KR20020004870A - 발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법 - Google Patents

발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020004870A
KR20020004870A KR1020010039723A KR20010039723A KR20020004870A KR 20020004870 A KR20020004870 A KR 20020004870A KR 1020010039723 A KR1020010039723 A KR 1020010039723A KR 20010039723 A KR20010039723 A KR 20010039723A KR 20020004870 A KR20020004870 A KR 20020004870A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
nucleoside
usha
genes
apha
Prior art date
Application number
KR1020010039723A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100779865B1 (ko
Inventor
마사히로 가케히
요시히로 우스다
유키코 다비라
신이치 스기모토
Original Assignee
에가시라 구니오
아지노모토 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에가시라 구니오, 아지노모토 가부시키가이샤 filed Critical 에가시라 구니오
Publication of KR20020004870A publication Critical patent/KR20020004870A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100779865B1 publication Critical patent/KR100779865B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 ushA 유전자 및 aph 유전자가 정상적으로 기능하지 않는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르 생산 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 배지중에서 배양하여 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 배지중에 생산하고 축적하는 단계 및 배지로부터 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 수집하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 제조방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법{Method for producing nucleotide by fermentation}
본 발명은 발효에 의해 뉴클레오타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르와 같은 뉴클레오타이드는 조미료, 약제 및 이의 원료 등으로 유용하다.
뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 산업적으로 제조하는 방법으로는, 발효에 의해 뉴클레오사이드를 생산하고 수득된 뉴클레오사이드를 효소적으로 인산화시켜 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 수득함을 포함하는 방법이 공지되어 있다.
한편, 발효에 의해 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 직접 제조하는 방법도 제안되었다. 예를 들어, 일본 특허 공보 제(소)56-12438호에는 아데닌 영양요구주이면서 데코이닌 또는 메티오닌 설폭사이드에 대해 내성이 있으며 5-구아닐산(구아노신 5-모노포스페이트, 이후 "GMP"로도 약칭됨)을 생산하는 능력을 지닌 바실러스(Bacillus) 속에 속하는 세균의 돌연변이주를 배양하고 배지중에서 생산되고 축적된 GMP를 수집함을 포함하여, 5-구아닐산을 제조하는 방법을 기재하고 있다. 또한, 이노신 생산 균주인 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 5-이노신산(이노신 5'-모노포스페이트, 이후 "IMP"로도 약칭됨)을 생산하는 균주를 유도하는 것도 수차례 언급되었다[참조 문헌: Magasanik, B. et al., J. Biol. Chem., 226, 339 (1957); Fujimoto, M., et al., Agr. Biol. Chem., 30, 605 (1966)]. 그러나, 직접적인 발효에 의해 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 것은 수율이 불충분하다는 문제가 있어 상기한 효소적 방법에 비해 실용적이지 못하다.
직접적인 발효에 의한 IMP 제조가 어려운 이유로는 IMP의 세포 투과성이 불량하고 IMP를 분해하는 분해 효소가 꽤 많이 편재하여 분포하고 있다는 것을 들 수 있다[참조 문헌: Nucleic Acid Fermentation, Edited by Aminosan Kakusan Shudankai, Kodansha Scientific, Japan]. 이러한 장애를 극복하기 위해, 뉴클레오타이드 분해 활성을 제거하려는 시도가 있었다. IMP를 이노신으로 분해하는 분해 효소로는, 5-뉴클레오티다제, 산 포스파타제, 알칼리 포스파타제 등이 있다[참조: 상기한 Nucleic Acid Fermentation]. 또한 상기한 일본 특허 공보 제56-12438호는 또한 높은 GMP 수율을 나타내는 세균 균주를, 뉴클레오티다제 활성이 감소된 것으로 나타난 돌연변이주로부터 수득할 수 있음을 제안하였다.
산업적인 수준으로 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 제조하는 기술로서 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)의 돌연변이주를 사용하여 IMP를 제조하는 방법이 개발되었다[참조 문헌: Furuya et al., Appl.Microbiol., 16, 981 (1968)].
상기한 바와 같이 직접적인 발효에 의해 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 제조하기 위한 다양한 연구가 실시되었고, 몇몇 성공적인 예도 또한 공지되어 있다. 그러나, 뉴클레오타이드 분해 효소에 대해 많은 점들이 알려져 있지 않아 수율 개선이 충분하게 연구되었다고 할 수 없다. 특히, 에스케리키아(Escherichia) 속에 속하는 세균으로부터 실질적인 수준의 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 제조한 예는 공지된 것이 없다.
본 발명은 상기한 기술적인 상황의 측면에서 실시되었고, 본 발명의 목적은 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여 IMP와 같은 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 성취하기 위해 본 발명의 연구자들이 꾸준히 연구를 실시한 결과, 공지된 유전자 외에 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이에 존재한다는 것을 발견하였고 이 유전자를 동정하는데 성공하였다. 또한, 본 발명자들은 공지된 5'-뉴클레오티다제 유전자 외에 이러한 신규한 유전자를 파괴하면, 이노신 생산 능력 또는 구아노신 생산 능력을 지닌 에스케리키아 콜라이가 IMP 또는 GMP를 생산하게 된다는 것을 밝혀내었다.
이에 따라, 본 발명은 다음을 제공한다.
(1) ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 배지중에서 배양하여 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 배지중에 생산하고 축적하는 단계; 및 배지로부터 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 수집하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
(2) 돌연변이를 ushA 유전자 및 aphA 유전자에 도입하거나 이러한 유전자가 정상적으로 기능하지 못하도록 이를 파괴하는, (1)에 따른 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
(3) 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르가 5'-이노신산 또는 5-구아닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, (1) 또는 (2)에 따른 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
(4) ushA 유전자 및 aphA 유전자가 파괴된, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균.
(5) 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르가 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, (4)에 따른 에스케리키아 속에 속하는 세균.
(6) 미생물의 모 균주, 또는 공지된 5'-뉴클레오티다제가 결실된 이의 유도체 균주를, 단일 탄소원으로서 제1 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 최소 배지 및 단일 탄소원으로서 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 최소 배지중에서 배양하여 모 균주 및 유도체 균주내 유전자의 발현 프로파일을 조사하는 단계;
탄소원으로서 제1 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 배지중에서 모 균주 및 유도체 균주를 배양하는 경우 이들 각각의 유전자의 발현량의 비율과, 탄소원으로서 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 배지중에서 모 균주 및 유도체 균주를 배양하는 경우 이들 각각의 유전자의 발현량의 비율의 곱을 계산하는 단계; 및
곱의 수치가 보다 높은 유전자를 하나 이상 선택하는 단계를 포함하여, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 축적에 영향을 미치는 5'-뉴클레오티다제 유전자를 탐색하는 방법.
(7) 제1 및 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르가 5'-이노신산 및 5'-구아닐산인, (6)에 따른 5-뉴클레오티다제 유전자를 탐색하는 방법.
(8) 단백질을 선택된 유전자로부터 주변 세포질로 이동시키는데 필요한 시그널 서열을 암호화할 수 있는 유전자를 선택하는 단계를 추가로 포함하여, 5'-뉴클레오티다제 유전자를 탐색하는 방법.
본 발명에 따라서, IMP 또는 GMP와 같은 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하는 직접 발효에 의해 제조할 수 있다.
이후에서 본 발명을 상세히 설명할 것이다.
(1) 공지되지 않은 5'-뉴클레오티다제 유전자 조사
에스케리키아 콜라이의 공지된 5'-뉴클레오티다제로는 ushA 유전자(GenBank 승인 번호 X03895)의 산물인 UDP-당 하이드롤라제(UshA)가 알려져 있다. 이 효소는 AMP, GMP, IMP 및 XMP와 같은 뉴클레오사이드 5'-포스페이트의 탈인산화를 촉매하여 상응하는 뉴클레오사이드를 생성하도록 하는 5'-뉴클레오티다제 활성을 지닌 것으로 공지되어 있다[참조 문헌: H.C. Neu, (1967) Journal of Biological Chemistry, 242, 3896-3904; A. Cowman, I.R. Beacham, (1980) Gene, 12, 281-286].
본 발명의 발명자들은 에스케리키아 콜라이 W3110 균주의 ushA 유전자를 파괴하여 뉴클레오타이드 분해 능력에 대한 이의 영향을 조사하였다. ushA 유전자 파괴된 W3110 균주(W△ushA)의 주변세포질에서의 5'-뉴클레오티다제 활성은 W3110 균주에 비해 현저하게 감소되었다. 그러나, 단일 탄소원으로서 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 함유하는 최소 배지에서 W△ushA 균주의 성장을 조사하는 경우, 이 균주는 성장할 수 있다. 따라서, 뉴클레오타이드 분해 능력은 ushA의 파괴만으로는 완전하게 상실되지 않는 것으로 여겨진다. 또한, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트가 단일 탄소원으로 사용되는 경우, 성장 개시가 지연되었다. 따라서, UshA가 기능하지 않는 경우에 유도되는 또다른 5'-뉴클레오티다제가 존재한다는 것을 예측할 수 있다.
본 발명의 발명자들은 상기한 발견을 근거로 하여, 공지되지 않은 5'-뉴클레오티다제에 대한 조사를 실시하여, 산 포스파타제 유전자(aphA)로서 언급되는 유전자의 산물[참조 문헌: M.C. Thaller, S. Schippa, A. Bonci, S. Cresti, G.M.Rossolini, (1997) FEMS Microbiology Letters, 146, 191-190, GeneBank 승인 번호 X86971] 또는 yjbP(GeneBank 승인 번호 AAC77025)가 5'-뉴클레오티다제 활성을 갖는다는 것을 밝혀내었다.
상기한 바와 같이 뉴클레오사이드 5'-포스페이트의 축적에 영향을 미치는 5'-뉴클레오티다제 등을 암호화하는 유전자는 다음에 대해서 조사할 수 있다.
먼저, 미생물 모 균주, 및 공지된 5'-뉴클레오티다제가 결실된 이의 유도체 균주를, 단일 탄소원으로서 IMP 또는 GMP와 같은 제1 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르 또는 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유한 최소 배지에서 배양한다. 미생물이 에스케리키아 콜라이인 경우, 공지된 5'-뉴클레오티다제는 상기한 UshA일 수 있다.
이어서, 상기한 균주의 유전자 발현 프로파일을 조사한다. 상세하게는, 야생형 균주 및 유도체 균주중에서 각각의 유전자에 대한 발현량의 비율을 조사한다.
그런 다음, 탄소원으로서 제1 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 함유하는 배지중에서 모 균주 및 유도체 균주를 배양하는 경우 이들 각각의 유전자의 발현량의 비율과, 탄소원으로서 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 함유하는 배지중에서 모 균주 및 유도 균주를 배양하는 경우 이들 각각의 유전자의 발현량의 비율의 곱을 각각의 유전자에 대해 계산하고, 곱의 수치가 보다 높은 하나 이상의 유전자를 선택한다.
유전자 발현 프로파일에 대한 방법이 특별히 제한되지는 않지만, 예를 들어 DNA 정렬 방법[참조 문헌: H. Tao, C. Bausch, C. Richmond, F.R. Blattner, T.Conway, (1999) Journal of Bacteriology, 181, 6425-6440]을 언급할 수 있다.
상기 선택한 유전자로부터, 단백질을 주변세포질로 이동시키는데 필요한 시그널 서열을 암호화할 수 있는 유전자를 선택함으로써 표적 유전자의 범위를 추가로 좁힐 수 있다. 이는, 표적 5'-뉴클레오티다제가 주변세포질로 이동하여 여기에서 기능하는 것으로 예상되기 때문이다.
하기 언급될 실시예에 나타낸 바와 같이, 에스케리키아 콜라이의 경우, 두 종류의 유전자 b0220(또한 o157로도 지칭됨) 및 yjbP를 선택하였다. 이러한 유전자들 중에서, yjbP는 산 포스파타제 유전자(aphA)이다. 다른 한편으로, b0220은 ykfE로 지정된, 기능이 확인되지 않은 유전자이다. 이러한 유전자가 에스케리키아 콜라이내에서 증폭되는 경우, ykfE 유전자 증폭 균주에서는 5-뉴클레오티다제 활성의 현저한 증가가 관찰되지 않지만, aphA 유전자 증폭 균주에서는 5-뉴클레오티다제 활성의 현저한 증가가 관찰되었다. 따라서, aphA 유전자 산물(AphA)이 5-뉴클레오티다제 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 이러한 방식으로, aphA 유전자는 뉴클레오사이드 5'-포스페이트의 축적에 영향을 미치는, 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 유전자인 것으로 밝혀졌다.
(2) 본 발명의 에스케리키아 속에 속하는 세균
본 발명의 에스케리키아 속에 속하는 세균은, ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균이다. 에스케리키아 속 자체에 속하는 세균은, 에스케리키아 콜라이와 같이 에스케리키아 속에 속하는 미생물이면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 상세하게는 다음 문헌[참조 문헌: Neidhardt, F.C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1]에 언급된 것을 사용할 수도 있다.
본 발명의 에스케리키아 속에 속하는 세균은, 예를 들어 모 균주와 같이 푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여, ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 돌연변이주 또는 유전자 조작주를 번식시킴으로써 수득할 수 있다. 또한, 본 발명의 에스케리키아 속에 속하는 세균은 모 균주와 같이, ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 균주를 사용하여, 푸린 뉴클레오사이드 생산 균주의 번식과 유사하게 번식시켜 수득할 수 있다.
푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균의 예에는, 이노신, 구아노신, 아데노신, 크산토신, 푸린 리보사이드, 6-메톡시푸린 리보사이드, 1,6-디아미노푸린 리보사이드, 6-플루오로푸린 리보사이드, 6-티오푸린 리보사이드, 2-아미노-6-티오푸린 리보사이드, 머캅토구아노신 등을 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균이 포함된다. 모 균주와 같이, 푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌 이러한 에스케리키아 세균을 사용하여, ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 돌연변이주 또는 유전자 조작주를 번식시킴으로써, 각각의 푸린 뉴클레오사이드에 상응하는 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르 생산 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 수득할 수 있다.
본 발명에서 언급된 푸린 뉴클레오사이드 생산 능력은 푸린 뉴클레오사이드를 배지중에서 생산하고 축적하는 능력을 의미한다. 또한, "푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌"이란 표현은 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 이. 콜라이의 야생형 균주, 예를 들어 W3110 균주로 수득된 것보다 다량의 푸린 뉴클레오사이드를 배지중에서 생산하고 축적한다는 것을 의미한다.
또한, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르 생산 능력은 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 배지중에서 생산하고 축적하는 능력을 의미한다. 또한, "푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌"이란 표현은 에스케리키아 속에 속하는 미생물이 이. 콜라이의 야생형 균주, 예를 들어 W3110 균주로 수득된 것보다 다량의 푸린 뉴클레오사이드를 배지중에서 생산하고 축적하는 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 하기하는 실시예 6에서 언급된 조건하에 배양하는 경우 미생물이 100㎎/L 이상, 보다 바람직하게는 500㎎/L 이상, 추가로 바람직하게는 1000㎎/L 이상의 양으로 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 생산하고 축적하는 것을 의미한다.
푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균은, 예를 들어 국제 특허 공보 제WO 99/03988호에 상세하게 기재되어 있다. 보다 상세하게는, 상기한 국제 특허 공보에 기술되어 있는 에스케리키아 콜라이 FADRaddG-8-3::KQ 균주(purFKQ, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)를 언급할 수 있다. 이 균주는, AMP 및 GMP에 의한 피드백 억제가 탈감작화되고 326번 위치의 라이신 잔기가 글루타민 잔기로 치환된 PRPP 아미도트랜스퍼라제를 암호화하는 돌연변이 purF를가지며, 이의 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD), 푸린 리프레서 유전자(purR), 아데노신 데아미나제 유전자(add) 및 이노신/구아노신 키나제 유전자(gsk)가 파괴되어 있다. 비공식 번호가 제AJ13334호인 이 균주는 부다페스트 조약하에 국제 기탁물로서, 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry; 현재 독립 행정 기관, 고등 공업 과학기술 연구소(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology), 국제 특허 유기체 기탁 기관; Chuo Dai-6, 1-1 Higash 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, postal code: 305-5466]에 1997년 6월 24일자로 기탁되었으며, FERM BP-5993의 수탁 번호를 부여받았다. 이 균주는 이노신 및 구아노신 생산 능력을 지닌다. 또한, 하기에서 언급할 실시예에 기술된 바와 같이 작제된, 돌연변이 purF 유전자 함유 플라스미드를 FADRaddeddyicPpgixapA 균주로 도입함으로써 수득한 균주를 이노신 생산 세균으로서 또한 적절하게 사용할 수 있다. 구아노신 생산 능력은, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신세타제를 각각 암호화하는 guaA 및 guaB 유전자를 이노신 생산 세균으로 도입하여 증강시킬 수 있다. 본 발명에서, 세균 균주는 상기한 균주로 한정되지 않으며, 푸린 뉴클레오사이드 생산 능력을 지닌 어떠한 균주도 제한없이 사용될 수 있다.
ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 돌연변이주 또는 유전자 재조합주는, 상기한 유전자를 변형시켜 유전자의 산물인 5'-뉴클레오티다제의 활성을 감소 또는 결실시키거나, 유전자의 전사를 감소시키거나 제거함으로써 수득할 수 있다. 이러한 미생물은, 예를 들어 유전자 재조합 방법[참조 문헌: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)]을 이용한 상동 재조합에 의해 염색체상의 ushA 유전자 및 aphA 유전자를, 정상적으로 기능하지 않는 ushA 유전자 및 aphA 유전자(이후 "파괴된 ushA 유전자" 및 파괴된 "aphA 유전자"로 지칭)로 대체시켜 수득할 수 있다.
상동 재조합에서는 염색체상의 서열과 상동성을 나타내는 서열을 갖는 플라스미드 등을 세균 세포내로 도입한다. 이어서, 상동 서열의 한 위치에서 특정한 빈도로 재조합이 발생하여 도입된 전체 플라스미드가 염색체로 통합된다. 이후에 상동 서열의 한 위치에서 재조합이 추가로 발생하는 경우, 플라스미드를 염색체로부터 다시 제거한다. 이때, 재조합의 위치에 따라 파괴된 유전자가 염색체상에 잔류할 수 있으며, 본래의 정상 유전자가 플라스미드와 함께 제거될 수 있다. 이러한 세균 균주를 선택함으로써 염색체상의 정상 ushA 유전자 또는 aphA 유전자가, 파괴된 ushA 유전자 또는 파괴된 aphA 유전자로 대체된 균주를 수득할 수 있다.
이러한 상동 재조합을 바탕으로 하는 유전자 파괴 기술은 이미 확립되어 있으며, 선형 DNA를 이용하는 방법, 온도 감수성 플라스미드를 이용하는 방법 등을 사용할 수 있다. 또한 표적 미생물 세포내에서 복제될 수 없는 약물 내성 유전자와 같은 마커 유전자가 내부에 삽입된 ushA 유전자 또는 aphA 유전자를 함유한 플라스미드를 사용하여 ushA 유전자 및 aphA 유전자를 파괴시킬 수 있다. 즉, 상기한 플라스미드로 형질전환되어 약물 내성을 획득한 형질전환체에서, 마커 유전자는 염색체 DNA로 통합된다. 마커 유전자의 양말단에 위치한 ushA 유전자 또는 aphA 유전자와 염색체상의 이러한 유전자와의 상동 재조합에 의해 마커 유전자가 염색체로 통합될 가능성이 높기 때문에, 유전자 파괴 균주를 효율적으로 선택할 수 있다.
유전자 파괴에 사용되는 파괴된 ushA 유전자 및 파괴된 aphA 유전자는, 구체적으로 제한 효소를 이용한 분해 및 결합에 의해 이들 유전자의 특정 영역을 결실시키고 다른 DNA 단편(마커 유전자 등)을 이들 유전자에 삽입시키거나, 부위 지시 돌연변이화[참조 문헌: Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)] 또는 화학 제제(예: 차아황산나트륨 또는 하이드록실아민)로의 처리[참조 문헌: Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270 (1978)]에 의해 ushA 유전자 또는 aphA 유전자의 암호화 영역, 프로모터 영역 등의 뉴클레오타이드 서열내로 뉴클레오타이드 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 도입하여 암호화된 리프레서의 활성을 감소 또는 결실시키거나, 또는 ushA 유전자 또는 aphA 유전자의 전사를 감소시키거나 제거함으로써 수득할 수 있다. 이러한 양태중에서, 제한 효소로 분해하고 결합시켜 ushA 유전자 또는 aphA 유전자의 특정 영역을 결실시키는 방법, 및 상기한 유전자내에 다른 DNA 단편을 삽입시키는 방법이, 방법의 신뢰성 및 안전성 측면에서 바람직하다. ushA 유전자 및 aphA 유전자의 유전자 파괴 순서는 특별히 제한되지 않으며, 둘 중에서 어느 것도 먼저 파괴할 수 있다.
ushA 유전자 및 aphA 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 자체가 공지되어 있기때문에, 뉴클레오타이드 서열을 기본으로 하는 PCR 또는 하이드리드화반응에 의해 이를 용이하게 수득할 수 있다. 예를 들어, ushA 유전자는 예를 들어 서열 1 및 2에 나타낸 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 에스케리키아 콜라이의 염색체 DNA로부터 수득할 수 있다. 또한, aphA 유전자의 N-말단 영역은 서열 3 및 7에 나타낸 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있으며, 이의 C-말단 영역은 서열 4 및 8에 나타낸 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있다.
서던 블롯팅 또는 PCR에 의해 염색체상의 유전자를 분석함으로써, 표적 유전자의 파괴 여부를 확인할 수 있다.
(3) 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 제조방법
뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르는, ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르 생산 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 배지중에서 배양하여 뉴클레오사이드 5'-포스페이트를 배지중에 생산하고 축적하고, 이 배지로부터 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 수집함으로써 제조할 수 있다.
배지로는 탄소원, 질소원, 무기이온, 및 경우에 따라 기타 유기 성분을 함유한 일반적인 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로는, 글루코스, 락토스, 갈락토스, 프럭토스, 아라비노스, 말토스, 크실로스, 트레할로스, 리보스 및 전분 가수분해물과 같은 당류; 글리세롤, 만니톨 및 소르비톨과 같은 알콜; 글루콘산, 푸마르산, 시트르산 및 석신산과 같은 유기산 등을 사용할 수 있다.
질소원으로는, 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄과 같은 무기 암모늄 염; 대두 가수분해물과 같은 유기 질소; 암모니아 가스, 암모니아수 등을 사용할 수 있다.
유기 미량 영양물로는 비타민 B1과 같은 비타민, 핵산(예: 아데닌 및 RNA) 또는 효모 추출물을 포함한 요구 물질을 적절한 양으로 가하는 것이 바람직하다. 이들 외에도, 경우에 따라 소량의 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등을 부가한다.
배양은 바람직하게는 호기성 조건하에 16 내지 72시간 동안 수행한다. 배양 온도는 30℃ 내지 45℃로 조절하고, pH는 배양 기간 동안에 5 내지 8로 조절한다. 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질뿐만 아니라 암모니아 가스 등을 사용하여 pH를 조절할 수 있다.
발효된 액체로부터 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 수집하는 것은, 일반적으로 이온 교환 수지 방법, 침전 방법 및 기타 공지된 기술을 사용하여 수행한다.
본 발명은 하기의 실시예를 참고로 하여 추가로 보다 상세하게 설명할 것이다.
실시예 1
에스케리키아 콜라이의 뉴클레오타이드 생산에 대한 ushA 파괴 효과
(1) ushA 파괴된 균주의 작제
에스케리키아 콜라이 W3110의 게놈 DNA로부터의 ushA 유전자 단편은 PCR로 증폭시킨다. 게놈 DNA를 RNA/DNA 맥시 키트(RNA/DNA maxi Kit; Qiagen)를 사용하여 추출한다. 서열 1 및 2에 나타낸 프라이머, 및 폴리머라제에 첨부된 지시사항에 따라 파이로베스트 DNA 폴리머라제(Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo)를 사용하여 PCR을 수행한다. PCR 실시 후, 증폭된 DNA 단편은 위저드 PCR 프렙스(Wizard PCR Preps; Promega)를 사용하여 정제한다. 제한 효소 SphI 및 SalI(Takara Shuzo)으로 분해한 후, 정제된 DNA 단편을 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올로 침전시킨다. SphI 및 SalI으로 유사하게 분해한 pHSG397(Takara Shuzo)은 DNA 결합 키트 버젼 2(Takara Shuzo)를 사용하여 결합시킨다. JM109의 컴피턴트 세포(Takara Shuzo)를 상기한 결합 혼합물로 형질전환시키고, 30㎍/㎖의 클로람페니콜(Sigma)을 함유한 LB 한천 플레이트(LB + 클로람페니콜 플레이트)에 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 배양한 후, 성장한 콜로니는 시험관중 30㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유한 LB 배지에서 배양하고, 플라스미드는 자동 플라스미드 추출기 PI-50(automatic plasmid extractor PI-50, Kurabo Industries)을 사용하여 추출한다. 수득한 플라스미드는 pHSGushA로 명명한다.
그런 다음, pHSGushA에 포함된 ushA 유전자로부터 HpaI 단편을 다음과 같이 제거한다. pHSGushA를 제한 효소 HpaI(Takara Shuzo)으로 분해하고 페놀/클로로포름으로 처리하고 에탄올로 침전시킨 다음, DNA 결합 키트 버젼 2를 사용하여 결합시킨다. JM109를 상기한 결합 용액으로 형질전환시키고, 나타난 콜로니로부터 플라스미드를 추출한다. 수득한 플라스미드를 SphI 및 SalI으로 분해하고 아가로스겔 전기영동하여, HpaI 분해 단편이 ushA 유전자 영역으로부터 결실되어 있는 삽입된 표적 단편을 함유한 플라스미드를 선택한다.
수득한 플라스미드 단편, 및 국제 특허 공보 제WO 99/03988호에 기술되어 있는 온도 감수성 플라스미드 pMAN997을 SphI 및 SalI으로 분해하여 수득한 단편을 결합시킨다. JM109를 결합 용액으로 형질전환시키고, 30℃에서 50㎍/㎖의 암피실린(Meiji Seika Kaisha)을 함유한 LB 한천 플레이트(LB + 암피실린 플레이트)상에서 콜로니를 선택한다. 콜로니는 시험관중 50㎍/㎖의 암피실린을 함유한 LB 배지에서 배양하고 플라스미드를 추출한다. SphI 및 SalI으로 분해하여 수득할 수 있는 바람직한 길이의 단편으로부터의 플라스미드를, ushA가 파괴된 플라스미드 pMAN△ushA로 사용한다. 상기한 pMAN997은 pMAN031의 VspI-HindIII 단편[참조 문헌: J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)]을 pUC19(Takara Shuzo)로 교환하여 수득한다.
W3110 균주는 pMAN△ushA로 형질전환시키고, 콜로니는 30℃에서 LB + 암피실린 플레이트상에서 선택한다. 선택된 콜로니는 액체 배양물로서 30℃에서 밤새 배양한다. 배양 브로쓰를 10-3배로 희석시키고, LB+암피실린 플레이트상에 접종하고, 콜로니를 42℃에서 선택한다. 선택된 콜로니를 LB + 암피실린 플레이트에 분산시키고, 30℃에서 배양한다. 그런 다음, 플레이트상의 세포의 1/8을 LB 배지 2㎖에 현탁시키고, 진탕시키면서 42℃에서 4 내지 5시간 동안 배양한다. 10-5배로 희석시킨 세포를 LB 플레이트상에 씨딩하고 수득된 콜로니중 수백개를 LB 플레이트 및 LB + 암피실린 플레이트상에 접종하고, 성장을 확인하여 암피실린 감수성 균주를 선택한다. 암피실린 감수성 균주중 몇개의 균주에 대해 콜로니 PCR을 수행하여 ushA 유전자의 결실을 확인한다. 이러한 방식으로 이. 콜라이 W3110로부터 유도된 ushA 파괴된 균주, W△ushA를 수득한다.
(2) 5'-뉴클레오티다제 및 뉴클레오타이드 동화작용 배양물의 측정
W3110 및 W△ushA를 37℃에서 LB 플레이트에서 배양하고, 에드워드 등의 방법[참조 문헌: C.J. Edwards, D.J. Innes, D.M. Burns, I.R. Beacham, (1993) FEMS Microbiology Letters, 114, 293-298]에 따라 증식 상태에 있는 세포로부터 주변세포질을 추출한다. 상기한 참조문헌에 기술되어 있는 공정을 사용하여, IMP, GMP 및 AMP에 대한 주변세포질 단백질의 5'-뉴클레오티다제 활성을 측정한다. 분당 1μmol의 인산을 생산하는 활성을 1단위로 지정한다. 결과적으로, 표 1에 나타낸 바와 같이 W△ushA의 주변세포질 5'-뉴클레오티다제 활성은 W3110에 비해 현저하게 감소되었다.
주변세포질 5'-뉴클레오티다제 활성(단위/단백질 ㎎)
균주 기질
IMP GMP AMP
W3110 14.0 10.8 14.2
W△ushA 0.21 0.16 0.03
W△ushA가 뉴클레오타이드 분해 능력을 완전히 상실했는지를 확인하기 위해, 단일 탄소원으로서 뉴클레오타이드를 함유한 최소 배지에서 이의 성장을 조사한다. W3110 및 W△ushA를 37℃에서 LB 배지에서 밤새 배양한 다음, 생리적 염수로 세척하고, 5.8g/L의 IMP 또는 6.7g/L의 GMP을 함유한 M9 최소 배지[참조 문헌: J.H. Miller, "A SHORT COURSE IN BACTERIAL GENETICS", Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1992] 50㎖를 가하고 37℃에서 배양한다. 적절한 시간이 경과한 후, 배양 브로쓰를 수집하고, 분광광도계 DU640(Beckman)을 사용하여 660㎚에서의 이의 흡광도를 측정한다. W△ushA의 성장물이 탄소원으로서 IMP 또는 GMP를 함유한 M9 배지를 분해하더라도, 이는 상기한 배지에서 성장할 수 있다. 이는, 뉴클레오타이드 분해 능력이 ushA의 파괴만으로는 완전히 상실되지 않음을 의미한다. 또한, 성장 개시가 지연되기 때문에, UshA가 기능하지 않는 경우에 유도되는 또다른 5'-뉴클레오티다제가 존재한다는 것을 예측할 수 있다.
실시예 2
신규한 5'-뉴클레오티다제 유전자의 탐색
실시예 1에서 예측된 5'-뉴클레오티다제 유전자는, 탄소원으로서 IMP 또는 GMP를 함유한 M9 배지중에서 배양하는 경우 W3110에 비해 W△ushA에서 보다 강력하게 발현되는 것으로 간주된다. W△ushA에서 작용하는 것으로 여겨지는 5'-뉴클레오티다제를 확인하기 위해, 탄소원으로서 IMP 또는 GMP를 함유한 M9 최소 배지중에서 배양된 W3110 및 W△ushA의 유전자 발현 프로파일을 비교한다.
유전자 발현 프로파일을 조사하기 위해, DNA 정렬 방법[참조 문헌: H. Tao, C. Bausch, C. Richmond, F.R. Blattner, T. Conway, (1999) Joural of Bacteriology, 181, 6425-6440]을 사용한다. 파노라마 이. 콜라이 유전자정렬(Panorama E. Coli Gene Arrays)은, 이. 콜라이의 4290개 유전자의 증폭된 DNA 단편이 스폿팅된 나일론 막으로 구성된 DNA 정렬로, 이를 사용함으로써 이. 콜라이의 전체 유전자의 mRNA 발현량을 한번에 포괄적으로 분석할 수 있다.
W3110 및 W△ushA를 단일 탄소원으로서 IMP 또는 GMP를 함유한 M9 배지중에서 배양하고, RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 증식 상태에 있는 세포로부터 RNA를 추출한다. 추출한 RNA 용액에 각각 10mM 및 0.25단위/㎖의 최종 농도로 MgCl2및 DNaseI(Boeringer Mannheim)을 함께 부가하여 오염된 게놈 DNA를 분해하고, 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 전체 RNA를 정제한다. 파노라마 이. 콜라이 유전자 정렬에 첨부되어 있는 지시 사항에 따라, AMV 역전사효소(Promega), dATP, dGTP, dTTP, [α-33P]-dCTP(Amersham Pharmacia) 및 랜덤 프라이머 pd(N)6(Amersham Pharmacia)을 사용하여 역전사반응을 실시하여 cDNA 프로브를 제조한다. 수득된 cDNA는 프로브퀀트(ProbeQuant; Amersham Pharmacia)를 사용하여 정제한다.
상기한 바와 같이 수득한 cDNA 프로브를 사용하여, 파노라마 이. 콜라이 유전자 정렬에 첨부된 지시사항에 따라 하이브리드화반응 및 세척을 실시한다. 막을 하이브리드화 백에 넣어 밀봉시키고, 48시간 동안 이미징 플레이트(Fuji Photo Film)와 접촉시키고, FLA3000G(Fuji Photo Film)을 사용하여 이미지를 포착한다. 이미지 분석 소프트웨어 AIS(Imaging Research)로 각 스폿의 농도를 정량화하고, 동일 막상의 전체 스폿 농도의 합에 대한 각 스폿의 농도의 비율을 모든 막에 대해제시한다. 유전자 발현의 증가 및 감소는 각 유전자의 상기한 비율의 수치를 비교함으로써 조사한다.
이러한 방식으로, 탄소원으로서 IMP를 함유한 M9 배지중에서 배양하는 경우에 W3110에 비해 W△ushA에서 발현량이 보다 많은 유전자, 및 탄소원으로서 GMP를 함유한 M9 배지중에서 배양하는 경우에 W3110에 비해 W△ushA에서 발현량이 보다 많은 유전자를 각각 선택한다. 그러나, 배양물의 경우에 탄소원을 교환하는 것이 다수의 유전자의 발현량을 변화시키기 때문에, 선택된 유전자의 수가 많으면 각 유전자의 기능을 확인하는 것이 어렵다. 따라서 후보 유전자의 범위를 좁히는 방법으로 하기의 선별 방법을 사용한다.
탄소원으로서 IMP 및 GMP를 사용하는 배양물 모두에서 표적 5'-뉴클레오티다제 유전자가 증가된 발현량을 나타내는 것으로 간주되기 때문에, 탄소원으로서 IMP를 사용하여 배양하는 경우에 수득된 W△ushA 및 W3110의 발현량의 비율(W△ushA/W3110) 및 탄소원으로서 GMP를 사용하여 배양되어 수득된 W△ushA 및 W3110의 발현량의 비율(W△ushA/W3110)의 곱을 계산하고, 보다 높은 수치의 곱을 나타내는 유전자를 탐색한다. 수치가 높은 상위 50개의 유전자를 표 2(1 내지 25번) 및 표 3(26 내지 50번)에 나타내었다. 이들 중에서, 기능이 공지되지 않은 유전자를 5'-뉴클레오티다제 활성을 가질 수 있는 후보로서 선택한다. W△ushA는 세포외 뉴클레오타이드를 분해하여 성장할 수 있기 때문에, 표적 5'-뉴클레오티다제가 주변세포질로 이동하여 여기에 기능해야만 하는 것으로 예측된다. 따라서, 기능이 공지되지 않은 유전자들중에서, 단백질이 주변세포질로 이동하는데 필요한 시그널 서열을 갖는 유전자만을 선택한다. 이러한 선별에 의해 후보 유전자는 두 종류의 b0220(또는 o157) 및 yjbP로 좁혀진다.
이들 유전자를 조사하여, b0220은 ykfE로서 지정된, 기능이 미확인된 것으로 언급된 유전자이고, yjbP는 산 포스파타제 유전자로서 언급된 유전자인 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: M.C. Thaller, S. Schippa, A. Bonci, S, Cresti, G.M. Rossolini, (1997) FEMS Microbiology Letters, 146, 191-198].
실시예 3
유전자 증폭에 의한 후보 유전자 평가
실시예 2에서 수득한 후보 유전자인 ykfE 및 aphA를 각각 증폭시킨 균주를 제조하여, 5'-뉴클레오티다제 활성에 대한 이 유전자의 영향을 조사한다. ykfE 및aphA의 유전자 단편은 서열 3 및 4에 나타낸 프라이머와 서열 5 및 6에 나타낸 프라이머를 각각 사용하여 증폭시킨다. ykfE 단편은 벡터 pSTV28(Takara Shuzo)에서 제한 효소 SalI 및 PstI(Takara Shuzo)을 이용하여 수득한 절단 부위내로 클로닝하여 pSTVykfE를 수득한다. 또한, aphA 단편은 벡터 pSTV28에서 제한 효소 SalI 및 SphI을 이용하여 수득한 절단 부위내로 클로닝하여 pSTVaphA를 수득한다. 상기한 바와 같이 제조한 각각의 플라스미드로 W△ushA를 형질전환시키고, 30㎍/㎖의 클로람페니콜을 함유한 LB 배지중 37℃에서 배양한다. 증식 상태에 있는 세포의 주변세포질에서 기질로서 IMP, GMP 및 AMP에 대한 5'-뉴클레오티다제 활성을 측정한다. 그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이 aphA 유전자 증폭은 벡터만을 함유한 균주와 비교시 5'-뉴클레오티다제 활성을 뚜렷히 증가시키고, 이에 따라 AphA 단백질이 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 반면, ykfE 증폭된 균주는 활성이 유의적으로 증가하지 않아 5'-뉴클레오티다제 활성을 갖지 않는 것으로 측정되었다.
aphA- 및 ykfE-증폭된 균주의 주변세포질에서의 5'-뉴클레오티다제 활성(U/단백질 ㎎)
균주 기질
IMP GMP AMP
W△ushA/pSTV 0.074 0.067 0.024
W△ushA/pSTVykfE 0.15 0.15 0.067
W△ushA/pSTVaphA 3.2 3.5 1.8
실시예 4
W△ushA내로 aphA의 파괴 도입
W△ushA 균주에서, 5'-뉴클레오티다제 활성이 있는 유전자로 추측되는 aphA에 대한 유전자 파괴를 수행한다. aphA의 N-말단 영역의 단편과 C-말단 영역의 단편은 서열 5 및 7에 나타낸 프라이머, 및 서열 4 및 8에 나타낸 프라이머를 각각 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 위저드 PCR 프렙스를 사용하여 정제한다. 각각 1㎕의 양으로 증폭 반응 용액을 혼합하고 이를 PCR 반응 용액에 가하고, 서열 3 및 4에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR 교차반응[참조 문헌: A.J. Link, D. Phillips, G.M. Church (1997) Journal of Bacteriology, 179, 6228-6237]을 실시하여, 중심 부분에서 약 300개의 뉴클레오타이드가 결실된 aphA 유전자 단편을 수득한다. 이 단편을 온도 감수성 플라스미드 pMAN997의 SalI-SphI 절단 부위에 삽입하여 유전자가 파괴된 pMAN△aphA를 수득한다. 유전자가 파괴된 이 플라스미드를 사용하여, W3110 및 W△ushA의 aphA 각각을 파괴하여, aphA 결핍 균주(W△aphA) 및 ushA- 및 aphA-이중 결핍 균주(W△ushA△aphA)를 수득한다.
실시예 5
W△ushA△aphA의 5'-뉴클레오티다제 활성 및 뉴클레오타이드 동화작용 배양물의 측정
W3110, W△ushA, W△aphA 및 W△ushA△aphA를 각각 LB배지에서 37℃에서 배양하고, 증식 상태에 있는 세포의 주변세포질중에서의 5'-뉴클레오티다제 활성을 측정한다. 결과는 표 5에 나타내었다. W△aphA에서의 활성이 W3110에 비해 대략 절반이 감소되더라도 이는 여전히 상당히 남아있으며, ushA가 이에 기여하는 것으로 여겨진다. 반면, 이중 결핍 균주인 W△ushA△aphA의 주변세포질중의 5'-뉴클레오티다제 활성은 추가로 감소되었고 실질적으로 제거되었다.
또한 각 균주의 뉴클레오타이드 분해 활성을 조사하기 위해, 이들 균주는 플라스크내에 탄소원으로서 IMP 또는 GMP를 함유하는 M9 배지중에서 배양한다. 상기한 탄소원 모두를 사용하면 W3110, W△aphA 및 W△ushA가 이 순서의 성장도로 성장하는 것으로 관찰되지만, 300시간 동안 배양을 실시하여도 W△ushA△aphA의 성장은 관찰되지 않았으며, 이에 따라 이 균주는 단일 탄소원으로서 IMP 또는 GMP를 함유한 M9 배지중에서 성장할 수 없음을 알 수 있다. 이러한 방식으로 이. 콜라이 W3110의 세포외 뉴클레오타이드 분해 능력은 ushA 및 aphA의 이중 결핍에 의해 성공적으로 결실되었다.
실시예 6
이노신 생산 세균에서의 ushA 및 aphA에 대한 유전자 파괴
IMP의 직접적인 발효 가능성을 조사하기 위해, 에스케리키아 콜라이의 이노신 생산 균주에서 ushA 및 aphA에 대한 유전자 파괴를 실시한다. 이노신 생산 세균으로서, 국제 특허 공보 제WO 99/03988호에 기술되어 있는 FADRaddeddyicPpgixapA(이후 "I"로 언급)를 사용한다. 제WO 99/03988호에서 언급된 플라스미드 pKFpurFKQ에 포함된 돌연변이 purE 유전자 단편을 BamHI 및 HindIII로 분해한 다음, 정제하고, 동일 효소로 분해한 pMW128(Nippon Gene)과 결합시킨다. 수득한 플라스미드 pMWpurFKQ를 I 균주로 도입한다. 수득한 균주 I/pMWpurFKQ는 배양 브로쓰에서 약 2 내지 3g/L의 이노신을 축적시키는 능력을 지니는 균주가 된다.
상기한 균주 FADRaddeddyicPpgixapA는 PRPP 아미노트랜스퍼라제 유전자(purF), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 푸린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전제(deoD), 푸린 리프레서 유전자(purR), 아데노신 데아미나제 유전자(add), 6-포스포글루코네이트 데하이드라제 유전자(edd), 아데닌 데아미나제 유전자(yicP), 포스포글루코스 이소머라제 유전자(pgi) 및 크산토신 포스포릴라제 유전자(XAPa)를 파괴시킨 균주이다. 또한 pKFpurFKQ는 326번 라이신 잔기가 글루타민 잔기로 치환되어 AMP 및 GMP에 의해 이의 피드백 억제가 제거된, PRPP 아미도트랜스퍼라제를 암호화하는 돌연변이 purF를 포함하고 있다[참조: 국제 특허 공보 제WO 99/03988호].
ushA 유전자가 파괴된 상기한 플라스미드 pMAN△ushA 및 aphA 유전자가 파괴된 플라스미드 pMAN△aphA를 사용하여 ushA-단일 결핍 균주(I△ushA/pMWpurFKQ),aphA-단일 결핍 균주(I△aphA/pMWpurFKQ) 및 ushA- 및 aphA-이중 결핍 균주(I△ushA△aphA/pMWpurFKQ)를 수득한다.
IMP 생산 능력에 대해 상기한 균주 각각을 평가한다. IMP 생산 능력을 평가하기 위한 배지, 배양 방법 및 분석 방법은 하기와 같다.
[기본 배지: MS 배지]
최종 농도
글루코스 40g/L(개별적으로 멸균시킴);
(NH4)2SO416g/L;
KH2PO41g/L;
MgSO47H2O 1g/L;
FeSO47H2O 0.01g/L;
MnSO44H2O 0.01g/L;
효모 추출물 8g/L; 및
CaCO330g/L(개별적으로 멸균시킴).
[배양 방법]
재충전 배양물: 보관된 세포를 37℃에서 밤새 LB 한천 배지(필요한 제제 부가)에 접종한다.
씨드 배양물: 재충전 세포를 37℃에서 밤새 LB 브로쓰(필요한 제제 부가)에 접종한다.
주 배양물: 씨드 배양 브로쓰를 37℃에서 500㎖들이 사카구치 플라스크중 20㎖의 2%의 MS 배지(아데닌, 및 경우에 따라 기타 제제 부가)중에 접종한다.
[분석 방법]
배양 브로쓰 500㎕를 시간 경과에 따라 추출하고, 15,000rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 H2O로 4배 희석하고 HPLC로 분석한다.
분석 조건:
칼럼: 아사히팩(Asahipak) GS-220(7.6㎜ ID×500㎜ L)
완충액: 0.2M NaH4PO4(인산을 사용하여 pH를 3.98로 조절)
온도: 55℃
유속: 1.5㎖/분
검출: UV 254㎚
보유 시간(분)
이노신 16.40
IMP 11.50
구아노신 19.67
GMP 13.04
결과는 표 6에 나타내었다. 표 6에 두개의 병행 실험의 결과를 각각 나타내었다. 배양 브로쓰에서는 I△ushA△aphA의 경우 IMP가 최대 약 1.0g/L로 축적되는 것으로 입증되었다.
플라스크에서의 배양에 의한 이노산 생산 세균의 ushA- 및 aphA-결핍 균주의 평가
균주 배양 시간(h) 이노신(g/L) IMP(g/L)
I/pMWpurFKQ 4848 2.32.3 00
I△ushA/pMWpurFKQ 5151 3.12.9 00
I△aphA/pMWpurFKQ 5151 3.63.2 00
I△ushA△aphA/pMWpurFKQ 5454 2.42.6 1.00.6
실시예 7
ushA- 및 aphA-이중 결핍 균주에 의한 GMP의 생산
본 발명에 의한 GMP 제조 가능성을 조사하기 위해, 실시예 6에서 수득한 ushA- 및 aphA-이중 결핍 균주 I△ushA△aphA/pMWpurFKQ에 구아노신 생산 능력을 부여한다. 구아노신 생산 능력을 부여하거나 증강시키는 것은, IMP의 GMP로의 반응을 촉매하는 효소의 유전자를 증강시킴으로써 수득한다. IMP를 XMP로 전환하는 반응은, guaA에 의해 암호화되는 IMP 데하이드로게나제에 의해 촉매되고, XMP를 GMP로 전환하는 반응은 guaB에 의해 암호화되는 GMP 신타제에 의해 촉매되는데, 이들 유전자는 에스케리키아 콜라이에서 오페론(guaBA)을 구성하는 것으로 공지되어있다. 이에 따라, 서열 9 및 10에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하여 에스케리키아 콜라이의 guaBA 오페론을 증폭시킨다. 증폭된 단편을 정제하고, 양 말단에 형성된 제한 효소 부위를 SacI 및 KpnI으로 분해한다. 분해된 단편은, SacI 및 KpnI으로 유사하게 분해시킨 pSTV28에 결합시키고, guaBA 유전자가 통합되어 있는 플라스미드 pSTVguaBA를 선택한다. 이 플라스미드는, I△ushA△aphA/pMWpurFKQ에 포함된 플라스미드 pMWpurFKQ와 함께 존재할 수 있다.
상기한 pSTVguaBA를 I△ushA△aphA/pMWpurFKQ 균주에 도입하여 I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA 균주를 수득한다. 또한 대조로서, 벡터 pSTV28이 도입된 I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTV28 균주를 제조한다.
실시예 6에서와 동일한 배양 방법 및 분석 방법에 따라, I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA 균주 및 I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTV28 균주에 대해 배양 브로쓰에 축적된 이노신, IMP, 구아노신 및 GMP를 정량한다. 결과는 표 7에 나타내엇다. 대조로서 사용된 I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTV28 균주에서는 pSTV28의 도입 영향으로 인해 배양 시간이 연장되어, I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA 균주의 것과는 상이한 결과를 제공한다. 구아노신의 피크는 다른 피크와 중복되어 이를 정량할 수 없었다. 한편, I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA 균주는 guaBA의 도입 덕분에 배양 브로쓰에 약 0.1g/L의 GMP를 축적시키는 것으로 입증되었다.
플라스크에서 이노신 생산 세균의 ushA- 및 aphA-결핍 균주의 배양
균주 배양시간(h) 이노신(g/L) IMP(g/L) 구아노신(g/L) GMP(g/L)
I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTV28 78 9.7 0.4 -* 0.0
I△ushA△aphA/pMWpurFKQ/pSTVguaBA 78 3.4 0.2 1.1 0.1
*는 정량이 불가능하다는 것을 나타낸다.
ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는, 본 발명의 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 이용하여, 배지중에 뉴클레오사이드 5'포스페이트 에스테르를 우수한 수율로 생산하고 축적할 수 있다.

Claims (8)

  1. ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균을 배지중에서 배양하여 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 배지중에 생산하고 축적하는 단계; 및
    배지로부터 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 수집하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 돌연변이가 ushA 유전자 및 aphA 유전자내로 도입되거나, 이들 유전자가 파괴되어 정상적으로 기능하지 못하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르가 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
  4. ushA 유전자 및 aphA 유전자가 파괴된, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 생산하는 능력을 지닌 에스케리키아 속에 속하는 세균.
  5. 제4항에 있어서, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르가 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 세균.
  6. 미생물의 모 균주, 또는 공지된 5'-뉴클레오티다제가 결실된 이의 유도체 균주를, 단일 탄소원으로서 제1 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 최소 배지 및 단일 탄소원으로서 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 최소 배지중에서 배양하여 모 균주 및 유도체 균주내 유전자의 발현 프로파일을 조사하는 단계;
    탄소원으로서 제1 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 배지중에서 모 균주 및 유도체 균주를 배양하는 경우 이들 각각의 유전자의 발현량의 비율과, 탄소원으로서 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르를 함유하는 배지중에서 모 균주 및 유도체 균주를 배양하는 경우 이들 각각의 유전자의 발현량의 비율의 곱을 계산하는 단계; 및
    곱의 수치가 보다 높은 유전자를 하나 이상 선택하는 단계를 포함하여, 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르의 축적에 영향을 미치는 5'-뉴클레오티다제 유전자를 탐색하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제1 및 제2 뉴클레오사이드 5'-포스페이트 에스테르가 5'-이노신산 및 5'-구아닐산인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 단백질을 선택된 유전자로부터 주변세포질로 이동시키는데 필요한 시그널 시열을 암호화할 수 있는 유전자를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
KR1020010039723A 2000-07-05 2001-07-04 발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법 KR100779865B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000204260 2000-07-05
JPJP-P-2000-00204260 2000-07-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020004870A true KR20020004870A (ko) 2002-01-16
KR100779865B1 KR100779865B1 (ko) 2007-11-27

Family

ID=18701553

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020010039723A KR100779865B1 (ko) 2000-07-05 2001-07-04 발효에 의한 뉴클레오타이드의 제조방법

Country Status (7)

Country Link
US (3) US20020098494A1 (ko)
EP (1) EP1170370B1 (ko)
KR (1) KR100779865B1 (ko)
CN (1) CN1268758C (ko)
BR (1) BR0102671A (ko)
DE (1) DE60123334T2 (ko)
ES (1) ES2272378T3 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100664653B1 (ko) * 2005-01-21 2007-01-04 씨제이 주식회사 Ｘｍｐ를 ｇｍｐ로 전환시킬 수 있으면서도, ｇｍｐ의분해에 관련되는 유전자가 불활성화되어 있는 대장균변이주 및 그를 이용하는 방법
KR20100127784A (ko) * 2008-02-25 2010-12-06 아지노모토 가부시키가이샤 5'-구아닐산의 제조법

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2271391C2 (ru) * 2003-09-03 2006-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНОЗИНА И 5'-ИНОЗИНОВОЙ КИСЛОТЫ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ПРИНАДЛЕЖАЩИХ К РОДУ Escherichia
BRPI0509056A (pt) * 2004-03-31 2007-08-21 Ajinomoto Kk bactéria pertencendo ao gênero bacillus ou ao gênero escherichia, e, métodos para produzir um nucleosìdeo de purina, para produzir um nucleotìdeo de purina e para produzir ácido 5'-guanìlico
EP2148698A4 (en) * 2007-04-20 2010-12-08 Nucleonics Inc MICROBIAL HOST-VECTOR COMPLEMENTATION SYSTEM
JP5636648B2 (ja) * 2009-08-10 2014-12-10 味の素株式会社 ５’−グアニル酸の製造法
CN102559667B (zh) * 2011-12-31 2013-12-04 浙江工业大学 脱氧次黄嘌呤在脱氧寡核苷酸链连接反应中的应用
US11278045B2 (en) * 2016-10-07 2022-03-22 Amano Enzyme Inc. Method for producing nucleic acid seasoning
CN108441532A (zh) * 2018-02-26 2018-08-24 安徽翠鸟生物技术有限公司 一种尿苷二磷酸的制备方法
KR102006976B1 (ko) * 2019-02-26 2019-08-06 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이를 이용한 퓨린 뉴클레오티드 제조방법
CN112574934B (zh) * 2020-10-12 2022-05-06 廊坊梅花生物技术开发有限公司 高产鸟苷的工程菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4024515Y1 (ko) 1964-05-28 1965-08-20
JPS5420195A (en) * 1977-07-14 1979-02-15 Ajinomoto Co Inc Preparation of guanosine-5'-monophosphoric acid
JPS5612438A (en) 1979-07-13 1981-02-06 Mitsubishi Heavy Ind Ltd Drag suction-head for sludge dredging
EP1004663B1 (en) * 1997-07-18 2007-02-07 Ajinomoto Co., Inc. Process and microorganism for producing purine nucleosides via fermentation

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100664653B1 (ko) * 2005-01-21 2007-01-04 씨제이 주식회사 Ｘｍｐ를 ｇｍｐ로 전환시킬 수 있으면서도, ｇｍｐ의분해에 관련되는 유전자가 불활성화되어 있는 대장균변이주 및 그를 이용하는 방법
US7741101B2 (en) 2005-01-21 2010-06-22 Cj Cheiljedang Corporation Escherichia strain capable of converting XMP to GMP and maintaining the inactivated state of gene(s) associated with GMP degradation and methods of using the same
KR20100127784A (ko) * 2008-02-25 2010-12-06 아지노모토 가부시키가이샤 5'-구아닐산의 제조법

Also Published As

Publication number Publication date
US20040152171A1 (en) 2004-08-05
US20080026428A1 (en) 2008-01-31
EP1170370A3 (en) 2003-03-05
BR0102671A (pt) 2002-03-05
ES2272378T3 (es) 2007-05-01
US7575901B2 (en) 2009-08-18
US20020098494A1 (en) 2002-07-25
CN1335403A (zh) 2002-02-13
EP1170370A2 (en) 2002-01-09
DE60123334T2 (de) 2007-09-06
KR100779865B1 (ko) 2007-11-27
EP1170370B1 (en) 2006-09-27
DE60123334D1 (de) 2006-11-09
CN1268758C (zh) 2006-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101086208B1 (ko) 푸린계 물질 생산균 및 푸린계 물질의 제조법
US20080026428A1 (en) Method for producing nucleotide by fermentation
EP1004663B1 (en) Process and microorganism for producing purine nucleosides via fermentation
KR101250826B1 (ko) 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법
KR101173533B1 (ko) 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법
JP5488594B2 (ja) プリンリボヌクレオシド及びリボヌクレオチドの製造方法
KR100882418B1 (ko) 이노신을 생산하는 미생물 및 그를 이용한 이노신 제조방법
JP4352716B2 (ja) バチルス属に属するイノシン生産菌及びイノシンの製造法
RU2333949C2 (ru) ШТАММЫ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis И Bacillus amyloliquefaciens-ПРОДУЦЕНТЫ ИНОЗИНА И СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ИНОЗИНА С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
JP4385611B2 (ja) プリンヌクレオシドおよびヌクレオチドの製造方法
JP2003219876A (ja) プリンヌクレオシドおよびプリンヌクレオチドの製造方法
JP4696404B2 (ja) 発酵法によるヌクレオチドの製造法
JP2007075108A6 (ja) プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法
JP5583311B2 (ja) プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
JP2007075109A6 (ja) プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法
JP2007075109A (ja) プリンヌクレオシド生産菌及びプリンヌクレオシド製造法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
G170 Publication of correction
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121114

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131031

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20141103

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151016

Year of fee payment: 9

LAPS Lapse due to unpaid annual fee