CN108441532A - 一种尿苷二磷酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种尿苷二磷酸的制备方法，其包括如下步骤：将尿苷、磷酸二氢钠、葡萄糖、硫酸镁与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷二磷酸发酵液；然后将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过分离提纯；再将纯化后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶，最后进行干燥、粉碎处理。本方法获得的尿苷二磷酸产品的紫外纯度在80％以上，含水量在8％以下，质量得率在60％以上，相对于核苷酸发酵来说，本方法生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3；预处理时间缩短为2/5；分离纯化的时间缩短为3/5。
Description
技术领域
本发明涉及一种尿苷二磷酸的制备方法，具体地说，是以尿苷为原料，通过发酵和醇沉结晶两步法生产尿苷二磷酸的方法。
背景技术
上世纪六、七十年代，我国开始以核苷一磷酸为原料，利用酵母发酵生产核苷三磷酸(NTP)，主要生产腺苷三磷酸(ATP)和胞苷三磷酸(CTP)。利用酵母发酵生产ATP的研究较多，在七、八十年代已有较稳定的发酵生产工艺，并能进行小规模的生产。但这种发酵生产ATP、CTP等的工艺过程还存在很多的弊端，比如工艺复杂、操作繁琐、生产成本高，而且不适合大规模生产。主要原因如下：
1、发酵底物浓度低,一般低于2％或20mg/ml，所得产物量不高，因而导致发酵设备利用率低，劳动生产率低，使生产成本增加。
2、发酵液预处理工艺不合理，使用离心分离和酒精沉淀再回溶的法，能耗大，时间长，回收率低。
3、分离纯化工艺不合理，分离纯化中采用的方法和使用的设备已落后，使周期长，回收率低，产品质量低，成本增加。
尿苷二磷酸(UDP)是合成阿普林津(Ampligen)的原料之一。阿普林津是一种错配双链RNA药物(Polyl:C12U)，具有抗病毒和免疫调节的双重作用，高效低毒。目前，在国外该药正在进行一些疾病的临床实验，包括慢性疲劳综合症、艾滋病、乙肝等。
对于尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)的制备方法很少有人进行深入的研究，只是其衍生物，尤其是UDP糖类由于药用广泛而引起国内外的重视。比如，专利文献98801453.X公开了一种尿苷二磷酸N乙耽葡糖胶的制备方法，该方法使用微生物菌体，由尿苷酸(UMP)和N乙耽葡糖胶制备尿苷二磷酸N乙耽葡糖胶(UDPAG)，并使N乙耽葡糖胶激酶共存。但到目前为止，国内仍没有高效率、低成本、操作简便的UTP和UDP生产工艺。
发明内容
本发明的目的是提供一种尿苷二磷酸(UDP)的制备方法，该方法生产周期短，产品得率高、成本低、操作简便。
本发明所述尿苷二磷酸(UDP)的制备方法，包括如下步骤：
1)将尿苷、磷酸二氢钠与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷二磷酸发酵液；
2)将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过微滤装置分离出澄清的微滤液；
3)将所述的微滤液进行分离纯化，采用不同浓度NaCl溶液进行淋洗、洗脱；
4)将所述洗脱后的收集液进行纳滤除盐；
5)将所述纳滤后的收集液用强碱型阴离子交换柱树脂进行脱色；
6)将脱色后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶、干燥。
其中，尿苷作为底物，以选用高纯度的为佳，如液相纯度在98％以上。
本发明所用的啤酒酵母(Saccaromycescerevisiae)可采用新鲜啤酒酵母，也可采用啤酒生产过程中淘汰的啤酒酵母，从经济角度考虑，采用啤酒生产中淘汰的但仍具有较高酶活性的酵母，该酵母细胞存活率在85％以上即可。其经过离心或压榨后成干酵母，酵母的含量(重量百分比)在20～25％。
在混合发酵时，每升发酵物含有尿苷30～40克，啤酒酵母350～500克，葡萄糖60～80克，磷酸二氢纳85～120克和硫酸镁6～9克，剩余的体积由水补足。
本发明啤酒酵母在冷冻条件下保存为佳，比如冷冻温度在-15℃～-20℃之间，冷冻时间为5～100天。
混合发酵的发酵温度为35～40℃，pH值为6.6～7.0，发酵时间为2～4小时。本发明采用一步法发酵，相对于核苷酸发酵来说，本方法生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3，此发酵过程的转化率可达80％以上。经液相色谱仪跟踪检测发现可以终止发酵，温度降至10～20℃使发酵终止，所用终止反应剂为冰块。其作用是蛋白变性剂，使相关酶失活。
对尿苷二磷酸发酵液进行预处理时，采用微滤方法，所述的微滤也称微孔过滤，其滤膜的孔径为0.05～5.0μm，微滤的主要作用是固液分离和去除发酵液中的部分蛋白，减少分离纯化步骤中的负担。微滤膜的材质可采用有机和无机两大类，有机聚合物有醋酸纤维素、聚丙稀、聚碳酸醋、聚矶、聚跌胶等。无机膜材料有陶瓷和金属等，其中，优选的为孔径为0.1μm的无机陶瓷膜，微滤时间为1～3小时。
经微滤处理后的溶液澄清，无悬浮物。但经过处理后还需进行分离纯化，分离纯化可采用本领域常用的方法，比如离子交换法。
离子交换法以选用强碱型阴离子交换树脂为佳，比如D280等。所用的条件可为：上柱总量：为阴离子交换树脂总交换量的1.05％～1.96％，即25～45mgUDP/ml树脂，上柱液浓度：UDP含量20～35g/L上柱，pH:6.0～7.0，上柱流速：1倍～1.5倍树脂体积/小时，上柱的终点：紫外暗箱检测有UDP的斑点出现。淋洗剂：0.03N、pH2.0NaCl溶液，洗涤流速：2倍～3倍树脂体积/小时，洗涤终点：紫外暗箱检测无UDP斑点出现。洗脱剂0.3N、pH2.0NaCl溶液，洗脱流速：0.5倍～1.0倍树脂体积/小时。
对于获得的尿苷二磷酸收集液需要经过过滤和脱色的一系列处理。其中，过滤采用纳滤(Nanofilitration,NF)分离方法，其不仅可以截流分子量介于反渗透膜和超滤膜之间的物质，而且还对无机盐有一定的截流率，本发明采用采用截留分子量为400～500道尔顿的纳滤设备，优选为卷式或管式的截留分子量为200～300道尔顿的纳滤设备。
脱色时可采用前述的分离纯化方法，采用强碱型阴离子交换树脂对其脱色，比如D201等。所用的条件可为：上柱总量：为阴离子交换树脂总交换量的25％～30％，即200～250mgUDP/ml，树脂上柱液浓度：UDP含量100～150g/L，上柱流速：0.5倍～1倍树脂体积/小时，上柱的终点：紫外暗箱检测无UDP斑点出现。
醇沉结晶采用乙醇水溶液沉淀，用80～95％乙醇沉淀，并调pH值为3.7～3.9，温度为20～30℃，最终酒精浓度达到60～65％，醇沉时间为6～8h。
醇沉后的产品还经过干燥处理，比如压滤干燥等。
本发明的尿苷二磷酸(UDP)的制备方法，具有以下优点：
(1)采用一步法发酵，即底物与酵母混合后进行发酵，缩短发酵时间1/2～2/3。
(2)使用微滤设备对发酵液进行预处理。在发酵液的预处理中引入微滤设备，使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜对发酵液进行微滤处理，微滤时间为1～4小时，微滤的主要作用是固液分离和去除发酵液中的部分蛋白，减少分离纯化步骤中的负担。经过微滤处理的发酵液可以直接上柱分离纯化，大大缩短了预处理的时间。同时也提高了产品回收率达到95～100％。
(3)分离纯化工艺过程中的提高上柱和洗涤的流速，缩短分离纯化周期。
(4)本方法获得的尿苷二磷酸产品的紫外纯度在80％以上，含水量在8％以下，质量得率在60％以上，相对于核苷酸发酵来说，本方法生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3；预处理时间缩短为2/5；分离纯化的时间缩短为3/5。由此产生的经济效益显著。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.发酵
首先对尿苷进行发酵(10升规模)，发酵条件：尿苷308g(按液相色谱纯度99％投料)；啤酒酵母3.6kg；葡萄糖636g；NaH2P04930.6g；硫酸镁53.4g；pH6.7；水加至10升；37℃保温，搅拌发酵2～4小时。啤酒酵母为啤酒生产中淘汰酵母，酵母细胞存活率为98％以上，其压榨后成干酵母中酵母的含量(重量百分比)为28％。然后用液相色谱仪进行跟踪检测发酵产物。用冰块降温至20℃，发酵终止，发酵转化率为90％。
2.微滤除蛋白：
使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜处理发酵液，微滤前先过80目滤布除去过大的固体颗粒，微滤中用20L的去离子水洗滤膜，分4～5次加入。微滤后，溶液澄清，无悬浮物，产品回收率96±2％。
3.UDP分离，采用阴离子交换法：
(1)方法：使用D280氯型强碱型阴离子交换树脂，pH6.5，上柱流速34L/hr；
淋洗：低盐洗脱：0.03N、pH2.0NaCl溶液；洗脱流速35～40L/hr；；
洗脱：0.3NNaCl、pH2.0溶液；洗脱流速10L/hr；
(2)结果：上柱量：为D280树脂总交换量的1.38％，即24mgUTP/ml树脂。柱分离中产品损失率：5％以内。
(3)鉴定方法：
开始收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。
停止收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。
4.纳滤除盐
(1)方法：使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备；纳滤中用50L的去离子水洗，分3～4次加入。
(2)结果：纳滤后产品浓度为50g/L，除盐率99％，产品损失率低于3％。
5.UDP脱色
(1)方法：使用D201强碱型阴离子交换树脂，上柱：pH3.0，上柱流速12L/hr；
(2)结果：上柱量：为D201树脂总交换量的10％，即49.4mg/ml树脂。柱分离中产品损失率：1％以内。
(3)鉴定方法：
开始收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。
停止收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。
6.UDP醇沉
(1)方法：用80～95％乙醇沉淀，用盐酸调节pH至3.80，在25℃，酒精浓度达到60％停止加入酒精，醇沉时间8h。醇沉沉淀产品状态松散，可以直接抽滤。
采用本实施例的方法获得的尿苷二磷酸产品参数：液相纯度：88％,紫外含量:80.5％，水分含量：7.4％，质量得率：62％。
实施例2
1.发酵
首先对尿苷进行发酵(9升规模)，发酵条件：尿苷277.2g(按液相色谱纯度99％投料)；啤酒酵母3.2kg；葡萄糖572.4g；NaH2P04837.5g；硫酸镁48.1g；pH6.7；水加至10升；37℃保温，搅拌发酵2～4小时。啤酒酵母为啤酒生产中淘汰酵母，酵母细胞存活率为95％以上，其压榨后成干酵母中酵母的含量(重量百分比)为25％。然后用液相色谱仪进行跟踪检测发酵产物。用冰块降温至15℃，发酵终止，发酵转化率为88％。
2.微滤除蛋白：
使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜处理发酵液，微滤前先过80目滤布除去过大的固体颗粒，微滤中用20L的去离子水洗滤膜，分4～5次加入。微滤后，溶液澄清，无悬浮物，产品回收率93±2％。
3.UDP分离，采用阴离子交换法：
(1)方法：使用D280氯型强碱型阴离子交换树脂，pH6.0，上柱流速30L/hr；
淋洗：低盐洗脱：0.03N、pH2.0NaCl溶液；洗脱流速32～35L/hr；；
洗脱：0.3NNaCl、pH2.0溶液；洗脱流速8L/hr；
(2)结果：上柱量：为D280树脂总交换量的1.26％，即22mgUTP/ml树脂。柱分离中产品损失率：5％以内。
(3)鉴定方法：
开始收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。
停止收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。
4.纳滤除盐
(1)方法：使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备；纳滤中用50L的去离子水洗，分3～4次加入。
(2)结果：纳滤后产品浓度为45g/L，除盐率98％，产品损失率低于2％。
5.UDP脱色
(1)方法：使用D201强碱型阴离子交换树脂，上柱：pH2.8，上柱流速10L/hr；
(2)结果：上柱量：为D201树脂总交换量的10％，即49.4mg/ml树脂。柱分离中产品损失率：1％以内。
(3)鉴定方法：
开始收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。
停止收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。
6.UDP醇沉
(1)方法：用80～95％乙醇沉淀，用盐酸调节pH至3.75，在25℃，酒精浓度达到61％停止加入酒精，醇沉时间8h。醇沉沉淀产品状态松散，可以直接抽滤。
采用本实施例的方法获得的尿苷二磷酸产品参数：液相纯度：89％,紫外含量:84.6％，水分含量：7.2％，质量得率：63％。
实施例3
1.发酵
首先对尿苷进行发酵(10升规模)，发酵条件：尿苷370g(按液相色谱纯度99％投料)；啤酒酵母4.3kg；葡萄糖763g；NaH2P041110g；硫酸镁64g；pH6.7；水加至10升；37℃保温，搅拌发酵2～4小时。啤酒酵母为啤酒生产中淘汰酵母，酵母细胞存活率为98％以上，其压榨后成干酵母中酵母的含量(重量百分比)为30％。然后用液相色谱仪进行跟踪检测发酵产物。用冰块降温至20℃，发酵终止，发酵转化率为87％。
2.微滤除蛋白：
使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜处理发酵液，微滤前先过80目滤布除去过大的固体颗粒，微滤中用20L的去离子水洗滤膜，分4～5次加入。微滤后，溶液澄清，无悬浮物，产品回收率95±2％。
3.UDP分离，采用阴离子交换法：
(1)方法：使用D280氯型强碱型阴离子交换树脂，pH6.5，上柱流速36L/hr；
淋洗：低盐洗脱：0.03N、pH2.0NaCl溶液；洗脱流速38～42L/hr；；
洗脱：0.3N、pH2.0NaCl溶液；洗脱流速14L/hr；
(2)结果：上柱量：为D280树脂总交换量的1.94％，即34mgUTP/ml树脂。柱分离中产品损失率：6％以内。
(3)鉴定方法：
开始收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。
停止收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。
4.纳滤除盐
(1)方法：使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备；纳滤中用50L的去离子水洗，分3～4次加入。
(2)结果：纳滤后产品浓度为50g/L，除盐率99％，产品损失率低于3％。
5.UDP脱色
(1)方法：使用D201强碱型阴离子交换树脂，上柱：pH3.0，上柱流速15L/hr；
(2)结果：上柱量：为D201树脂总交换量的12％，即59.8mg/ml树脂。柱分离中产品损失率：1％以内。
(3)鉴定方法：
开始收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。
停止收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。
6.UDP醇沉
(1)方法：用80～95％乙醇沉淀，用盐酸调节pH至3.72，在25℃，酒精浓度达到60％停止加入酒精，醇沉时间8h。醇沉沉淀产品状态松散，可以直接抽滤。
采用本实施例的方法获得的尿苷二磷酸产品参数：液相纯度：89％,紫外含量:81.4％，水分含量：7.7％，质量得率：60％。
将实施例1-3的生产方法进行对比，结果见表1。
表1：实施例1-3检测的指标结果对比
本发明不局限于上述具体的实施方式，对于本领域的普通技术人员来说从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将尿苷、磷酸二氢钠、葡萄糖、硫酸镁与啤酒酵母混合发酵，发酵终止后得尿苷二磷酸发酵液；
2)将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过微滤装置分离出澄清的微滤液；
3)将所述的微滤液进行分离纯化，采用不同浓度NaCl溶液进行淋洗、洗脱；
4)将所述洗脱后的收集液进行纳滤除盐；
5)将所述纳滤后的收集液用强碱型阴离子交换柱树脂进行脱色；
6)将脱色后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶、干燥。
2.根据权利要求1所述尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于在混合发酵时，每升发酵物含有尿苷30～40克，啤酒酵母350～500克，葡萄糖60～80克，磷酸二氢纳85～120克和硫酸镁6～9克。
3.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述啤酒酵母为酵母细胞存活率在85％以上的淘汰啤酒酵母。
4.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于混合发酵的发酵温度为35～40℃，pH值为6.6～7.0，发酵时间为2～4小时。
5.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于温度降至10～20℃使发酵终止，所用终止反应剂为冰块。
6.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的预处理采用微滤处理，所用微滤膜的孔径为0.05～5.0μm。
7.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的分离纯化采用离子交换法，选用强碱型阴离子交换树脂。
8.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的纳滤采用截留分子量为400～500道尔顿的纳滤设备。
9.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述的脱色采用吸附的方法，选用强碱型阴离子交换树脂。
10.根据权利要求1或2所述的尿苷二磷酸的制备方法，其特征在于所述醇沉结晶时，用80～95％乙醇沉淀，并调pH值为3.7～3.9，温度为20～30℃，最终酒精浓度达到60～65％，醇沉时间为6～8h。
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