CN1268758C - 发酵生产核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
通过如下方法生产核苷5’-磷酸酯：在培养基中培养属于埃希氏菌属、具有产核苷5’-磷酸酯能力的细菌，以在培养基中产生和积累核苷5’-磷酸酯，并由培养基中收集核苷5’-磷酸酯，所述细菌中ushA基因和aphA基因功能异常。
Description
发明背景
发明领域
本发明涉及发酵生产核苷酸的方法。核苷5’-磷酸酯等核苷酸可用作调味品、药物、其原材料等。
相关技术介绍
工业生产核苷5’-磷酸酯的已知方法包括发酵产生核苷，然后使所得核苷酶促磷酸化，以得到核苷5’-磷酸酯。
另一方面，也提出了直接通过发酵生产核苷5’-磷酸酯的方法。例如，日本专利公开(Kokoku)56-12438公开了一种生产5’-鸟苷酸的方法，包括培养一种属于芽孢杆菌属的细菌并收集培养基中产生和积累的GMP，所述细菌为腺嘌呤营养缺陷型，具有对德夸菌素或甲硫氨酸亚砜的抗性，具有生成5’-鸟苷酸(鸟嘌呤5’-单磷酸，也下文也简称为“GMP”)的能力。而且，有数篇关于来自产肌苷的枯草杆菌菌株并产生5’-肌苷酸(肌苷5’-单磷酸，下文也称为“IMP”)的衍生菌株的报导(Magasanik，B.等，生物化学杂志，226，339(1957)；Fujimoto，M.等，农业生物化学，30，605(1966))。但是，直接发酵生产核苷5’-磷酸酯通常效率较低，与上述酶法相比无实用价值。
关于直接发酵生产IMP存在困难的原因，已知的有IMP的细胞通透性差，降解IMP的降解酶广泛存在(核酸发酵，Aminosan KakusanShudankai编，Kodansha Scientific，日本)。为了克服这些障碍，人们已尝试缺失核苷酸降解活性。至于降解IMP成肌苷的降解酶，人们认为有5’-核苷酸酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶等(核酸发酵，上文)。此外，上述日本专利公开56-12438也提出，可以从具有低核苷酸酶活性的突变菌株获得具有高GMP产率的细菌。
至于工业水平生产核苷5’-磷酸酯的技术，已经发展了一种利用产氨短杆菌的突变菌株生产IMP的方法(Furuya et al.，应用微生物学，16，981(1968))。
如上所述，对直接发酵生产核苷5’-磷酸酯已经进行了一些研究，也已知一些成功的实例。但是，关于核苷酸降解酶尚有诸多不明之处，因而，产率的提高尚未被充分研究。具体而言，尚未有以属于埃希氏菌属的细菌实用规模生产核苷5’-磷酸酯的实例。
发明概述
本发明的完成过程中考虑了上述技术现状，本发明的目的是提供使用属于埃希氏菌属的细菌生产IMP等核苷5’-磷酸酯的方法。
发明人为达成上述目的进行了大量研究。结果，发明人发现，大肠杆菌中存在未知的编码5’-核苷酸酶的基因，并成功鉴定了该基因。并且，他们发现，如果新基因和已知的5’-核苷酸酶基因被破坏，具有肌苷或鸟苷生成能力的大肠杆菌可以生产IMP或GMP。至此，完成了本发明。
即，本发明提供：
(1)生产核苷5’-磷酸酯的方法，包括在培养基中培养属于埃希氏菌属、具有产核苷5’-磷酸酯能力的细菌，以在培养基中产生和积累核苷5’-磷酸酯，并由培养基中收集核苷5’-磷酸酯，所述细菌中ushA基因和aphA基因功能异常。
(2)上述(1)中的生产核苷5’-磷酸酯的方法，其中，向ushA或aphA基因中引入突变或破坏该基因以使其功能异常。
(3)上述(1)或(2)的生产核苷5’-磷酸酯的方法，其中，核苷5’-磷酸酯选自5’-肌苷酸或5’-鸟苷酸。
(4)属于埃希氏菌属、具有生成核苷5’-磷酸酯能力的细菌，其中，ushA和aphA基因被破坏。
(5)上述(4)中的属于埃希氏菌属的细菌，其中，核苷5’-磷酸酯选自肌苷酸或鸟苷酸。
(6)寻找影响核苷5’-磷酸酯积累的5’-核苷酸酶基因的方法，包括在含有第一种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的基本培养基中和含有第二种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的基本培养基中，培养亲本微生物菌株和已知的5’-核苷酸酶缺失的其衍生菌株，以观察亲本菌株和衍生菌株中的基因表达图谱，
计算亲本菌株和衍生菌株培养在含有第一种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的培养基中时各种基因的表达量的比例，和亲本菌株和衍生菌株培养在含有第二种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的培养基中时各种基因的表达量的比例，获得其乘积，选择具有较大乘积值的一个或多个基因。
(7)上述(6)的寻找5’-核苷酸酶基因的方法，其中，第一种核苷5’-磷酸酯为5’-肌苷酸，第二种核苷5’-磷酸酯为鸟苷酸。
(8)上述(6)或(7)的寻找5’-核苷酸酶基因的方法，还包括由选定基因中选择可以编码蛋白转运进入周质所需的信号序列的基因。
根据本发明，IMP和GMP等核苷5’-磷酸酯可以使用属于埃希氏菌属的细菌通过直接发酵生产。
优选实施方案
以下详述本发明。
(1)寻找未知5’-核苷酸酶基因
已知有一种大肠杆菌5’-核苷酸酶UDP-糖水解酶(UshA)，它是ushA基因(GenBank索引号X03895)的产物。已知该酶有5’-核苷酸酶活性，催化AMP、GMP、IMP和XMP等核苷5’-磷酸酯脱磷酸产生相应核苷(H.C.Neu，(1967)生物化学杂志，242，3896-3904；A.Cowman，I.R.Beacham，(1980)基因，12，281，286)。
发明人破坏了大肠杆菌W3110菌株的ushA基因，考察了其对核苷酸降解能力的影响。ushA基因破坏菌株(WΔushA)周质的5’-核苷酸酶活性较W3110菌株显著下降。但是，在含有核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的基本培养基中观察WΔushA菌株的生长时，该菌株可以生长。因此，人们认为，仅仅破坏ushA基因，核苷酸降解能力并为完全丧失。并且，当核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源时，迟滞了生长的开始。因此，估计在UshA没有功能时，有另一种5’-核苷酸酶被诱导。
发明人基于前述发现试图寻找未知的5’-核苷酸酶，发现报导为酸性磷酸酶基因(aphA)的一种基因(M.C.Thaller，S.Schippa，A.Bonci，S.Cresti，G.M.Rossolini，(1997)FEMS微生物通讯，146，191-198，GenBank索引号X86971)或yjbP(GenBank索引号AAC77025)的产物具有5’-核苷酸酶活性。
上述编码影响核苷5’-磷酸酯的积累的5’-核苷酸酶的基因可以按如下方法寻找。
首先，在含有如IMP或GMP的第一种核苷5’-磷酸酯或第二种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的基本培养基中，培养一种微生物亲本菌株和其中缺失了已知的5’-核苷酸酶的衍生菌株。当微生物是大肠杆菌时，已知的5’-核苷酸酶可以是上述的UshA。
然后，研究这些菌株的基因表达图谱。具体而言，观察各个基因在野生菌株和衍生菌株中表达量的比例。
最后，计算亲本菌株和衍生菌株培养在含有第一种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的培养基中时各种基因的表达量的比例，和亲本菌株和衍生菌株培养在含有第二种核苷5’-磷酸酯作为唯一碳源的培养基中时各种基因的表达量的比例，得到其乘积，选择具有较大乘积值的一个或多个基因。
尽管获得基因表达图谱的方法没有特别的限制，可以提及的一个实例是DNA阵列法(H.Tao，C.Bausch，C.Richmond，F.R.Blattner，T.Conway，(1999)细菌学杂志，181，6425-6440)。
由上述选定基因中，可以通过选择编码蛋白转运到周质必需的信号序列的基因进一步缩小靶基因的范围。这是因为，预计5’-核苷酸酶转运到周质中并其此发挥其功能。
对于大肠杆菌，如后文实施例所示，选择了两种基因b0220(也称为o157)和yjbP。其中，yjbP是酸性磷酸酶基因(aphA)。而b0220的功能尚未确定，被称为ykfE。当这些基因在大肠杆菌中扩增时，在ykfE基因扩增菌株中未观察到5’-核苷酸酶活性的显著增加，而aphA基因扩增菌株中观察到了5’-核苷酸酶活性的显著增加。因此，这证实aphA基因产物(AphA)具有5’-核苷酸酶活性。这样，发现aphA是编码影响核苷5’-磷酸酯积累的5’-核苷酸酶的基因。
(2)本发明的属于埃希氏菌属的细菌
本发明的属于埃希氏菌属的细菌是属于埃希氏菌属、具有产生核苷5’-磷酸酯能力的细菌，其中ushA基因和aphA基因功能异常。属于埃希氏菌属的细菌没有特别的限制，只要其为属于埃希氏菌属的细菌即可，如大肠杆菌。具体而言，可以使用Neidhardt等的文献(Neidhardt，F.C.et al.，大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌，美国微生物学会，华盛顿，1208，表1)中列出的菌株。
本发明属于埃希氏菌属的细菌可以通过以下方法获得：使用属于埃希氏菌属、具有嘌呤核苷生成能力的细菌作为亲本菌株，培育ushA基因和aphA基因功能异常的突变菌株或基因重组菌株。并且，本发明的属于埃希氏菌属的细菌也可通过按照培育嘌呤核苷生成菌株类似的方法培育作为亲本菌株的ushA基因和aphA基因功能异常的菌株获得。
属于埃希氏菌属、具有嘌呤核苷生成能力的细菌的实例包括属于埃希氏菌属、具有产生肌苷、鸟苷、腺苷、次黄苷、嘌呤核苷、6-甲氧嘌呤核苷、2，6-二氨基嘌呤核苷、6-氟嘌呤核苷、6-硫嘌呤核苷、2-氨基-6-硫嘌呤核苷、巯基鸟苷等的能力的细菌。通过使用属于埃希氏菌属、具有嘌呤核苷生成能力的细菌作为亲本菌株，培育ushA基因和aphA基因功能异常的突变菌株或基因重组菌株，可以获得属于埃希氏菌属、具有产生相应于各种嘌呤核苷的核苷5’-磷酸酯能力的细菌。
本发明中嘌呤核苷生成能力是指在培养基中产生和积累嘌呤核苷的能力。此外，“具有嘌呤核苷生成能力”的表达是指属于埃希氏菌属的微生物以较野生型大肠杆菌如W3110菌株更大的量在培养基中产生和积累嘌呤核苷。
并且，产生核苷5’-磷酸酯的能力是指在培养基中产生和积累核苷5’-磷酸酯的能力。此外，“具有嘌呤核苷生成能力”的表达是指属于埃希氏菌属的微生物以较野生型大肠杆菌如W3110菌株更大的量在培养基中产生和积累嘌呤核苷，优选该微生物在后文实施例6中的条件下培养时，以100mg/L或更大的量产生和积累核苷5’-磷酸酯，更优选1000mg/L或更大。
属于埃希氏菌属、具有嘌呤核苷生成能力的细菌的细节可以参见国际专利公开WO99/03988。更具体地说，可以提及上述国际专利公开中所述的大肠杆菌FADRaddG-8-3::KQ菌株(purFKQ，purA-，deoD-，purR-，add-，gsk-)。该菌株携带编码一种PRPP转酰胺酶的突变purF，该酶的AMP和GMP反馈抑制被脱敏，其中326位赖氨酸残基为谷氨酰胺残基置换，该菌株中琥珀酰胺-AMP合酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)、嘌呤抑制物基因(pruR)、腺苷脱氨酶基因(add)和肌苷/鸟苷激酶基因(gsk)被破坏。该菌株的内部编号为AJ13334，于1997年6月24日根据布达佩斯条约在通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为独立管理法人，国立先进工业科技研究所，国际专利生物材料保藏机构，chuo Dai-6，1-1Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japen，邮政编码：305-5466)进行了国际保藏，保藏号为FERM BP-5993。该菌株具有产生肌苷和鸟苷的能力。并且，该菌株可通过将含有突变pruF基因的质粒导入FADRaddeddyi cPpgixapA菌株获得，后者是按照后文实施例所述构建的，也可以用作肌苷生产细菌。鸟苷生产能力也可通过将分别编码IMP脱氢酶和GMP合成酶的guaA和guaB基因导入肌苷生产菌得到提高。在本发明中，细菌菌株不限于前述菌株，任何具有嘌呤核苷生成能力的菌株均可使用，而没有什么特别限制。
ushA基因和aphA基因功能异常的突变菌株或基因重组菌株可通过以下方法获得：修饰这些基因，使得这些基因的产物5’-核苷酸酶的活性降低或缺失，或者降低或消除这些基因的转录。这样的微生物可以通过以下方法获得：利用遗传重组法(分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，细菌学杂志，162，1196(1985))，通过同源重组用功能异常的ushA基因和aphA基因(以下也称为“破坏ushA基因”和“破坏aphA基因”)取代染色体上的ushA基因和aphA基因。
在同源重组中，具有与染色体上的序列同源的序列的质粒等被导入细菌细胞中。然后，在同源序列的某一位置以一定频率发生重组，使得被导入的质粒全部被整合进染色体中。其后在同源序列的位置再次发生重组，质粒又从染色体上除去。此时，取决于重组的位置，破坏的基因可能会保留在染色体上，而原来的正常基因可能会随质粒一起除去。通过选择这种菌株，可以得到染色体上的ushA基因或aphA基因被破坏的ushA基因或破坏的aphA基因取代的菌株。
已经建立了基于同源重组的基因破坏技术，也可使用利用线性DNA的方法，利用温度敏感型质粒的方法等。ushA基因和aphA基因的破坏也可以通过使用含有内部插入了药物抗性基因等标记基因的ushA基因或aphA基因的质粒进行，所述质粒不能在靶微生物细胞内复制。即，在用上述质粒转化从而获得了药物抗性的转化子中，标记基因整合进染色体DNA。由于该标记基因通过位于标记基因两端的ushA基因或aphA基因序列与染色体上的相应基因同源重组整合进染色体的可能性很大，可以有效地选择基因破坏菌株。
用于基因破坏的破坏的ushA基因和破坏的aphA基因可以通过以下方法获得：用限制酶消化并连接缺失基因中的特定区域，将其它DNA片段(标记基因等)插入这些基因，或通过定点突变向ushA基因或aphA基因的编码区、启动子区等核苷酸序列引入一个或多个核苷酸的置换、缺失、插入、增加或倒转(Kramer，W.和Frits，H.J.，酶学方法，154，350(1987))，或用次亚硫酸钠或羟胺等化学试剂处理(Shortle，D和Nathans，D.美国国家科学院院刊，75，270(1978))，使得编码的抑制物的活性降低或缺失，或ushA基因或aphA基因的转录降低或消除。在这些实施方案中，考虑到确定性和稳定性，用限制酶消化并连接以缺失ushA基因或aphA基因的一定区域的方法和将其它DNA片段插入这些基因的方法是优选的。ushA基因和aphA基因破坏的顺序没有特别的限制，可以首先破坏任一个。
ushA基因和aphA基因的核苷酸序列是已知的，因此，可以根据这些核苷酸序列通过PCR或杂交方便地得到这些基因。例如，ushA基因可以使用SEQ ID NO：1和2所示的引物通过PCR由大肠杆菌的染色体DNA获得。并且，aphA基因的N-末端区域可以使用SEQ ID NO：3和7的引物通过PCR获得，其C-末端区域可以使用SEQ ID NO：4和8的引物通过PCR获得。
靶基因是否已经被破坏可以通过DNA印迹或PCR分析染色体上的基因证实。
(3)生成核苷5’-磷酸酯的方法
核苷5’-磷酸酯可以通过以下方法获得：在培养基中培养属于埃希氏菌属、具有产生核苷5’-磷酸酯能力的细菌，以在培养基中产生和积累核苷5’-磷酸酯，然后由培养基中收集核苷5’-磷酸酯，其中所述细菌中ushA基因和aphA基因功能异常。
培养基可以是含有所需的碳源、氮源、无机离子和其它有机成分的普通培养基。碳源可以是糖，如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、海藻糖、核糖和淀粉水解物；醇，如甘油、甘露醇和山梨糖醇；或有机酸，如葡糖酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸等。
氮源可以是无机铵盐，如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵，大豆水解物等有机氮，氨气，氨水等。
至于微量有机营养，最好以合适的量加入所需的物质，包括维生素B1等维生素、腺苷和RNA等核酸或酵母提取物。此外，需要时加入少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。
优选在好气条件下培养16到72小时。培养温度控制在30℃到45℃，pH控制在5到8。可以加入无机或有机酸性或碱性物质、氨气等调节pH。
从培养液中收集核苷5’-磷酸酯一般通过组合使用离子交换数值法、沉淀法和其它已知技术完成。
实施本发明的最佳方式
以下将参照具体实施例更具体地阐明本发明。实施例1.ushA基因破坏对大肠杆菌核苷酸生成的影响
(1)ush-破坏菌株的构建
由大肠杆菌W3110菌株的基因组DNA，通过PCR扩增ushA基因片段。使用RNA/DNA maxi试剂盒(Qiagen)提取基因组DNA。使用SEQ ID NO：1和2所示引物以及Pyrobest DNA聚合酶(Takara Shuzo)按照聚合酶所附的说明进行PCR。PCR之后，使用Wizard PCR Preps(Progema)纯化扩增的DNA片段。用限制酶SphI和SalI(TakaraShuzo)消化之后，纯化的DNA片段进行酚/氯仿处理和乙醇沉淀。使用DNA连接试剂盒Ver.2(Takara Shuzo)与用SphI和SalI类似消化的pHSG397质粒(Takara Shuzo)连接。用上述连接混合物转化JM109感受态细胞(Takara Shuzo)，涂布于含有30μg/ml氯霉素(Sigma)的LB琼脂平板上(LB+氯霉素平板)。37℃培养过夜后，长出的菌落37℃下在含有30μg/ml氯霉素的LB培养基中试管培养，质粒使用自动质粒提取器PI-50(Kurabo Industries)提取。获得的质粒称为pHSGushA。
然后，按如下所述由pHSGu shA中所含的ushA基因中除去HpaI片段。pHSGushA用限制酶HpaI(Takara Shuzo)消化，进行酚/氯仿处理和乙醇沉淀，使用DNA连接试剂盒Ver.2连接。JM109用该连接溶液转化，由出现的菌落中提取质粒。所得的质粒用SphI和SalI消化，进行琼脂糖凝胶电泳，以选择含有HpaI消化片段由ushA基因区缺失的插入靶片段的质粒。
所得的质粒片段和用SphI和SalI消化温度敏感型质粒pMAN997(国际专利公开WO99/03988)得到的片段连接。JM109用连接溶液转化，30℃下在含有50μg/ml氨苄青霉素(Meiji Seika Kaisha)的LB琼脂平板(LB+氨苄青霉素)上选择菌落。菌落30℃下在含有50μg/ml氨苄青霉素的培养基中试管培养，提取质粒。质粒pMANΔushA用作ushA破坏质粒，可以通过SphI和SalI消化由该质粒获得所需长度的片段。上述pMAN997可以通过交换pMAN031(细菌学杂志，162，1196(1985))和pUC19(Takara Shuzo)的VspI-HindIII片段获得。
W3110菌株用pMANΔushA转化，30℃在LB+氨苄青霉素平板上选择菌落。选择的菌落在30℃下液体培养过夜。培养液稀释10-3倍，在LB+氨苄青霉素平板上接种，42℃下选择菌落。选择的菌落涂布在LB+氨苄青霉素平板上，30℃培养。然后，平板上的1/8细胞悬浮在2毫升LB培养基中，42℃下振荡培养4到5个小时。稀释10-5倍的细胞接种LB平板，将获得的菌落中的几百个菌落接种在LB平板和LB+氨苄青霉素平板上，确认生长，以选择氨苄青霉素敏感菌株。对几株氨苄青霉素敏感菌株进行菌落PCR，以确证ushA基因的缺失。这样，获得了来自大肠杆菌W3110的ushA基因破坏菌株WΔushA。
(2)测定5’-核苷酸酶和核苷酸同化培养
W3110和WΔushA 37℃下在LB培养基中培养，在按照Edwards的方法(C.J.Edwards，D.J.Innes，D.M.Burns，I.R.Beacham，(1993)FEMS微生物通讯，114，293-298)在增殖阶段由细胞中提取周质。使用上述参考文献所述的方法，测定周质蛋白对IMP、6MP和AMP的5’-核苷酸酶活性。每分钟产生1微摩尔磷酸的活性定义为1个单位。与W3110相比，WΔushA的周质5’-核苷酸酶活性显著下降，结果见表1。
表1：周质5’-核苷酸酶活性
(单位/毫克蛋白)
| 菌株 | 底物 | ||
| IMP | GMP | AMP | |
| W3110 | 14.0 | 10.8 | 14.2 |
| WΔushA | 0.21 | 0.16 | 0.03 |
为了确证WΔushA是否完全丧失核苷酸降解能力，在含有核苷酸为唯一碳源的基本培养基中观察其生长。W3110和WΔushA在LB培养基中37℃下培养过夜，然后用生理盐水洗涤，加入到含有5.8g/L IMP或6.7g/L GMP的50毫升M9基本培养基中(J.H.Miller，“细菌遗传学的短暂历程”，冷泉港实验室出版社，纽约，1992)，37℃培养。一定时间后，收集培养液，使用分光光度计DU640(Beckman)测定600nm吸光度。尽管WΔushA在含有IMP或GMP作为唯一碳源的M9培养基中生长下降，但它可以在该培养基中生长。这表明仅破坏ushA没有完全丧失核苷酸降解能力。并且，由于生长的起始迟滞，预期存在其它5’-核苷酸酶，它在UshA没有功能时被诱导。
实施例2：寻找新的5’-核苷酸酶基因
据认为，当WΔushA和W3110在含有IMP或GMP为唯一碳源的M9培养基中培养时，实施例1推测的5’-核苷酸酶基因在前者中的表达较后者中强。为了鉴定被认为在WΔushA中有功能的5’-核苷酸酶，比较了在含有IMP或GMP为唯一碳源的M9培养基中生长的W3110和WΔushA的基因表达图谱。
为了比较基因表达图谱，使用了DNA阵列法(H.Tao，C Bausch，C.Richmond，F.R.Blattner，T.Conway，(1999)细菌学杂志，181，6425-6440)。全景大肠杆菌基因阵列(Sigma Genosis)是由点印有大肠杆菌4290个基因的扩增DNA片段的尼龙膜组成的DNA阵列，利用该阵列可以全面分析大肠杆菌全部基因的mRNA表达量。
W3110和WΔushA培养在含有IMP或GMP作为唯一碳源的M9培养基中，使用Rneasy mini试剂盒(Qi agen)由处于增殖阶段的细胞提取RNA。提取的RNA溶液用加入氯化镁和DnaseI(BoeringerMannheim)至终浓度分别为10mM和0.25U/ml，以降解污染的基因组DNA，总RNA然后通过酚/氯仿提取和乙醇沉淀纯化。使用AMV逆转录酶(Promega)、dATP、dGTP、dTTP、[α-33P]-dCTP(均为AmershamPharmacia产品)和随机引物pd(N)6(Amersham Pharmacia)，按照全景大肠杆菌基因阵列所附的说明，进行逆转录反应，以制备cDNA探针。
使用如上述获得的cDNA探针，按照全景大肠杆菌基因阵列所附的说明进行杂交和洗涤。将膜置于杂交袋中，与成像板(Fuji PhotoFilm)接触48小时，使用FLA3000G(Fuji Photo Film)捕获图像。各个点的浓度使用图像分析软件AIS(Imaging Research)定量，列出各个膜上各个点浓度相对于膜上所有点浓度之和的比例。比较各个基因的该比例值，确定基因表达的增加和降低。
这样，分别选择培养在含有IMP作为唯一碳源的M9培养基中时WΔushA中的表达量较W3110大的基因，和培养在含有GMP作为唯一碳源的M9培养基中时WΔushA中的表达量较W3110大的基因。但是，由于培养物碳源的变化可以引起多种基因表达量的波动，选择的基因数量较大，难以确证各个基因的功能。因此，为了缩小候选基因的范围，使用了下列筛选方法。
由于认为靶5’-核苷酸酶基因在使用IMP和GMP作为唯一碳源培养时的表达量均增加，计算培养在含有IMP作为唯一碳源的M9培养基中时WΔushA和W3110中表达量的比例(WΔushA/W3110)，和培养在含有GMP作为唯一碳源的M9培养基中时WΔushA和W3110中表达量的比例(WΔushA/W3110)，得到其乘积，寻找具有较大乘积值的基因。具有较大值的前50个基因示于表2(1-25)和表3(26-50)。选择其中功能未知的基因作为可能具有5’-核苷酸酶活性的候选基因。由于WΔushA可以通过降解细胞外核苷酸生长，预期靶5’-核苷酸酶应该会迁移至周质并在此发挥功能。因此，在功能未知的基因中，仅选择具有蛋白转运至周质必需的信号序列的基因。通过这些筛选，候选基因的范围缩小到两种：b0220(或o157)和yjbP。
当研究这些基因时，发现b0220据报导为功能未鉴定的称为ykfE的基因，yjbP据报导为酸性磷酸酶基因(aphA)(M.C.Thaller，S.Schippa，A.Bonci，S.Cresti，G.M.Rossolini，(1997)FEMS微生物通讯，146，191-198)。
表2：WΔushA和W3110培养在含有IMP或GMP作为碳源的M9培养基中观察到的基因表达图谱(1-25)
| IMP表达率(I) | GMP表达率(G) | I×G | 基因 |
| 11.3 | 5.5 | 61.7 | pyrB |
| 3.5 | 7.3 | 25.2 | malE |
| 4.5 | 2.0 | 9.1 | pyrI |
| 3.6 | 2.2 | 8.0 | udp |
| 3.9 | 2.0 | 7.9 | deoD |
| 2.8 | 2.6 | 7.2 | yeiN |
| 1.9 | 3.7 | 7.2 | lamB |
| 5.1 | 1.2 | 6.0 | b0220(o157) |
| 3.5 | 1.7 | 5.9 | DeoA |
| 2.1 | 2.7 | 5.5 | YeiC |
| 2.1 | 2.6 | 5.4 | tsx |
| 3.0 | 1.8 | 5.3 | b1036(o173) |
| 4.2 | 1.2 | 4.9 | DeoC |
| 2.3 | 2.1 | 4.8 | NupC |
| 2.4 | 2.0 | 4.8 | FadB |
| 2.1 | 2.3 | 4.8 | YejD |
| 1.5 | 3.2 | 4.8 | MalF |
| 1.9 | 2.3 | 4.4 | CirA |
| 2.6 | 1.7 | 4.3 | CarA |
| 1.5 | 2.9 | 4.2 | LivJ |
| 3.2 | 1.3 | 4.0 | TalB |
| 0.9 | 4.5 | 4.0 | FliD |
| 1.5 | 2.6 | 4.0 | MalM |
| 1.6 | 2.4 | 3.9 | DppA |
| 1.0 | 4.0 | 3.8 | FliC |
表3：WΔushA和W3110培养在含有IMP或GMP作为碳源的M9培养基中观察到的基因表达图谱(26-50)
| IMP表达率(I) | GMP表达率(G) | I×G | 基因 |
| 0.8 | 4.4 | 3.7 | CheA |
| 2.8 | 1.3 | 3.7 | DeoB |
| 1.3 | 2.7 | 3.6 | GlpK |
| 2.1 | 1.7 | 3.5 | b2341(f714) |
| 1.8 | 1.8 | 3.3 | YeiK |
| 2.8 | 1.2 | 3.3 | Cdd |
| 2.0 | 1.6 | 3.2 | b2673(o81) |
| 1.8 | 1.7 | 3.1 | YeiP |
| 1.9 | 1.7 | 3.1 | YeiR |
| 0.9 | 3.3 | 3.0 | MotB |
| 3.1 | 1.0 | 3.0 | YafP |
| 2.0 | 1.5 | 3.0 | b0221(f826) |
| 1.6 | 1.8 | 2.9 | YjbP |
| 0.7 | 4.0 | 2.9 | tap |
| 1.9 | 1.5 | 2.9 | pyrH |
| 1.5 | 1.9 | 2.8 | s seA |
| 1.8 | 1.6 | 2.8 | ybeK |
| 0.8 | 3.3 | 2.7 | flgN |
| 1.9 | 1.4 | 2.7 | glnA |
| 2.0 | 1.3 | 2.7 | ygaD |
| 2.3 | 1.2 | 2.7 | entE |
| 1.7 | 1.6 | 2.6 | yafY |
| 1.9 | 1.4 | 2.6 | nupG |
| 1.8 | 1.7 | 2.6 | fepA |
| 1.2 | 2.2 | 2.6 | b3524(假定的) |
实施例3：通过基因扩增评价候选基因
制备实施例2中得到的候选基因ykfE和aphA均被扩增的菌株，以研究基因扩增对5’-核苷酸酶活性的影响。ykfE和aphA基因片段分别使用SEQ ID NO：3和4以及SEQ ID NO：5和6所示的引物扩增。将ykfE片段克隆到载体pSTV28(Takara Shuzo)中限制酶SalI和PstI(Takara Shuzo)的切割位点，得到pSTVykfE。而aphA片段被克隆到载体pSTV28中限制酶SalI和SphI的切割位点，得到pSTVaphA。WΔushA用如上所述制备的质粒转化，37℃培养在含有30μg/ml氯霉素的LB培养基中。测定处于增殖阶段的细胞周质中对底物IMP、GMP和AMP的5’-核苷酸酶活性。结果，与仅携带有表4所示载体的菌株相比，aphA基因扩增提供了显著的5’-核苷酸酶活性的增加，因此，证实了AphA蛋白有活性。另一方面，ykfE扩增菌株为显示显著的活性增加，因此，可以确定它没有5’-核苷酸酶活性。
表4：aphA-和ykfE-扩增菌株周质中5’-核苷酸酶活性
(U/毫克蛋白)
| 菌株 | 底物 | ||
| IMP | GMP | AMP | |
| WΔushA/pSTV | 0.074 | 0.067 | 0.024 |
| WΔushA/pSTVykfE | 0.15 | 0.15 | 0.067 |
| WΔushA/pSTVaphA | 3.2 | 3.5 | 1.8 |
实施例4：将aphA破坏导入WΔushA
在WΔushA菌株中进行aphA基因的破坏，该基因被推测为5’-核苷酸酶活性的基因。aphA N末端区片段和C末端区片段分别使用SEQ ID NO：3和7以及SEQ ID NO：4和8所示的引物通过PCR扩增，使用Wizard PCR Preps纯化。混合各扩增反应溶液各1μL，加入至PCR反应溶液，使用SEQ ID NO：3和4所示引物进行交换PCR(A.J.Link，D.Phillips，G.M.Church(1997)细菌学杂志，179，6228-6237)，得到含有中心区域缺失约300个核苷酸的aphA基因片段。将该片段插入温度敏感型质粒pMAN997的SalI-SphI切割位点，得到基因破坏质粒pMANΔaphA。使用该基因破坏质粒破坏W3110和WΔushA中的各个aphA基因，得到aphA-缺陷菌株(WΔaphA)和ushA-和aph-双重缺陷菌株(WΔushAΔaphA)。
实施例5：测定WΔushAΔaphA的5’-核苷酸活性和和核苷酸同化培养
W3110、WΔushA、WΔaphA和WΔushAΔaphA均于37℃培养在LB培养基中，测定增殖阶段细胞周质的5’-核苷酸酶活性。结果示于表5。尽管WΔaphA的活性较W3110降低了约一半，但存留的活性仍然足够强，可能ushA对其有帮助。另一方面，双重缺陷菌株WΔushAΔaphA周质中的5’-核苷酸酶活性进一步降低，基本上消除了。
表5：W3110、WΔushA、WΔaphA和WΔushAΔaphA的5’-
核苷酸酶活性(U/毫克蛋白)
| 菌株 | 底物 | |||
| IMP | GMP | AMP | XMP | |
| W3110 | 14.0 | 10.9 | 14.2 | 8.7 |
| WΔaphA | 5.8 | 4.1 | 6.0 | 3.9 |
| WΔushA | 0.21 | 0.16 | 0.03 | 0.10 |
| WΔushAΔaphA | 0.010 | 0.009 | 0.012 | 0.019 |
而且，为了研究各个菌株的核苷酸降解能力，将这些菌株在含有IMP或GMP作为唯一碳源的M9培养基中摇瓶培养。在两种培养基中，生长强度的顺序都时W3110、WΔaphA和WΔushA，而WΔushAΔaphA培养300小时后也未见生长，因此，这说明WΔushAΔaphA不能在含有IMP或GMP为唯一碳源的M9培养基中生长。这样，大肠杆菌W3110降解细胞外核苷酸的能力通过ushA和aphA的双重缺陷成功地消除了。
实施例6：在肌苷生产菌中破坏ushA和aphA的基因破坏
为了研究直接发酵IMP的可能性，在大肠杆菌肌苷生产菌株中进行ushA和aphA的基因破坏。使用国际专利公开WO99/03988中所述的FADRaddeddyicPpgixapA(以下称为“I”)作为肌苷生产菌。WO99/03988中提及的质粒pKFpurFKQ所含的突变purF基因片段用BamHI和HindIII消化，然后纯化并连接至用同样的酶消化的pMW218(Nippon Gene)。所得的质粒pMWpruFKQ被导入I菌株中。所得的菌株I/pMWpurFKQ成为了具有在培养液中积累2-3克/升肌苷的能力的菌株。
上述菌株FADRaddeddyi cPpgixapA中，PRPP转酰胺酶基因(purF)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)、嘌呤抑制物基因(purR)、腺苷脱氨酶基因(add)、6-磷酸葡糖酸脱水酶基因(edd)、腺苷脱氨酶基因(yicP)、磷酸葡糖异构酶基因(pgi)和次黄苷磷酸化酶基因(xapA)被破坏。并且，pKFpurFKQ含有编码PRPP转酰胺酶的突变purF，其中326位赖氨酸残基被谷氨酰胺残基取代，AMP和GMP的反馈抑制不存在(见国际质粒公开WO99/03988)。
使用上述ushA基因破坏的质粒pMANΔushA和aphA基因破坏的质粒pMANΔaphA，获得了ushA-单缺陷菌株(IΔushA/pMWpurFKQ)、aphA-单缺陷菌株(IΔaphA/pMWpurFKQ)以及ushA-和aph-双重缺陷菌株(IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ)。
评价上述每个菌株的IMP生产能力。培养基、培养方法和评价IMP生产能力的分析方法示于以下。
(基本培养基：MS培养基)
终浓度
葡萄糖 40g/L(单独灭菌)
硫酸铵 16g/L
磷酸二氢钾 1g/L
七水硫酸镁 1g/L
七水硫酸亚铁 0.01g/L
四水硫酸锰 0.01g/L
酵母提取物 8g/L
碳酸钙 30g/L(单独灭菌)
(培养方法)
更新培养：接种储存细胞，LB琼脂培养基(加入必需的试剂)，37℃，过夜。
种子培养：接种更新细胞，LB培养液(加入必需的试剂)，37℃，过夜。
主培养：以2％的量接种种子培养液，MS培养基(加入腺苷和其它必需的试剂)，37℃，20ml，500ml容积Sakaguchi烧瓶。
(分析方法)
按时间进程去500μl培养液，15,000rpm离心5分钟，上清用水稀释4倍，HPLC分析。
分析条件：
层析柱：Asahipak GS-220(7.6mm ID×500mm L)
缓冲液：0.2M NaH4PO4(用磷酸调pH为3.98)
温度：55℃
流速：1.5ml/min
检测：UV 254nm
保留时间(分钟)
肌苷 16.40
IMP 11.50
鸟苷 19.67
GMP 13.04
结果见表6。在表6中，分别示出了两个平行实验的结果。结果证实在培养液中IΔushAΔaphA最多积累约1.0g/L IMP。
表6：通过摇瓶培养评价肌苷生产菌的ushA-和aphA-缺陷菌株
| 菌株 | 培养时间(h) | 肌苷(g/L) | IMP(g/L) |
| I/pMWpurFKQ | 4848 | 2.32.3 | 00 |
| IΔushA/pMWpurFKQ | 5151 | 3.12.9 | 00 |
| IΔaphA/pMWpurFKQ | 5151 | 3.63.2 | 00 |
| IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ | 5454 | 2.42.6 | 1.00.6 |
实施例7：通过ushA-和aphA-双重缺陷菌株生产GMP
为了探究通过本发明生产GMP的可能性，赋予实施例6中获得的ushA-和aphA-双重缺陷菌株IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ鸟苷生产能力。赋予或增强鸟苷生产能力通过增强催化IMP到GMP的反应的酶的基因达到。IMP转变成XMP的反应由guaA编码的IMP脱氢酶催化，XMP转化成GMP的反应由guaB基因编码的GMP合成酶催化，已知大肠杆菌中这些基因组成一个操纵子(guaBA)。因此，使用SEQ ID NO：9和10所示引物进行PCR，以扩增大肠杆菌guaBA操纵子。纯化扩增的片段，两端形成的限制酶位点是用SacI和KpnI消化的。消化的片段连接至SacI和KpnI类似消化的pSTV28，选择整合了guaBA基因的质粒pSTVguaBA。该质粒可以与IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ携带的质粒pMWpurFKQ共存。
上述pSTVguaBA被导入IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ菌株，得到IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA菌株。并且，通过导入载体pSTV28，制备IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTV28菌株作为对照。
根据与实施例6相同的培养方法和分析方法，定量分析IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA和IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTV28菌株的培养液中积累的肌苷、IMP、鸟苷和GMP。结果示于表7中。在用作对照的IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTV28菌株中，由于导入pSTV28的影响，培养时间延长，其结果不同于IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA的结果。鸟苷无法定量，因为其峰与其它峰重叠。另一方面，结果证实，由于导入了guaBA，IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA菌株在培养液中积累了约0.1g/L GMP。
表7：在摇瓶中培养的肌苷生产菌的ushA-和aphA-缺陷菌株
| 菌株 | 培养时间(h) | 肌苷(g/L) | IMP(g/L) | 鸟苷(g/L) | GMP(g/L) |
| IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTV28 | 78 | 9.7 | 0.4 | -* | 0.0 |
| IΔushAΔaphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA | 78 | 3.4 | 0.2 | 1.1 | 0.1 |
*表示无法定量。
序列表
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<120>发酵生产核苷酸的方法
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<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：PCR引物
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cgcgcatgct cgtcgctttg ggttttc 27
<210>2
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Claims (4)
1.生产核苷5′-磷酸酯的方法，包括在培养基中培养属于埃希氏菌属、具有产核苷5′-磷酸酯能力的细菌，以在培养基中产生和积累核苷5′-磷酸酯，并由培养基中收集核苷5′-磷酸酯，所述细菌中ushA基因和aphA基因编码的酶的活性因这些基因被破坏而被降低或被消除，其中所述的核苷5′-磷酸酯是5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述的细菌是大肠杆菌。
3.属于埃希氏菌属、具有生产5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的能力的细菌，其中，ushA和aphA基因被破坏。
4.权利要求3的细菌，其中所述的细菌是大肠杆菌。
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