CN1209464C - 多脱氧核苷酸的合成方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供在没有模板和引物存在的条件下使耐热性的脱氧核苷酸聚合酶作用于脱氧核苷酸合成多脱氧核苷酸的合成方法；以这样得到的多脱氧核苷酸作探针筛选cDNA文库的筛选方法；以及将上述合成的DNA结合到含有生物细胞的基因的双链DNA的3′-OH末端，然后用它转化细胞，通过培养该细胞使DNA插入染色体DNA，使来自该基因的蛋白质表达的方法；染色体DNA的合成方法以及染色体的合成方法。还可提供创造天然不存在的DNA，再通过该基因创造新的蛋白质，提供新的生理的、药理的活性物质的手段。

Description

多脱氧核苷酸的合成方法

本发明涉及合成多脱氧核苷酸(DNA)的方法，这种合成方法是模板非依赖性的、引物非依赖性的方法(以下也可叫做：“模板和引物非依赖性的”或简称“ntp式的”)。本发明有关染色体DNA的合成方法以及染色体制造方法，更详细地说，是涉及这样一种方法，该方法并不是某种脱氧核苷酸聚合酶(以下简称“DNA聚合酶”)读取模板的遗传信息的“复制”，而是“创造性地”，即合成作为新的遗传信息的DNA、而这样合成的DNA中的一部分具有染色体DNA必须的着丝点区、端粒区和复制起始区。

到目前为止合成DNA的主要方法有2种，即利用DNA合成酶的方法和化学合成的方法。

利用DNA合成酶合成DNA的方法。例如，有通过DNA聚合酶由DNA模板合成DNA的方法，有通过逆转录酶由模板RNA合成DNA的方法等，即所谓的模板依赖性的DNA合成方法等。然而这些方法中无论哪一种方法为了要合成DNA，都需要一条短的DNA链或者RNA链组成的引物和一条模板DNA链。最近虽然已开发了称之为聚合酶链式反应法或叫PCR法[Saiki等，Scienee，第487-491页，(1988)]可以简单地扩增模板DNA的方法，但仍需要模板DNA和引物。

化学合成方法有通过磷酸二酯法或磷酸三酯法等进行合成的方法，这些方法合成过程复杂，花时间，且只能合成数十个碱基，而且纯化合成的DNA很难。合成的装置有市售，但价格高，而且必须使用特别的试剂，这也是它的缺点。虽然现在还没有尝试，为了制造DNA，依赖于化学合成方法，事实上用这种方法要合成数千bp(base pair，即碱基对)是不可能的。当然可以预想一下，即使可以合成，价格也相当昂贵。因此也可以想象到通过使创造的DNA表达来创造蛋白质是不可能的。

关于染色体DNA的合成可以说与上面的DNA合成的情况一样。即：生物具有的染色体是由二条直链DNA(染色体DNA)和组蛋白等蛋白质组成的。上述双链DNA中存在作为必需要素的染色体表现功能的3个区。这3个区是：①着丝点区(有丝分裂和减数分裂时，参与被复制的染色体的适当的分配)、②端粒区(参与染色体的稳定和复制等)、③复制起始区(ARS)(有复制点的性质，参与DNA复制的起始)。

无论缺了那一区域，该染色体DNA都变得不稳定，会在细胞分裂过程中消失。如果将上述①～③区域的碱基序列全拼起来，其长度超过1000碱基对，所以要从头合成这些碱基是非常困难的。

以前提出了如下的人工染色体的制造技术方案。即：通过基因重组技术手法切出来自生物的DNA，只取出必要的部分，通过将这部分DNA接到别的DNA上，制造出独立的人工染色体。象上述提案那样，要将作为染色体DNA必需的3个区域一个一个地连接起来，人工染色体的制造的确有可能。但是，达到那种程度的作业是非常烦杂的，还缺乏生产性。

本发明的目的就在于提供不依赖于模板和引物的创造DNA即遗传信息的方法。以及提供制造染色体的方法，即：容易地合成具有染色体必需要素的着丝点区、端粒区以及复制起始区的双链线型DNA(染色体DNA)，再用合成的染色体DNA制造染色体。

本发明的DNA合成方法的特征是：在模板和/或引物不存在、而存在蛋白质的条件下使脱氧核苷酸聚合。

本发明的染色体DNA的合成方法的特征是：在模板和/或引物不存在的反应体系中，在蛋白质存在条件下使脱氧核苷酸聚合。

本发明人在DNA合成的研究中有各种发现。例如，由Thermococcuslitoralis DNA聚合酶(New England，Bio·lab′s)和缓冲液A[10mMKCl、10mM(NH₄)₂SO₄、20mM Tris/HCl(pH8.8)、6mMMgCl₂、0.1％特里顿(Triton)100(都是最终浓度)]以及脱氧核苷酸[dATP、dCTP、dGTP和dTTP(最终浓度都是200μM)]组成的反应液于37℃反应3小时，然后取出一些反应液加到1％琼脂糖凝胶上进行电泳后，通过溴乙锭染色，紫外灯下观察。结果如图1照片所示，可以看到从1kbp(1000碱基对)到30kbp的很宽范围内都有染色的DNA带。

接下来，准备不加脱氧核苷三磷酸的反应液，向里面加入脱氧核酸酶I或核酸酶A，于37℃反应2小时，可以完全水解反应液和酶液中的也许以杂质存在的DNA或RNA(它们可以成为引物或模板)。然后加入脱氧核苷三磷酸，进行与上述同样的反应。如果反应是模板、引物依赖性的反应，当然就不会引起DNA的合成。但是反应是npt式的反应，所以引起了DNA的合成。琼脂糖凝胶电泳的结果，当然可以看到DNA带。大约在1kbp～30kbp很宽的范围内都可看到染色的DNA带。这表明这个反是ntp式的反应。即这个反应与可成为模板或引物的DNA或RNA没关系，它是按照聚合酶本身带有的创造DNA的信息进行的反应。

以下，就Thermococcus litoralis DNA聚合酶进行的ntp式的DNA合成反应中，改变反应条件，能否合成大小在1kbp～30kbp以上的DNA进行了研究。即，在通常的反应液中加入脱氧核酸酶(Dnase I)，37℃反应30分钟，然后再于通常的74℃反应3小时，通过溴乙锭染色，如图5表示的那样，在10kbp附近出现染的很浓的DNA带。从这一结果确认根据反应条件有可能任意改变生成的DNA长度。

以下确认了由Thermococcus litoralis DNA聚合酶进行的ntp式的合成反应在时间上向后推移了。如图6所示那样，观察到直到1个小时后反应还未发生的所谓滞后期，2个小时后反应才开始。2小时～3小时之间看到最大反应速度。这时的反应速度是0.8碱基/秒/1分子酶，这一速度是通过Thermococcus litoralis DNA聚合酶进行的通常的模板和引物依赖性的DNA聚合反应速度的76分之一[Korng等人著、J.Biol.Chem第268卷，第1965-1975页，(1993)]。是大肠杆菌聚合酶I参与的聚合反应速度的57分之一[Kornberg.DNA Replication 2nd ed.W.H.Freeman and Company San Fran cis co CA.(1992)]。可以认为这一反应是与通常的模板以及引物依赖性的DNA合成反应完全不同的别的反应。

接下来研究了在ntp式的DNA合成反应中对于底物脱氧核苷三磷酸的特异性(即这个反应的底物特异性)。分别准备4种(A、T、G、C)脱氧核苷三磷酸中的任一种脱氧核苷酸、或是二种组合的、三种组合的、四种组合的标准样品，以这些样品作为底物，分别进行通常的DNA合成反应。取一部分反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳，然后用溴乙锭染色。如图2所示的那样，除了加有4种脱氧核苷酸的以外，加了3种脱氧核苷酸的dATP、dCTP、dTTP组合和dATP、dGTP、dTTP组合的反应液的电泳也可看到DNA带。然而加了4种的反应液与加了3种的后两组的反应液的电泳后的DNA带分布不同。就是说，前者的DNA的大小大约分布在1kbp～30kbp的范围内，而后者分布在大约10kbp以上范围内，比这再大的DNA几乎看不到了。因此，这些ntp式的反应中的DNA合成产物有可能是其它种类的DNA产物。即暗示这个ntp式的DNA合成反应中有可能存着几个不同的DNA合成反应。

为研究本发明的ntp式的合成反应中得到的DNA(以下称为“ntp-DNA”)的特征，大量制备了该DNA。作为DNA的纯化方法我们采用了氯化铯-溴乙锭密度梯度平衡离心法[J.Sambrook等，Molecular Cloning(A Laboratory Manual)、Cold Spring Harbor，Laboratory Press，1989年出版]。结果从475ml的反应液中可以回收9.5mg的DNA。

利用这样制备的样品，研究这一ntp式的反应中合成的产物(ntp-DNA)究竟是单链还是双链，利用对单链DNA特异的核酸Sl或绿豆核酸酶去切样品。结果如图7所示的那样，ntp-DNA不能被对单链特异的核酸酶切断。由此暗示这个ntp-DNA可能是双链DNA。

为了研究ntp-DNA的结构进行了圆二色光谱分析和透射电子显微镜观察。首先进行圆二色光谱分析如图8所示，将用作测试对象的质粒DNA与限制酶作用后的线型的典型的B型双螺旋结构的DNA比较，两者大致类似。由此可以确认这个ntp-DNA是B型双螺旋结构的DNA。若通过透射电子显微镜观察，则如图9所示可以确认它是直链状的，而且从它的直径判断是双链的DNA。经过以上分析，本发明人等确认ntp-DNA是双链直线状DNA。

下面对ntp-DNA的碱基组成进行了分析。首先通过脱氧核酸酶I和磷酸二酯酶I以及碱性磷酸酶将ntp-DNA水解，分解成单个的脱氧核苷酸。用Cosmosil5 C18反相柱(Nakaraichem.制)对水解液进行色谱分析(高速液相色谱，日本分光社制)，对各种脱氧核苷酸进行定量。其结果如表1所示。碱基组成分别是：脱氧腺苷酸34.4％、脱氧胞苷酸是15.6％、脱氧鸟苷酸是17.4％、脱氧胸腺嘧啶核苷酸是32.6％，所以GC的含量是33％。

                         表1

    脱氧核苷酸                      组成(％)

        dA                            34.4

        dC                            15.6

        dG                            17.4

        dT                            32.6

下面分析了ntp-DNA的相邻碱基出现的频率(nearest neighborfrequency)。在通常的反应液中加入[α-³²P]标记的脱氧核苷三磷酸，进行常规的DNA合成反应。然后将反应液经Sepharose 12凝胶过滤柱(pharmacia社制)层析，按DNA的峰分别收集DNA溶液，再用乙醇沉淀纯化。最后溶解于TE缓冲液中。用微球菌核酸酶和胰磷酸酯酶酶切这一标记的DNA，让它分解为3′-一磷酸脱氧核苷酸。再将这分解的混合液过Cosmosil 5 C₁₈反相柱层析，可分别回收到脱氧腺苷3′-一磷酸(dAp)、脱氧胞苷-3′-一磷酸(dCp)、脱氧鸟苷3′-一(dGp)、脱氧胸苷3′-一磷酸的各个峰，通过液体闪烁计数仪测定各个峰的³²P的放射能，分析相邻碱基出现的频率。其结果如图2所示，得到了具有一定规律性的排列。即，在dA的前面dT和dG出现的频率高，在dC前面dT出现的频率高，在dG前面dA出现频率高，在dT前面dA和dC出现的频率高，由此确认在分析的ntp-DNA的序列中存在着一定倾向的排列。

                          表2

 α-³²P标记        脱氧核苷-3′-一磷酸的放射活性     

脱氧核苷三磷酸

                    dAp      dCp        dGp        dTp

                   pmol％   pmol％     pmol％     pmol％

           dATP    0    0  1.3  1.5  17.3 19.3  71.0  79.2

dCTP    0     0     0     0     2.7    10.8   22.2   89.2

dGTP    17.0  97.1  0     0     0.2    1.1    0.3    1.7

dTTP    34.0  44.2  40.5  52.6  2.5    3.2    0      0

下面进行这种ntp-DNA分子的克隆，PUC19经限制酶Smal(东洋纺织社制)切后作为克隆载体，ntp-DNA经D Nase I作用切成具有平端的片断，再经碱性磷酸酶(宝酒造社制)脱磷酸，接着再用T4多核苷酸酶(东洋纺织社制)磷酸化，最后用Klenow片断修复，这样制备的ntp-DNA片断用作插入DNA。将插入DNA与上述克隆载体连接，为了确认被克隆的质料有无插入DNA，通过限制酶进行酶切，再通过电泳可以确认有无插入DNA。然后挑选有目的DNA插入的菌落，本发明人将它们命名为质粒pTL34，pTL57和pTL85。

接下来，确定质粒pTL34、pTL57和pTL85中的插入DNA的碱基序列。利用Sanger双脱氧链终止法[Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第74卷，第5463～5467，(1977)]测定碱基序列，确定的碱基序列如序列表的序列号1、2和3所示(表3)。

表3

序列表

序列号：1

序列长度：56

序列类型：核酸

链数：二条链

拓朴型：直线型

序列种类：其它的核酸(新合成DNA)

反意义链：是

TATCTAGATA    TCTAGATATC     TAGATATCTA

GATATCTAGA TATCTAGATA TCTAGA 56

序列表

序列号：2

序列长度：34

序列类型：核酸

链数：二条链

拓朴型：直线型

序列种类：其它核酸(新合成DNA)

反意义链：是

CTAGATATCT ATCTAGATAT CTATCTAGAT ATCT 34

序列表

序列号：3

序列长度：34

序列类型：核酸

链数：二条链

拓朴型：直线型

序列种类：其它核酸(新合成DNA)

反意义链：是

TAGATATCTA GATCTAGATA TCTATCTAGA TATC 34

下面检索这种DNA与已知的DNA有无共同性。其结果如表4，表5和表6所示。由此可知，包括人在内的很多生物的染色体中都保存这种DNA序列。有趣的是这一序列中还包含存在于着丝点附近的小的卫星DNA等的基因调节部位。

                    表4

存取序号         菌落种类                    相同性(％)

X90770     L. esculentum微小卫星DNA               83.0

L16355     人染色体10                               80.0

X92189     D. polychroa微小卫星DNA                79.6

X78915     D. melanogaster GATA12重复序列         79.6

L19324     Xnopus  laevis重组活性基因             77.8

Z68892     B. vulgaris微小卫星DNA                 77.8

                   表5

存取序号         菌落种类                    相同性(％)

L13120     人重复序列                             84.8

X90937     L. esculentum微小卫星DNA             89.7

X78912     D. melanogasterGATA5重复序列         84.8

K0079 7    鼠重复序列                             84.8

X92189     D. palychroa微小卫星DNA              89.7

                        表6

存取序号  菌落种类                          相同性(％)

L13122    人重复序列                          79.4

M35828    2BKm重复序列                        79.4

Z33997    牛微小卫星DNA                       79.4

K01665    D. melanogaster BKm DNA           82.4

X90770    L. esculentum微小卫星DNA          76.5

为确认这种ntp-DNA能否成为例如从番茄染色体文库中检索具有与这一DNA碱基序列相同或类似的序列的探针，可将这种ntp-DNA的5′末端磷酸基用(γ-³²p)ATP标记后，作成检索用的探针。作为标记的探针也可以使用各种荧光标记的探针。利用这个探针通过噬斑杂交从番茄染色体cDNAλ噬菌体文库进行筛选，结果检测出很多阳性信号。从检测出阳性信号的噬斑中分离出λ噬菌体，确定碱基序列，结果与预想的一样，可以确认含有ntp-DNA序列。由此可以确认，ntp-DNA可以成为简单筛选存在于各种cDNA文库中与这一碱基序列相同或类似的序列的探针。

为了确认ntp-DNA具有高频率重组活性，进行了如下的实验。实验中所用的酵母的基因操作方法按罗兹等人的方法进行[Methods inYeast Genetics(A.Laboratory Course Mannual)Cold Spring.HarborLaboratory.Press(1990)]。

首先通过PCR法扩增来自质粒pCH110(Pharmacia制)的β-半乳糖苷酶基因。但基因的上游引物5′-末端加了面包酵母(Saccharomyces cerevisiae)的GAL1启动子，下游引物5′-末端加了面包酵母转录结束信号CYC1的反意义序列，无论那个序列都要事先能使β-半乳糖苷酶基因的密码和框架配合。通过这一操作β-半乳糖苷酶基因就可以在酵母内表达了。其次，在含有这个β-半乳糖苷酶基因的双链DNA的3′-OH末端通过Thermococcus.litoralis聚合酶合成ntp-DNA。这一操作也可使用DNA连接酶，将ntp-DNA连接到β-半乳糖苷酶基因的两端。然后使连接好的基因转染酵母，在平板培养基上培养酵母细胞，通过平板将酵母细胞分散开培养，测定β-半乳糖苷酶的活性。假如确认有β-半乳糖苷酶活性，则原来酵母中没有的β-半乳糖苷酶被表达了。在转染的DNA中因为不存在酵母复制起点，所以在酵母细胞内不能进行复制。因此可以认为酵母细胞内的β-半乳糖苷酶就是该酶基因整合到酵母染色体后表达的产物。酵母中β-半乳糖苷酶活性测定结果，的确有β-半乳糖苷酶活性，证明该基因已整合到酵母染色体中(表7)。这一事实表明，这种ntp-DNA有引起高频率重组的作用，不需要特别的载体，使来自插入基因的蛋白质表达。利用本发明可以不需要表达载体这一烦琐的作业而使目的蛋白质表达。这一方法也可用于酵母以外的其它生物(例如大肠杆菌等原核生物以及真核生物)中。

                         表7

  样品号                   β-半乳糖苷酶活性

                          nmol/min/mg(蛋白质)

    1                             0.5

    2                             0.4

    3                             304

    4                             0.6

    5                             0.5

    6                             1.0

    7                             0.5

    8                             207

    9                             0.8

    10                            335

    11                            0.3

    12                            0.5

    13                                      0.3

    14                                      0.6

    15                                      0.2

    16                                      0.5

    17                                      0.7

    18                                      256

    19                                      0.2

    20                                      0.3

本发明正是基于包括上述进展在内的许多新的发现，涉及如下内容：在模板和引物不存在而有蛋白质存在条件下使脱氧核苷酸聚合为特征的DNA合成法；通过这一方法合成的多脱氧核苷酸；使这个DNA转染细胞，再通过培养转染了的细胞创造出新的DNA的方法；以及这个DNA和其用途。

本发明的ntp-DNA合成方法，如上所述，是在不存在模板和引物而有蛋白质存在条件下进行的。虽然聚合反应是通过DNA聚合酶进行的，但也可以将该聚合酶本身作为蛋白质使用。所说的聚合酶也可以用别的蛋白质代替。

优选的聚合酶大约在20℃以上不失活，理想的是在大约60℃以上也不失活，最理想的聚合酶即使在大约70℃以上也不失活。例如属于Thermococcus属的细菌DNA聚合酶除了上述的Thermococcus litoralis的DNA聚合酶(Vent DNA Polymerase(trademark)，New EnglandBiolabs)以外还有Thermococcus profundus(ATCC 51592)的DNA聚合酶，Thermococcus peptonophilus DNA聚合酶；Thermococcusstetteri DNA聚合酶。

而属于Thermus属的细菌DNA聚合酶有Thermus aquaticus的DNA聚合酶(Ampli Taq DNA Polymerase(trademark)、PerkinElmer)、Thermus thermophilus DNA聚合酶(Tth DNA Polymerase(trademark)，Promega)、Thermus flavus-derived DNA聚合酶(TflDNA Polymerase(trademark)Promega)、Thermus lacteus(ATCC 31557)DNA聚合酶、Thermus rubens(ATCC31556)的DNA聚合酶、Thermus ruber(ATCC 51134)的DNA的聚合酶、Thermus filifomis(ATCC 43280)DNA聚合酶、ThermusScotoductus(ATCC 27978)DNA聚合酶。

上述DNA聚合酶既可以单独使用，也可以将2种以上(2种、3种…)聚合酶混合使用。同时用两种以上聚合酶聚合脱氧核苷酸与只用1种比，一次合成的DNA更多样化(即，可得到碱基序列更多种多样的DNA(群))。通过这一方式例如在染色体的合成中使可成为染色体DNA的DNA的含量增高了。

使用的脱氧核苷酸有dATP、dTTP、dGTP和和dCTP若反应体系中存在这4种核苷酸或其中3种，聚合反应就可进行。

脱氧核苷酸与DNA聚合酶的反应最好是在pH6附近的弱酸性、中性或pH10以下的弱碱性条件下进行。

反应温度和时间可以选择在聚合酶不失活的范围内，20℃以上，理想的是大约60℃以上聚合酶表现活性的温度范围下，通过反应0.5～24小时，理想的是1～15小时，最理想的时间是2～10小时，可以使反应快速进行。例如：可以于74℃反应数小时，或者按通常的PCR反应条件，如，反复进行如下循环条件下的反应：①95℃下保持1分钟、②45℃保持2分钟、③74℃下保持3分钟。

反应起初经过若干延迟时间后开始，很快达到最大反应速度。通过本发明的方法合成的ntp-DNA是不依赖于可作为模板和引物的DNA或RNA而只依赖于反应体系中存在的蛋白质(聚合酶)的信息合成的。

合成的DNA的大小通常在1kbp～30kbp之间，可通过反应条件使DNA的大小改变。例如若使用4种DNA的材料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP可以得到1～30kbp的DNA，若使用其中的3种，如以dATP、dCTP、dTTP为材料，可以得到大约10kbp的DNA，而以4种核苷酸为材料的反应体系中加入脱氧核酸酶I可以得到大约10kbp的DNA。

这样得到的ntp-DNA产物是双链DNA，其碱基组成，如实施例12为dA：34.4％、dC：15.6％；dG：17.4％；dT：32.6％。dG和dC的总和是33％。还有实施例14中DNA碱基序列里dTdA、dTdC、dAdG、dAdT、dCdT序列出现的频率高(实施例13，表2)。

合成的ntp-DNA因为有高频率重组活性，所以不用表达载体，就可转染酵母、大肠杆菌及其它的原核生物或真核生物，可使源于ntp-DNA的蛋白质表达。

另外，将ntp-DNA，例如用放射性同位素荧光色素(荧光素、生物素衍生物、7-羟基香豆素、若丹明B、曙红)等标记，用作探针去筛选与ntp-DNA相同或类似的来自人染色体着丝点或番茄染色体文库以及其它cDNA文库的序列。使用噬斑杂交法和DNA印迹法等众所周知的方法进行筛选。

而本发明人发现了如下使人吃惊的事。即：通过上述反应合成的DNA，在其碱基序列中，有作为染色体DNA表现功能所必需的3个区域的序列即8碱基或12碱基重复序列或没有重复的序列。如果将这个染色体DNA导入细胞内它容易与细胞内自然产生的组蛋白等蛋白质(染色体的另一要素)结合。

因此，用上述的DNA聚合酶，在细胞外或细胞内合成DNA，可以用合成的DNA作为细胞内的染色体DNA，使它成为染色体。

就是说：在细胞外部(试管内等)通过DNA聚合酶合成同一分子中具有着丝点区、端粒区以及复制起始区3个要素的双链DNA，然后导入细胞内，这个DNA(染色体DNA)在细胞内与组蛋白等蛋白质结合，行使一条染色体的功能。而若作为染色体行使一次功能，与细胞分裂同期，它只被复制一次，向每个子细胞只传给一个。或用表达载体，在细胞内让DNA聚合酶作用然后通过这个DNA聚合酶制造出染色体DNA，就可以把它作为细胞内染色体。

而作为染色体DNA行使功能的DNA是通过蛋白质，例如DNA聚合酶合成的新的DNA分子集团中的一部分。在合成的新的DNA分子集团中也有不行使染色体功能的DNA分子。将这样的DNA导入细胞内，它在细胞分裂过程中就消失了。换言之，将合成的新的DNA分子集团导入细胞内，然后培养这种细胞，经过一定次数的细胞分裂之后如果还有剩下的DNA，也可以说，这个DNA具备作为染色体DNA所必需的要素，可以充分地行使染色体DNA的功能。

如上所述，将合成的DNA导入细胞内，它就可充当染色体了。这里可以使用的细胞具体的有：人Hela细胞、人KB细胞、人CAPAN-1细胞、老鼠L1210细胞、老鼠3T3细胞、猴子COS7细胞、人PANC-1细胞等。而在这一反应体系中将耐药性基因等希望的基因以双链形式事先加入到这个反应体系中，在这个DNA两端附加上合成的新的DNA，作成一个含有目的基因的独立的染色体。也就是说可以使目的基因染色体化。

而本发明中使用的耐热的DNA聚合酶的制法，或编码这个酶的基因的纯化方法现在是众所周知的方法，若是本专业人员的话，很容易操作。以下列举了有关的公报：特开平2-60585号、特公平8-24570(特开平2-434号)、特开平5-68547号、特公平7-59195号(特开平5-130871号)、特开平5-328969号、特开平7-51061号、特开平6-339373号、特开平6-7160号等。

如上所述，本发明的目的是不依赖模板和引物，只通过DNA聚合酶创造出DNA即遗传信息，这样创造的DNA在基因工程领域内会起到重要的作用。通过创造天然不存在的DNA，可以创造基因，由这个基因创造蛋白质也是有可能的，例如，有可能创造出天然不存在的生理活性物质，如：酶、受体、信号传递物质，激素、抗癌物质、抗病毒物质、免疫抑制物质、膜运输蛋白质、与发育相关的物质、细胞骨架物质、与脑神经有关的物质等。而且这样创造的DNA可以作为遗传信息的片段去窥视生物进化过程中遗传信息的创造。使遗传信息再现，当然也可以利用它产生有用的突变体等。例如：认为存在于这一创造的DNA的构成要素中的重复序列有阐明基因复制、转录、表达的作用，也有成为由已知基因筛选这一调节部位的探针的作用。另外还有如下作用，即将这个ntp-DNA加到已知的基因的末端，然后插入到宿主细胞，会引起与宿主染色体的高频率的同源重组，可以使来自该基因的蛋白质表达。本发明实施简单且便宜，不需要特别的装置，预计在将来的基因工程领域内会起到更大的作用。

通过本发明可以很容易地合成带有着丝点区，端粒区以及复制起始区且连系在一起的双链直线型DNA(染色体DNA)，同时用得到的染色体DNA可以很容易地制造染色体。

附图的简单说明

图1是实施例1中合成的ntp-DNA溴乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳照片。

图2是说明脱氧核苷酸在实施例3的ntp-DNA合成中的影响的琼脂糖凝胶电泳照片。1是用dCTP、dGTP和dTTP合成的ntp-DNA，2是用dATP、dGTP和dTTP合成的，3是用dATP、dCTP和dTTP合成的，4是用dATP、dCTP和dGTP合成的，5是用dATP、dCTP和dGTP、dTTP合成的ntp-DNA的电泳结果。

图3是说明通过实施例4给出的各种DNA聚合酶合成ntp-DNA的琼脂糖凝胶电泳图，1是大肠杆菌聚合酶I(DNA聚合酶I)。2：Thermococus litoralis DNA聚合酶(Tli DNA聚合酶)，3：Thermusthermophilus DNA聚合酶(Tth聚合酶)，4：Thermus aquaticus DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)。

图4是确认实施例5中给出的酶中有无DNA或RNA掺杂的琼脂糖凝胶电泳照片。1：通常的ntp-DNA合成，2：用R Nase A进行过前处理的Tli DNA聚合酶，3：R Nase A处理的tRNA，4：R Nase A未处理的tRNA，5：R Nase A处理的λ/Hind III，6：R Nase A未处理的λ/Hind III，7：D Nase I进行前处理的Tli DNA聚合酶，8：DNase I处理的tRNA，9：D Nase Iλ/Hind III。

图5表示实施例6给出的合成的ntp-10kbp DNA的琼脂糖凝胶电泳图。1：10kbp ntp-DNA，2：通常的ntp-DNA。

图6：表示实施例7的ntp-DNA合成时间的推移的图。

图7：表示实施例9给出的通过单链特异核酸酶对ntp-DNA进行酶切的琼脂糖凝胶电泳图。1：Sl核酸酶处理的ntp-DNA，2：Sl核酸酶处理的λ/Hind III，3.Sl核酸酶处理的M13mp18单链DNA，4.绿豆核酸酶处理的ntp-DNA，5.绿豆核酸酶处理的λ/Hind III，6.绿豆核酸酶处理的M13mp18单链DNA，7、8、9分别是未经单链特异的核酸酶处理的ntp-DNA、λ/Hind III、M13mp单链DNA。

图8：实施例10的ntp-DNA圆二色光谱。实线是pPT1/ECoRI，虚线是ntp-DNA。

图9：实施例11的ntp-DNA的电子显微镜照片。

图10：表达载体pN897。

以下以实施例进一步说明本发明，但本发明并不受这些实施例限制。

实施例1(通过Thermococcus litoralis聚合酶(Vent DNAPolymerase(trademark)、New England biolabs)合成ntp-DNA)

先配制反应液100μl：其中含有缓冲液A[10nM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄、20mM Tris/HCl(pH8.8)、6mM MgCl₂、0.1％先特里顿X-100(都是终浓度)]、脱氧核苷酸[dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)]、20单位/ml Thermococcus litoralis聚合酶。然后向反应液中加入等量的矿物油(Sigma社制)，74℃下反应3小时。然后，取20μl反应液进行1％琼脂糖、Tris/乙酸/EDTA凝胶电泳[Sambrook.T等Molecular Cloning(A Laboratory Manual)ColdSpring Harbor Laboratory Press 1989年发行]，电泳后用溴乙锭染色、照相，其结果，可以看到如图1照片所示那样，在大约1kbp～30kbp范围内都有染色的DNA带。

实施例2(用核苷酸，通过Thermococcus litoralis DNA聚合酶合成ntp-DNA)

向含有缓冲液A、核苷酸[ATP、CTP、GTP和TTP(最后终浓度都是200μM)]、20单位/ml Thermococcus.litoralis DNA聚合酶的100μl反应液中加入等量的矿物油，74℃下反应3小时。然后取20μl反应液加到1％琼脂糖、Tris/乙酸/EDTA凝胶上，进行电泳，电泳后用溴乙锭染色、照相，结果未出现被染色的RNA带，由此表明在这个ntp式的合成反应中，核苷酸不能作为底物。

实施例3(脱氧核苷酸在Thermococcus litoralisDNA聚合酶进行的ntp-DNA合成中的影响)

向含有缓冲液A、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP、dTTP中的任意一种或2种、3种、4种(终浓度都是200μM)〕、20单位/mlThermococcus litoralis DNA聚合酶的100μl反应液中加入等量的矿物油，74℃下反应3小时。然后各取反应液10μl加到1％琼脂糖、Tris/乙酸/EDTA凝胶上进行电泳，电泳后用0.5μg/ml溴乙锭染色、照相。其结果如图2所示，使用全部4种核苷酸的以及使用dATP、dGTP、dTTP3种核苷酸的，还有使用dATP，dCTP和dTTP3种核苷酸时，能看到ntp-DNA带，使用其它的1种，2种，3种核苷酸的反应都没有看到ntp-DNA带。由此表明，在ntp-DNA合成反应中存在着对成为底物的脱氧核苷三磷酸的特异性(即，这个反应的底物特异性)。而且，加了全部4种脱氧核苷三磷酸的反应中，合成的ntp-DNA分布于大约1kbp～30kbp范围内，而加了3种的反应中合成的DNA带分布于大约10kbp以上范围内，在这范围以上的带几乎看不到了。由这些DNA带分布的不同暗示出这些ntp-DNA合成产物可能是其它种类的DNA。即，暗示出在这个ntp式的DNA合成反应中可能包含几个不同的反应。

实施例4(利用各种DNA聚合酶合成ntp-DNA)

向含有缓冲液A、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP以及dTTP(终浓度都是200μM)〕、各种DNA聚合酶〔20单位/ml Thermococcuslitoralis DNA聚合酶或者50单/ml Thermus aqualicus DNA聚合酶、或是40单位/ml Thermus Thermo philis DNA聚合酶(都是终浓度)〕的100μl反应液中加入等量的矿物油，74℃下反应3小时。另外向含有缓冲液B〔60mM磷酸缓冲液(pH7.4)，6mM MgCl₂〕、脱氧核苷酸〔300μM dATP和dTTP以及15mM dGTP和dCTP(都是终浓度)〕、2.5单位/ml大肠杆菌DNA聚合酶I的100μl反应液中加入等量的矿物油，37℃下反应3小时。然后，从各个反应液中取出10μl加到1％琼脂、Tris/乙酸/EDTA凝胶上进行电泳，电泳后，用0.5g μg/ml溴化乙锭染色、照相。其结果如图3所示，来自嗜热菌Thermus aqualicus和ThermusThermophilus的DNA聚合酶的反应中，可分别看到数个bp～10kbp和数个bp～7kbp(相同顺序)的DNA带。可是同样来自原核细菌的大肠杆菌的DNA聚合酶的反应中却看不到DNA带。由此可看出，这个ntp式的DNA反应因聚合酶种类不同而有很大的差别。包括Thermus litoralisDNA聚合酶在内的DNA聚合酶的反应中都可发生ntp-DNA的合成反应，表明这个反应是个相当普遍的现象。

实施例5(确认ntp-DNA合成反应中有无DNA或RNA混在酶中)

向含有缓冲液A、1μg/ml核酸酶A(R Nase A、Worthington社制)或1.25μg/ml脱氧核酸酶I(D Nase I Boehringer MannheimBiochemical制)、20单位/ml Thermus litoralis DNA聚合酶的反应液92μl中加入等量矿物油，37℃下反应2小时，再向反应液中加入8μl2.5mM的脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP以及dTTP(终浓度都是200μM)〕，74℃下反应3小时，然后向20μl反应液中加1μl 500mMEDTA，这样的样品用于1％琼脂、Tris/乙酸/EDTA凝胶电泳。电泳后用0.5μg/ml溴化乙锭染色、照相。另外，为了看到各个核酸酶的阳性反应，作为对照实验，配制含有缓冲液A、1μg/ml转移RNA(tRNA、Sigma社制)或30μg/ml Hind III切的λDNA(λ/Hind III东洋纺织社制)的92μl反应液，进行与上述相同的反应和电泳。其结果如图4所示那样，R Nase A和D Nase I在该缓冲液中的确可以切断各自的RNA和DNA(同顺序)。因此反应液用R Nase A和D Nase I处理可分解也许混在反应液中的RNA或DNA，这也表明，从发生ntp式的合成来看，这个反应中的确不需要RNA或DNA引物。

实施例6(通过Thermococcus litoralis聚合酶合成10kbp的ntp-DNA)

向含有缓冲液A、1.25μg/ml DNase I、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、20单位/mlThermococcus litoralis DNA聚合酶的反应液100μl中加入等量的矿物油，37℃下反应30分钟，接着再于74℃下反应3小时后，取20μl反应液加到1％琼脂糖、Tris/HCl/EDTA凝胶上进行电泳，电泳后用0.5μg/ml溴化乙锭染色、照相。结果如图5所示，在10kbp附近出现浓的DNA带。这一结果表明，有可能根据反应条件可以任意地改变所生成的DNA长度。

实施例7(ntp-DNA合成反应的推移)

向含有缓冲液A、脱氧核酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、〔α-³²P〕标记的脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是100μM、3.3×10⁶Bq/pmol)〕、20单位/ml Thermococcus litoralis DNA聚合酶的50μl反应液中加入等量的矿物油，于74℃下分别反应0，1，2，3和4小时，然后加入2μl500mMEDTA终止反应，再将4μl的反应液加入到96μl的小牛胸腺DNA中，通过液体闪烁仪测定酸不溶组分的³²P的放射能。其结果如图6所示，直到反应后1小时，仍没有脱氧核苷酸掺入，2小时后才开始出现，直到反应4小时后，才编入了大约9％的加入的脱氧核苷酸。而从1小时至2小时的反应计算最大反应速度，一个蛋白质分子，每秒掺入0.88碱基。这个速度是Thermococcus litoralis DNA聚合酶通常的模板以及引物依赖性DNA聚合反应速度的76分之一，大肠杆菌DNA聚合酶I的57分之一，所以可以认为这种反应是与通常的模板及引物依赖性的DNA合成反应完全不同的别的反应。

实施例8(ntp-DNA合成产物的纯化)

向含有缓冲液A、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、20单位/ml Thermococcus litoralis DNA聚合酶的475ml的反应液中加入等量的矿物油，于74℃下反应3小时。然后向反应液中加入与矿物油等量的氯仿，17700xg离心2分钟，将上层液移到别的容器内。通过这一操作，将矿物油从反应液去除后，向剩下的溶液中加入0.1倍量的乙酸钠溶液和2.5倍量的乙醇，于-85℃下保存2小时。然后将它离心分离后回收DNA，溶解于5ml TE缓冲液中〔10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕。这一粗制的DNA溶液经氯化铯-溴化乙锭密度梯度平衡离心〔Sambrook等，MolecularCloning(A Laboratory Manual)Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989年发行〕纯化。可得到9.5mg ntp-DNA。

实施例9(利用对单链DNA特异的核酸酶切ntp-DNA)

将含有Sl缓冲液〔50mM醋酸/NaOH(pH5.0)、30mM NaCl、1mM ZnSo₄、26单位/ml Sl核酸酶(宝酒造社制)〕或者是MB缓冲液〔30mM醋酸/NaOH(pH4.6)、280mM NaCl、1mM ZnSO₄、43单位/ml绿豆核酸酶(东洋纺织社制)〕、58.5μg/ml ntp-DNA或者是20μg/ml M13mp18单链DNA的10μl反应液于37℃反应5分钟，然后加1μl 500mMEDTA终止反应，再将反应液加到1％琼脂糖、Tris/乙酸/EDTA凝胶上电泳，电泳后用0.5μg/ml溴化乙锭染色，照相。结果如图7所示，单链DNA被切断，原有带消失，但ntp-DNA反应前后的带无变化，它没有被核酸酶切断。由此暗示出ntp-DNA是单链以外的DNA，例如可能是双链DNA。

实施例10(通过圆二色光谱解析ntp-DNA的双螺旋结构)

将实施例8中制备的ntp-DNA700μg溶解于TE缓冲液〔10mMTris/HCl(pH8.0)，、1mM EDTA〕0.5ml里，用圆二色分光光度仪J-500A(日本分光株式会社)，于室温下测定溶液的圆二色光谱。测定结果如图8所示，图8中实线代表的ntp-DNA表示出与虚线代表的典型的双链B型DNA所代表的直线型pPT1质粒DNA的圆二色光谱几乎类似的光谱。这暗示每单位浓度的这种DNA存在着同样“密度”的右手螺旋。因此得出的结论是这个ntp-DNA是双链B型DNA。

实施例11(通过电子显微镜观察ntp-DNA)

利用实施例7中制备的ntp-DNA 0.05μg，通过查里巴斯哈〔J.Virol.第12卷第1131～1138页(1973)〕的方法使用透射电子显微镜观察，结果如图9所示，ntp-DNA是直线型DNA。

实施例12(ntp-DNA的碱基组成)

将含有缓冲液C〔25mM Tris/HCl(pH8.0)、25mM MgCl₂〕、1.5mg/ml ntp-DNA、50单位DNase I 5单位/ml磷酸二酯酶I、2.3单位/ml碱性磷酸酶(宝酒造社制)的20μl反应液于37℃反应2小时。然后将反应液通过用PA试剂(10mM磷酸二氢钠∶乙腈＝98∶2)平衡了的4ml的Cosmosil 5 C18柱(Na Karaichem制)，再用PA试剂洗脱，从dA、dC、dG、dT各峰的面积测定它们各自重量，计算碱基组成的比率。结果如表1所示，dA：34.4％、dC：15.6％、dG：17.4％、dT：32.6％，所以GC含量为33％。

实施例13(ntp-DNA相邻碱基出现的频率)

向含有缓冲液A、脱氧核苷酸〔d ATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、〔α-³²P〕标记的脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是100nM、3.3×10⁶Bq/pmol)〕、20单位/ml Thermococcus litoralis DNA聚合酶的50μl反应液中加入等量的矿物油，于74℃下反应3小时。然后加20mM EDTA终止反应。再向反应液中加酚∶氯仿(1∶1)溶液、7700xg离心2分钟，将40μl上层液过24ml Sepharose12凝胶过滤柱(Pharmacia)，用TE缓冲液洗脱，然后加入550μg/ml小牛胸腺DNA 3μl、0.1倍量的乙酸钠溶液、2.5倍量的乙醇，混合后，-85℃放置一夜。于4℃下，21600g离心40分钟后，沉淀用70％乙醇洗净干燥后溶解于20μl TE缓冲液，再加入缓冲液MP〔20mM琥珀酸/NaOH(pH6.0)、10mM CaCl₂、19单位/mlmicrococcus核酸酶、0.5单位/ml胰磷酸二酯酶(都是终浓度)〕，整个反应液840μl于37℃反应3小时。然后全部反应液过4ml的Cosmosil5C₁₈柱(Nakaraichem制)。用甲酸钙洗脱，回收dAp、dCp、dGp、dTp各峰，将溶液的容积调到1.5ml，各取200μl移入Ledicap(Beckman制)干燥后用液体闪烁器测定³²P的放射能。其结果如图2所示，碱基序列存在偏移。

实施例14(ntp-DNA的克隆)

使含有缓冲液D〔50mM Tris/HCl(pH7.6)、10mM MnCl₂、0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)〕、400μg/ml ntp-DNA、0.08单位/ml DNase I的反应液于15℃下反应20分钟，然后加20μl 500mMEDTA终止反应，再加入等量的酚∶氯仿(1∶1)混合，9600xg离心5分钟，将上层液移到别的容器。(以上略称为酚处理)上层液加入等量的氯仿混合后进行上述的离心操作，将上层液移到别的容器，该上层液再经氯化铯-溴化乙锭密度梯度平衡离心纯化，然后溶解于TE缓冲液〔10mM Tris/HCl(pH8.0)、1mM EDTA〕40μl中(成为ntp-DNA/DNase I)。

进行上述DNA的脱磷酸化。将含有脱磷酸化缓冲液〔50mMTris/HCl(pH9.0)、10mM MgCl₂〕，60μg/ml ntp-DNA/D Nase I、100单位/ml碱性磷酸酶(宝酒造社制)的100μl反应液于65℃反应1小时，进行酚处理，向反应液中加入0.1倍量的3M醋酸钠混合后再加入2.5倍量的乙醇，-20℃下放置一夜。于4℃下21600xg离心30分钟(以下简称为乙醇沉淀)。沉淀用70％乙醇洗净、干燥后，溶于10μl TE缓冲液中(成为脱磷酸化ntp-DNA/DNase I)。

进行上述DNA的磷酸化。使含有磷酸化缓冲液〔50mM咪唑/HCl(pH6.4)，18mM MgCl₂、5mMDTT〕、6％聚乙二醇#8000、150μMATP、120μg/ml脱磷酸化ntp-DNA/D Nase I、1.5单位/μl T4多核苷酸激酶(东洋纺织社制)的40μl反应液37℃反应1小时，然后经酚处理和乙醇沉淀纯化DNA，溶解于10μl TE缓冲液(成为磷酸化ntp-DNA/D Nase I)。

磷酸化ntp-DNA/D Nase I反应中，双链DNA的某些地方存在变为一条链的间隙，所以通过DNA聚合酶进行修复。使含有修复缓冲液〔50mM Tris/HCl(pH7.5)、10mM MgSO₄、0.1m MDTT、50μg/mlBSA〕、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、120μg/ml磷酸化ntp-DNA/D Nase I、166单位/mlKlenow片断(东洋纺织社制)的50μl反应液于25℃反应15分钟，然后经酚处理和乙醇沉淀纯化DNA，溶解于10μl TE缓冲液(成为修复ntp-DNA/D Nase I)。

进行上述DNA的磷酸化。使含有磷酸化缓冲液〔50mM咪唑/HCl(pH6.4)、18mM MgCl₂、5mM DTT〕、6％聚乙二醇#8000、150μMATP、120μg/ml脱磷酸化ntp-DNA/D Nase I、1.5单位/μl T4多核苷酸激酶(东洋纺织社制)的反应液40μl于37℃反应1小时，然后经酚处理和乙醇沉淀纯化DNA，溶解于10μl TE缓冲液(成为磷酸化ntp-DNA/D NaseI)。

在磷酸化ntp-DNA/D Nase I反应中，双链DNA的某些地方另存在变为单链的间隙，所以，通过DNA聚合酶进行修复。使含有修复缓冲液〔50mM Tris/ml(pH7.5)、10mM MgSO₄、0.1mM DTT、50μg/mlBSA〕、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是25μM〕、120μg/ml磷酸化ntp-DNA/D Nase I、166单位/ml Klenow片断(东洋纺织社制)的50μl反应液于25℃反应15分钟，接着进行酚处理和乙醇沉淀纯化DNA，最后溶于10μl TE缓冲液。(成为修复ntp-DNA/D Nase I)。

接下来制备克隆载体。使含有Sma I缓冲液〔10mM Tris/HCl(pH7.5)、7mM MgCl₂、20mM KCl、7mM 2-巯基乙醇〕、125μg/mlpUC19、1.6单位/μl SmaI的200μl反应液30℃反应2小时。然后经酚处理和乙醇沉淀纯化DNA，沉淀溶于80μl的蒸馏水。向里边加入10μl 10倍量的脱磷酸化缓冲液、10μl 0.4单位/ml碱性磷酸酶，总量配成100μl，60℃下反应30分钟。之后经酚处理、乙醇沉淀，纯化DNA，将沉淀溶于20μl TE缓冲液(成为pUC19/SmaI)。

下面对DNA进行连接反应。使含有连接缓冲液〔30mMTris/HCl(pH7.8)、10mMDTT、1mMATP〕、10μg/ml pUC19/SmaI、60μg/ml修复ntp-DNA/D Nase I、600单位/ml T4 DNA连接酶(Promega制)的反应液100μl于16℃反应24小时。然后于65℃下放置10分钟使酶失活。用一部分连接反应液转染大肠杆菌(E.Coli)JM109、于LB苄青霉素平板〔1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml异丙基-β-D-半乳糖吡喃苷(IPTG)、40μg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D半乳糖苷(X-gal)、1.5％琼脂粉〕挑选转化菌落。

在上述挑选中，分离阳性菌落，制备质粒〔Sambrook等，Molecularcloning(A.Laboratory manual〕。结果分离出来自3种ntp-DNA的DNA片段被克隆的质粒DNA，分别命名为pTL34、pTL57和pTL85。

实施例15(ntp-DNA碱基序列的确定)

利用双脱氧链终止法确定插入pTL34，pTL57和pTL85的ntp-DNA的碱基序列。得到的序列分别表示为序列表中的序列1、2、3(表3)。从这一结果发现克隆到pTL34的ntp-DNA产物是8个碱基的重复序列。而克隆于pTL57的ntp-DNA是12个碱基的重复序列，克隆于pTL85的DNA也是类似于重复序列的序列。

下面使用Genbank数据库对序列表中的序列1、2、3表示的碱基序列进行同源性检索。结果如表4、表5和表6(同顺)表示的那样，这些序列从低等直到高等生物保存了很多，其中已知位于着丝点附近的小的卫星DNA中存在这些序列，可以推测，这些序列在遗传学可能有重要作用。

实施例16(用ntp-DNA作为探针筛选重复序列)

向20μg/ml ntp-DNA中加入交换缓冲液〔50mM咪唑/HCl(pH6.4)、18mM MgCl₂、5mM DTT、0.1mM精脒HCl。0.1mMEDTA〕和0.1mM ADP、1mMATP、1μM〔r-³²P〕ATP(111TBq/mmol)4.8％聚乙二醇8000、400单位/ml T4多核苷酸激酶、37℃、温育30分钟、加入终浓度为20mM的EDTA终止反应。经酚处理，乙醇沉淀，回收DNA，把它作为杂交探针。

为筛选重复序列，进行噬斑杂交。首先将大肠杆菌(Escherichiacoli)Y1090(γ-)接种于50ml加了20％麦芽糖的NZYM培养其中〔1％酪蛋白(酶水解产物)、0.5％NaCl、0.5％酵母提取物、0.1％酪蛋白水解氨基酸、0.2％MgSO₄·7H₂O，pH7.0〕，于37℃培养5小时。通过4000xg离心10分钟，收集菌体，悬浮于0.01M MgSO₄，作成悬浊液，与用SM〔0.58％NaCl、0.2％MgSO₄·7H₂O，50mMTris/HCl(pH7.5)、0.01％明胶〕适当稀释的番茄cDNA文库λ噬菌液(Clonetech CLT10836)混合，37℃培养20分钟，将它加到ZNCYM下层琼脂培养基，然后在上面再加一层NZYM琼脂培养基，37℃培养一夜。在这个培养皿的琼脂上放置硝酸纤维素滤膜(millipore社制)，放一分钟，然后慢慢地将滤膜揭下来，于室温下干燥20分钟。再将它放在浸了变性液(0.2N NaCl、1.5M NaCl)的滤纸(Whatman 3MMWhatman社制)上，放5分钟，然后再放到浸了中和液〔3M NaCl、0.3M柠檬酸三钠2水合物(20×SSC)、2M Tris/HCl(pH7.5)〕的滤纸上，放5分钟，将滤膜在中和液中浸1分钟、2×SSC中性液中浸5分钟后，用3MM滤纸吸干.再将滤膜夹在3MM滤纸、于真空烘箱中80℃干燥2小时。接下来将干燥后的滤膜在杂交液〔50mMHepes/NaOH(pH7.0)、0.2％聚乙烯吡咯烷酮、0.2％phycol400、0.2％小牛血清清蛋白、100μg/ml变性的鲑精DNA、50％甲酰胺〕充分地浸湿。再加50ml杂交液，密封，42℃下放一夜。倒掉杂交液，再加入加了经100℃加热5分钟后冰冷却的杂交探针的杂交液10ml，再密封，42℃培养一夜。将滤膜在洗净液I(2×SSC、0.1％SDS)浸1小时，接下来再在洗净液2(0.5×SSC、0.1％SDS)浸泡，50℃下洗2小时，再在3MM滤纸上干燥滤膜，进行放射自显影，找阳性噬斑。结果，找到了阳性噬斑，由此表明，ntp-DNA，例如在小的卫星DNA的筛选中可以作为探针。

用巴斯德吸管将这种阳性噬斑移入1ml SM液中，滴一滴氯仿，室温下放1小时，然后再用SM适当地稀释，与100μl细菌悬浊液一起加到500ml的NZCYM培养基中，37℃培养一夜然后向里边加入10μl氯仿，经7870xg，10分钟离心，回收血清，向这一上清液中加30μl缓冲液L1(20mg/ml R Nase A，6mg/ml D Nase I，0.2mg/ml小牛血清清蛋白，10mM EDTA、100mM Tris/HCl，300mM NaCl，pH7.5)。37℃培养30分钟，然后再加入冷的缓冲液L2(30％聚乙二醇6000，3M NaCl)2ml、在冰中放1小时，17700xg 4℃下离心15分钟，回收沉淀。将该沉淀悬浮于缓冲液L3(100mM Tris/HCl、100mM NaCl、25mMEDTA、pH7.5)1ml中，接着再加1ml溶液L4(4％SDS)，于70℃培养10分钟，然后加入冰中冷却的溶液L5(2.25M醋酸钾缓冲液，pH4.8)1ml，混合后，于4℃下21600xg离心30分钟，回收上清，将上清加到事先已用缓冲液QBT(750mM NaCl、50mM Mops、15％乙醇pH7.0、15％特里顿X-100)平衡了的QIAGENTIP-20柱(Chiagen社制)，进行柱层析。用缓冲液QC(1M NaCl、50mMMops、15％乙醇、pH7.0)2ml洗柱子，再用15ml缓冲液QF(1.25MNaCl，50mM Tris/HCl，15％乙醇pH8.5)将DNA洗脱出来，向洗下来的DNA中加入0.8倍量的异丙醇、-20℃下放置20分钟，于4℃下21600g离心30分钟，回收DNA。该DNA沉淀用70％乙醇洗净干燥后，溶于10μl TE缓冲液〔10mM Tris/HCl(pH8.0)、1m MEDTA〕。本发明人将这个λ噬菌体DNA命名为λTL2 DNA。

接下来确定这个λTL2 DNA的碱基序列。采用上述的双脱氧链终止法。作为引物使用市售的λgt11引物.结果，存在着来自ntp-DNA的重复序列。这表明这个ntp-DNA可作为筛选这一重复序列的探针。

实施例17(通过ntp-DNA引发的高频率重组法)

向25μg质粒pCH110中加缓冲液BM〔50mM Tris/HCl(pH7.5)、10mM MgCl₂、100mM NaCl、1mM DTT〕、2000单位/ml BamHI(东洋纺织社制)，总量为100μl的反应液于37℃下反应2小时。然后经酚处理、乙醇沉淀、回收DNA。再将它溶于25μl TE缓冲液〔10mMTris/HCl(pH8.0)，1mM EDTA〕。然后向这25μl DNA溶液中加入PCR缓冲液〔10mM Tris/HCl(pH8.3)，50mM KCl、3.5mM MgCl₂、0.001％酪蛋白〕、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、1nM G1引物、1nM G2引物、25单位/ml Amli TaqDNA聚合酶；作成总量为2.5ml反应液。在这反应液上层加入等量的矿物油(sigma社制)。经95℃下1分钟、50℃下2分钟、72℃下3分钟的温度循环，重复30次循环，然后用等量的氯仿除去矿物油，经酚处理，乙醇沉淀，回收DNA，溶于20μl TE缓冲液。这个粗制DNA溶液再通过前述的氯化铯-溴化乙锭密度梯度平衡离心法精制。结果得到20μg的在β-半乳糖苷酶基因的上游有面包酵母的GAL1启动子，而它的下游有面包酵母转录终止信号CYC1末端序列的DNA。将这一DNA溶解于20μl TE缓冲液，然后加入缓冲液A〔10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、20mM Tris/HCl(pH8.8)、6mM MgCl₂、0.1％特里顿X-100(都是终浓度)、脱氧核苷酸〔dATP、dCTP、dGTP和dTTP(终浓度都是200μM)〕、20单位/ml Thermus litoralis DNa聚合酶，总量调为2ml作为反应液，然后于74℃下反应3小时。再经酚处理、乙醇沉淀，回收DNA，溶解于20μl TE缓冲液中，再通过氯化铯-溴化乙锭密度梯度平衡离心精制，将得到的DNA溶于20μl TE缓冲液中。

将面包酵母接种于20ml YPD培养基(1％酵母提取液、2％蛋白胨、2％葡萄糖、30℃下培养过夜。然后取2ml培养液移到200ml的YPD培养基中、再于30℃下培养过夜，接着400g离心5分钟，收集酵母细胞，加入20ml的SED溶液(1M山梨糖醇、25mM EDTA、50mMDTT)，使细胞悬浮，于30℃下培养10分钟，再同样离心，收集酵母细胞，悬浮于20ml的SCE溶液〔1M山梨糖醇、100mM柠檬酸/NaOH(pH5.8)、10mMEDTA〕。然后加入0.2ml的葡萄糖苷酶，30℃下培养1小时，然后于300g离心5分钟，收集酵母原生质球。将这一沉淀用20ml 1M山梨糖醇洗2次。最后再用20ml的STC溶液〔1M山梨糖醇、10mM CaCl₂、10mM Tris/HCl(pH7.5)〕洗净。将沉淀悬浮于1ml STC溶液，分成每份100μl。取其中100μl加入上述DNA溶液5μl，室温放置10分钟，然后加入1ml PEG溶液〔20％聚乙二醇3300、10mM CaCl₂、10mM Tris/HCl(pH7.4)，室温放置10分钟。300g、离心5分钟后，沉淀悬浮于150μl的SOS培养基(2M山梨糖醇10ml、1M CaCl₂ 0.1ml、YPD培养基6.7ml、1％亮氨酸27μl、蒸馏水3.17ml)，于30℃下培养20分钟，然后加到预先于45℃融化了的6mlSYG琼脂培养基〔18.2％山梨糖醇、2％琼脂、0.67％酵母膏(不含氨基酸)、2％葡萄糖、0.001％腺嘌呤、0.004％尿嘧淀〕，铺在SYG琼脂平板培养基上，30℃下培养3天。

从平板培养基挑选菌落接种于5ml的YPD培养基中，30℃下培养过夜。400g离心5分钟，沉淀悬浮于250μl的BK缓冲液〔100mMTris/HCl(pH8.0)，1mM DTT，20％甘油〕。再向里边加入12.5μl PMSF溶液(40mM苯甲基磺酰氟)，激烈搅拌。再加入250μl BK缓冲液，充分搅拌。17700g离心15分钟，将上清移到别的容器，向50μl的上清液中加入50μl BK缓冲液和0.9mlZ缓冲液(1.61％Na₂HPO₄·7H₂O、0.55％NaH₂PO₄、0.075％KCl 0.0246％MgSO₄、0.27％β-巯基酚)、28℃下培养5分钟。然后通过加0.2mlONPG溶液(4mg/ml O-硝基苯-β-D-半乳糖吡喃苷)，使反应开始，于28℃培养30分钟后加入0.5ml 1M Na₂CO₃溶液，终止反应。然后测定420nm的吸光度。利用Brad Ford色素结合法〔Brad Ford(Anal，Biochem)第72卷，第248～254页(1976)〕对蛋白质定量，从吸光度和蛋白质的量计算出菌抽提液中的β-半乳糖苷酶活性。20个检测样品中有4个有β-半乳糖苷酶活性(表6)。这一结果证明，半乳糖苷酶借助于其末端加上的ntp-DNA被导入酵母染色体中了。使用与β-半乳糖苷酶基因序列互补的荧光标记(罗丹明标记)的探针和使用与ntp-DNA互补的荧光标记(用荧光素标记)的探针，对那些有β-半乳糖苷酶活性的菌株进行双重原位杂交。结果发现，β-半乳糖苷酶基因与ntp-DNA靠近，存在于酵母染色体中。由此表明ntp-DNA有引起高频率重组的活性。

实施例18(染色体DNA的合成)

使如下配比的1ml反应液于74℃反应3小时。反应液组成为：10mM KCl、10mM(NH₄)₂SO₄、20mM Tris/HCl(pH8.8)、6mMMgCl₂、0.1％Triton X-100(sigma制)、脱氧核苷三磷酸(0.2mMdATP 0.2mM M dTTP、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、20单位/mlThermococcus litoralis DNA聚合酶(商品名：Vent DNA聚合酶、NewEngland Biolabs.社制)。

然后取20μl反应液加到1％琼脂糖凝胶上进行电泳(Sambrook等，Molecular Cloning(A laboratory manual)cold Spring HarborLaboratory Press 1989年发行)，电泳后用0.5μg/ml溴化乙锭染色，紫外线下照相，结果可看到合成的100～50,000碱基对大小的DNA。

对剩下的上述980μl反应液通过酚处理、氯仿洗、乙醇沉淀、氯化铯密度梯度平衡离心法(分子遗传学实验法、小关治男等人著，共立出版(株)，1983年)，精制DNA，得到大约20μg DNA。

(染色体DNA的碱基序列)

将所得DNA的一半用于确定DNA碱基序列。已经弄清楚的一部分碱基序列表示在序列表1-3中。DNA的碱基序列是多样的，有重复序列、或其中部分序列中不含重复序列的序列。具体地讲在得到的DNA中有〔CTAGATAT〕8碱基序列多次重复的部分(参考序列表1)。这一重复部分被认为发挥着丝点的功能。另外也有〔TTGGGG〕富含鸟嘌呤的重复序列，这部分发挥着端粒的功能。此外，还有〔TAGATATCTATC〕、〔GGAAT〕等重复序列。

(染色体DNA向细胞的导入)

将上述剩下的一半DNA，通过磷酸钙共沉淀法导入细胞内(人的Hela细胞)(导入后该DNA与组蛋白结合)，进行继代培养。大约在分裂10次后，从细胞中提取DNA，以(CTAGATAG)15为探针，利用DNA印迹法(分子遗传学实验法)进行DNA的检索。从结果可知细胞内残存着该DNA。

由此表明得到的DNA中含有起着染色体功能的染色体DNA(假如，合成的DNA不具备着丝点区域、端粒区域，或复制起始区域，就不会发挥作为染色体DNA的功能，细胞分裂后应当一个剩余的DNA也没有，既使用(CTAGATAT)15探针进行检索，应当什么也检测不出来了)。而Hela细胞内原有的DNA(即，Hela细胞的染色体DNA)和本实施例中导入的DNA，其大小不同，可以区分开，不会混淆。

通过原位杂交方法，以荧光标记的探针作为记号，用足够高的放大倍数的显微镜可以观察到分裂期染色体。

实施例19

用Thermus aquaticus DNA聚合酶代替实施例18中用的Thermococcus litoralis DNA聚合酶(Ampli taq DNA polymerase(trade mark)、Perkin elmer)也可得到与实施例18同样的结果。

实施例20

用Thermus thermophilus DNA聚合酶代替实施例18中用的Thermococcus litoralis DNA聚合酶(Tth DNA polymerase(trademark)、Promega)也可得到与实施例18同样的结果。

实施例21

本实施例中给出了在细胞内合成染色体DNA并在同一细胞内制造染色体的方法。

构建将Thermococcus litoralis DNA聚合酶基因插入真核细胞的表达载体的质粒pN897(图10)(这个构建操作若是本专业人员是很容易的。参照特开平6-7160号公报等。也可以使用下面的质粒。Gen Bankaccession number：M74196、ATCC保藏号68487、ATCC保藏号68447)。将这个质粒通过常规的磷酸钙法导入猴细胞cos7中。是否导入cos7细胞则以pN897带的耐新霉素基因作为选择的标志，通过在含有400μg/ml G418的培养基(含20％胎牛血清的Dalbetuco培养基)上培养确认。

导入pN897的cos7细胞再通过含有10μg/ml地塞米松的培养基培养2天，使pN897内的老鼠乳腺肿瘤病毒的LTR启动子活化。通过Western印迹法确认在cos7细胞内产生了Thermococcus litoralis DNA聚合酶蛋白质。这个蛋白质在细胞内合成染色体DNA，其中一部分合成的染色体DNA作为这个细胞的染色体发挥其功能，这可利用与实施例18同样的方法证明。

Claims (7)

1.一种多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，在没有模板以及引物两者的存在下，将含有脱氧核苷酸和蛋白质的反应液加热到20～90℃，使其反应0.5～24小时，使脱氧核苷酸聚合，其中所述脱氧核苷酸至少都含有脱氧腺苷5′-三磷酸(dATP)和脱氧胸腺嘧啶核苷5′-三磷酸(dTTP)，

上述蛋白质是属于Thermococcus属的细菌的脱氧核苷酸聚合酶和/或属于Thermus属的细菌的脱氧核苷酸聚合酶。

2.如权利要求1中记载的多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，属于上述Thermococcus属的细菌是Thermococcus litoralis。

3.如权利要求1中记载的多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，属于Thermus属的细菌是Thermus thermophilus和/或Thermusaquaticus。

4.如权利要求1记载的多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，上述脱氧核苷酸还含有脱氧胞嘧啶核苷5′-三磷酸(dCTP)和/或脱氧鸟苷5′-三磷酸(dGTP)。

5.如权利要求1记载的多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，在60～90℃的温度下进行反应。

6.如权利要求1记载的多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，在弱酸性、中性或弱碱性的溶液条件下进行反应。

7.如权利要求1记载的多脱氧核苷酸的合成方法，其特征在于，反应是在pH6～10条件下进行的。

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