CN1191370C - Atp再生反应系统、利用该系统的腺苷酸的检验方法、rna检测方法和atp放大方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供在微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使其转换为ADP，然后在多磷酸化合物存在下，将多磷酸合成酶作用于ADP，使其转换为ATP和多磷酸化合物的ATP再生反应系统；在多磷酸化合物存在下，将磷酸基转移酶作用于AMP，使其转换为ADP，再将多磷酸合成酶作用于ADP，使其转换为ATP的ATP再生反应系统，以及利用该再生反应系统的腺苷酸或RNA的检验方法；ATP放大方法。

Description

ATP再生反应系统、利用该系统的腺苷酸的检验方法、 RNA检测方法和ATP放大方法

                       技术领域

本发明涉及ATP再生反应系统，以及利用该系统的腺苷酸的检验方法、RNA检测方法以及ATP放大方法

更详细地讲，本发明涉及在动植物的代谢和生物合成系统中生成的ATP、ADP、AMP或它们的混合物等所谓的腺苷酸的检验方法，本发明可应用于例如通过生物发光来测定ATP(腺苷三磷酸)，在食品加工厂等中通过检测肉眼看不见的微生物来检验清洁度，以及测定食用肉、鲜鱼、蔬菜等食物的鲜度。

本发明还涉及用于检测核糖核酸(RNA)的，特别是用于检测存在于高等生物细胞中的与蛋白质合成有重要关系的信使核糖核酸(mRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、转运核糖核酸(tRNA)的方法。

另外，本发明还涉及能使动植物的代谢和生物合成系统中生成的ATP量级联放大的方法，通过利用该方法检测生物发光，可以检测出以往不能检测的极微量的ATP，所以可应用于在食品加工厂等中通过检测肉眼看不见的微生物来检验清洁度，以及测定食用肉、鲜鱼、蔬菜等食物的鲜度。

                        背景技术

ATP(腺苷三磷酸)是活生物的指标。因此，通过将来自微生物的ATP用于生物发光，可进行以光作为指标的微生物的卫生检验(例如特公平6-34757号公报、特许第1911659号)。然而，对于微量微生物，由ATP产生的生物发光不足以进行上述检验。

例如，将作为催化剂的酶(例如来自发光昆虫的荧光素酶)作用于微生物污染的指标成分ATP时，已知可以产生荧光发光。然而，在上述荧光发光的测定中，存在着发光的稳定性差、发出的光在非常短的时间内就消失的缺点。因此为了获得灵敏度和精度，需要对反应时间进行严密控制，以及为了捕获短时间内就会消失的发光，需要特别的光度计等。

特开平8-47399号公报中公开了特征为“在测定荧光素酶作用下产生的生物发光的方法中，在共存多磷酸化合物或其盐、以及巯基化合物的条件下进行生物发光反应”的技术。利用该技术，可获得生物发光的稳定性等新型效果，进而有可能通过使用常规光度计进行生物发光的测定，并具有提高普及率的效果。上述特开平8-47399号公报中使用的多磷酸化合物是三多磷酸、焦磷酸等三磷酸、二磷酸或它们的盐。

然而，上述特开平8-47399号公报公开的方法由于没有ATP新的再生系统，所以存在着随着ATP的消耗，发光随时间推移而衰减的缺点。因此，为了使发光量不衰减并持续稳定，人们不得不进行底物浓度、氧浓度、pH、温度的研究。

另一方面，特开平9-234099号公报中公开了通过生物发光法对环AMP进行定量的方法。

该方法的特征在于，包括用3’5’-环核苷酸磷酸二酯酶对环AMP进行水解，进而在反应体系中生成AMP的“反应1”；在镁离子、微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于该AMP，使AMP转换为ADP的“反应2”；在镁离子、磷酸烯醇式丙酮酸存在下，将丙酮酸激酶作用于该ADP，使ADP转换为ATP和丙酮酸的“反应3”；在荧光素、镁离子(或其它金属离子)以及溶解氧的存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而产生发光的“反应4”；通过测定“反应4”中产生的发光量，对环AMP进行定量的方法(Methods in Enzymology 38，62-65；1974)。

然而，该方法由于将由环AMP转换的AMP转换为ADP后，在磷酸烯醇式丙酮酸存在下，再将丙酮酸激酶作用于该ADP并最终生成ATP，所以存在以下问题。即，一分子的磷酸烯醇式丙酮酸中只含有一个磷酸基(-PO₃ ^--)，因此由ADP向ATP的转换不充分，为了大量再生ATP，必须大量补充磷酸烯醇式丙酮酸，所以不经济。

另外，磷酸烯醇式丙酮酸具有非常不耐热且容易分解的性质，将餐饮场所等刚煮熟的食物作为被检验物时，将含有磷酸烯醇式丙酮酸的试剂加到被检验物中的话，磷酸烯醇式丙酮酸就会分解，进而有可能导致由ADP向ATP的转换不充分(对于产品温度处于60～70℃左右的被检验物，可以使用耐热性酶进行测定)。就是说，有可能导致由ATP产生的荧光发光稳定性差且发光在非常短时间内消失的问题。

另外，被检验物中一般都存在着数种细菌，如果在该细菌中存在分解磷酸烯醇式丙酮酸的酶，就有可能导致无法补充磷酸，以及由ADP向ATP的转换不充分的问题。

在特公昭53-5752号公报和再公表特许WO98/48031中，公开了利用ATP的再生反应系统便宜地制备ATP的方法。特公昭53-5752号公报所述的方法的特征在于，将多磷酸合成酶以及腺苷酸激酶作用于AMP、ADP和多磷酸化合物。该方法是将多磷酸合成酶作用于1分子ADP和多磷酸化合物进而生成1分子ATP，然后将腺苷酸激酶作用于该1分子ATP和1分子AMP进而生成2分子ADP，再将多磷酸合成酶作用于该2分子ADP进而生成2分子ATP。由于该方法的目的是由AMP大量合成ATP，所以考虑到含有很多作为杂质的ADP，不能应用于通过检测微量存在的ATP来检验清洁度以及测定食物的鲜度。

再公表特许WO98/48031所述的方法的特征在于，将多磷酸合成酶以及腺苷酸激酶作用于AMP和多磷酸化合物。利用该方法，在使用ATP的酶反应体系中，不用添加高价的ATP，而是由便宜的AMP制备ATP，或可使消耗的ATP有效地再生。然而该ATP的制备方法即使在反应当初不存在ATP时，也能由便宜的AMP制备ATP，因此该方法不能应用于通过检测微量存在的ATP来检验清洁度或测定食物的鲜度。

目前，已知存在于高等生物细胞中并参与蛋白质合成的核糖核酸(RNA)起着将来自DNA的遗传信息传递给其它细胞的介导作用(广海启太郎著《在实验中学习生物化学》，p205，化学同人，1987.7.10)。已明确在细胞质内合成的蛋白质是由核DNA的碱基序列次序决定的。遗传密码，即，已知为编码三联体(三联子密码)的3个不重复的碱基组合规定了各个氨基酸。并且，遗传信息通过称为信使(邮差)RNA(mRNA)的中介分子，从核传递到核糖体上的蛋白质合成系统。该分子携有与核DNA互补的碱基序列，与编码三联体对应的mRNA上的3个碱基的组合已知为密码子，DNA首先在第1阶段起着合成mRNA的“模板”的作用。

上述mRNA被转运到核糖体，借助于tRNA的帮助，合成特定的蛋白质。对于这样的RNA在知道其组成后，可广泛地应用于与人们健康有关的领域(例如，疾病的诊断或治疗药的开发)以及检测食品中细菌污染的领域(清洁度检验)等，并且，最近在代谢和生物合成的领域也引起了人们的注目。

检测RNA组成的技术众所周知，例如，通过离心分离从酵母中分离RNA，然后用紫外分光光度计(色谱)测定吸收光谱的方法，以及在水解RNA后，通过电泳分离测定核苷酸的吸收光谱的方法等已广为人知。

特公平8-2320号公报中公开了测定样品中具有3’-末端多聚核糖腺苷酸片段的多核苷酸的方法。该方法包括以下步骤。(a)在无机磷酸存在下，用多核苷酸磷酸酶对样品中的核酸进行消化，然后将3’-末端多聚核糖腺苷酸片段转化为含有ADP的多聚核糖核苷二磷酸的步骤；(b)消化步骤(a)生成的ADP经磷酸化后，制备ATP的步骤；以及(c)检测磷酸化步骤(b)中生成的ATP或磷酸化步骤的副产物的步骤。具有3’-末端多聚核糖腺苷酸的多核苷酸是真核生物mRNA时，检测ATP的步骤中，在荧光素酶的存在下与荧光素反应，进而产生生物发光反应并检测ATP量的技术也已经公开。

通过上述方法，可以通过ATP产生的生物发光来检测真核生物mRNA的组成。另外，通过将mRNA消化为AMP或ADP，以及由ADP向ATP的磷酸化，可以定量各成分。

如上所述，通过依赖于ATP的酶反应中的生物发光来检测真核生物的mRNA组成的技术虽然在特公平8-2320号公报中已经公开，但其中所述的生物发光的测定就象前面提到的那样，存在着发光的稳定性差且发光在非常短时间内消失的缺点，以及存在着为了获得灵敏度和精度，需要对反应时间进行严密控制，以及为了捕获短时间内消失的发光，需要使用特别的光度计的问题。

特开平11-69997号公报中描述了除作为污染指标成分的ATP以外，还可以同时测定用以往的荧光素和荧光素酶发光试剂难以测定的ADP、AMP以及RNA，并且即使有少量污染也可以高灵敏度地进行检测，并可精确地进行清洁度评价的清洁度检验试剂和使用该试剂的清洁度检验方法。利用该方法测定RNA时，通过RNA分解酶由RNA生成5’-单核苷酸(AMP、GMP、CMP和UMP)，将生成的单核苷酸中的AMP转换为ATP，然后在荧光素存在下将荧光素酶作用于该ATP，并通过测定发光量来测定RNA。在该反应体系中，在最终步骤中由于生成AMP和焦磷酸，而它们又可再生成ATP，所以在一系列的ATP转换反应体系中生成的发光没有衰减，仍维持高水平，至少能稳定10分钟。该ATP再生系统是将丙酮酸正磷酸二激酶作用于AMP、焦磷酸以及磷酸烯醇式丙酮酸的系统。然而，就象上面提到的那样，1分子磷酸烯醇式丙酮酸只含有一个磷酸基，使得由AMP向ATP的转换不充分，因此为了大量再生ATP，必须大量补充磷酸烯醇式丙酮酸，所以不经济。另外，由于磷酸烯醇式丙酮酸具有非常不耐热且容易分解的性质，所以在添加到高温的被检验物中时容易被分解，进而有可能导致由AMP向ATP的转换不充分，ATP产生的荧光发光稳定性差且发光在非常短的时间内消失的问题。

                   发明的公开

本发明的第一个目的在于，提供新型的ATP再生系统。

本发明的第二个目的在于，提供腺苷酸的检验方法。

本发明的第三个目的在于，提供RNA的检测方法。

本发明的第四个目的在于，提供ATP的放大方法。

本发明提供如下所示的ATP再生反应系统，以及利用该系统的腺苷酸检验方法，RNA的检测方法以及ATP的放大方法。

(1)ATP再生反应系统，其特征在于，在微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使AMP转换为2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是该多磷酸化合物中存在的磷酸基数)存在下，将多磷酸合成酶作用于该2分子ADP，使其转换为2分子的ATP和1分子的多磷酸化合物(n-2)。

(2)ATP再生反应系统，其特征在于，在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)的存在下，将磷酸基转移酶作用于AMP，使其转换为ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在该多磷酸化合物(n-1)的存在下，将多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其转换为ATP和多磷酸化合物(n-2)。

(3)依赖于生物发光的腺苷酸的检验方法，该方法是在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而生成AMP并发光，通过测定生成的发光量对腺苷酸进行检验的方法；

其特征在于，具备在微量的ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使其转换为2分子的ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将多磷酸合成酶作用于该2分子ADP，使其转换为2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反应系统，该ATP再生反应系统的特征在于，微量ATP为来自污染的ATP。

(4)依赖于生物发光的腺苷酸的检验方法，该方法是在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而生成AMP并发光，通过测定生成的发光量对腺苷酸进行检验的方法；

其特征在于，具备在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将磷酸基转移酶作用于AMP，使其转换为ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在该多磷酸化合物(n-1)存在下，将多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其转换为ATP和多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反应系统。

(5)依赖于生物发光检测RNA的方法，该方法是通过RNA分解酶对样品中的RNA进行分解，进而得到单核苷酸，将该单核苷酸中的AMP转换为ATP，并在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于该ATP，测定生成的发光量对RNA中的AMP进行定量的方法；

其特征在于，具备在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将磷酸基转移酶作用于AMP，使其转换ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在该多磷酸化合物(n-1)存在下，将多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其转换为ATP和多磷酸化合物(n-2)的ATP再生反应系统。

(6)级联放大ATP的方法，其特征在于，反复进行在微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使其转换为2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将多磷酸合成酶作用于该2分子ADP，使其转换为2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的步骤。

(7)腺苷酸的检验方法，该方法是在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而生成AMP并发光，然后通过测定生成的发光量对腺苷酸进行检验的方法；

其特征在于，反复进行在被检验物中含有的ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使其转换为2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将多磷酸合成酶作用于该2分子ADP，使其转换为2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的步骤，将ATP级联放大后，在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于放大的ATP，进而生成AMP并发光。

                    附图的简单说明

图1是在本发明的第1个ATP再生反应系统中ATP浓度为1.65μM时，本发明和以往系统之间的相对发光量随时间的变化图。

图2是在本发明的第2个ATP再生反应系统中，研究ATP浓度随时间变化的图。

图3是在腺苷酸的测定中用或不用本发明的第2个ATP再生反应系统时，相对发光量随时间的变化图。

图4是用本发明的第2个ATP再生反应系统，并通过生物发光检测RNA的结果图。

图5是用纯化的多磷酸合成酶(PPK[1])(图6(a))以及除去ADP的多磷酸合成酶(PPK[2])(图6(b)，研究添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)时发光随时间变化的图。

图6是在改变多磷酸、AMP浓度的ATP再生系统中，研究添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)时发光随时间变化的图。(a)中多磷酸为900μM、AMP为600μM，(b)中多磷酸为900μM、AMP为60μM，(c)中多磷酸为90μM，AMP为600μM。

图7是通过本发明的ATP级联放大反应生成的ATP浓度随时间的变化图。

                实施发明的最好的模式

首先，就本发明的第一个ATP再生反应系统进行说明。

本发明的第一个ATP再生反应系统的特征在于，在微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使AMP转换为2分子ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将多磷酸合成酶作用于该2分子ADP，使其转换为2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)。

本发明中使用的多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)，优选n为10～1000。作为这种多磷酸化合物的例子，例如化学合成的10～100个磷酸基聚合成直链状的多磷酸。使用这种多磷酸化合物，由ADP可很容易地转换为ATP，且再生ATP时只需补充少量多磷酸，所以经济。另外，这种多磷酸化合物由于磷酸基聚合成直链状，所以具有耐热性，即使添加到产品温度为60～70℃左右的被检验物中也不容易分解，使得稳定测定成为可能。另外，由于磷酸基直链状聚合，所以细菌中存在酶时也难于分解。

本发明中使用的多磷酸化合物可以是来自细菌的多磷酸化合物。作为这种多磷酸化合物(n)的例子，例如n为10～1000的多磷酸化合物。这种多磷酸化合物由于10～1000个磷酸基直链状聚合，所以具有优良的耐热性和抗菌性。

作为本发明中使用的多磷酸化合物的其它例子，例如将多磷酸合成酶作用于ATP而生物合成的产物。通过提高多磷酸化合物的收率，可以使多磷酸化合物的造价降低。

上述多磷酸化合物的生物合成，例如可以利用特开平5-153993号公报等公开的以往的多磷酸化合物的制备方法。使用该方法，在以抑制酶失活为目的的镁等金属离子存在下，将多磷酸合成酶作用于ATP和多磷酸化合物(n)，进而生物合成多磷酸化合物(n+1)。

本发明中使用的多磷酸合成酶具有作用于多磷酸和ADP进而合成ATP，并且不存在ADP、但ATP过剩时，可作用于ATP进而合成多磷酸和ADP的性质。

本发明的第一个ATP再生反应系统是必须要有微量ATP存在的反应系统，并且，由于含有将ADP转换为ATP的步骤，所以使用的多磷酸合成酶优选不含杂质、特别是不要含有ATP和ADP。通常可购得的微生物多磷酸合成酶中由于含有ATP和ADP，所以优选使用对其进行纯化处理，尽可能地降低ATP和ADP浓度的酶。特别是将本发明的第一个ATP再生反应系统应用于本发明的依赖于生物发光的腺苷酸检验方法中时，使用的多磷酸合成酶中ATP或ADP的浓度越高，该检验方法的精度就越低。因此，其中的ATP浓度优选在10pM以下，更有选在1pM以下，最优选完全不含ATP，ADP浓度优选在10pM以下，更有选在1pM以下，最优选完全不含ADP。

通常，4分子多磷酸合成酶结合1分子ADP，这成了ADP混入的主要原因。因此，最好使用将多磷酸合成酶(10～100μg/ml)与0.1mM多磷酸化合物混合后，于37℃保温10分钟，进而将ADP转换为ATP并除去ADP后，混合下述生物发光试剂盒，一直纯化到检测不出ATP为止的多磷酸化合物。

同样，腺苷酸激酶也优选使用经纯化处理，尽可能使ATP和ADP浓度降低的腺苷酸激酶。进而，其中的ATP浓度优选在10pM以下，更优选在1pM以下，最优选完全不含ATP，ADP浓度优选在10pM以下，更优选在1pM以下，最优选完全不含ADP。

本发明的第一个ATP再生反应系统的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。第一个ATP再生反应系统的腺苷酸激酶的浓度为1000～30000单位(一个单位是在37℃、1分钟内生成1pmol的ADP所需的酶活性)、多磷酸化合物(n)的浓度为100～1000μM、多磷酸合成酶的浓度为100～10000单位(一个单位是在37℃、1分钟内生成1pmol的ATP所需的酶活性)。

以下，就本发明的第二个ATP再生反应系统进行说明。

本发明的第二个ATP再生反应系统的特征在于，在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)的存在下，将磷酸基转移酶作用于AMP，使其转换为ADP和多磷酸化合物(n-1)，然后在该多磷酸化合物(n-1)的存在下，将多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其转换为ATP和多磷酸化合物(n-2)。

在第二个ATP再生反应系统中使用的多磷酸化合物(n)与在本发明的第一个ATP再生反应系统中使用的多磷酸化合物(n)相同。

本发明的第二个ATP再生反应系统中使用的磷酸基转移酶以及多磷酸合成酶也优选使用经纯化处理，使ATP和ADP浓度尽可能降低的酶。因此，磷酸基转移酶的ATP浓度优选在10pM以下，更优选在1pM以下，最优选完全不含ATP，而ADP浓度优选在10pM以下，更优选在1pM以下，最优选完全不含ADP。多磷酸合成酶的ATP浓度以及ADP浓度和上述相同。

本发明的第二个ATP再生反应系统的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。第二个ATP再生反应系统的多磷酸化合物(n)的浓度为100～1000μM，AMP的浓度为10～1000μM，磷酸基转移酶的浓度为100～10000单位(一个单位是在37℃、1分钟内生成1pmol的ADP所需的酶活性)，多磷酸合成酶的浓度为100～10000单位(一个单位是在37℃、1分钟内生成1pmol的ATP所需的酶活性)比较合适。

以下，就本发明的腺苷酸的第一个检验方法进行说明。

本发明的腺苷酸的第一个检验方法是在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而生成AMP并发光，通过测定生成的发光量对腺苷酸进行检验的方法；其特征在于，具备本发明的第一个ATP再生反应系统。

以下反应过程给出了本发明的腺苷酸第一个检验方法。

(1)通过荧光素酶进行的发光反应：

第一个ATP再生反应系统

(2)通过腺苷酸激酶进行的反应：

(3)通过多磷酸合成酶进行的反应：

在上述反应过程中，如(1)所示，将荧光素酶作用于ATP、荧光素、溶解氧以及以抑制酶失活为目的的镁离子等金属粒子，产生生成AMP、焦磷酸、氧化型荧光素、二氧化碳及发光的反应，通过测定由荧光素酶作用而产生的光，可以对作为污染指标成分的ATP进行检测、以及对食品加工厂等的清洁度进行判定。

如果不存在ATP再生反应系统，随着ATP的消耗，反应(1)终止，发光也消失。因此，在本发明中使用了新的第一个ATP再生反应系统。

上述第一个ATP再生反应系统包括将腺苷酸激酶(ADK)作用于ATP和反应(1)生成的AMP，使其转换为2分子ADP的反应(2)，和在以抑制酶失活为目的的镁离子等金属离子、多磷酸化合物(n)存在下，将多磷酸合成酶(PPK)作用于上述2分子ADP，使其转换为2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)的反应(3)。

该反应的要点叙述如下。首先，通过反应(1)消耗ATP，发光并生成AMP。该AMP在腺苷酸激酶(ADK)存在下，与系统中残存的ATP反应，转换为2分子的ADP(反应(2))。该2分子ADP在多磷酸合成酶(PPK)存在下，与1分子多磷酸化合物(n)反应，消耗2分子磷酸，生成2分子ATP和1分子多磷酸化合物(n-2)(反应(3))。另外，该反应可以认为是2分子ADP与2分子多磷酸化合物(n)反应，消耗2分子的磷酸，进而生成了2分子ATP和2分子多磷酸化合物(n-1)。在本说明书中，按照前者的反应式进行了说明，但本发明并不限定于该反应式。

然后，该ATP再供给到反应(1)，在消耗ATP并发光的同时，ATP的一部分供给到反应(2)，用于AMP向ADP的转换。以下，作为ATP消耗系统的反应(1)和作为ATP再生系统的反应(2)和反应(3)同时连续反复进行，该反应只要存在多磷酸化合物就可继续进行。实际上持续至多磷酸化合物(n)的磷酸分子数n达到3左右。此时，作为起始原料使用的多磷酸化合物(n)是n为10以上的化合物，即，使用10个以上磷酸直链状聚合形成的化合物。例如，如果在反应系统中含有浓度为200～300μM左右的n在40～80左右的多磷酸化合物，发光就可以延续10分钟以上、且稳定，1小时以后也不会完全消失。但n小于9时，为了使发光长时间持续，必须要多加。

利用本发明的第一个ATP再生反应系统的腺苷酸检验方法的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。在该方法中，荧光素和荧光素酶可以利用含有二者的市售试剂盒，溶解氧可以利用空气中的氧。其它试剂的浓度与第一个ATP再生反应系统中的浓度相同。

本发明的腺苷酸第一个检验方法由于具备本发明的第一个ATP再生反应系统，所以不仅生物发光的光量增大，而且可使发光时间大幅度增加。

在本发明的腺苷酸第一个检验方法中，优选以被检验物中的微量ATP作为起始物质，独立进行本发明第一个ATP再生反应系统，进而预先增大ATP量，然后通过向其中添加生物发光试剂，可以显著提高ATP的检测灵敏度。

另外，以ATP的检验方法为例，对本发明的腺苷酸第一个检验方法进行说明，但本发明的腺苷酸第一个检验方法并不限定于ATP的检验，也可以应用于ADP的检验。即，如果存在ADP，就象上述反应过程表明的那样，ADP成为触发因素使得第一个ATP再生反应系统运作，生成ATP。然而，由上述反应过程可知，该方法不能作为AMP的检验方法。因此，该方法可应用于食用肉、鲜鱼、蔬菜等生物鲜度的测定。

以下，就本发明的腺苷酸的第二个检验方法进行说明。

本发明的腺苷酸的第二个检验方法是在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而生成AMP并发光，通过测定生成的发光量对腺苷酸进行检验的方法；其特征在于，具备本发明的第二个ATP再生反应系统。

本发明的腺苷酸的第二个检验方法表示在以下反应过程中。

(1)通过荧光素酶进行的发光反应：

第二个ATP再生反应系统

(2)通过磷酸基转移酶进行的反应：

(3)通过多磷酸合成酶进行的反应：

在上述反应过程中，如(1)所示，将荧光素酶作用于ATP、荧光素、溶解氧以及以抑制酶失活为目的的镁离子等金属粒子，产生生成AMP、焦磷酸、氧化型荧光素、二氧化碳并发光的反应，并通过测定由荧光素酶作用而产生的光，可以对污染指标成分ATP进行检测，以及对食品工厂等的清洁度进行判定。

如果不存在ATP的再生反应系统，随着ATP的消耗，反应(1)终止，发光也消失。因此，在本发明中使用了新的第二个ATP再生反应系统。

本发明的腺苷酸第二个检验方法由于具备本发明的第二个ATP再生反应系统，所以不仅生物发光的光量增大，而且可使发光时间大幅度增加。

该反应的要点叙述如下。首先，通过反应(1)消耗ATP，发光并生成AMP。该AMP通过反应(2)转换为ADP后，通过反应(3)由ADP再生成为ATP。然后，该ATP再供给到反应(1)，消耗ATP并发光。以下，同时连续反复进行作为ATP消耗系统的反应(1)和作为ATP再生系统的反应(2)和反应(3)。在该ATP再生系统中，不使用来自污染的ATP，而是由AMP经ADP转换为ATP，所以即使ATP浓度非常稀，由于不依赖于ATP量，而是依赖于多磷酸化合物的磷酸量，所以可以获得生物发光时间的持续效果。

然而，在上述由AMP再生成ADP的反应(2)中，如果在多磷酸化合物(n)存在下，将上述AMP与磷酸基转移酶(APP)反应，则可以从多磷酸化合物消耗掉一个磷酸，转换为ADP和多磷酸化合物(n-1)。然后，在由上述ADP再生成ATP的反应(3)中，如果在多磷酸化合物(n-1)存在下，将上述ADP与多磷酸合成酶(PPK)反应，则可多磷酸化合物(n-1)再消耗掉一个磷酸，转换为ATP和多磷酸化合物(n-2)。

通过进行本发明的第二个ATP再生反应系统，在由AMP转换为ATP的再生反应系统中，不使用来自污染的ATP，而是由AMP经ADP转换为ATP，所以即使ATP浓度非常稀，由于不依赖于ATP量，而是依赖于多磷酸化合物的磷酸量，所以可以获得生物发光的发光时间的持续效果。进而，可以使腺苷酸的检测灵敏度提高，并且可以在食品加工厂等中通过检测肉眼看不见的微生物来检验清洁度，以及测定食用肉、鲜鱼、蔬菜等食物的鲜度。另外，除了测定污染指标成分ATP以外，也可以测定AMP或ADP。即，如果存在AMP或ADP，就象上述反应过程所表明的那样，通过本发明的第二个ATP再生反应系统可生成ATP。

利用本发明的第二个ATP再生反应系统的腺苷酸检验方法的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。在该方法中，荧光素和荧光素酶可以利用含有二者的市售试剂盒，溶解氧可以利用空气中的氧。其它试剂的浓度与第二个ATP再生反应系统中的浓度相同。

本发明的腺苷酸第二个ATP再生反应系统，可以更稳定地对利用本发明第一个ATP再生反应系统难以检测的更少量的腺苷酸进行检测。

即，在本发明第一个ATP再生反应系统的反应(2)中，由AMP转换为ADP时，使用腺苷酸激酶(ADK)和测定所需的少量来自污染的ATP，生成2分子ADP。然后，在反应(3)中，在多磷酸合成酶(PPK)作用下由生成的2分子ADP生成2分子ATP。因此，在上述第一个ATP再生反应系统中，测定所需的来自污染的ATP是测定系统(反应(1))和再生系统(反应(2)和反应(3))两者所必须的。因此，ATP量最初充足存在时，荧光发光的稳定性好，维持长时间发光是没有问题的，而测定浓度极稀薄的ATP时，最初的再生系统的反应(反应(2)和反应(3))有可能无法顺利进行(稀薄的ATP和稀薄的AMP遭遇的几率小，难以引起反应)，且荧光发光的稳定性差，发光也可能在非常短的时间内消失。

与此相反，本发明的第二个ATP再生反应系统，在再生系统中完全不使用来自污染的ATP时，也可以进行ATP的再生反应，所以可以用于检测浓度极稀薄的ATP。本发明的第二个腺苷酸的检验方法是通过结合该新型的第二个ATP再生反应系统的生物发光来检验腺苷酸的方法。

以下，通过生物发光对本发明的RNA进行检测的方法进行说明。本发明的通过生物发光检测RNA的方法是通过RNA分解酶对样品中的RNA进行分解，进而得到单核苷酸，将该单核苷酸中的AMP转换为ATP，并在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于该ATP，测定生成的发光量对RNA中的AMP进行定量的方法；其特征在于，具备本发明的第二个ATP再生反应系统。

本发明的通过生物发光检测RNA的方法由于具备本发明的第二个ATP再生反应系统，所以可以有效地进行将由RNA得到的核苷酸中的AMP转换为ADP，然后转换为ATP的步骤。然后，生物发光时产生的AMP通过该ATP再生反应系统再生成ATP，结果不仅生物发光的发光量没有衰减，而且可以稳定地持续下去，进而有可能用便宜且结构简单的光度计来检测RNA中的AMP。

在本发明中，样品中RNA的分离方法可以用公知的方法进行。例如，通过水解、离心分离、电泳中任一种方法或它们组合来分离RNA的方法。

从细胞中分离RNA时，可以采用离心分离。例如，酵母总RNA的提取是通过用苯酚对细胞破碎物进行处理，切断巨大分子的氢键，引起蛋白质的变性。不透明的悬浊液经离心分离分成2相，下面的苯酚相含有DNA，上面的水相含有碳水化合物和RNA。变性的蛋白质再经离心分离除去，然后用乙醇使RNA沉淀，得到的生成物不含有DNA，但夹杂着多糖类物质，对此进行纯化时，可以用淀粉酶进行处理。

将RNA分解为组成碱基时，可以采用水解方法。即，用RNA水解酶对RNA进行处理，生成5’-单核苷酸(AMP、GMP、CMP和UMP)。RNA水解酶可以使用已知的酶，例如可以使用核酸酶S1等。

以往，对通过上述步骤生成的碱基，可以通过纸层析进行分离，并用紫外线检测。另外，由于在pH3.5的柠檬酸缓冲液中，组成碱基带有分别完全不同的电荷，所以可以通过电泳分开。再者，通过强酸型离子交换柱层析进行分离，并利用其特定的紫外吸收光谱进行鉴定。

在本发明中，用RNA水解酶对RNA进行水解，并分解成组成碱基。将得到的5’AMP、GMP、CMP和UMP等核苷酸中的5’AMP转换为ADP，然后转换为ATP，将荧光素/荧光素酶与ATP反应，推定存在的AMP量，并由此推定RNA的量。

利用本发明的第二个ATP再生反应系统的RNA检测方法的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。在该方法中，荧光素和荧光素酶可以利用含有二者的市售试剂盒，溶解氧可以利用空气中的氧。RNA水解酶的浓度，例如使用核酸酶S1时，其浓度为10～1000单位(一个单位为于37℃、一分钟内使1μgRNA成为酸可溶性时所需的酶活性)比较合适。其它试剂的浓度与第二个ATP再生反应系统中的浓度相同。

以下，就本发明的级联放大ATP的方法进行说明。

该方法是利用本发明的第一个ATP再生反应系统级联放大ATP的方法。即，本发明的ATP放大方法的特征在于，反复进行在微量ATP存在下，将腺苷酸激酶作用于AMP，使其转换为ADP，然后在多磷酸化合物(n)(式中n是磷酸基数)存在下，将多磷酸合成酶作用于该ADP，使其转换为ATP和多磷酸化合物(n-2)的步骤。

首先，在第一循环反应中，通过腺苷酸激酶使ATP和AMP直接反应，转换为2分子ADP(第一个反应)。然后，该2分子ADP在多磷酸合成酶作用下与多磷酸化合物(n)反应，转换为2分子ATP和多磷酸化合物(n-2)(第二个反应)。然后，进行反应系统的第二个循环反应，此时，在反应系统的第一次循环中生成的上述2分子ATP与2分子AMP反应，转换为4分子ADP(第一个反应)。然后，该4分子ADP在多磷酸合成酶作用下与多磷酸化合物(n-2)反应，转换为4分子ATP和多磷酸化合物(n-6)(第二个反应)。以下，通过反复多次进行反应系统的第3次反应、反应系统的第4次反应、反应系统的第5次反应...，使ATP量增加。该反应是由反应系统的第一次反应中添加的微量ATP引发的，以后引起级联反应，只要存在AMP和多磷酸化合物，就可长时间持续下去，ATP随着反应系统的反应次数呈2的幂指数倍增加。

利用本发明的第一个ATP再生反应系统的ATP放大方法的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。该方法的AMP浓度为10～100μM比较合适。其它试剂的浓度与第一个ATP再生反应系统中的浓度相同。

本发明人等发现，在ATP级联放大反应中使用肌酸激酶和肌磷酸或丙酮酸激酶和磷酸烯醇式丙酮酸代替多磷酸化合物和多磷酸激酶时，也可发生同样的反应。即，只要是可以使2分子ADP转换为2分子ATP的磷酸化合物和酶，从原理上讲都可以发生ATP级联放大反应。然而，多磷酸化合物与多磷酸激酶的组合，具有通过一分子合成多个ATP的能力，所以对于连续发生的ATP放大反应有利。

利用本发明的第一个ATP再生反应系统对ATP进行放大后，以通过荧光素酶进行生物发光为特征的腺苷酸检验方法的温度通常为30～50℃，时间为10～100分钟左右比较合适。在该方法中，荧光素和荧光素酶可以利用含有二者的市售试剂盒，溶解氧可以利用空气中的氧。其它试剂的浓度与第一个ATP再生反应系统中的浓度相同。

本发明的ATP级联放大方法可以使微量的ATP放大，然后在荧光素和溶解氧存在下与荧光素酶反应，生成AMP并发光，测定生成的发光量，则可以得到相当于增加部分的ATP的光量，所以可以检测以往不能检测的极微量ATP。从原理上讲，连存在于最初反应系统的一分子ATP都可能检测。

                         实施例

以下结合实施例和比较例，进一步对本发明进行具体地说明。

实施例1

对于包括本发明的第一个ATP再生反应系统的检验腺苷酸的生物发光系统(本发明)和不包括ATP再生反应系统的生物发光系统(比较例)，在以下条件进行了生物发光随时间变化的研究。

①具备第一个ATP再生反应系统时的情况(实施例1)

(1)多磷酸合成酶(PPK)                1000U(单位)

(2)腺苷酸激酶(ADK)                  22000U(单位)

(3)多磷酸化合物(n＝65)              260μM(浓度)

(4)ATP                              1.65μM(浓度)

                                    小计25μl(体积)

(5)生物发光试剂盒                   25μl(体积)

(Boehringer Mannheim公司生产)

                                    合计50μl(体积)

将上述(1)～(3)的ATP再生反应系统中需要的试剂和(4)的被检验物ATP混合成体积为25μl。然后，将该混合物于37℃与(5)的生物发光试剂(荧光素、荧光素酶为主要成分的生物发光试剂)25μl反应，通过光度计(Amersham pharmacia biotech公司生产)测定生成的发光量，研究发光随时间的变化。发光量的测定是在反应开始后的100分钟内进行的，每隔10分钟测定一次。

②不具备ATP再生反应系统时的情况(比较例1)

为了不引起ATP再生反应，除了上述(2)的试剂外，进行与实施例1完全相同的操作。

图1给出了上述①和②的结果。从该结果可以看出，在不具备ATP再生反应系统的比较例1中，发光量在反应初期达到顶峰，经过10分钟后减少至三分之一，以后随着时间推移逐渐减少。因此，采用该比较例所示的以往的腺苷酸测定法时，需要精确的光度计。与此相反，在具备ATP再生反应系统的本发明的实施例1中，在反应开始20分钟后的发光量是反应初期的10倍，并且在发光量的增强的同时，可维持高水平、无衰减的长时间(30分钟以上)稳定。因此，在本发明的系统中，如果使用精确的光度计，即使微量的ATP也能够检测，进而可以显著提高食品检验、卫生检验的精度。另一方面，在食品检验、卫生检验中，用以往精度进行ATP的检测时，即使不使用高价且高精度的光度计，也能通过便宜且简单的光度计对ATP进行检测。

在该实施例中，作为多磷酸合成酶可以直接使用市售的酶，但在该市售酶中含有杂质ATP和ADP。因此，样品中完全不含ATP和ADP时，酶中作为杂质含有的ATP和ADP也会引发上述的ATP再生反应系统，进而即使样品中完全不含ATP和ADP时，也能观察到杂质ATP和ADP引起的发光。因此，为了提高腺苷酸的测定精度，将使用的酶中的腺苷酸浓度尽可能降低是很重要的。

实施例2

对于在本发明的第二个ATP再生反应系统中，多磷酸合成酶(PPK)以及磷酸基转移酶(APP)会对该ATP再生反应系统产生怎样的影响进行了实验。

实验材料

(1)多磷酸合成酶缓冲液(PPK缓冲液)            3μl

(2)0.1mM(浓度)腺苷一磷酸(AMP)               3μl

(3)30mM(浓度)多磷酸化合物(n＝65)            3μl

(4)离子交换水                               19μl

(5)多磷酸合成酶(PPK)                        1μl

(6)磷酸基转移酶(APP)                        1μl

                                            合计30μl(体积)

PPK缓冲液：①HEPES缓冲液50mM，pH7.0，②(NH₄)₂SO₄40mM，

③MgCl₂的混合物

将上述(1)～(6)于30℃的条件下进行温育，在反应后5分钟、15分钟、60分钟各取10μl样品。然后，将全部样品添加到已经添加了10μl荧光素和5μl荧光素酶的测定用孔中，用光度计(ARVO公司生产)测定生成的发光量。

从发光量可以知道不同经过时间时的ATP浓度。结果如图2所示。从图2可知，ATP的浓度在反应后5分钟、15分钟、60分钟，以及随着时间的延长均在增加。该实验表明，通过多磷酸合成酶(PPK)和磷酸基转移酶(APP)两个酶，可以由AMP生成ATP。因此，这些反应可以用作ATP再生反应系统，以及也可以利用该ATP再生反应系统，通过生物发光来检测AMP。

实施例3

对于包括本发明的第二个ATP再生反应系统的检验腺苷酸的生物发光系统(本发明)和不包括ATP再生反应系统的生物发光系统(比较例)，在以下条件下进行了生物发光随时间变化的研究。

①具备第二个ATP再生反应系统时的情况(实施例3)

(1)多磷酸合成酶缓冲液(PPK缓冲液)           3μl

(2)0.1mM(浓度)腺苷一磷酸(AMP)              3μl

(3)30mM(浓度)多磷酸化合物(n＝65)           3μl

(4)离子交换水                              19μl

(5)多磷酸合成酶(PPK)                       1μl

(6)磷酸基转移酶(APP)                       1μl

                                           合计30μl(体积)

没有第二个ATP再生反应系统时(对照)的情况(比较例3)

(7)1.65μM(浓度)腺苷三磷酸(ATP)            3μl

(8)离子交换水                              27μl

                                           合计30μl(体积)

将上述(1)～(6)的具有再生反应系统的样品和上述(7)～(8)的无再生反应系统的样品，分别于30℃的条件下温育20分钟，然后将全部样品都添加到已经添加了10μl荧光素和5μl的荧光素酶的测定用孔中，用光度计(ARVO公司生产)测定生成的发光量，并研究发光随时间的变化。发光量的测定是在反应开始后至14分钟的时间内，通过测定反应刚开始后、经过6分钟后、经过13分钟后的发光量的方法而进行的。

结果如图3所示。从图3可知，在没有ATP的再生反应系统的实验中，反应开始后就达到了高峰的发光量在经过6分钟后减少至六分之一以下，以后随着时间变化逐渐减少。由此可知，使用以往的测定法时，需要精确的光度计。与此相反，具备依赖于多磷酸的ATP再生反应系统时，在反应刚开始就达到高峰的发光量在经过6分钟后发光量的衰减受到抑制，维持在高水平且稳定的状态。因此，在本发明中使用精确的光度计时，能够检测微量的ATP，并可以提高食品检验、卫生检验的精度。另一方面，在食品检验、卫生检验中，如果在以往的ATP检测范围内可以满足标准，不使用高价且高精度的光度计，通过便宜且简单的光度计也能够对ATP进行检测。

例如，想要对浓度在100nM以下的极稀薄的ATP进行测定时，由于不依赖于初期ATP浓度且ATP再生反应系统稳定地发挥作用，所以可以高灵敏度地检测腺苷酸。

实施例4

①从酵母中分离RNA

试剂和设备

1.干燥酵母                           200g

2.苯酚溶液(900g/L)                   1L

3.醋酸钾(200g/L，pH5)                200mg

4.纯乙醇                             3L

5.乙醚                               500mg

6.37℃的恒温槽                       5台

方法

将30g干酵母悬浮于预先加热到37℃的120ml水中。于该温度保温15分钟，然后加入160ml浓苯酚。将悬浮液于室温下机械搅拌30分钟后，为了破坏其乳化状态，于冷冻条件、3000G离心分离15分钟。用Komagome移液器小心地取上层水相，用冷冻离心机于10000G、离心分离5分钟，使变性的蛋白质沉淀。上清液中加入终浓度为20g/L地醋酸钾，加入2倍量的乙醇，使RNA沉淀。将溶液于冰中冷却，放置1小时后，于冷冻条件、2000G离心分离5分钟，收集沉淀。该RNA用乙醇水溶液、乙醇、最后用乙醚洗，于空气中干燥，分离出约4％酵母干重的RNA。

②通过水解RNA制备核苷酸

试剂和设备

1.市售的tRNA                       2μl

2.附带缓冲液                       1μl

3.蒸馏水                           6.5μl

4.核酸酶S1                             0.5μl

方法

将市售的tRNA 2μl溶解于附带缓冲液1μl、蒸馏水6.5μl、核酸酶S1 0.5μl中，于37℃温育10分钟。然后，在生成的5’-单核苷酸中，通过以下反应将AMP转换为ATP，通过测定生物发光来进行测定。

③通过测定生物发光对AMP进行鉴定

试剂

1.多磷酸合成酶缓冲液(PPK缓冲液)        3μl

2.0.1mM(浓度)腺苷一磷酸(AMP)           3μl

3.30mM(浓度)多磷酸化合物(n＝65)        3μl

4.离子交换水                           19μl

5.多磷酸合成酶(PPK)                    1μl

6.磷酸基转移酶(APP)                    1μl

方法

将上述1.～6.试剂于30℃条件下进行温育，于反应后5分钟、15分钟、60分钟各取10μl样品。然后，将全部样品都添加到已经添加了10μl荧光素和5μl的荧光素酶的测定用孔中，用光度计(ARVO公司生产)测定生成的发光量。

从发光量可以知道不同经过时间时的ATP浓度。结果如图2所示。从图2可知，ATP的浓度在反应后5分钟、15分钟、60分钟，以及随着时间的延长均在增加。该实验表明，通过多磷酸合成酶(PPK)和磷酸基转移酶(APP)两个酶，可以由AMP生成ATP，因此，这些反应可用作ATP的转换系统，以及也可以通过生物发光检测AMP，并鉴定RNA组成核苷酸AMP。

实施例5

通过生物发光测定检测RNA

试剂

1.多磷酸合成酶缓冲液(PPK缓冲液)           4μl

2.实施例4中得到的RNA水解产物              2μl

3.30mM(浓度)多磷酸化合物(n＝65)           2μl

4.离子交换水                         7μl

5.多磷酸合成酶(PPK)                  2μl

6.磷酸基转移酶(APP)                  3μl

方法

将上述1.～6.试剂于30℃条件下进行温育，反应60分钟后，将全部样品都添加到已经添加了10μl荧光素和5μl的荧光素酶的测定用孔中，用光度计(ARVO公司生产)测定生成的发光量。

图4的最上端给出了发光量。作为对照，使用添加没有经核酸酶水解处理的RNA样品替代试剂2(图4的第二段)的样品，以及不添加RNA，只添加核酸酶样品(图4的第三段)的样品。通过实验可知，RNA分解是生物发光所必需的。即，RNA分解生成AMP的过程是必要的。

通过实际上以纯AMP作为样品时，可生成ATP并生物发光(图4的第4段)的现象，也可了解到上述必要性。另外，添加RNA水解产物，但不添加多磷酸合成酶、磷酸基转移酶的情况如图4的第5段所示。此时，由于没有通过AMP生成ATP，所以没有生物发光。

从这些实验可知，通过使RNA的组成核苷酸AMP生成ATP，并使其进行生物发光，可以对RNA进行检测。RNA的检测灵敏度由于依赖于通过生物发光的ATP的检测灵敏度，所以其检测灵敏度非常高。

实施例6

该实施例使用来自酶的多磷酸合成酶、和纯化该酶并除去了作为杂质含有的ADP的多磷酸合成酶，对具备本发明的第一个ATP再生反应系统的检验腺苷酸的生物发光系统(本发明)和不具备ATP再生系统的生物发光系统(比较例)，在以下条件下研究了发光随时间的变化。

①多磷酸合成酶的纯化过程(PPK[1]的制备)

对大肠杆菌MV1184(pBC10:ppk)进行培养。在培养开始2.5小时后添加0.5mM的IPTG，对多磷酸合成酶进行诱导。2小时后，收集菌体并悬浮于60ml的Tris/HCl蔗糖缓冲液中。将此于-80℃冷冻，于冰上过夜，以使其融解。然后，加250μg/L溶菌酶进行溶菌。进行超声处理，加DNase70单位/μL、RNase 10mg/L，高速离心后，除去未破碎菌体，测量上清的液量，向其中0.2g/L的硫酸铵。通过离心使酶沉淀，加磷酸缓冲液使其溶解。用0.2μm的过滤器除去微粒，通过疏水层析(Phenyl Sepharose HP)(Pharmacia公司生产)、离子交换层析(MonoS5/5)(Pharmacia公司生产)进行纯化。得到的纯化酶PPK[1]在SDS-PAGE上呈现几乎单一的条带。

②从多磷酸合成酶PPK[1]除去ADP的步骤(PPK[2]的制备)

将①中得到的大肠杆菌激酶PPK[1]200μL(5×10³单位，12μg)与0.1mM的多磷酸化合物混合，于37℃保温10分钟，将与酶结合的ADP转换为ATP并游离出来。向其中加入纯化的多磷酸合成酶(5×10⁵单位)，于37℃保温10分钟，除去剩余的多磷酸化合物(如果没有该步骤，多磷酸合成酶不会从柱子中洗脱下来)。洗脱出的多磷酸合成酶经Smart system(MonoS)(Pharmacia公司生产)纯化，得到纯化酶PPK[2]。

使用纯化酶PPK[1]和PPK[2]，研究在以下的条件下发光随时间的变化。

实施例6a

使用多磷酸合成酶PPK[1]时

(1)多磷酸合成酶(PPK[1])                120U

(2)腺苷酸激酶(ADK)                     90U

(3)多磷酸化合物(n＝65)                 900μM(浓度)

(4)AMP                                 600μM(浓度)

(5)+ATP                                0.165μM(浓度)

                                       小计25μl(体积)

(6)生物发光试剂盒                      25μl(体积)

(Boehringer Mannheim公司生产)

                                       合计50μl(体积)

将(1)～(5)混合，反应规定时间后，添加(6)，测定发光量。

另外，除去试剂(ホ)，其它都与上述一样测定发光量。

测定结果如图5所示。图5(a)是使用纯化的多磷酸合成酶(PPK[1])，研究添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)时发光随时间的变化图。比较两者，可知添加ATP(+ATP)的发光强度高。

实施例6b

使用多磷酸合成酶PPK[2]时

在实施例6a中代替多磷酸合成酶PPK[1]，使用除去了ADP的多磷酸合成酶PPK[2]，其它操作完全一样，结果如图5b所示。比较添加ATP(+ATP)和不添加ATP(-ATP)时发光随时间的变化，可知添加ATP(+ATP)的发光强度明显地高。

上述结果表明，在实施例6a中不添加ATP(-ATP)时也发光，是由于来自多磷酸合成酶的ADP或ATP成了本发明ATP再生反应系统的触发因素，进而引起发光。在实施例6b中不添加ATP(-ATP)时的发光强度与实施例6a的情况相比明显地低，是由于纯化多磷酸合成酶后除去了ADP，使得ATP放大反应的速度变得非常慢的缘故。因此，检验样品中有无ATP时，要将使用的多磷酸合成酶充分纯化后，尽可能使ADP和ATP浓度降低。经过这样操作，可将来自酶并作为杂质的ATP和ADP引起的放大效应抑制到最小限度，并可高精度地检验样品中有无ATP。

实施例7

该实施例使用纯化多磷酸合成酶(PPK[2])，改变底物多磷酸化合物以及AMP的浓度，研究了底物浓度对ATP再生系统的影响。

实施例7a

(1)多磷酸合成酶(PPK[2])             120U(单位)

(2)腺苷酸激酶(ADK)                  90U(单位)

(3)多磷酸化合物(n＝65)              900μM(浓度)

(4)AMP                              600μM(浓度)

(5)+ATP                             0.165μM(浓度)

                                    小计25μl(体积)

(6)生物发光试剂盒                   25μl(体积)

(Boehringer Mannheim公司生产)

                                  合计50μl(体积)

将(1)～(5)混合，反应规定时间后，添加(6)，测定发光量。

另外，除去试剂(5)，其它都与上述一样测定发光量。

测定结果如图6(a)所示。

实施例7b

(1)多磷酸合成酶(PPK[2])            120U(单位)

(2)腺苷酸激酶(ADK)                 90U(单位)

(3)多磷酸化合物(n＝65)             900μM(浓度)

(4)AMP                             60μM(浓度)

(5)+ATP                            0.165μM(浓度)

                                   小计25μl(体积)

(6)生物发光试剂盒                  25μl(体积)

(Boehringer Mannheim公司生产)

                                   合计50μl(体积)

以下，进行与实施例7a同样的操作，测定发光量。

另外，除了试剂(5)以外，其余都与上述一样测定发光量。

测定结果如图6(b)所示。

实施例7c

(1)多磷酸合成酶(PPK[2])            120U(单位)

(2)腺苷酸激酶(ADK)                 90U(单位)

(3)多磷酸化合物(n＝65)             90μM(浓度)

(4)AMP                             600μM(浓度)

(5)+ATP                            0.165μM(浓度)

                                   小计25μl(体积)

(6)生物发光试剂盒                  25μl(体积)

(Boehringer Mannheim公司生产)

                                   合计50μl(体积)

以下，进行与实施例7a同样的操作，测定发光量。

另外，除了试剂(5)以外，其它操作完全相同，测定发光量。

测定结果如图6(c)所示。

参照图6(a)可知，AMP和多磷酸化合物充分且存在ATP再生反应系统时发光强度高，持续时间长。而不存在ATP发光反应系统时，发光强度低得多。参照图6(b)可知，由于AMP浓度达到了十分之一，AMP中作为杂质含有的ADP、ATP浓度也达到了十分之一，结果来自杂质的ADP或ATP引起的发光(背景)受到抑制，由添加的ATP引起的发光能更显著地被观察到。值得注意的是，在这样的条件下，如果不添加ATP，ATP的放大几乎不会发生，发光也几乎观察不到。即，由于背景几乎为零，样品中的微量ATP的检测可以达到更高的精度。

参照图6(c)可知，AMP充分存且存在ATP再生反应系统时，若多磷酸化合物浓度低，则发光强度也低，如果不存在ATP再生反应系统，则发光强度更低。这表明，为了使本发明的第二个ATP再生反应系统充分发挥作用，AMP和多磷酸化合物的浓度最好分别为10～100μM、100～1000μM左右。

以上结果表明，通过将本发明的ATP再生反应系统中使用的酶中的ADP和ATP浓度尽可能地降低，可以明显提高利用本发明的ATP再生反应系统的腺苷酸的检测灵敏度。

实施例8

为了比较不添加ATP进行反应时的条件和添加ATP进行反应时的条件，研究了在以下条件下发光随时间的变化。

①不添加ATP反应的情况

(1)多磷酸合成酶缓冲液              10μl

(2)腺苷一磷酸(AMP)                 7.5μl

(3)3mM多磷酸化合物(n＝65)          22.5μl

(4)多磷酸合成酶                    15μl

(5)腺苷酸激酶                      3μl

(6)离子交换水                      17μl

                                   合计75μl

将上述(1)～(6)的样品混合，每隔一定测定时间取样(5μl)，利用Boehringer Mannheim公司生产的ATP测定试剂盒测定ATP的浓度。

②添加ATP反应的情况

(1)多磷酸合成酶缓冲液                  10μl

(2)腺苷一磷酸(AMP)                     7.5μl

(3)3mM多磷酸化合物(n＝65)              22.5μl

(4)多磷酸合成酶                        15μl

(5)腺苷酸激酶                          3μl

(6)1.65μM ATP                         12μl

(7)离子交换水                          12μl

                                       合计75μl

将上述的(1)～(7)混合，每隔一定测定时间取样(5μl)，利用Boehringer Mannheim公司生产的ATP测定试剂盒测定ATP的浓度。

测定结果如图7所示。从测定结果可以看出，添加ATP进行反应时，从反应后30分钟开始ATP量急剧上升，经过180分钟后达到最高峰。与此相反，不添加ATP进行反应时，ATP量没有增加，维持在低水平。这表明，如果添加微量ATP，它可能成为触发因素，引起ATP的级联放大反应。

根据本发明的ATP放大方法，即使是极微量的ATP，也可以使其放大并可以高灵敏度地进行检测，进而可以提高食品检验、卫生检验的精度。另外，通过便宜且简单的光度计就可以检测ATP。

                      产业上的实用性

本发明的第一个或第二个ATP再生反应系统由于使用含有多个、优选使用含有10个以上磷酸基的多磷酸化合物及多磷酸合成酶，所以将它们用于通过生物发光的腺苷酸检验方法和RNA检测方法时，与以往的方法相比，可以使生物发光的光量大大增大的同时，也可以使发光时间的持续更久，其结果提高了腺苷酸和RNA的检测灵敏度。另外，利用本发明的第一个ATP再生反应系统时，可以便宜且高效地级联合成ATP。

Claims (3)

1.ATP再生反应系统，其特征在于，在磷酸基数为n的多磷酸化合物存在下，将磷酸基转移酶作用于AMP，使其转换为ADP和磷酸基数为n-1的多磷酸化合物，然后在该磷酸基数为n～1的多磷酸化合物存在下，将多磷酸合成酶作用于上述ADP，使其转换为ATP和磷酸基数为n-2的多磷酸化合物。

2、依赖于生物发光的腺苷酸的检验方法，该方法是在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于ATP，进而生成AMP并发光，通过测定生成的发光量对腺苷酸进行检验的方法；

其中，具备权利要求1所述的ATP再生反应系统。

3、依赖于生物发光检测RNA的方法，该方法是通过RNA分解酶对样品中的RNA进行分解，进而得到单核苷酸，将该单核苷酸中的AMP转换为ATP，并在荧光素和溶解氧存在下，将荧光素酶作用于该ATP，测定生成的发光量对RNA中的AMP进行定量的方法；

其中，具备权利要求1所述的ATP再生反应系统。

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