CN1993478A - 测定fad合成酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及确定黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的方法，和鉴定调节该酶活性的化合物的方法。

Description

测定FAD合成酶的方法
发明领域
本发明涉及确定黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶的活性的方法和鉴定调节该酶的活性的方法。
背景
FAD合成酶催化辅因子黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的生物合成中的最终步骤，FMN和FAD是很多酶的关键辅因子。
细菌中的FAD合成酶是具有两种酶活性的双功能蛋白。一种酶活性，即黄素激酶(FK)活性，是核黄素(rfl)的磷酸化，以产生FMN。另一种酶活性，即FAD合成酶(FADS)活性，是FMN的腺苷酸化，以产生FAD。预测这种生物合成途径存在于许多致病细菌物种中，并且预测，这两种酶促步骤，即FK和FADS对细菌存活力都是关键的(Gerdes et al.，J.Bacteriol.，184：4555-4572，2002)。
在许多细菌，包括枯草芽孢杆菌(Kearney et al.，J.Biol.Chem.，254：9551-9557，1979)和产氨棒杆菌(Spencer et al.，Biochemistry，15：1043-1053，1976)上进行了调查FAD合成酶的酶活性的研究。枯草芽孢杆菌和产氨棒杆菌的体外实验显示FAD合成酶的FK和FADS都采用ATP。但是，FAD合成酶的酶活性需要其黄素底物处于特定氧化还原状态。例如，体外显示枯草芽孢杆菌需要还原的黄素以得到FK和FADS活性。相反，报道了来自产氨棒杆菌的FAD合成酶在缺乏添加的还原剂的条件下催化由Rfl形成FMN和由FMN形成FAD，因此采用氧化的黄素作为底物。
发明概述
FAD合成酶是一种双功能蛋白，其具有两种酶活性：(1)黄素激酶(FK)活性，其是核黄素(rfl)的磷酸化，以产生FMN，和(2)FAD合成酶(FADS)活性，其是FMN的腺苷酸化，以产生FAD，或该反应的逆转，即FAD脱腺苷酸为FMN。本发明部分是基于以下发现，即来自致病物种葡萄球菌、链球菌或沙门氏菌的细菌FAD合成酶的酶活性需要还原的底物。此外，发现来自沙门氏菌的细菌FK的活性需要还原的核黄素。
本发明也包括通过在测试化合物存在下确定FMN或FAD形成或消耗而鉴定FAD调节剂的活性的方法。此外，可以通过在测试化合物存在下测定FMN形成而确定FK调节剂的活性。本发明特别适合于用高通量筛选(HTS)鉴定感兴趣的化合物。
因此，一方面，本发明包括确定细菌合成酶活性的方法。该方法包括使选自葡萄球菌，链球菌、沙门氏菌的细菌FAD合成酶或其功能片段与FAD合成酶的还原的底物接触；并且确定细菌FAD合成酶的活性。还原的底物可以是核黄素、FMN或FAD。
另一方面，本发明包括确定特别是FADS或细菌黄素激酶(FK)的活性的方法。例如，该方法包括使选自葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌的细菌FK或其功能片段与还原的核黄素接触；并且确定细菌FK的活性。
另一方面，本发明包括鉴定能够调节细菌黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的化合物的方法。该方法包括使选自葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌的细菌FAD合成酶或其功能片段与细菌FAD合成酶的还原的底物和测试化合物接触；并且确定细菌FAD合成酶的活性，其中与对照相比，化合物存在下活性的增加或减少表明该化合物调节FAD合成酶活性。
另一方面，本发明包括鉴定能够调节细菌FADS或FK的化合物的方法。例如，该方法包括使沙门氏菌的细菌FK或其功能片段与还原的核黄素和测试化合物接触；并且确定细菌FK的活性，其中与对照相比，化合物存在下活性的增加或减少表明该化合物调节FK活性。
在上文描述的筛选方法中，葡萄球菌可以是金黄色葡萄球菌；链球菌可以是肺炎链球菌，并且沙门氏菌可以是鼠伤寒沙门氏菌。用于本发明的测试化合物可以是诸如肽、肽模拟物、小分子或其它药物的化合物。
附图简述
图1描述了表示FAD合成酶的系统发生距离的系统树图。
图2描述了来自鼠伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的FAD合成酶的蛋白比对。
图3描述了具有RibF调节活性的化合物。
发明详述
本发明部分提供了鉴定新的抗菌化合物的方法。本发明是基于以下发现，即来自某些病原体的FAD合成酶的酶活性需要还原的底物。本发明提供了确定FAD合成酶的酶活性和鉴定增加或减少其活性的化合物的方法。目标病原体包括来自肠杆菌科的物种(如鼠伤寒沙门氏菌)、葡萄球菌物种(如金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌)和链球菌物种(如肺炎链球菌、变异链球菌和酿脓链球菌)。
FAD合成酶
编码来自多种细菌物种的FAD合成酶的核酸是本领域公知的。例如，编码来自鼠伤寒沙门氏菌的FAD合成酶的核酸序列可以从GenBank以AE008695获得；编码来自金黄色葡萄球菌的FAD合成酶的核酸序列可以从GenBank以NC_002758获得；编码来自肺炎链球菌的FAD合成酶的核酸序列可以从GenBank以AE008474获得。
来自细菌属葡萄球菌属、链球菌属或沙门氏菌属的FAD合成酶可以用本领域公知的方法容易地获得。例如，可以用来自鼠伤寒沙门氏菌的FAD合成酶分离编码来自同一类或其它细菌物种的FAD合成酶同源物的cDNAs和基因。示例的方法包括但不限于核酸杂交法以及DNA和RNA扩增法，所述方法的实例是核酸扩增技术的各种使用(如聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应)。
例如，可以采用本领域技术人员公知的方法，用来自鼠伤寒沙门氏菌的核酸的全部或一部分作为DNA杂交探针来筛选来自任何需要的细菌的文库，从而直接分离FAD合成酶的cDNAs或基因组DNAs。可以设计和合成基于鼠伤寒沙门氏菌的FAD核酸序列的特异性寡核苷酸引物。此外，可以通过本领域技术人员公知的方法，如随机引物、DNA标记、切口翻译或末端标记技术，直接用完整序列合成DNA探针。此外，可以设计特异性引物，并且用于扩增这些序列的一部分或全长。可以在扩增反应期间直接标记得到的扩增产物，或者在扩增反应后进行标记，并且用作探针，以便在合适的严格性条件下分离全长cNNA或基因组片段。可以通过对这些片段测序而获得cDNA或基因组片段的序列。基于与已知基因序列的同源性而对未知基因进行测序和表征的方法是本领域公知的(参见，例如Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Manual，CSH Press 1989)。
FAD合成酶的变体和功能片段
FAD合成醇的变体包括基本保留了FAD合成酶的生物活性(如FK和/或FADS活性)的那些变体。典型的变体保留了野生型FAD合成酶活性的70％以上，例如，野生型FAD合成酶活性的75％，80％，85％，90％，95％或99％。可以用本领域公知的方法测定变体的活性。变体包括由于天然等位基因变异或诱变而导致氨基酸序列不同的多肽。在另一实例中，功能变体典型地仅仅包含保守变异或非关键残基或非关键区域中的变异。“保守性氨基酸取代”是指氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分枝侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
由于FAD合成酶是具有FK和FADS活性的双功能分子，可以将具有这些活性的FAD合成酶的功能片段用于本发明的方法中。功能片段是指具有FK或FADS活性的FAD合成酶的片段或变体。典型地，FK或FADS片段保留了野生型FAD合成酶活性的70％以上，例如，野生型FAD合成酶活性的75％，80％，85％，90％，95％或99％。
通常，FADS活性存在于FAD合成酶的N-末端结构域，并且FK活性存在于FAD合成酶的C-末端结构域(Krupa et al.，(2001)TrendsBiochem.Sci.，10：1712-1728)。例如，已经证明在大肠杆菌中，蛋白N-末端中的FAD合成酶氨基酸突变显著减少了FADS活性，而蛋白C-末端中的突变减少了FK活性(参见美国专利No.5514574)。此外，来自细菌海栖热袍菌的FAD合成酶(GenBank ID AAD35939)的X-线晶体结构揭示了两个结构域的构造，其中N-末端结构域与腺苷酰转移酶在结构上同源，C-末端结构域与黄素结合蛋白在结构上同源(Wanget al.，(2003)Proteins，52：633-635)。
可以通过常规的计算机化同源性检索程序鉴定FADS或FK结构域。例如，可以用同源性研究预测结构域边界，用于设计具有FK活性的蛋白片段或具有FADS活性的片段。公开了许多已知的算法，并且可以使用多种可商购的软件进行检索方法。软件的实例包括MacPattern(EMBL)、BLASTN和BLASTX(NCBIA)。例如，可以使用在Sybase系统上实施BLAST(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)和BLAZE(Brutlag et al.(1993)Comp.Chem.17：203-207)检索算法的软件来鉴定与已知FK结构域或FADS结构域同源的FK结构域或FADS结构域。在一个实例中，可以用NBLAST程序，得分＝100，字长＝12来进行BLAST核苷酸检索，以获得与FADS或FK结构域同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，得分＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白检索，以获得与FADS或FK结构域同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的有空位的比对，可以按照Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中的描述利用Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(如XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
在一个实例中，可以通过与海栖热袍菌FADS结构进行比较，鉴定金黄色葡萄球菌中的FADS结构域(Wang et al.(2003)Proteins52：633-635)。例如，可以用海栖热袍菌的N-末端结构域，即残基Val2-Ser136，预测金黄色葡萄球菌酶的FADS结构域边界。通过比较N-末端结构域和金黄色葡萄球菌酶的序列，预测从氨基酸Met1到大约Ser148的蛋白具有FADS活性，并且预测从金黄色葡萄球菌的氨基酸Ser148到Ile323的蛋白具有FK活性。
然后，可以容易地检测变体或预测的多肽的活性。简言之，可以检测预测具有FADS活性的多肽片段催化从FMN形成FAD的能力，如Efimov et al.(1998)Biochemistry 37：9716-9723中的描述，在此引入其内容作为参考，也可以检测预测具有FK活性的多肽片段催化从核黄素形成FMN的能力，如Efimov et al.(1998)Biochemistry37：9716-9723中的描述，在此引入其内容作为参考。
FAD合成酶蛋白
可以从感兴趣的细菌物种分离本发明的方法中使用的具有FADS活性的FAD合成酶蛋白或片段。分离FAD合成酶的方法是本领域公知的，例如，参见Efimov et al.(1998)Biochemistry 37：9716-9723，在此引入其内容作为参考。或者，可以重组制备FAD合成酶或其功能片段。如果重组制备FADS，可以将FAD合成酶克隆到合适的表达载体中。典型地，重组表达载体包括一个或多个调节序列，所述调节序列是基于用于表达的宿主细胞而选择的。调节序列与要表达的FAD合成酶核酸序列可操作性连接。“可操作性连接”表示FAD合成酶核酸序列与调节序列以允许FAD合成酶核酸序列表达的方式连接(如，在体外转录/翻译系统中，或当载体被导入宿主细胞中时在宿主细胞中)。术语“调节序列”包括启动子、增强子和其它表达控制元件(如聚腺苷酸化信号)。所述调节序列描述于例如Goeddel(1990)MethodsEnzymol.1 85：3-7。
然后可以将表达载体导入感兴趣的宿主细胞。例如，宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，可以在诸如大肠杆菌的细菌细胞、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞中表达具有FADS活性的功能片段。其它合适的宿主细胞是本领域技术人员公知的。可以通过常规转化或转染技术将表达载体导入宿主细胞。此处用到的术语“转化”和“转染”是指多种本领域公知的用于将外来核酸(如DNA)导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以参见Sambrook，et al.(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)和其它实验室手册。
还原的底物
本发明的方法要求给FADS提供还原的黄素底物或给FK活性提供还原的核黄素。
为了提供还原的黄素，可以将还原剂加入氧化的黄素的溶液，以将其转化为其还原形式。还原剂可以是酶系统，例如，氧化还原酶蛋白和烟酰胺底物，如来自细菌哈氏孤菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD(P)H依赖性氧化还原酶(Tu，Antiox.Redox.Signal.，3：881-897，2001)。或者，还原剂可以是化学物质，如连二亚硫酸钠、硼氢化物，例如但不限于硼氢化钠，或例如但不限于钯的催化剂存在下是氢(Ghisla，Methods Enzymol.，66：361-373，1980)。合适的还原性化学物质可以由本领域技术人员容易地鉴定。
可以检测还原剂的效力，测定其产生FADS活性的底物的能力。例如，为了进行所述实验，在25℃下，在测试的还原剂、25mMTris·HCl pH 7.5、ATP、核黄素和FAD合成酶存在下进行反应。温育15分钟后，猝灭反应，进行分析，以便对例如产生的FAD的量进行定量。
测量FAD合成酶或FK活性
通过对体外反应或产物形成(例如ADP，FMN，Ppi或FAD)中底物(例如核黄素、ATP或FMN)更新的量进行定量，可以测量FAD合成酶的酶活性，即FADS或FK活性。所述方法是本领域公知的。例如，通过色谱分离和伴随的对每种单独的黄素的吸光度或荧光检测，可以测量底物消耗和/或生成。此外，通过偶联于需要FMN或FAD进行更新的酶，可以测量FMN和FAD。
简言之，在一个实例中，为了确定FADS活性，可以通过分析正向反应而确定消耗的FMN的量或生成的FAD的量。在该实例中，通过添加FMN而起始FADS反应，从而可以进行体外酶促反应。在猝灭反应后，可以通过阴离子交换高效液相色谱对消耗的FMN或生成的FAD的量进行定量(Entsch et al.(1983)Anal.Biochem.13：401-408，在此引入其内容作为参考)。
或者，可以确定反向反应，其中FADS催化从FAD形成FMN。简言之，在该实例中，通过添加FAD可以起始FADS反应，从而进行体外酶促反应。淬灭反应后，可以通过阴离子交换高效液相色谱对消耗的FAD或生成的FMN的量进行定量(Entsch et al.(1983)Anal.Biochem.13：401-408)。
在另一实例中，可以通过偶联于需要FMN或FAD的酶测量FMN和FAD。FMN偶联酶的一个实例费氏弧菌是荧光素酶(Stanley(1971)Anal.Biochem.39：441-453)。采用费氏弧菌荧光素酶，通过产生的荧光量对荧光素酶活性进行定量。可以通过阴离子交换高效液相色谱对消耗的FAD或生成的FMN的量进行定量FAD偶联酶的一个实例是apo-D-氨基酸氧化酶(Hinkkanen(1983)Anal.Biochem.132：202-208)。可以通过产生的过氧化氢的量对apo-D-氨基酸氧化酶的活性进行定量。
对于FK活性，可以确定消耗的核黄素的量或生成的FMN的量。在该实例中，通过添加核黄素而起始FK反应，从而可以进行体外酶促反应。猝灭反应后，可以通过阴离子交换高效液相色谱对消耗的核黄素或生成的FMN的量进行定量(Entsch et al.(1983)Anal.Biochem.13：401-408)。
或者，底物ATP消耗的测定值或产物ADP和焦磷酸盐的生成量可以用于确定FAD合成酶的酶活性。对于FK反应，可以通过阴离子交换高效液相色谱确定消耗的ATP的量或生成的ADP的量。对于FK反应，可以通过偶联于需要ADP进行更新的酶系统，如丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶(其中通过消耗的NADH的量对乳酸脱氢酶活性进行定量)而确定生成的ADP量(Jaworek et al.(1985)in Methods ofEnzymatic Analysis(Bergmeyer，H.U.，ed)3rd Ed，7：365-369)。对于FADS反应，通过添加焦磷酸酶而产生的焦磷酸盐的量和释放的磷酸盐的检测可以用于确定FADS活性。在一个实例中，通过采用产生比色读数的孔雀绿和钼酸铵，可以对磷酸盐的量进行定量(Lanzetta et al.(1979)Anal.Biochem.100：95-97)。
筛选方法
本发明包括鉴定能够调节细菌黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的化合物的方法。在一个实例中，该方法包括使选自葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌的细菌FAD合成酶或其功能片段与细菌FAD合成酶的还原的底物和测试化合物接触；并且确定细菌FAD合成酶的活性，其中与对照相比，化合物存在下活性的增加或减少表明该化合物调节FAD合成酶活性。可以按照上文的描述确定细菌FAD合成酶的活性。
在另一实例中，本发明包括鉴定能够调节细菌FADS或FK的化合物的方法。该方法可以包括使沙门氏菌的细菌FK或其功能片段与还原的核黄素和测试化合物接触；并且确定细菌FK的活性，其中与对照相比，化合物存在下活性的增加或减少表明该化合物调节FK活性。
用于上述方法中的测试化合物包括诸如肽、肽模拟物、小分子或其它药物的化合物。
上文的例子是为了说明本发明，不应该解释为以任何方式限制本发明。本领域技术人员可以理解，本发明的精神和范围内包括了各种变化形式。
实施例
实施例1：金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌ribF基因的分离
为了克隆ribF，设计了具有位于基因5’末端侧翼的Nde1位点(加下划线的)和位于3’末端侧翼的Sal1或EcoR1位点(加下划线的)的PCR正向和反向引物。按照制造商的描述，用High Fidelity PCR Master聚合酶(Roche，IN)从金黄色葡萄球菌(5’AAACGTGGATCC CATATGAAAGTCATAGAAGTG 3’(SEQ IDNO：1))和(5’AAACGT GAATTCCTAAATATTATAAGCTAC3’(SEQID NO：2))，肺炎链球菌(5’AAACGT CATATGATTATTACTATTCC3’(SEQ ID NO：3))和(5’AAACGT GTCGACTTAAGACCAATTCCGAG3’(SEQ ID NO：4))，以及鼠伤寒沙门氏菌(5’AGCT CATATGAAGCTGATACGCG3’(SEQ ID NO：5))和(5’AGCT GAATTCTTACACCTGCCCGGC3’(SEQ ID NO：6))扩增DNA。
用Nde1和Sal1消化PCR产物，并且连接到用这两种限制酶切割的表达载体中。用连接混合物化学转化TOP10感受态细胞。将细胞铺板到补加了卡那霉素(25ug/ml)的LB板上，在37℃温育过夜。通过DNA测序，检验从不同细菌菌落制备的质粒的正确插入。将正确的质粒转化到大肠杆菌中进行蛋白过量表达，以产生得到金黄色葡萄球菌RibF、肺炎链球菌RibF和鼠伤寒沙门氏菌RibF的菌株。
(1)金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌RibF的纯化
为了纯化金黄色葡萄球菌RibF，37℃下在具有25μg/mL卡那霉素的LB培养基中生长大肠杆菌的细胞，直到OD600为0.5，然后用0.5mM IPTG诱导，在20℃生长4小时。将来自6L该发酵液的细胞重悬于70mL裂解缓冲液：50mM Tris·HCl pH8.0，1mM DTT，10mM EDTA，25mM NaCl。4℃下通过弗氏压碎器以18,000psi将细胞破碎两次，然后4℃下以10,000rpm离心60分钟。将上清液级分加样到20mL Q-Seph FF(Amersham Biosciences)上，用缓冲液A：50mM Tris·HCl pH8.0，1mM DTT，1mM EDTA，25mM NaCl平衡。用6倍柱体积的缓冲液A洗涤柱子，用10倍柱体积的从25mM-350mM NaCl的线性梯度洗脱。合并主要级分，调节到1M硫酸铵。将该级分加样到20mL Ph-Sepharose柱(Amersham Biosciences，NJ)，用缓冲液：50mM Tris·HCl pH 8.0，1mM DTT，1mM EDTA，1M硫酸铵平衡。用从1M-0M硫酸铵的线性梯度洗脱蛋白。合并含有蛋白的级分，在Amicon CentriPrep浓缩器中浓缩，加样到用25mMTris·HCl pH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1mM DTT，1mM EDTA平衡的200mL HiPrep Sephacryl S-200(Amersham Biosciences，NJ)中。等分纯蛋白，在-80℃储存。
采用与上文相同的程序纯化肺炎链球菌RibF。
为了纯化鼠伤寒沙门氏菌RibF，37℃下在含有25μg/mL卡那霉素的LB培养基中生长大肠杆菌细胞，直到OD600为0.5，然后用0.5mM IPTG诱导，在20℃下生长3小时。将来自2L该发酵液的细胞重悬于75mL裂解缓冲液：20mM Tris·HCl pH 8.0，1mM DTT，10mM EDTA，25mM NaCl。4℃下通过弗氏压碎器以18,000psi将细胞破碎两次，然后4℃下以10,000rpm离心30分钟。将上清液级分加样到15mL SP-Seph FF(Amersham Biosciences)上，用缓冲液A：50mM Tris·HCl pH 8.0，1mM DTT，1mM EDTA，25mM NaCl平衡。用3倍柱体积的缓冲液A洗涤柱子，用20倍柱体积的从25mM-500mM NaCl的线性梯度洗脱。合并含蛋白的级分，合并含有蛋白的级分，在Amicon CentriPrep浓缩器中浓缩，加样到用25mM Tris·HClpH 8.0，150mM NaCl，10％甘油，1mM DTT，1mM EDTA平衡的200mL HiPrep Sephacryl S-200(Amersham Biosciences，NJ)中。等分纯蛋白，在-80℃储存。
实施例2：金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和鼠伤寒沙门氏菌RibF蛋白的酶测定
为了测定金黄色葡萄球菌RibF，进行了体外时程实验，并且通过高效液相色谱进行分析。在100μL的50mM磷酸钠pH 7.0，0.002％Brij-35，1mM氯化镁和0.5mM ATP中进行反应。在指出的时间，以200nM的终浓度加入金黄色葡萄球菌RibF，其来自按照上文制备的60μM的储液。在指出的时间，以1mM的终浓度加入连二亚硫酸钠(Aldrich，WI)，其来自在氮气吹扫的水中制备的10mM的储液。在指出的时间，以0.050mM加入核黄素，其来自在水中制备的0.10mM的储液。在指出的时间，以0.050mM加入FMN，其来自在水中制备的0.10mM的储液。25℃下温育反应，在各个时间用100μL 20mMEDTA pH 8.0猝灭反应。通过高效液相色谱(HPLC)分析样品，这是通过将25μL注射到用磷酸钠pH 2.8平衡的季胺阴离子交换柱402.IC×250mm(Vydac，CA)上而实现的。通过荧光检测(442nm激发波长，520发射)以及保留时间和面积的比较鉴定各个峰。
条件 μM核黄素     μMFMN     μMFAD
  无酶+核黄素 86     0     0
  金黄色葡萄球菌RibF+核黄素 50     22     0
  金黄色葡萄球菌RibF+连二亚硫酸钠+核黄素 1 41 28
  金黄色葡萄球菌RibF+FMN 0     44     0
  金黄色葡萄球菌RibF+连二亚硫酸钠+FMN 0 11 28
                      表1
表1的数据显示了在缺乏连二亚硫酸钠的条件下，金黄色葡萄球菌RibF表现了可检测和可测量的FK活性，但没有表现可检测和可测量的FADS活性。在存在连二亚硫酸钠的条件下，金黄色葡萄球菌RibF表现了可检测和可测量的FK和FADS活性。
为了测定肺炎链球菌RibF，按照上文所述进行了体外时程实验，并且通过高效液相色谱进行分析，不同的是在指出的时间，以200nM的终浓度加入肺炎链球菌RibF，其来自按照上文制备的6.0μM的储液。45分钟时间点的数据示于表2。
条件  μM核黄素     μMFMN     μMFAD
无酶+核黄素  77     0     0
肺炎链球菌RibF+核黄素  17     53     0
肺炎链球菌RibF+连二亚硫酸钠+核黄素 27 25 16
肺炎链球菌RibF+FMN  0     42     0
肺炎链球菌RibF+连二亚硫酸钠+FMN 0 13 26
                  表2
表2的数据显示了在缺乏连二亚硫酸钠的条件下，肺炎链球菌RibF表现了可检测和可测量的FK活性，但没有表现可检测和可测量的FADS活性。在存在连二亚硫酸钠的条件下，肺炎链球菌RibF表现了可检测和可测量的FK和FADS活性。
为了测定鼠伤寒沙门氏菌RibF，按照上文所述进行了体外时程实验，并且通过高效液相色谱进行分析，不同的是在指出的时间，以1.3μM的终浓度加入鼠伤寒沙门氏菌RibF，其来自按照上文制备的26μM的储液。10分钟时间点的数据示于表3。
条件  μM核黄素   μMFMN     μMFAD
  无ATP+核黄素  36   0     0
  鼠伤寒沙门氏菌RibF+核黄素  36   0     0
  鼠伤寒沙门氏菌RibF+连二亚硫酸钠+核黄素 1 13 25
                       表3
表3的数据显示了在缺乏连二亚硫酸钠的条件下，鼠伤寒沙门氏菌RibF没有表现可检测和可测量的FK活性，也没有表现可检测和可测量的FADS活性。在存在连二亚硫酸钠的条件下，鼠伤寒沙门氏菌RibF表现了可检测和可测量的FK和FADS活性。
实施例3：制备金黄色葡萄球菌RibF的功能片段
通过与海栖热袍菌结构比较，设计金黄色葡萄球菌黄素激酶结构域蛋白。在Lys146和Ile147之间选择结构域边界。由于预测C-末端黄素激酶结构域蛋白开始于α-螺旋结构域基序，改变了构建体设计，引入两个突变，即T150D和S151E，预测它们提供N-末端α-螺旋的稳定性(Seale et al.，(1994)Prot.Sci.3：1741-1745)。
用与上文对全长金黄色葡萄球菌蛋白描述的方法相似的标准分子生物学技术制备含有编码金黄色葡萄球菌FK结构域的DNA的质粒。在大肠杆菌中过量表达后，用与上文对全长金黄色葡萄球菌蛋白描述的方法相似的标准蛋白纯化技术纯化蛋白。
通过用上文对全长金黄色葡萄球菌FAD合成酶描述的HPLC测定检测FMN形成，测定蛋白的FK结构域。在100μL的50mM HEPESpH 7.5，0.002％Brij-35，10mM氯化镁，5.0mM ATP，20μM核黄素和50nM酶中进行反应。与全长金黄色葡萄球菌FAD合成酶相比，用FK结构域蛋白观察到了FK活性的相似比率(表4)。
  蛋白   FK活性，min-1
  金黄色葡萄球菌FK结构域   1.6
  金黄色葡萄球菌全长RibF   1.7
                  表4
实施例4：鉴定调节RibF活性的化合物
在递增量的化合物A存在下进行金黄色葡萄球菌RibF的测定，以测量化合物的抑制量。起始与核黄素的反应，检测焦磷酸盐产物，从而同时测定FK和FADS活性。室温下在含有100μL的50mM HEPES pH7.5，0.002％Brij-35，1mM乙二胺四乙酸，0.1mg/mL焦磷酸酶，2％二甲亚砜，2mM氯化镁，100μM ATP，10μM核黄素，10mM连二亚硫酸钠，80nM金黄色葡萄球菌RibF和浓度从0.78-400μM的化合物A的96孔微量滴定板中进行反应。20分钟后，用10μL 200mM的乙二胺四乙酸猝灭反应。2小时后，加入150μL磷酸孔雀绿检测试剂(Lanzetta et al.(1979)Anal.Biochem.100：95-97)。通过与不含化合物A的反应(无抑制)和与20mM乙二胺四乙酸的反应(完全抑制)进行比较，计算抑制百分比。如图3所示，化合物A显示出剂量依赖性抑制，产生50％抑制的浓度(IC50)是29μM。
                            序列表
<110>Astrazeneca AB
<120>测定FAD合成酶的方法
<130>101371 US
<150>US 60/600,667
<151>2004-08-10
<160>9
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>33
<212>DNA
<213>肺炎链球菌
<400>1
aaacgtggat cccatatgaa agtcatagaa gtg                                 33
<210>2
<211>30
<212>DNA
<213>肺炎链球菌
<400>2
aaacgtgaat tcctaaatat tataagctac                                     30
<210>3
<211>26
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌
<400>3
aaacgtcata tgattattac tattcc                                         26
<210>4
<211>29
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌
<400>4
aaacgtgtcg acttaagacc aattccgag                                      29
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌
<400>5
agctcatatg aagctgatac gcg                                            23
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>金黄色葡萄球菌
<400>6
agctgaattc ttacacctgc ccggc                                          25
<210>7
<211>323
<212>PRT
<213>金黄色葡萄球菌
<400>7
Met Lys Val Ile Glu Val Thr His Pro Ile Gln Ser Lys Gln Tyr Ile
1               5                   10                  15
Thr Glu Asp Val Ala Met Ala Phe Gly Phe Phe Asp Gly Met His Lys
            20                  25                  30
Gly His Asp Lys Val Phe Asp Ile Leu Asn Glu Ile Ala Glu Ala Arg
        35                  40                  45
Ser Leu Lys Lys Ala Val Met Thr Phe Asp Pro His Pro Ser Val Val
    50                  55                  60
Leu Asn Pro Lys Arg Lys Arg Thr Thr Tyr Leu Thr Pro Leu Ser Asp
65                  70                  75                  80
Lys Ile Glu Lys Ile Ser Gln His Asp Ile Asp Tyr Cys Ile Val Val
                85                  90                  95
Asn Phe Ser Ser Arg Phe Ala Asn Val Ser Val Glu Asp Phe Val Glu
            100                 105                 110
Asn Tyr Ile Ile Lys Asn Asn Val Lys Glu Val Ile Ala Gly Phe Asp
        115                 120                 125
Phe Thr Phe Gly Lys Phe Gly Lys Gly Asn Met Thr Val Leu Gln Glu
    130                 135                 140
Tyr Asp Ala Phe Asn Thr Thr Ile Val Ser Lys Gln Glu Ile Glu Asn
145                 150                 155                 160
Glu Lys Ile Ser Thr Thr Ser Ile Arg Gln Asp Leu Ile Asn Gly Glu
                165                 170                 175
Leu Gln Lys Ala Asn Asp Ala Leu Gly Tyr Ile Tyr Ser Ile Lys Gly
            180                 185                 190
Thr Val Val Gln Gly Glu Lys Arg Gly Arg Thr Ile Gly Phe Pro Thr
        195                 200                 205
Ala Asn Ile Gln Pro Ser Asp Asp Tyr Leu Leu Pro Arg Lys Gly Val
    210                 215                 220
Tyr Ala Val Ser Ile Glu Ile Gly Thr Glu Asn Lys Leu Tyr Arg Gly
225                 230                 235                 240
Val Ala Asn Ile Gly Val Lys Pro Thr Phe His Asp Pro Asn Lys Ala
                245                 250                 255
Glu Val Val Ile Glu Val Asn Ile Phe Asp Phe Glu Asp Asn Ile Tyr
            260                 265                 270
Gly Glu Arg Val Thr Val Asn Trp His His Phe Leu Arg Pro Glu Ile
        275                 280                 285
Lys Phe Asp Gly Ile Asp Pro Leu Val Lys Gln Met Ash Asp Asp Lys
    290                 295                 300
Ser Arg Ala Lys Tyr Leu Leu Ala Val Asp Phe Gly Asp Glu Val Ala
305                 310                 315                 320
Tyr Asn Ile
<210>8
<211>305
<212>PRT
<213>肺炎链球菌
<400>8
Met Ile Ile Thr Ile Pro Ile Lys Asn Gln Lys Asp Ile Gly Thr Pro
I               5                   10                  15
Ser Asp Ser Val Val Val Leu Gly Tyr Phe Asp Gly Ile His Lys Gly
            20                  25                  30
His Gln Glu Leu Phe Arg Val Ala Asn Lys Ala Ala Arg Lys Asp Leu
        35                  40                  45
Leu Pro Ile Val Val Met Thr Phe Asn Glu Ser Pro Lys Ile Ala Leu
    50                  55                  60
Glu Pro Tyr His Pro Asp Leu Phe Leu His Ile Leu Asn Pro Ala Glu
65                  70                  75                  80
Arg Glu Arg Lys Leu Lys Arg Glu Gly Val Glu Glu Leu Tyr Leu Leu
                85                  90                  95
Asp Phe Ser Ser Gln Phe Ala Ser Leu Thr Ala Gln Glu Phe Phe Ala
            100                 105                 110
Thr Tyr Ile Lys Ala Met Asn Ala Lys Ile Ile Val Ala Gly Phe Asp
        115                 120                 125
Tyr Thr Phe Gly Ser Asp Lys Lys Thr Ala Glu Asp Leu Lys Asp Tyr
    130                 135                 140
Phe Asp Gly Glu Val Ile Ile Val Pro Pro Val Glu Asp Glu Lys Gly
145                 150                 155                 160
Lys Ile Ser Ser Thr Arg Ile Arg Gln Ala Ile Leu Asp Gly Asn Val
                165                 170                 175
Lys Glu Ala Gly Lys Leu Leu Gly Ala Pro Leu Pro Ser Arg Gly Met
            180                 185                 190
Val Val His Gly Asn Ala Arg Gly Arg Thr Ile Gly Tyr Pro Thr Ala
        195                 200                 205
Asn Leu Val Leu Leu Asp Arg Thr Tyr Met Pro Ala Asp Gly Val Tyr
    210                 215                 220
Val Val Asp Val Glu Ile Gln Arg Gln Lys Tyr Arg Ala Met Ala Ser
225                 230                 235                 240
Val Gly Lys Asn Val Thr Phe Asp Gly Glu Glu Ala Arg Phe Glu Val
                245                 250                 255
Asn Ile Phe Asp Phe Asn Gln Asp Ile Tyr Gly Glu Thr Val Met Val
            260                 265                 270
Tyr Trp Leu Asp Arg Ile Arg Asp Met Thr Lys Phe Asp Ser Val Asp
        275                 280                 285
Gln Leu Val Asp Gln Leu Lys Ala Asp Glu Glu Val Thr Arg Asn Trp
    290                 295                 300
Ser
305
<210>9
<211>312
<212>PRT
<213>鼠伤寒沙门氏菌
<400>9
Met Lys Leu Ile Arg Gly Ile His Asn Leu Ser Gln Ala Pro His Gly
1               5                   10                  15
Cys Val Leu Thr Ile Gly Asn Phe Asp Gly Val His Arg Gly His Arg
            20                  25                  30
Ala Leu Leu Gln Gly Leu Gln Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Leu Pro
        35                  40                  45
Val Val Val Met Ile Phe Glu Pro Gln Pro Leu Glu Leu Phe Ala Thr
    50                  55                  60
Asp Lys Ala Pro Ala Arg Leu Thr Arg Leu Arg Glu Lys Leu His Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Ala Gln Cys Gly Val Asp Tyr Val Leu Cys Val Lys Phe Asp Arg
                85                  90                  95
Arg Phe Ala Ala Leu Thr Ala Gln Thr Phe Ile Ser Glu Leu Leu Val
            100                 105                 110
Glu Arg Leu Gly Val Gln Phe Leu Ala Val Gly Asp Asp Phe Arg Phe
        115                 120                 125
Gly Ala Ser Arg Ala Gly Asp Phe Leu Leu Leu Gln Lys Ala Gly Ala
    130                 135                 140
Glu Tyr Gly Phe Ala Val Ser Ser Thr Gln Thr Phe Cys Glu Gly Gly
145                 150                 155                 160
Val Arg Ile Ser Ser Thr Ala Val Arg Gln Ala Leu Ala Glu Asp Asn
                165                 170                 175
Leu Ala Leu Ala Glu Ser Leu Leu Gly His Pro Phe Thr Ile Ser Gly
            180                 185                 190
Arg Val Val His Gly Asp Glu Leu Gly Arg Thr Ile Gly Phe Pro Thr
        195                 200                 205
Ala Asn Leu Pro Leu Arg Arg Gln Val Ser Pro Val Lys Gly Val Tyr
    210                 215                 220
Ala Val Glu Val Thr Gly Leu Gly Asp Lys Pro Leu Pro Gly Val Ala
225                 230                 235                 240
Asn Ile Gly Thr Arg Pro Thr Val Ala Gly Val Arg Gln Gln Leu Glu
                245                 250                 255
Val His Leu Leu Asp Val Val Met Asp Leu Tyr Gly Arg His Ile Asp
            260                 265                 270
Val Ile Leu Arg Lys Lys Ile Arg Asn Glu Gln Arg Phe Ala Ser Leu
        275                 280                 285
Asp Glu Leu Lys Ala Gln Ile Ala Arg Asp Glu Leu Thr Ala Arg Lys
    290                 295                 300
Phe Phe Gly Leu Ala Gly Gln Val
305                 310

Claims (14)

1.确定细菌黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的方法，该方法包括：
使选自葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌的细菌FAD合成酶或其功能片段与细菌FAD合成酶的还原的底物接触；并且
确定细菌FAD合成酶的活性。
2.权利要求1的方法，其中所述葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。
3.权利要求1的方法，其中所述链球菌是肺炎链球菌。
4.权利要求1的方法，其中所述沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。
5.权利要求1的方法，其中所述还原的底物是FMN或FAD。
6.确定细菌黄素激酶(FK)活性的方法，该方法包括：
使沙门氏菌的细菌FK或其功能片段与还原的核黄素接触；并且
确定细菌FK的活性。
7.权利要求6的方法，其中所述沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。
8.鉴定能够调节细菌黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成酶活性的化合物的方法，该方法包括：
使选自葡萄球菌、链球菌、沙门氏菌的细菌FAD合成酶或其功能片段与细菌FAD合成酶的还原的底物和测试化合物接触；并且
确定细菌FAD合成酶的活性，其中与对照相比，化合物存在下活性的增加或减少表明该化合物调节FAD合成酶活性。
9.权利要求8的方法，其中所述葡萄球菌是金黄色葡萄球菌。
10.权利要求8的方法，其中所述链球菌是肺炎链球菌。
11.权利要求8的方法，其中所述沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。
12.权利要求8的方法，其中所述还原的底物是FMN或FAD。
13.鉴定能够调节细菌黄素激酶的化合物的方法，该方法包括：
使沙门氏菌的细菌FK或其功能片段与还原的核黄素和测试化合物接触；并且
确定细菌FK的活性，其中与对照相比，化合物存在下活性的增加或减少表明该化合物调节FK活性。
14.权利要求13的方法，其中所述沙门氏菌是鼠伤寒沙门氏菌。
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