列，优选pET28b(+)；(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，接种至LB液体培养基，20～37℃、50～250r/min振荡培养0.5～2h，获得转化产物；(3)将转化产物涂布于含10～100μg/mL卡那霉素的平板，20～37℃培养，筛选获得含重组FAD合成酶编码基因的工程菌。

本发明所述重组基因工程菌为大肠杆菌(Escherchia coli)BL21(DE3)/pET28b(+)-fads，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2017731，保藏日期2017年11月27日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明还提供一种所述重组FAD合成酶在生产黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用，所述的应用为：将含重组FAD合成酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液提取的重组FAD合成酶与缓冲液混合，加入底物黄素单核苷酸(FMN)、ATP和二价金属阳离子构成反应体系，在20～50℃(优选37℃)反应完全，取反应液进行高效液相色谱检测获得色谱图，根据黄素腺嘌呤二核苷酸标准曲线获得反应液中黄素腺嘌呤二核苷酸含量，将反应液分离纯化，获得黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)；所述二价金属阳离子为Mg²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺或Cu²⁺(优选Mg²⁺、Mn²⁺)；所述反应体系中，黄素单核苷酸加入终浓度0.01～50mmol/L(优选0.025-0.5mM，最优选0.5mM)，所述ATP加入终浓度0.1～5mmol/L(优选0.125-5mM，更优选5mM)；所述重组FAD合成酶的含量为0.0002～0.02mg/mL，即0.654～65.4U/mL(优选6.54U/mL)。

进一步，所述重组FAD合成酶按如下方法制备：(1)将含重组FAD合成酶编码基因的工程菌接种至LB斜面培养基，在20～37℃(优选37℃)下活化后接入LB液体培养基，在20～37℃、50～250r/min培养8～48h后(优选37℃、200rpm、12h)，以体积浓度0.1％～20％(优选3％)接种量转入发酵培养基，20～37℃、50～250r/min培养至OD600达到0.4-1.0后(优选37℃、200rpm、OD600为0.6)，加入诱导剂，在20～37℃、50～250r/min培养4～48h(优选30℃、200rpm、5h)后，获得发酵液；所述诱导剂为IPTG或乳糖，IPTG终浓度0.01～1.51mM(优选0.5mM)，乳糖终浓度0.1～50g/L(优选5g/L)；(2)将发酵液离心取菌体，用无菌水洗涤之后，加入pH7.4的PBS缓冲液混匀，在35％振幅(额定功率120W)、工作1秒暂停3秒的条件下超声破碎10min后，离心收集上清，将上清液以体积比8:2的比例与镍柱填料混合后装柱，在250r/min转速振动混匀，用含20mM咪唑的binding buffer以1.0mL/min流速洗涤至紫外检测仪中显示无杂蛋白流出；再用含500mM咪唑的elution buffer以1.0mL/min流速洗涤，根据紫外检测仪收集目标蛋白，用含5mM DTT的pH7.4、PBS缓冲液透析，截留液用3000Da超滤管离心，滤饼即为重组FAD合成酶。

进一步，所述黄素腺嘌呤二核苷酸标准曲线按如下方法制备：用pH7.4PBS缓冲液将黄素腺嘌呤二核苷酸配成50、100、200、300、400mg/L梯度浓度的黄素腺嘌呤二核苷酸标准样品溶液，进行高效液相色谱检测，以峰面积为横坐标，以黄素腺嘌呤二核苷酸标准样品溶液浓度为纵坐标，制作标准曲线。高效液相色谱法测定条件：SHIMADZU SIL-20A色谱柱为Inertsil ODS-3C18反相柱(4.6×250mm)，流速：0.5mL/min；检测波长为230nm，柱温为25℃，流动相A为35％甲醇，流动相B为65％5mM庚烷磺酸钠。

本发明用于培养大肠杆菌的培养基为常规培养基，可市购，也可自制。优选LB液体培养基，终浓度组成为：10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母粉、10g/L NaCl，溶剂为去离子水，pH值自然。LB固体培养基在LB液体培养基中再加入15g/L琼脂。在121℃下灭菌20min。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

(1)本发明运用基因工程技术构建无名假丝酵母源黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶大肠杆菌重组菌，育种目标明确、效率高；(2)利用大肠杆菌表达FAD合成酶，经蛋白纯化后，可进行体外催化合成FAD；(3)该FAD合成酶温度适用性较广，在20℃到50℃都能起作用；(4)运用重组FAD合成酶体外催化合成FAD，初步研究发现每毫克FAD合成酶每分钟最高可转化合成约3.271μM的FAD，比腺苷脱氨酶缺陷的Sarcina lutea突变体发酵生产FAD提高了30倍，比产氨棒杆菌基因工程菌生产FAD提高了6倍，比重组无名假丝酵母T-FD-FM27菌株发酵生产FAD提高了15倍，本发明具有产物浓度高、杂质少，更容易纯化等优点。另外，跟化学法合成FAD相比，该方法具有工艺要求简单、环境友好等优点。

附图说明

图1为基因组步移技术获得的无名假丝酵母合成酶FAD基因的PCR扩增产物凝胶电泳图。其中条带1为第一轮PCR产物，条带2为第二轮PCR产物，条带3为第三轮PCR产物。

图2为高效表达载体pET28b(+)-fads构建流程和图谱。

图3为FAD标准样品HPLC分析结果图。FAD保留时间为5.069min。

图4为HPLC分析的FAD浓度-峰面积标准曲线。

图5为实例3所得重组酶合成FAD的HPLC分析结果图。FAD的保留时间为5.086min。

图6为FAD合成酶的最适反应温度。

图7为二价金属离子对FAD合成酶酶活的影响。

图8为FAD合成酶的最适反应pH。

图9为固定FMN浓度下，FAD合成酶的米氏方程。左图为反应速度V对ATP浓度作图；右图为1/V对1/ATP作图。

图10为固定ATP浓度下，FAD合成酶的米氏方程。左图为反应速度V对FMN浓度作图；右图为1/V对1/FMN作图。

具体实施方式

下面结合具体实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：利用基因组步移技术获取无名假丝酵母fads基因

(1)以无名假丝酵母ATCC 20850基因组为模板，使用真核微生物18S rRNA基因的通用引物(上游引物5’ATTGGAGGGCAAGTCTGGTG3’；下游引物5’CCGATCCCTAGTCGGCATAG3’)，常规PCR扩增获得无名假丝酵母18S rRNA基因片段，送至生工公司测序；将获得的469个碱基长的无名假丝酵母18S rRNA基因片段序列在NCBI上进行同源比对，找到与无名假丝酵母亲缘关系最接近的4种菌株(Debaryomyces fabryi、Debaryomyces hansenii、Candidaglabrata和Candida albicans)，并在NCBI上获取它们的FAD合成酶基因(fads)序列，同源比对后，在保守处设计扩增无名假丝酵母fads(fads_Cf)的引物(上游引物5’TCTGAATTACCCTTTCCAAATCTT3’；下游引物GCATTCTTTCTCAACATATA3’)，常规PCR扩增，纯化PCR产物送生工公司测序，即获得fads_Cf部分基因序列。

(2)根据步骤(1)所获取的fads_Cf部分基因序列，由基因内部设计三条特异性引物SP1(5’AGCCGGTGCATATCCAACATCAC3’)、SP2(5’GTCACACCCTACTAAGAAATCCCAG3’)、SP3(5’GCCAATCATGATCAGTCACCTGCTC3’)和随机引物LAD1(5’ACGATGGACTCCAGAGCGGCCCGCVNVNNNGGAA3’)。

(3)以无名假丝酵母基因组为模板，利用随机引物LAD1和特异性引物SP1进行第一轮PCR；将第一轮PCR产物进行梯度稀释(10倍、50倍、100倍、500倍)，分别作为第二轮PCR模板，以引物LAD1和特异性引物SP2进行第二轮PCR；将第二轮PCR产物进行梯度稀释(10倍、50倍、100倍、500倍)，分别作为第三轮PCR模板，以引物LAD1和特异性引物SP3进行第三轮PCR。

(4)将三轮PCR产物分别按顺序进行凝胶电泳检测(见图1)，将第三轮的PCR产物条带进行切胶回收，并克隆至pMD19T-simple载体，进行DNA测序。

(5)将测序结果在NCBI网站上进行比对，获取完整fads_Cf基因，即假丝酵母FAD合成酶基因fads，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2：高表达载体的构建

(1)根据实施例1获得的假丝酵母FAD合成酶基因fads序列(核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，设计引物(正向引物CGCGGATCCTATGGAGAACGGAAATCTGGC下划线的序列为限制性内切酶BamH I切点；反向引物：CCCAAGCTTTTATGTACGGTTAGATATTC下划线的序列为限制性内切酶Hind III切点)；以cDNA为模板，利用RCR技术扩增fads序列。PCR反应条件：95℃变性5min；接着进行30个循环，参数为94℃，1min；55℃，30s；72℃，60s；最后72℃延伸10min。

(2)PCR产物经切胶回收，用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切回收后克隆至同样经BamH I和Hind III酶切的载体pET28b(+)相应位点，获得fads基因高表达重组质粒pET28b(+)-fads，重组质粒构建图谱见图2。

(3)取100μL商品化大肠杆菌DH5α感受态细胞(购自全式金公司)，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮，取10μL所得质粒pET28b(+)-fads，加入到感受态细胞中轻轻混匀，冰上静置30min，42℃热激90s，立即放置冰中静置2min，加入890μL LB液体培养基，37℃、200r/min震荡培养1h，取200μL培养液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)抗性的LB平板上，37℃过夜培养，即获得含有pET28b(+)-fads质粒的大肠杆菌DH5α。提取质粒即可获得pET28b(+)-fads质粒。

实施例3：工程菌的获得

(1)取100μL大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。

(2)取10μL实施例2所获质粒pET28b(+)-fads，加入到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中轻轻混匀，冰上静置30min。

(3)42℃热激90s，立即放置冰中静置2min。

(4)加入890μL LB液体培养基，37℃、200r/min震荡培养1h。

(5)取200μL培养液涂布于含有卡那霉素(50μg/mL)抗性的LB平板上，37℃过夜培养，所得菌种提取质粒经BamH I和Hind III酶切验证并测序鉴定正确后保存，即为重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-fads。

实施例4：FAD的合成和测定

1、将实施例3所得的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b(+)-fads经LB斜面培养基在37℃活化后接入LB液体培养基，在37℃、200r/min培养12h后，以3％(体积浓度)接种量转入50mL LB液体培养基中，37℃、200r/min震荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，30℃、200r/min震荡培养5h后，离心取菌体，用无菌水洗涤之后，加入PBS缓冲液(pH 7.4)打匀，经超声破碎后，离心收集上清，过镍柱纯化即得到所述重组FAD合成酶1.027mg，酶活约3.36×10⁴U/mg。

酶活定义为pH 7.4时，在15min内，每分钟转化1μM FAD所需要的酶量。

超声破碎条件为：选择35％振幅(额定功率120W)，工作1秒暂停3秒，置于冰浴的每10mL样品破碎10min。

过镍柱纯化条件为：将细胞破碎液的上清部分与镍柱填料以8:2体积比混合，并于250r/min转速振动，使填料与重组蛋白充分混匀。在紫外检测仪的检测下，以1.0mL/min流速，用含20mM咪唑的binding buffer洗涤，至紫外检测仪中显示无更多杂蛋白流出。用含500mM咪唑的elution buffer，以1.0mL/min流速洗下重组蛋白，根据紫外检测仪中显示的流出蛋白的浓度，收集前10mL蛋白。用含5mM DTT的PBS缓冲液(pH7.4)透析除去elutionbuffer，并且截留液用3000Da超滤管离心浓缩蛋白。浓缩后的蛋白用BSA试剂盒确定蛋白浓度。

2、酶促反应如下：用PBS缓冲液(pH 7.4)溶解底物黄素腺嘌呤单核苷酸(FMN)和ATP，使底物FMN终浓度为0.5mM，ATP终浓度为5mM，再加入二价金属离子Mg²⁺终浓度为10mM以及终浓度为0.002mg/mL(即6.72U/ml)的重组FAD合成酶，置于37℃水浴中避光反应15min。然后沸水浴处理10min使酶失活，终止反应，取反应液用高效液相色谱法测定产物FAD谱图，以FAD标准品为对照，根据FAD标准曲线获得反应液中FAD含量。

高效液相色谱法测定条件：SHIMADZU SIL-20A色谱柱为Inertsil ODS-3C18反相柱(4.6×250mm)，流速：0.5mL/min；检测波长为230nm，柱温为25℃，流动相A为35％甲醇，流动相B为65％5mM庚烷磺酸钠。

结果显示：FAD标准品的出峰时间为5.069min(图3)。

绘制FAD标准曲线：用PBS缓冲液(pH7.4)溶解FAD粉末，配置成50、100、200、300、400mg/L梯度浓度的FAD标准样品溶液，进行高效液相色谱检测，根据液相检测结果制作FAD浓度-峰面积标准曲线(图4)。根据标准曲线计算获得重组FAD合成酶催化底物ATP和FMN所产生的FAD含量。酶促反应液中产物FAD的出峰时间为5.086min(图5)，跟标准样品出峰时间基本一致(图3)。另外，酶促反应液主要是FAD产物峰(主峰)，而其它杂峰比较少，说明酶促反应产物浓度高、杂质少，这有利于后续纯化。

实施例5：重组FAD合成酶的酶学特性研究

对实施例4中获得的重组FAD合成酶进行酶学特性研究，包括最适反应温度、最适pH、最适储存pH、二价金属阳离子等对FAD合成的影响。

(1)反应温度的影响：用PBS缓冲液(pH 7.4)溶解底物FMN、ATP和Mg²⁺，使其终浓度分别达到0.5mM、5mM和10mM。加入终浓度为0.002mg/mL(即6.54U/ml)的重组FAD合成酶，分别置于不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃和50℃)水浴中避光反应120min。沸水浴处理10min使酶失活。反应后的样品用实施例4中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图6显示：在20℃-50℃反应温度下，均有产物FAD形成，说明酶的作用温度较宽；而最适反应温度为37℃。

(2)二价金属阳离子的影响：用PBS缓冲液(pH 7.4)配置终浓度为0.5mM的FMN和终浓度为5mM的ATP，加入终浓度为0.002mg/mL(即6.54U/ml)的重组FAD合成酶，并混合，加入终浓度各自分别为1mM、5mM、和10mM的二价金属离子Mg²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺和Cu²⁺，分别在37℃水浴中避光反应120min。沸水浴处理10min使酶失活。反应后的样品用实施例4中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图7显示：二价金属离子的加入都有利于活力的提高，相对而言，10mM的Mg²⁺和1mM的Mn²⁺对酶活的促进作用最明显。

(3)反应pH的影响：配置不同pH(pH 5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0和10.0)的PBS缓冲液，用于配置含终浓度为0.5mM的FMN、终浓度为5mM的ATP和终浓度为10mM的Mg²⁺的反应液，加入终浓度为0.002mg/mL(即6.54U/ml)的重组FAD合成酶，置于37℃水浴中避光反应120min。沸水浴处理10min使酶失活。反应后的样品用实施例4中所述液相检测方法检测FAD产量。结果如图8显示：中性至碱性条件下酶活较高。

实施例6：重组FAD合成酶的米氏方程

1、底物溶于pH 7.4PBS缓冲液中，浓度分别为：FMN为0.025mM；ATP为0.125mM、0.25mM、0.5mM、0.75mM、1.0mM、1.5mM。加入二价金属离子Mg²⁺至终浓度为10mM以及终浓度为0.002mg/mL(即6.54U/ml)的重组FAD合成酶。37℃水浴中避光反应15min，沸水浴10min使酶失活。反应后的样品使用液相检测方法检测FAD产量(同实施例4)。在固定FMN浓度下，测定反应初速度(V)，以V对ATP(mM)作米氏方程，结果如图9(左边)所示。以1/V对1/ATP(μM)作lineweaver-Burk图，结果如图9(右边)所示，所对应方程为Y＝0.03793×X+0.4059，Km＝0.1214±0.07464mM，V_max＝2.6695±0.3715μM/min/mg。

2、底物溶于pH 7.4PBS缓冲液中，底物浓度分别为：ATP为0.5mM；FMN为0.025mM、0.05mM、0.075mM、0.1mM、0.125mM、0.15mM。加入二价金属离子Mg²⁺至终浓度为10mM以及终浓度为0.002mg/mL(即6.54U/ml)的重组FAD合成酶。37℃水浴中避光反应15min，沸水浴10min使酶失活。反应后的样品使用液相检测方法检测FAD产量(同实施例4)。在固定ATP浓度下，测定反应初速度，以V对FMN(mM)作米氏方程，结果如图10(左边)所示。以1/V对1/FMN(mM)作Lineweaver-Burk图，结果如图10(右边)所示，所对应方程为：Y＝0.01951×X+0.2497，Km＝0.04737±0.03158mM，V_max＝3.271±0.79μM/min/mg。

3、底物溶于pH 7.4PBS缓冲液中，浓度分别为：FMN为0.5mM；ATP为5mM。加入二价金属离子Mg²⁺至终浓度为10mM以及终浓度为0.002mg/mL(即6.54U/ml)的重组FAD合成酶。37℃水浴中避光反应15min，沸水浴10min使酶失活。反应后的样品使用液相检测方法检测FAD产量(同实施例4)。15分钟内，每毫克FAD合成酶每分钟最高可转化合成约3.271μM的FAD。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种重组FAD合成酶、编码基因、工程菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 840

<212> DNA

<213> 无名假丝酵母(Candida famata)

<400> 1

atggagaacg gaaatctggc ttatcaacac aactttcttg cgagatgtga agaggcttca 60

aagttggtga atgacttttt gaatgatact ttaccactgg gattagtgcc cgagaggcga 120

aaaggttata tatatgacaa ggatagaagg caaacggtaa aggaaaggat acataagagc 180

ttagaagttt ttgataaggc gatagaagta catgggcttg aagagattgc aatttcgtat 240

aatggaggaa aagattgttt ggtaatgctt attctattga tggcatctat tcataagaag 300

tttaccattt caccaaccaa agactcatcg ttgaaagttt tgccaacaga ttataaactc 360

gattctatct acatcaattc tgaattaccc tttccaaatc tttcggattt tataaagagt 420

tcaacagcat attatcattt aaatcctatt ataatacaaa gttcattaaa agaaggattc 480

gaaaaatatt tgaatgaaat taatcctaaa gtgaaatcaa tattcgttgg aattcggtac 540

tcggaccctt atggttcgaa cttagaatat gagcaggtga ctgatcatga ttggcccaaa 600

ttcttaagaa ttcatcctat tttgcattgg aagtatgagg atatctggga tttcttagta 660

gggtgtgact tgaactattg tgagatgtat gaccaaggtt atacgagttt aggtggtatt 720

aataatacca cccccaaccc ctacttaaaa ataggtgatg ttggatatgc accggcttat 780

atgatgagaa agaatgcaga tgaaagagaa agatcgggca gaatatctaa ccgtacataa 840

<210> 2

<211> 279

<212> PRT

<213> 无名假丝酵母(Candida famata)

<400> 2

Met Glu Asn Gly Asn Leu Ala Tyr Gln His Asn Phe Leu Ala Arg Cys

1 5 10 15

Glu Glu Ala Ser Lys Leu Val Asn Asp Phe Leu Asn Asp Thr Leu Pro

20 25 30

Leu Gly Leu Val Pro Glu Arg Arg Lys Gly Tyr Ile Tyr Asp Lys Asp

35 40 45

Arg Arg Gln Thr Val Lys Glu Arg Ile His Lys Ser Leu Glu Val Phe

50 55 60

Asp Lys Ala Ile Glu Val His Gly Leu Glu Glu Ile Ala Ile Ser Tyr

65 70 75 80

Asn Gly Gly Lys Asp Cys Leu Val Met Leu Ile Leu Leu Met Ala Ser

85 90 95

Ile His Lys Lys Phe Thr Ile Ser Pro Thr Lys Asp Ser Ser Leu Lys

100 105 110

Val Leu Pro Thr Asp Tyr Lys Leu Asp Ser Ile Tyr Ile Asn Ser Glu

115 120 125

Leu Pro Phe Pro Asn Leu Ser Asp Phe Ile Lys Ser Ser Thr Ala Tyr

130 135 140

Tyr His Leu Asn Pro Ile Ile Ile Gln Ser Ser Leu Lys Glu Gly Phe

145 150 155 160

Glu Lys Tyr Leu Asn Glu Ile Asn Pro Lys Val Lys Ser Ile Phe Val

165 170 175

Gly Ile Arg Tyr Ser Asp Pro Tyr Gly Ser Asn Leu Glu Tyr Glu Gln

180 185 190

Val Thr Asp His Asp Trp Pro Lys Phe Leu Arg Ile His Pro Ile Leu

195 200 205

His Trp Lys Tyr Glu Asp Ile Trp Asp Phe Leu Val Gly Cys Asp Leu

210 215 220

Asn Tyr Cys Glu Met Tyr Asp Gln Gly Tyr Thr Ser Leu Gly Gly Ile

225 230 235 240

Asn Asn Thr Thr Pro Asn Pro Tyr Leu Lys Ile Gly Asp Val Gly Tyr

245 250 255

Ala Pro Ala Tyr Met Met Arg Lys Asn Ala Asp Glu Arg Glu Arg Ser

260 265 270

Gly Arg Ile Ser Asn Arg Thr

275

Claims

1.一种重组FAD合成酶，其特征在于所述重组FAD合成酶氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述重组FAD合成酶的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.一种由权利要求2所述重组FAD合成酶的编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

5.如权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌按如下方法制备：(1)将重组FAD合成酶的编码基因克隆至外源基因表达质粒上，获得重组质粒；所述外源基因表达质粒为下列之一：①pET系列，②pUC系列，③pGEM系列，④pBluescript系列；(2)将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，接种至LB液体培养基，20～37℃、50～250r/min振荡培养0.5～2h，获得转化产物；(3)将转化产物涂布于含10～100μg/mL卡那霉素的平板，20～37℃培养，筛选获得含重组FAD合成酶编码基因的工程菌。

6.如权利要求4-5之一所述重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌为大肠杆菌(Escherchia coli)BL21(DE3)/pET28b(+)-fads，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO:M 2017731，保藏日期2017年11月27日，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072。

7.一种权利要求1所述重组FAD合成酶在生产黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含重组FAD合成酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的发酵液提取的重组FAD合成酶与pH5-10缓冲液混合，加入底物黄素单核苷酸、ATP和二价金属阳离子构成反应体系，在20～50℃反应完全，将反应液分离纯化，获得黄素腺嘌呤二核苷酸；所述二价金属阳离子为Mg²⁺、Co²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺或Cu²⁺。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述反应体系中，黄素单核苷酸加入终浓度0.01～50mmol/L，所述ATP加入终浓度0.1～5mmol/L；所述重组FAD合成酶的含量为0.654～65.4U/mL。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述重组FAD合成酶按如下方法制备：(1)将含重组FAD合成酶编码基因的工程菌接种至LB斜面培养基，在20～37℃下活化后接入LB液体培养基，在20～37℃、50～250r/min培养8～48h后，以体积浓度0.1％～20％接种量转入发酵培养基，20～37℃、50～250r/min培养OD600为0.4-1.0后，加入诱导剂，在20～37℃、50～250r/min培养4～48h后，获得发酵液；所述诱导剂为IPTG或乳糖，IPTG终浓度0.01～1.51mM，乳糖终浓度0.1～50g/L；(2)将发酵液离心取菌体，用无菌水洗涤之后，加入pH 7.4的PBS缓冲液混匀，在35％振幅、工作1秒暂停3秒的条件下超声破碎10min后，离心收集上清，将上清液以体积比8:2的比例与镍柱填料混合后装柱，在250r/min转速振动混匀，用含20mM咪唑的binding buffer以1.0mL/min流速洗涤至紫外检测仪中显示无杂蛋白流出；再用含500mM咪唑的elution buffer以1.0mL/min流速洗涤，根据紫外检测仪收集目标蛋白，用含5mM DTT的pH7.4、PBS缓冲液透析，截留液用3000Da超滤管离心，滤饼即为重组FAD合成酶。