CN112760303B - 一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用 - Google Patents

一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用，通过提取星海链霉菌的基因组；以基因组为DNA模板，采用PCR扩增技术，得到星海链霉菌中的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列即metK目的片段；将metK目的片段与表达载体pET‑32a(+)进行双酶切后连接，构建重组质粒；采用热激化法将重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中，并经过异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷诱导表达，得到SxMAT；通过对高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶进行变性后复性的方式，得到高纯度的SxMAT，所述SxMAT在温度为25‑55℃，pH值为8‑10.5时稳定性好，且产物的光学纯度(ee)>90％，产率为80％，SxMAT与氟化酶联用构建体外双酶级联反应，有益于人们对链霉菌中氟化通路的理解以及衍生对氟化天然产物的应用。

Description

一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于蛋白质与酶工程技术领域，具体涉及一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用。
背景技术
S-腺苷-L-甲硫氨酸，即S-腺苷甲硫氨酸，常用缩写方式包括SAM、SAM-e和AdoMet。在生物体内，S-腺苷甲硫氨酸是以L-甲硫氨酸(L-Met)和三磷酸腺苷(ATP)为底物，在甲硫氨酸腺苷转移酶也叫S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶(MAT,EC 2.5.1.6)的催化下形成的。在此反应中，首先生成S-腺苷-L-甲硫氨酸和三聚磷酸盐；随后，得到的三聚磷酸盐被不对称水解，产生焦磷酸盐(ppi)和正磷酸盐(pi)。S-腺苷-L-甲硫氨酸广泛存在于动物、植物和微生物体内，参与生物体内40多种生化反应，是生物体内重要的生理活性物质。S-腺苷-L-甲硫氨酸作为一种重要代谢中间化合物，通过转甲基、转硫基和转氨丙基等反应参与人体众多代谢途径，是保证人体正常生命活动所不可或缺的重要物质。临床研究表明，S-腺苷-L-甲硫氨酸对肝脏疾病、抑郁症、关节炎等许多疾病具有治疗效果，同时，S-腺苷-L-甲硫氨酸是细胞内原有的代谢物，具有易吸收、副作用小等特点。1999年，美国FDA批准S-腺苷-L-甲硫氨酸以SAM-e为名字，作为膳食补充剂在美国上市。近年来，国内外尝试用S-腺苷-L-甲硫氨酸对肝脏疾病、抑郁症等进行治疗，并获得一定成效，使其市场需求不断扩大。
S-腺苷-L-甲硫氨酸的制备始于上世纪50年代，主要有化学合成法，微生物发酵法和酶催化法三种。相比于化学合成法和微生物发酵法，酶催化法因具有立体选择性高、反应条件温和、反应时间短、产物易分离、对环境友好等特点，成为近年来研究S-腺苷-L-甲硫氨酸制备的热点方向。迄今为止，已经从不同来源的细菌中分离并鉴定出甲硫氨酸腺苷转移酶，如毕赤酵母、甲烷球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热厌氧菌、大肠杆菌等。甲硫氨酸腺苷转移酶虽然广泛存在于动物、植物和微生物，但天然表达的甲硫氨酸腺苷转移酶含量少，分离纯化困难，因而限制了酶催化法的大规模使用。因此，构建高效表达甲硫氨酸腺苷转移酶工程菌成为用酶催化法制备S-腺苷-L-甲硫氨酸的首要任务。与此同时，S-腺苷-L-甲硫氨酸是一种含有两个手性中心的化合物，具有(R,S)-SAM和(S,S)-SAM两种异构体，但仅有(S,S)-SAM具有生物活性。尽管如此，并没有报道能够通过酶催化法获得较纯的产物(S,S)-SAM的方法。
氟化天然产物因其具有独特的物理和化学性质而受到生物学家和化学家的持续关注。氟化酶(FLA)作为一种已发现的酶，其能够将无机氟离子(F-)催化到有机分子中形成碳-氟(C-F)键，生成有机氟化物。在2002年，英国David O’Hagan教授的研究小组从卡特利亚链霉菌(Streptomyces cattleya)中分离出第一个天然氟化酶(由flA基因编码)。它能够利用无机氟离子和S-腺苷-L-甲硫氨酸催化SN2生物亲核反应，生成5’-氟化脱氧腺苷(5’-FDA)和L-甲硫氨酸。随着对氟化酶及其代谢通路的研究，从2014年到2016年，在不同菌种中确定了四个新的氟化酶。其中，在星海链霉菌(Streptomyces xinghaiensis)中发现的氟化酶具有最优的酶学性质。因此以甲硫氨酸腺苷转移酶化生成的产物S-腺苷-L-甲硫氨酸作为氟化酶催化的反应底物，构建一个双酶级联反应，更有益于人们对链霉菌中氟化通路的理解以及衍生对氟化天然产物的应用。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶。
本发明的第二目的是提供一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶的制备方法。
本发明的第三目的是探讨高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶在酶催化法中生产S-腺苷-L-甲硫氨酸、与氟化酶的双酶级联等反应中的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶，所述转移酶的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述转移酶由星海链霉菌中提取的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列metK与表达载体pET-32a(+)进行双酶切后连接得到。
进一步，所述转移酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH值为8.5，且所述转移酶催化的产物的光学纯度(ee)>90％，产率为80％，所述转移酶的热稳定性范围为25-55℃，pH稳定范围为8-10.5。
进一步，所述转移酶一种Co2+依赖型的酶。
进一步，具体步骤如下：
1)提取星海链霉菌的基因组；
2)以步骤1)中的基因组为DNA模板，采用PCR扩增技术，得到星海链霉菌中的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列即metK目的片段；
3)将步骤2)中的metK目的片段与表达载体pET-32a(+)进行双酶切后连接，构建重组质粒；
4)采用热激化法将步骤3)中的重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中，并经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，得到高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶即SxMAT；
5)通过对步骤4)中的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶进行变性后复性的方式，得到高纯度的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶。
进一步，步骤3)中所述双酶切的位点分别为NdeI和XhoI。
进一步，所述的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶在酶催化法中生产S-腺苷-L-甲硫氨酸、与氟化酶的双酶级联反应中的应用。
进一步，所述的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶与氟化酶联用，构建体外双酶级联反应，直接催化底物无机氟离子和中间产物S-腺苷-L-甲硫氨酸，生成5’-氟化脱氧核糖。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
1、本发明方法应用基因工程的方法，以提取的星海链霉菌基因组做为模板，进行PCR扩增得到MAT的基因序列metK目的片段，再经过分子克隆得到重组质粒pET-32a(+)-metK，将重组质粒pET-32a(+)-metK转化至大肠杆菌原核表达系统实现高效的异源表达，最后经过诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导表达，得到表达量较高的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶SxMAT，制备过程简单、成本低廉、适合大规模生产；
2、本发明通过对SxMAT重组蛋白的包涵体部分进行变性后再复性的纯化方式，获得了高纯度的目的蛋白，即分离纯化简单、操作方便、约生产成本；
3、本发明中甲硫氨酸腺苷转移酶SxMAT具有较好的立体选择性，其催化生成的产物S,S)-SAM光学纯度(ee)高达99％并且具有生物活性，产物的产率为80％；
4、本发明中验证了甲硫氨酸腺苷转移酶SxMAT是Co2+依赖型的酶，其最适反应温度为55°C、最适反应pH值为8.5，且在温度为25-55℃、pH值为8-10.5时生物活性的稳定性好；
5、本发明构建了双酶级联反应，以甲硫氨酸腺苷转移酶SxMAT的反应产物S-腺苷-L-甲硫氨酸作为氟化酶的反应底物，利用HPLC和LC-MS检测终产物5’-氟脱氧腺苷的生成，拓展了对含氟天然产物在细菌中的生物合成途径的认识，更有益于人们对链霉菌中氟化通路的理解同时扩大了氟化天然产物的生物应用，可以为氟化物的生物法合成领域提供信息参考，推进氟化物生物法合成的工业化进程。
本发明的其它优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
本发明的附图说明如下：
图1是本发明中利用基因组提取、PCR扩增、双酶切等技术构建的重组质粒pET-32a(+)-metK结果图；
图2是本发明中SxMAT的蛋白纯化SDS-PAGE结果；
图3是本发明中SxMAT的HPLC的活性验证结果；
图4是本发明中SxMAT的LC-MS的活性验证结果；
图5是本发明中SxMAT的最适反应温度的测定结果；
图6是本发明中SxMAT的热稳定性的测定结果；
图7是本发明中SxMAT的最适反应pH值的测定结果；
图8是本发明中SxMAT的pH稳定性的测定结果；
图9是本发明中SxMAT金属离子选择性的测定结果；
图10是本发明中SxMAT对Co2+浓度依赖的测定结果；
图11是金属离子对SxMAT二级结构影响的测定结果；
图12是金属离子对SxMAT的热稳定性的测定结果；
图13是SxMAT以L-甲硫氨酸作为底物得到的米曼氏酶动力学拟合曲线图；
图14是SxMAT以三磷酸腺苷作为底物得到的米曼氏酶动力学拟合曲线图；
图15是本发明中SxMAT和氟化酶参与的双酶级联反应HPLC检测结果图；
图16是本发明中SxMAT和氟化酶参与的双酶级联反应LC-MS检测结果图；
图17是本发明中SxMAT和氟化酶的双酶级联反应示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶(SxMAT)的制备
1、实验方法
具体步骤如下：
1)提取星海链霉菌的基因组；
将星海链霉菌在土豆培养基中培养5-8天后，使用基因组提取试剂盒提取星海链霉菌的基因组(gDNA)，稀释10倍后于-20℃保存备用；
2)以步骤1)中的基因组为DNA模板，采用PCR扩增技术，得到星海链霉菌中的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列即metK目的片段；
设计分别含有NdeI和XhoI酶切位点的上下游引物，以步骤1)中提取基因组(gDNA)为DNA模板，根据表1和表2所示进行PCR扩增，以得到MAT基因序列metK的目的片段。
表1 PCR扩增的反应体系
10倍稀释的gDNA模版 1μL
10μM上游引物 2μL
10μM下游引物 2μL
Pfu DNA Polymerase 0.5μL
dNTP mix 4μL
10×Pfu Buffer 8μL
ddH2O 32.5μL
总体积 50μL
表2 PCR扩增的程序
98℃ 2min
98℃ 10s
70℃ 30s
72℃ 80s
72℃ 10min
3)将步骤2)中的metK目的片段与表达载体进行双酶切后连接，构建重组质粒；
将PCR扩增得到的metK目的片段和表达载体pET-32a(+)分别使用NdeI和XhoI限制性核酸内切酶进行双酶切后用T4连接酶连接，得到构建好的重组质粒pET-32a(+)-metK；
4)采用热激化法将步骤3)中的重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中，并经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，得到高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶即SxMAT；
将重组质粒pET-32a(+)-metK和大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞混合均匀，在冰上放置30min后，于42℃加热90s进行热激。向热激后的细胞混合液中加入400μL的无抗LB液体培养基，37℃摇床180r/pm振荡培养1h后，于超净台中取50μL涂布于含有200μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基中，在37℃恒温培养箱中倒置培养16h。挑取平板中的单菌落于含200μg/mL氨苄霉素的LB培养基直至600nm(OD600)处的吸光度值达到0.6左右，加入终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，16℃培养24h后，收集菌体，得到高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶即SxMAT；
5)通过对步骤4)中的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶进行变性后复性的方式，得到高纯度的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶；
向收集的菌体中加入适量裂解液(100mMTris-HCl，pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑，0.5mg/mL溶菌酶)重悬菌体，为了防止目的蛋白的降解，还需加入PMSF蛋白酶抑制剂(1mM)。4℃冰浴30min后进行超声破碎，破碎条件为：Ф6变幅杆，P＝30％，开3s，关7s。将破碎后得到的菌液使用低温高速离心机，9000×g离心30min，收集沉淀；
使用蛋白洗涤液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl，2M尿素，1mM EDTA)将破碎离心后的沉淀重悬，对沉淀进行洗涤以及除去包涵体中的脂类和部分杂蛋白，9000×g离心20min，收集沉淀部分即为粗制包涵体。使用蛋白变性液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，8M尿素，20mM DTT)对粗制包涵体进行溶解，4℃搅拌变性2h后，9000×g离心20min，收集上清液即为包涵体溶解液；
将包涵体溶解液放于透析袋中，于蛋白复性液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，50mMNaCl，1mM EDTA)中透析24h，中途换一次透析液，透析结束后使用10kDa超滤管浓缩至0.5mL左右，此蛋白液即为复性蛋白，使用储存缓冲液将浓缩好的蛋白每管100μL分装备用，并于-80℃冷冻存储，即得到高纯度的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶；
6)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对各成分进行分析测定，并通过BSA法对蛋白定量。
2、实验结果
结果如图1所示，A为星海链霉菌基因组(gDNA)的提取结果，B为以星海链霉菌的基因组为DNA模板，采用PCR扩增技术扩增出MAT基因序列metK的目的片段，C为以重组质粒pET-32a(+)-metK的单菌落为模板，菌落PCR扩增结果，D为重组质粒pET-32a(+)-metK的双酶切结果；
结果如图2所示，A为重组蛋白的整体表达情况，B为对重组蛋白的包涵体进行变性后再复性的结果，由图2中A得知蛋白绝大多数以包涵体的形式存在，由图2中B得知复性后的蛋白纯度较高，可以进行后续活性验证实；
采用BSA法对重组蛋白进行蛋白定量，得出复性得到的蛋白浓度为38mg/mL，说明复性法得到的重组蛋白纯度较高，是后续验证酶活的基础。
实施例2：HPLC和LC-MS检测SxMAT的生物活性
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、金属离子K+-Mg2+/Co2+、TCA
2、实验方法
该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、底物L-Met(5mM)和ATP(5mM)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)/Co2+(10mM)，同时分别设立只含有ATP、只含有L-Met、只含有SxMAT、只含有ATP和L-Met的阴性对照组，各组反应2h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min，上清液用0.22μm的滤膜过滤后用于HPLC以及LC-MS分析。
3、实验结果
由如图3可知，结果显示只有实验组有产物峰，而阴性对照组没有产物峰，由图4可知，结果显示[M+H]+为399.1443，与理论一致，即可以将产物定性为S-腺苷-L-甲硫氨酸。
实施例3：测定温度对SxMAT活性的影响以及SxMAT的热稳定性
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、金属离子K+-Mg2+、TCA
2、实验方法
SxMAT最适反应温度的测定：该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、底物L-Met(5mM)和ATP(5mM)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)，各分别在温度为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃摇床中130rpm/min反应2h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC分析。
SxMAT热稳定性的测定：该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)，各组分别在温度为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃孵育1h后加入终浓度为5mM的ATP和5mM的L-Met，在55℃摇床中130rpm/min反应1h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC分析。
3、实验结果
由图5可知，SxMAT最适反应温度为55℃；
由图6可知，SxMAT在25-55℃时稳定性较好。
实施例4：测定pH对SxMAT活性的影响以及SxMAT的pH稳定性
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、金属离子K+-Mg2+、TCA
2、实验方法
SxMAT最适反应pH的测定：该反应总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、底物L-Met(5mM)和ATP(5mM)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)，分别溶于100mM的乙酸-乙酸钠(sodium acetate)缓冲液(pH 2.0-5.0)，100mM的磷酸盐(sodium phosphate)缓冲液(pH5.5-7.0)，100mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5-10.0)，100mM的KCl-NaOH缓冲液(pH 10.5-13.0)，在55℃摇床中130rpm/min反应2h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清用于HPLC分析。
pH稳定性的测定：该反应总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)，分别溶于100mM的乙酸-乙酸钠(sodium acetate)缓冲液(pH 2.0-5.0)，100mM的磷酸盐(sodium phosphate)缓冲液(pH 5.5-7.0)，100mM的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5-10.0)，100mM的KCl-NaOH缓冲液(pH 10.5-13.0)，在55℃孵育1h后加入终浓度为5mM的ATP和5mM的L-Met，在55℃摇床中130rpm/min反应1h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC分析。
3、实验结果
由图7可知，SxMAT最适反应pH值为8.5；
由图8可知，SxMAT在pH值为8-10.5时较稳定。
实施例5：测定金属离子对SxMAT活性及二级结构的影响
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、TCA、K+、Mg2+、Na+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+、Al3+、EDTA、
2、实验方法
各金属离子对SxMAT活性的影响：该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、底物L-Met(5mM)和ATP(5mM)，加入终浓度为1mM的不同金属离子(K+、Mg2+、Na+、Cu2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Mn2+、Co2+、Fe3+、Al3+)以及终浓度为1mM金属离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)，在最适反应温度55℃以及最适反应pH 8.5的条件下，摇床中130rpm/min反应2h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC分析。
Co2+浓度依赖性实验：该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、底物L-Met(5mM)和ATP(5mM)，向反应体系中分别添加终浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4、5、6、8、10的Co2+，55℃摇床中130rpm/min反应2h后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清用于HPLC分析。
圆二色谱(CD)测定各金属离子对SxMAT二级结构的影响：设立五组实验，每组实验体积500μL：SxMAT母液浓度为38mg/mL，终浓度为1mg/mL；Mg2+母液浓度为500mM，终浓度为20mM；K+母液浓度为500mM，终浓度为150mM；Co2+母液浓度为500mM，终浓度为5mM；Zn2+母液浓度为500mM，终浓度为5mM，体系如表3所示：
表3圆二色谱反应体系
Figure BDA0002936527790000101
3、实验结果
各金属离子对SxMAT活性的影响：由图9可知，K+、Mg2+、Mn2+、Co2+能激发SxMAT的活性；
Co2+浓度依赖性：由图10可知，Co2+浓度的浓度越大，SxMAT的相对活性较高，当Co2+浓度大于6mM时，SxMAT的相对活性较稳定；
各金属离子对SxMAT二级结构的影响：由图11可知，与SxMAT在100mM Tris-HCl(pH8.5)中的二级结构相比，SxMAT在150mM的K+和5mM的Co2+中的二级结构相似，而在5mM Zn2+或者20mM的Mg2+中二级结构有所改变，这说明K+和Co2+不会影响SxMAT的二级结构，而Mg2+和Zn2 +均会影响SxMAT的二级结构。
实施例6：测定金属离子对SxMAT热稳定性的影响
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、TCA、K+-Mg2+、Zn2+、Co2+
2、实验方法
该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)，并向反应体系中分别添加终浓度为10μM和1mM的Zn2+和Co2+，分别在温度为25℃、35℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃孵育1h后加入终浓度为5mM的ATP和5mM的L-Met，于55℃摇床中130rpm/min反应1h，反应结束后，向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC分析。
3、实验结果
由图12可知，在10μM和1mM的Co2+中，SxMAT的热稳定性较好。此外，在较高浓度1mMCo2+存在的条件下，SxMAT的热稳定性最好。而不论高低浓度有Zn2+的存在均会影响SxMAT的热稳定性。
实施例7：SxMAT的酶动力学参数的测定
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、TCA、K+-Mg2+/Co2+
2、实验方法
该反应在100mM，pH 8.5的Tris-HCl缓冲液中进行，总体积为500μL，其中包含有SxMAT(6mg/mL)、金属离子K+(150mM)-Mg2+(20mM)/Co2+(10mM)，在最适反应温度55℃以及最适反应pH 8.5的条件下反应：
底物L-Met对SxMAT的酶动力学常数测定：分别将终浓度为200μM、400μM、800μM、1000μM、2000μM、4000μM、8000μM和10000μM的L-Met添加到500μL的反应体系中，在反应时间1min、3min、5min、7min和10min时取100μL，并向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC检测；
底物ATP对SxMAT的酶动力学常数测定：分别将终浓度为200μM、400μM、800μM、1000μM、2000μM、4000μM、8000μM和10000μM的ATP添加到500μL的反应体系中，在反应时间1min、3min、5min、7min和10min时取100μL，并向反应体系中加入150μL浓度为12％的TCA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清过膜用于HPLC检测。
3、实验结果
表4 SxMAT的酶动力学参数
Figure BDA0002936527790000121
底物L-Met对SxMAT的酶动力学常数测定：按照SAM标准曲线所获得的计算公式，得到各个样品中SAM的浓度。随后，根据检测的产物浓度，做出在相同L-Met浓度下，横坐标为时间，纵坐标为产物浓度的曲线，进而得到线性方程的斜率，即为SAM在该底物浓度下的初始反应速率，进而可以得到8种不同L-Met浓度下的产物初始反应速率。在利用初始反应速率，做出横坐标为L-Met浓度，纵坐标为初始反应速率的曲线，如图13所示，通过拟合软件Origin，拟合得到L-Met对SxMAT的酶动力学；
底物ATP对SxMAT的酶动力学常数测定：按照SAM标准曲线所获得的计算公式，得到各个样品中SAM的浓度。随后，根据检测的产物浓度，做出在相同ATP浓度下，横坐标为时间，纵坐标为产物浓度的曲线，进而得到线性方程的斜率，即为SAM在该底物浓度下的初始反应速率，进而可以得到8种不同ATP浓度下的产物初始反应速率。在利用初始反应速率，做出横坐标为ATP浓度，纵坐标为初始反应速率的曲线，如图14所示，通过拟合软件Origin，拟合得到ATP对SxMAT的酶动力学；
酶动力学参数测定结果如表4所示，可以看出，在反应液中添加Co2+后，SxMAT的各项酶动力学参数均有所提高。
实施例8：
1、实验材料
以实施例1中的方法制备得到的SxMAT、Tris-HCl缓冲液、L-Met、ATP、TCA、FLA、KF
2、实验方法
将SxMAT置于最适反应温度55℃以及最适反应pH 8.5的条件下，SxMAT以ATP和L-Met为底物进行催化反应，反应1h后，95℃加热5min对体系中的SxMAT灭活，12000rpm/min离心10min后取上清200μL，加入终浓度为2mg/mL的FLA以及终浓度为200mM的KF，加水定容至500μL，42℃反应1h后，95℃加热5min对体系中的FLA灭活，12000rpm/min离心10min后取上清用于HPLC和LC-MS的检测。
3、实验结果
由图15和图17可知，SxMAT以ATP和L-Met为底物与FLA进行双酶级联反应，产物5’-FDA的保留时间在6min左右，双酶级联反应生成的产物与阳性对照组的产物峰时间一致，说明经过两步酶促反应，能够产生5’-FDA，为了进一步验证反应产物中有5’-FDA，经过LC-MS检测，由图16可知，检测到的[M+H]+＝270.1023，与理论计算一致。这一实验表明SxMAT和FLA在体外经过两步酶促反应，可以直接生成氟化代谢通路的中间产物5’-FDA。验证了利用氟化酶，能够潜在的生成[18F]-氟化物，应用于PET的可行性。
最后用说明的是：以上所述仅为本发明的优选实验而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、同等替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶及其制备方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1194
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcccgtg cccagacata cacctcggaa tccgtcaccg aaggccaccc cgacaaggtc 60
gccgaccaga tatccgacgc cctgctcgac gagatcctgc ggatcgaccc cgcggcgcgc 120
tgcgcctgcg aaaccctcgt caccaccgga ctcgtggtgg tggccgggga gctgggcacc 180
accgcccgga tcgatgtgcc cgacgtcgtg cgggcggtcc tgcgcgacat cgggtacgac 240
agcgcccgcc agggcttcga cggcaacagc tgcggcatca tcgtcacgct cgaccggcag 300
tcccccgaca tcgcacgggg tctcgactcc tcgtgggaga gccgcaccgc caggggagat 360
atcgtcccgc tggaccgcca gggcgccggc gaccagggca tgatggtcgg ctacgcctgc 420
gacgagaccc cggagctcat gccgctgccc atctccctgg cacaccggct ggcccggcgc 480
ctcagcgagg tgcgcaggac gggcgtgctg ccgtatctgc ggcccgacgg caagacgcag 540
gtgaccgtgg attacgagaa cgggcgcccg gcccgggtgt ccacgatcgt ggtgtccgcc 600
cagcacaccc ccgacgtcga cgtggaacgc gtcctggcac cggagatccg tgcgcaggtg 660
atcgagccct gcctgaccgg ggagcgggcg gaggaccggc ccgtcgtcct ggtgaacccg 720
accgggcgtt tcgagagcgg cggaccggtg gcggacgtcg ggctcacggg ccgcaaggtc 780
atcgtggaca cctacgggag catggcgcgg cacggcggcg gggccttcag cggcaaggac 840
ccctcgaagg tggaccggtc ggccgcgtac gccgcgcgct gggccgccaa gaacgtcatc 900
gcggccgggc tcgcggaacg ctgcgaggtc catctgagct acgcgatcgg cgtggcacgg 960
ccggtgggtg tgcacgtgga gaccttcggc accgaccggg tggatcccgt gcgcctggcc 1020
aaggtcgtgc cggacttctt cgatctgagg cccgcggcga tcgtacggga cctgcggctc 1080
aaccgtcccg tcttccgggc gaccgcggcc tacggccact tcggccggga ggagccgggc 1140
ttcacctggg aggagcggtc gcgggcggcg gagctcgcgg cggcgctggc atga 1194
<210> 2
<211> 397
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid sequence)
<400> 2
Met Ser Arg Ala Gln Thr Tyr Thr Ser Glu Ser Val Thr Glu Gly His
1 5 10 15
Pro Asp Lys Val Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ile
20 25 30
Leu Arg Ile Asp Pro Ala Ala Arg Cys Ala Cys Glu Thr Leu Val Thr
35 40 45
Thr Gly Leu Val Val Val Ala Gly Glu Leu Gly Thr Thr Ala Arg Ile
50 55 60
Asp Val Pro Asp Val Val Arg Ala Val Leu Arg Asp Ile Gly Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Ala Arg Gln Gly Phe Asp Gly Asn Ser Cys Gly Ile Ile Val Thr
85 90 95
Leu Asp Arg Gln Ser Pro Asp Ile Ala Arg Gly Leu Asp Ser Ser Trp
100 105 110
Glu Ser Arg Thr Ala Arg Gly Asp Ile Val Pro Leu Asp Arg Gln Gly
115 120 125
Ala Gly Asp Gln Gly Met Met Val Gly Tyr Ala Cys Asp Glu Thr Pro
130 135 140
Glu Leu Met Pro Leu Pro Ile Ser Leu Ala His Arg Leu Ala Arg Arg
145 150 155 160
Leu Ser Glu Val Arg Arg Thr Gly Val Leu Pro Tyr Leu Arg Pro Asp
165 170 175
Gly Lys Thr Gln Val Thr Val Asp Tyr Glu Asn Gly Arg Pro Ala Arg
180 185 190
Val Ser Thr Ile Val Val Ser Ala Gln His Thr Pro Asp Val Asp Val
195 200 205
Glu Arg Val Leu Ala Pro Glu Ile Arg Ala Gln Val Ile Glu Pro Cys
210 215 220
Leu Thr Gly Glu Arg Ala Glu Asp Arg Pro Val Val Leu Val Asn Pro
225 230 235 240
Thr Gly Arg Phe Glu Ser Gly Gly Pro Val Ala Asp Val Gly Leu Thr
245 250 255
Gly Arg Lys Val Ile Val Asp Thr Tyr Gly Ser Met Ala Arg His Gly
260 265 270
Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala
275 280 285
Ala Tyr Ala Ala Arg Trp Ala Ala Lys Asn Val Ile Ala Ala Gly Leu
290 295 300
Ala Glu Arg Cys Glu Val His Leu Ser Tyr Ala Ile Gly Val Ala Arg
305 310 315 320
Pro Val Gly Val His Val Glu Thr Phe Gly Thr Asp Arg Val Asp Pro
325 330 335
Val Arg Leu Ala Lys Val Val Pro Asp Phe Phe Asp Leu Arg Pro Ala
340 345 350
Ala Ile Val Arg Asp Leu Arg Leu Asn Arg Pro Val Phe Arg Ala Thr
355 360 365
Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu Glu Pro Gly Phe Thr Trp Glu
370 375 380
Glu Arg Ser Arg Ala Ala Glu Leu Ala Ala Ala Leu Ala
385 390 395

Claims (1)

1.一种高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶在酶催化法中生产S-腺苷-L-甲硫氨酸及与氟化酶的双酶级联反应中的应用，其特征在于，所述转移酶为一种Co2+依赖型的酶，其DNA序列如SEQ ID NO .1所示，所述转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示，所述转移酶由星海链霉菌中提取的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列metK与表达载体pET-32a(+)进行双酶切后连接得到；
所述转移酶的制备方法具体步骤如下：
1)提取星海链霉菌的基因组；
2)以步骤1)中的基因组为DNA模板，采用PCR扩增技术，得到星海链霉菌中的甲硫氨酸腺苷转移酶的基因序列即metK目的片段；
3)将步骤2)中的metK目的片段与表达载体pET-32a(+)进行双酶切后连接，构建重组质粒，所述双酶切的位点分别为NdeI和XhoI；
4)采用热激化法将步骤3)中的重组质粒转化到大肠杆菌BL21的感受态细胞中，并经过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达，得到高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶即SxMAT；
5)通过对步骤4)中的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶的包涵体部分进行变性后复性的方式，得到高纯度的高立体选择性的甲硫氨酸腺苷转移酶；
所述转移酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH值为8.5，且所述转移酶催化的产物的光学纯度(ee)>90％，产率为80％，所述转移酶的热稳定性范围为25-55℃，pH稳定范围为8-10.5，反应液中添加金属离子Co2+能提高转移酶活性；
所述转移酶与氟化酶联用，构建体外双酶级联反应，直接催化底物无机氟离子和ATP以及L-Met，生成5’-氟化脱氧腺苷。
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