CN108486195A

CN108486195A - 一种用酶法制备udp的方法

Info

Publication number: CN108486195A
Application number: CN201810158877.1A
Authority: CN
Inventors: 李豪; 李克进
Original assignee: Anhui Kingfisher Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Anhui Kingfisher Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2018-09-04

Abstract

本发明公开了一种用酶法制备UDP的方法，将尿苷、糖类碳源、无机离子与酵母混合、并以大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶作为催化剂进行保温发酵，得到尿苷二磷酸发酵液；然后进行冰块降温预处理，并通过分离提纯；再将纯化后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶，最后进行干燥、粉碎处理。本发明通过酵母与基因工程菌的联合作用，简便、经济、合理地大量合成尿苷二磷酸，可以获得纯度非常高的目标化合物，简化了生产工艺，适合于工业化生产。

Description

一种用酶法制备UDP的方法

技术领域

本发明涉及一种用酶法制备UDP的方法，具体地说，是以尿苷为原料，加入大肠杆菌重组表达蛋白提取物和无机离子混合发酵，然后通过微滤、树脂分离除杂、纳滤除盐、树脂脱色和醇沉等进行纯化生产尿苷二磷酸(UDP)的方法。

背景技术

上世纪六、七十年代，我国开始以核苷一磷酸为原料，利用酵母发酵生产核苷三磷酸 (NTP)，主要生产腺苷三磷酸(ATP)和胞苷三磷酸(CTP)。利用酵母发酵生产ATP的研究较多，在七、八十年代已有较稳定的发酵生产工艺，并能进行小规模的生产。但这种发酵生产ATP、CTP等的工艺过程还存在很多的弊端，比如工艺复杂、操作繁琐、生产成本高，而且不适合大规模生产。主要原因如下：

1、发酵底物浓度低,一般低于2％或20mg/ml，所得产物量不高，因而导致发酵设备利用率低，劳动生产率低，使生产成本增加。

2、发酵液预处理工艺不合理，使用离心分离和酒精沉淀再回溶的法，能耗大，时间长，回收率低。

3、分离纯化工艺不合理，分离纯化中采用的方法和使用的设备已落后，使周期长，回收率低，产品质量低，成本增加。

尿苷二磷酸(UDP)是合成阿普林津(Ampligen)的原料之一。阿普林津是一种错配双链 RNA药物(Polyl:C12U)，具有抗病毒和免疫调节的双重作用，高效低毒。目前，在国外该药正在进行一些疾病的临床实验，包括慢性疲劳综合症、艾滋病、乙肝等。

对于尿苷二磷酸(UDP)和尿苷三磷酸(UTP)的制备方法很少有人进行深入的研究，只是其衍生物，尤其是UDP糖类由于药用广泛而引起国内外的重视。比如，专利文献98801453.X 公开了一种尿苷二磷酸N乙耽葡糖胶的制备方法，该方法使用微生物菌体，由尿苷酸(UMP) 和N乙耽葡糖胶制备尿苷二磷酸N乙耽葡糖胶(UDPAG)，并使N乙耽葡糖胶激酶共存。但到目前为止，国内仍没有高效率、低成本、操作简便的UTP和UDP生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用酶法制备UDP的方法。所述方法包括：在一个体外(细胞外) 反应系统中，以尿苷、糖类碳源为底物，加入无机离子与酵母，以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸酶作为催化剂，通过生物转化产生尿苷二磷酸发酵液。然后将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过分离提纯；再将纯化后的尿苷二磷酸(UDP)进行醇沉结晶，最后进行干燥、粉碎处理。

作为本发明的优选方式，酵母菌体需要进行通透性处理。酵母菌体的通透处理可使用表面活性剂、有机溶剂。表面活性剂包括Triton-X100、NymeenS-215、烷基二甲胺等，促进酵母细胞通透性和UDPG生成的物质均可使用，可单独使用或多种混合使用。表面活性剂以0.1～ 50g/Kg的浓度使用，优选以1～20g/Kg的浓度使用。有机溶剂可使用二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，以1～60ml/Kg的浓度使用，优选以2～10ml/Kg的浓度使用。

所述的尿苷二磷酸如下制备：将尿苷、酵母、无机盐和糖类碳源混合、以大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸酶作为催化剂进行反应。所述的酵母经过通透性处理，使得酵母与外界的物质交换更为通畅。所述的无机离子包括阳离子和阴离子；较佳地，所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子；更佳地，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生；较佳地，所述的磷酸二氢钾的终浓度为50±10g/L(更佳地为50±8g/L；更佳50±5g/L)；较佳地，所述的硫酸镁的终浓度是3.5±0.5g/L(更佳地为3.5±0.3g/L；更佳地为3.5±0.2g/L)；所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖；较佳地是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度是35±10g/L(更佳地为35±8g/L；更佳地为35±5g/L)；所述的尿苷的终浓度是25±10g/L(更佳地为25±8g/L；更佳地为25±5g/L)；所述的酵母的终浓度是240± 50g/L(更佳地为240±30g/L；更佳地为240±20g/L)。

以大肠杆菌重组表达尿苷二磷酸酶的方法包括：

(1)提供重组表达载体，其中包括尿苷二磷酸酶编码基因galU(其与驱动表达的元件如启动子操作性连接)；

(2)将(1)的重组表达载体转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌BL21；

(3)培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸酶；较佳地，重组表达时，当菌株在培养基中OD600达到0.5时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养3.5 小时，收集菌体，破碎，分离上清。

将尿苷、酵母和工程酶混合，混合发酵的发酵温度为35～40℃，pH值为6.6～7.0，发酵时间为2～5小时。本发明采用一步法发酵，相对于核苷酸发酵来说，本方法生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3，此发酵过程的转化率可达80％以上。经液相色谱仪跟踪检测发现可以终止发酵，温度降至10～20℃使发酵终止，所用终止反应剂为冰块。其作用是蛋白变性剂，使相关酶失活。

对尿苷二磷酸发酵液进行预处理时，采用微滤方法，所述的微滤也称微孔过滤，其微滤膜的孔径为0.05～5.0μm，微滤的主要作用是固液分离和去除发酵液中的部分蛋白，减少分离纯化步骤中的负担。微滤膜的材质可采用有机和无机两大类，有机聚合物有醋酸纤维素、聚丙稀、聚碳酸醋、聚矶、聚跌胶等。无机膜材料有陶瓷和金属等，其中，优选的为孔径为 0.1μm的无机陶瓷膜，微滤时间为1～2。

经微滤处理后的溶液澄清，无悬浮物。但经过处理后还需进行分离纯化，分离纯化可采用本领域常用的方法，比如离子交换法。

离子交换法以选用强碱型阴离子交换柱树脂为佳，比如D280等。所用的条件可为：上柱总量：为阴离子交换树脂总交换量的1.26％～1.96％，即25～50mgUDP/ml树脂，上柱液浓度：UDP含量25～45g/L上柱，pH:6.0～7.0，上柱流速：1倍～1.5倍树脂体积/小时，上柱的终点：紫外暗箱检测有UDP的斑点出现。淋洗剂：0.03N、pH2.0NaCl溶液，洗涤流速： 2倍～3倍树脂体积/小时，洗涤终点：紫外暗箱检测无UDP斑点出现。洗脱剂0.3N、pH2.0NaCl 溶液，洗脱流速：0.5倍～1.0倍树脂体积/小时。

对于获得的尿苷二磷酸收集液需要经过过滤和脱色的一系列处理。其中，过滤采用纳滤(Nanofilitration,NF)分离方法，其不仅可以截流分子量介于反渗透膜和超滤膜之间的物质，而且还对无机盐有一定的截流率，本发明采用的是卷式或管式的截留分子量为400～500 道尔顿的纳滤设备，优选采用截留分子量为200～300道尔顿的纳滤设备。

脱色时可采用前述的分离纯化方法，采用强碱型阴离子交换树脂对其脱色，比如D201 等。所用的条件可为：上柱总量：为阴离子交换树脂总交换量的25％～30％，即200～250mgUDP/ml，树脂上柱液浓度：UDP含量70～110g/L，上柱流速：0.5倍～1倍树脂体积/ 小时，上柱的终点：紫外暗箱检测无UDP斑点出现。

醇沉结晶采用乙醇水溶液沉淀，用80～95％乙醇沉淀，并调pH值为3.7～3.9，温度为 20～30℃，最终酒精浓度达到60～65％，醇沉时间为6～8h。

本发明的尿苷二磷酸的制备方法，具有以下优点：

(1)采用高底物浓度，尿苷浓度在4％以上，利用工程酶提高转化率，缩短发酵时间1/2～ 2/3。

(2)使用微滤设备对发酵液进行预处理。在发酵液的预处理中引入微滤设备，使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜对发酵液进行微滤处理，微滤时间为1～4小时，微滤的主要作用是固液分离和去除发酵液中的部分蛋白，减少分离纯化步骤中的负担。经过微滤处理的发酵液可以直接上柱分离纯化，大大缩短了预处理的时间。同时也提高了产品回收率达到95％～ 100％。分离纯化工艺过程中的提高上柱和洗涤的流速，缩短分离纯化周期。

(3)本方法获得的尿苷二磷酸产品的紫外纯度在80％以上，含水量在8％以下，质量得率在60％以上，相对于核苷酸发酵来说，本方法生产UDP的发酵时间缩短为1/2～2/3；预处理时间缩短为2/5；分离纯化的时间缩短为3/5。由此产生的经济效益显著。

(4)制备目标物的原料来源广泛，价格低廉；制备过程无需特殊或危险性试剂，对设备，人员素质等无高等级要求。工艺过程简单，便捷，可通过两步或三步反应即可制的目标化合物。提供的纯化方法简便，无需特殊设备，成本低廉。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细说明：

本发明揭示了一种用酶法制备UDP的方法，以尿苷、葡萄糖为原料，加入无机离子与酵母，以大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶作为生物催化剂，通过生物转化生产UDP，经过分离提纯和醇沉结晶实现高质量UDP的生产。利用本发明，可以有效地制备UDP，简化了后续分离工艺，适合于工业化生产。

本发明的方法基于以下技术原理：利用大肠杆菌表达尿苷二磷酸酶与酵母、尿苷混合，保温发酵反应合成尿苷二磷酸，发酵液通过微滤实现微滤液澄清，再将微滤液经分离纯化后加入乙醇进行醇沉结晶。

本发明反应时所用的酵母是能够将尿苷转化到UDP的菌体，任何有该转化机制的酵母菌均可应用。本发明采用啤酒厂废酵母，其细胞存活率90％以上。

作为本发明的优选方式，所述的酵母菌体需要进行通透性处理。酵母菌体的通透处理可使用表面活性剂、有机溶剂。表面活性剂包括Triton-X100、NymeenS-215、烷基二甲胺等，促进酵母细胞通透性和UDPG生成的物质均可使用，可单独使用或多种混合使用。表面活性剂通常以0.1～50g/Kg的浓度使用，优选以1～20g/Kg的浓度使用。有机溶剂可使用二甲苯、甲苯、脂肪醇、丙酮、乙酸乙酯等，通常以1～60ml/Kg的浓度使用，优选以2～10ml/Kg的浓度使用。

1.发酵

首先对尿苷进行发酵(10升规模)：尿苷320g(按液相色谱纯度99％投料)；啤酒酵母 3.6kg；加入表面活性剂30～50g；葡萄糖650g；KH2P04950g；硫酸镁52.6g；加入大肠杆菌重组表达的尿苷二磷酸酶50～80g；pH6.7；水加至10升；37℃保温，搅拌发酵2～4小时。啤酒酵母为啤酒生产中淘汰酵母，酵母细胞存活率为98％以上。然后用液相色谱仪进行跟踪检测发酵产物。用冰块降温至15℃，发酵终止，发酵转化率为90％。

2.微滤除蛋白：

使用孔径为0.1μm无机陶瓷膜处理发酵液，微滤前先过80目滤布除去过大的固体颗粒，微滤中用20L的去离子水洗滤膜，分4～5次加入。微滤后，溶液澄清，无悬浮物，产品回收率96±2％。

3.UDP分离，采用阴离子交换法：

(1)方法：使用D280氯型强碱型阴离子交换树脂，pH6.5，上柱流速20L/hr；

淋洗：低盐洗脱：0.03N、pH2.0NaCl溶液；洗脱流速30～40L/hr；；

洗脱：0.3NNaCl、pH2.0溶液；洗脱流速10L/hr；

(2)结果：上柱量：为D280树脂总交换量的1.58％，即32mgUTP/ml树脂。柱分离中产品损失率：5％以内。

(3)鉴定方法：

开始收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。

停止收集：取高盐洗脱液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。

4.纳滤除盐

(1)方法：使用截流分子量为200-300道尔顿的纳滤设备；纳滤中用50L的去离子水洗，分3～4次加入。

(2)结果：纳滤后产品浓度为45g/L，除盐率99％，产品损失率低于3％。

5.UDP脱色

(1)方法：使用D201强碱型阴离子交换树脂，上柱：pH3.0，上柱流速10L/hr；

(2)结果：上柱量：为D201树脂总交换量的10％，即48.2mg/ml树脂。柱分离中产品损失率：1％以内。

(3)鉴定方法：

开始收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，出现明显斑点。

停止收集：取纳滤收集液1～2滴，在暗箱紫外分析仪中观察，无明显斑点出现。

6.UDP醇沉

(1)方法：用80～95％乙醇沉淀，用盐酸调节pH至3.80，在25℃，酒精浓度达到60％停止加入酒精，醇沉时间8h。醇沉沉淀产品状态松散，可以直接抽滤。

采用本实施例的方法获得的尿苷二磷酸产品参数：液相纯度：86.4％,紫外含量:83.7％，水分含量：7.6％，质量得率：67％。

本发明不局限于上述具体的实施方式，对于本领域的普通技术人员来说从上述构思出发，不经过创造性的劳动，所作出的种种变换，均落在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用酶法制备UDP的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将尿苷、糖类碳源、大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶、无机离子与酵母混合保温发酵，发酵终止后得尿苷二磷酸发酵液；

2)将所述的尿苷二磷酸发酵液进行冰块降温预处理，并通过微滤装置分离出澄清的微滤液；

3)将所述的微滤液进行离子交换，采用不同浓度NaCl溶液进行淋洗、洗脱；

4)将所述洗脱后的收集液进行纳滤除盐；

5)将所述纳滤除盐后的收集液用强碱型阴离子交换柱树脂进行脱色；

6)将脱色后的尿苷二磷酸进行醇沉结晶、干燥。

2.如权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述的无机离子包括阳离子和阴离子；所述的阳离子选自：镁离子、钾离子或钠离子；所述的阴离子是磷酸根离子；所述的碳源选自：葡萄糖、果糖或蔗糖。

3.如权利要求2所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述的无机离子由磷酸二氢钾、硫酸镁产生；所述的磷酸二氢钾的终浓度为50±10g/L；所述的硫酸镁的终浓度是3.5±0.5g/L。

4.如权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述的碳源是葡萄糖；所述的葡萄糖的终浓度是35±10g/L；所述的尿苷终浓度是25±10g/L；所述的酵母的终浓度是240±50g/L。

5.如权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，所述大肠杆菌产生重组表达的尿苷二磷酸酶，其方法包括：

(1)提供重组表达载体，包括尿苷二磷酸酶编码基因galU；

(3)培养(2)的重组大肠杆菌BL21，从而表达尿苷二磷酸酶。

6.如权利要求5所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于，在重组表达尿苷二磷酸酶时，当菌株在培养基中OD600达到0.5时，加入IPTG诱导，IPTG终浓度为0.5mM，诱导后继续培养3.5小时，收集菌体，破碎，分离上清。

7.根据权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于所述混合发酵的发酵温度为35～40℃，pH值为6.6～7.0，发酵时间为2～5小时；当可以终止发酵时，温度降至10～20℃使发酵终止，所用终止反应剂为冰块。

8.根据权利要求l所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于所述的预处理采用微滤处理，所用微滤膜的孔径为0.05～5.0μm。

9.根据权利要求l所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于在纳滤除盐时，过滤采用截留分子量为400～500道尔顿的纳滤设备。

10.根据权利要求1所述的用酶法制备UDP的方法，其特征在于所述醇沉结晶时，用80～95％乙醇沉淀，并调pH值为3.7～3.9，温度为20～30℃，最终酒精浓度达到60～65％，醇沉时间为6～8h。