KR20100127784A - 5'-구아닐산의 제조법 - Google Patents

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Abstract

이노신산(IMP) 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산(GMP) 신테타제의 활성이 증대되도록 개변된 세균에 IMP를 반응시켜 GMP를 수득한다.

Description

5'-구아닐산의 제조법{Process for production of 5'-guanylic acid}
본 발명은 5'-구아닐산의 제조법, 및 그 제조에 사용되는 신규 미생물에 관한 것이다. 5'-구아닐산은, 조미료, 의약 및 이들의 원료로서 유용하다.
5'-구아닐산(구아노신-5'-모노인산, 이하 「GMP」라고도 한다)의 공업적인 제법으로서는, 구아노신을 발효법에 의해 제조하고, 수득된 구아노신을 효소적으로 인산화하여 5'-구아닐산을 수득하는 방법이 알려져 있다(특허 문헌 1 내지 4).
또한, GMP 신테타제 활성을 증대시킨 에스케리키아속(Escherichia)에 속하는 미생물과, 글루코스 대사에 의해 생성되고 5'-크산틸산(XMP)으로부터 GMP의 합성에 필요한 아데노신-3인산(ATP)을 생합성하는(이하, 「ATP를 재생한다」라고도 한다) 활성이 높은 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)를, XMP와 암모니아 또는 글루타민을 포함하는 배지에서 배양하고, XMP를 고효율로 GMP로 변환하여 배양액 중에 GMP를 생성 축적시키는 제조법도 알려져 있었다(비특허 문헌 1).
한편, GMP를 발효법에 의해 제조하는 방법이 제안되어 있다. 예를 들면, 특허 문헌 5에는, 아데닌 요구성을 가지며, 또한 데코이닌 또는 메티오닌 설폭사이드에 내성을 나타내고, GMP 생산능을 갖는 바실러스속(Bacillus)의 변이주를 배양하고, 배지 중에 생성 축적된 GMP를 채취하는 것을 특징으로 하는 GMP의 제조법이 개시되어 있다. 또한 특허 문헌 6에서는, 이노신산(이노신산-5'-모노인산, 이하 「IMP」라고도 한다) 생산능을 갖는 에스케리키아속 세균의 2종류의 5'-뉴클레오티다제 유전자를 결실시키고, 또한 IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 유전자를 증강시킨 주를 배양하고, 배지 중에 생성 축적된 GMP를 채취하는 것을 특징으로 하는 GMP의 제조법이 개시되어 있다. 그러나, 일반적으로 GMP의 직접 발효는 수율이 충분하지 않고, 상기한 효소법과 비교하여 반드시 실용적이지 않다.
지금까지 IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제의 활성을 높인 에스케리키아속의 세균을 이용하여, IMP를 원료로 하여 GMP를 생산한 예는 보고되어 있지 않다.
특허 문헌 1: 일본 공개특허공보 제(평)07-231793호
특허 문헌 2: 일본 공개특허공보 제(평)10-201481호
특허 문헌 3: 국제공개 제96/37603호 팜플렛
특허 문헌 4: 일본 공개특허공보 2001-245676호
특허 문헌 5: 일본 특허공보 제(소)56-12438호
특허 문헌 6: 일본 공개특허공보 2002-355087호
비특허 문헌 1: Tatsuro Fujio 외, Biosci. Biotech. Biochem., 1997년, 제61권, 5호, 840-845 페이지
본 발명은, 미생물을 사용하여 IMP로부터 GMP를 제조하는 방법을 제공하는 것, 및 당해 방법에 사용할 수 있는 IMP를 고효율로 GMP로 변환하는 것이 가능한 신규 미생물을 창제하는 것을 과제로 한다.
본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 연구를 한 결과, IMP 데하이드로게나제, 및 GMP 신테타제의 활성이 증대되도록 개변된 에스케리키아속의 미생물을 이용함으로써, IMP가 고효율, 고속도로 GMP로 변환되는 것을 밝혀내고, 또한, IMP를 고효율로 GMP로 변환하는 것이 가능한 신규 미생물을 창제하는 것에도 성공하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 1 형태는, 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성이 증대되도록 개변된, 이노신산을 5'-구아닐산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물에, 이노신산을 작용시켜 5'-구아닐산을 생성시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 5'-구아닐산의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이, guaB 유전자 및 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성을 증대시키도록 개변된 미생물인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, guaA 유전자가 하기 (A) 또는 (B)의 단백질을 암호화하는, 상기 방법을 제공하는 것이다.
(A) 서열번호 2에 기재한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(B) 서열번호 2에 기재한 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 5'-구아닐산 신테타제 활성을 갖는 단백질.
본 발명의 다른 형태는, guaB 유전자가 하기 (C) 또는 (D)의 단백질을 암호화하는, 상기 방법을 제공하는 것이다.
(C) 서열번호 10에 기재한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
(D) 서열번호 10에 기재한 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 이노신산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이, 또한, ushA 유전자 및 aphA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이, 또한, purR 유전자, add 유전자 및 purA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이, 또한, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이, 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 세균, 바실러스속(Bacillus) 세균, 또는 코리네형(Coryneform) 세균인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이 에스케리키아속(Escherichia) 세균인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 상기 미생물이 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 상기 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, guaB 유전자 및 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성이 증대되도록 개변되며, 또한 ushA 유전자, aphA 유전자 및 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된, 이노신산을 5'-구아닐산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 또한, purR 유전자, add 유전자 및 purA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된, 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 장내세균과에 속하는 세균, 바실러스속 세균, 또는 코리네형 세균인, 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 에스케리키아속 세균인, 상기 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 형태는, 에스케리키아 콜라이인, 상기 미생물을 제공하는 것이다.
도 1은 JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주를 IMP와 반응시켰을 때의, IMP, XMP 및 GMP의 농도 변화를 도시하는 그래프.
도 2는 JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주 및 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주를 IMP와 반응시켰을 때의, IMP(A) 및 GMP(B)의 농도 변화를 도시하는 그래프.
도 3은 (A) JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주를 IMP와 반응시켰을 때의, IMP 및 GMP의 농도 변화를 도시하는 그래프. (B) JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주를 XMP와 반응시켰을 때의, XMP 및 GMP의 농도 변화를 도시하는 그래프. (C) JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주를 IMP 또는 XMP와 반응시켰을 때의 GMP의 축적량을 도시하는 그래프.
도 4는 (A) MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA주를 IMP와 반응시켰을 때의, IMP, XMP 및 GMP의 농도 변화를 도시하는 그래프. (B) MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA주를 IMP 또는 XMP와 반응시켰을 때의 GMP의 축적량을 도시하는 그래프.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<I> 본 발명의 방법에 있어서 사용되는 미생물
본 발명의 방법에 있어서 사용되는 미생물은, IMP 데하이드로게나제 활성 및 GMP 신테타제 활성이 증대되도록 개변되어, IMP를 GMP로 변환하는 능력을 갖는 미생물이다.
미생물로서는, 장내세균과에 속하는 세균, 코리네형 세균(Coryneform bacterium), 바실러스(Bacillus)속 세균 등을 들 수 있다.
장내세균과에 속하는 세균으로서는, 에스케리키아(Escherichia)속 세균, 판토에아(Pantoea)속 세균, 엔테로박터(Enterobacter)속 세균, 클렙시엘라(Klebsiella)속 세균, 세라티아(Serratia)속 세균, 에르위니아(Envinia)속 세균, 살모넬라(Salmonella)속 세균, 모르가넬라(Morganella)속 세균 등을 들 수 있다. 에스케리키아속 세균으로서는, 에스케리키아 콜라이 등, 에스케리키아속에 속하는 세균이면 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로는 Neidhardt 외의 저서[참조: Neidhardt, FR. C. et al., Escherichia coli and Salmonella Typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, table 1]에 거론되고 있는 것을 이용할 수 있다. 또한, 엔테로박터속 세균으로서는, 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등, 판토에아속 세균으로서는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis) 등을 들 수 있다.
코리네형 세균으로서는, 미생물 분야의 당업자에게 이미 알려진 분류에 의해 코리네형 세균으로서 분류되는 세균, 지금까지 브레비박테리움속으로 분류되어 있었지만, 현재는 코리네박테리움속으로 재분류되어 있는 세균[참조: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1991)], 및 코리네박테리움속에 가까운 유연균인 브레비박테리움속에 속하는 세균 등을 들 수 있다. 이러한 코리네형 세균의 예를 이하에 열거한다.
코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티쿰(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루나에(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리움(Corynebacterium lilium)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 서모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes)
코리네박테리움 하큘리스(Corynebacterium harculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)
브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum)
브레비박테리움 로제움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티쿰(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오게니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리눔(Brevibacterium cerinum)
마이크로박테리움 암모니아필룸(Microbacterium ammoniaphilum)
바실러스속 세균으로서는, 미생물 분야의 당업자에게 이미 알려진 분류에 의해 바실러스속으로서 분류되는 세균을 사용할 수 있고, 구체적으로는, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀롤리케파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기와 같은 미생물에 있어서, IMP 데하이드로게나제(guaB 유전자 산물) 및 GMP 신테타제(guaA 유전자 산물)의 활성을 증대시키는 방법에 관해서 설명한다.
본 발명에 있어서, 「IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제의 활성이 증대되도록 개변되었다」란, 에스케리키아속 세균 등의 미생물의 비개변주, 예를 들면 야생주보다도, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제의 활성이 높은 것을 의미한다.
IMP 데하이드로게나제는, 하기 반응을 촉매하는 효소이며, 「IMP 데하이드로게나제 활성」이란 IMP로부터 XMP를 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 말한다. IMP 데하이드로게나제 활성은, 예를 들면, Gilbert의 방법으로 측정할 수 있다[참조: Gilbert, H. J., Lowe, C. R. and Drabble, W. T., Biochem J., 1979, Dec 1, 183(3), 481-94].
NAD+ + IMP + H2O → NADH H+ + XMP
또한, GMP 신테타제란, 하기 반응을 촉매하는 효소(EC 6.3.4.1)이며, 「GMP 신테타제의 효소 활성」이란, XMP로부터 GMP를 생성하는 반응을 촉매하는 활성을 의미한다.
ATP + XMP + NH3 → AMP + 피로인산 + GMP
GMP 신테타제 활성은, 예를 들면, Spector의 방법[참조: Spector, T., Methods Enzymol., 1978, 51, p219]에 의해, NADH의 감소 속도를 조사함으로써 측정할 수 있다.
IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제의 활성을 증대시키기 위해서는, 이러한 효소를 각각 암호화하는 guaB 유전자, 및 guaA 유전자의 발현량을 상승시키는 것이 바람직하다. 발현량을 상승시키는 방법으로서는, IMP 데하이드로게나제를 암호화하는 DNA 및 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA의, 세균의 세포 내의 카피수를 상승시키는 방법을 들 수 있다. 세포 내의 카피수를 상승시키기 위해서는, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제를 각각 암호화하는 DNA 단편을, 에스케리키아속 세균 등의 미생물에서 기능하는 벡터와 연결하여 재조합 DNA를 제작하고, 이것을 숙주에 도입하여 형질전환하면 양호하다. guaB 유전자와 guaA 유전자는, 동시에 카피수를 높여도 되고, 각각 독립적으로 카피수를 높여도 된다. 에스케리키아 콜라이의 경우, guaB 유전자와 guaA 유전자는 오페론(GenBank accession No. M10101)을 형성하고 있으며, guaBA 오페론을 벡터에 연결하여 재조합 DNA를 제작하고, 이것을 숙주에 도입하여 형질전환해도 된다. 형질전환주의 세포 내의, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제를 암호화하는 유전자(guaB 유전자 및 guaA 유전자)의 카피수가 상승하는 결과, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제의 활성이 증대된다.
세포 내의 카피수의 상승은, IMP 데하이드로게나제 유전자 및 GMP 신테타제 유전자를 상기 숙주의 염색체 DNA 위에 다카피 존재시킴으로써도 달성할 수 있다. 에스케리키아속 세균에 속하는 세균의 염색체 DNA 위에, IMP 데하이드로게나제 유전자 및 GMP 신테타제 유전자를 다카피로 도입하기 위해서는, 염색체 위에 다카피 존재하는 서열을 표적으로 이용하여 상동 재조합에 의해 실시할 수 있다. 염색체 DNA 위에 다카피 존재하는 서열로서는, 반복성(repetitive) DNA, 전이 인자의 말단부에 존재하는 역반복(inverted repeat) 등을 이용할 수 있다. 또는, 일본 공개특허공보 제(평)2-109985호에 개시되어 있는 바와 같이, 목적 유전자를 트랜스포존에 탑재하고 이것을 전이시켜 염색체 DNA 위에 다카피 도입하는 것이라도 가능하다. 어느 방법에 의해서도 형질전환주 내의 IMP 데하이드로게나제 유전자 및 GMP 신테타제 유전자의 카피수가 상승하는 결과, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제의 활성이 증대된다.
상기 유전자를 도입하기 위한 벡터로서는, pSTV29, pMW218, pUC19 등의 플라스미드 벡터, λ1059, λBF101, M13mp9 등의 파지 벡터를 들 수 있다. 또한 트랜스포존으로서는, Mu, Tn10, Tn5를 들 수 있다.
IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA는, 그 염기 서열이 공지이기 때문에, 그 서열에 기초하여 프라이머를 합성하고, 에스케리키아속 세균 등의 미생물의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR법에 의해 증폭을 실시함으로써 취득할 수 있다. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이의 guaA 유전자로서는 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있고, 에스케리키아 콜라이의 guaB 유전자로서는 서열번호 9의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이러한 유전자는, 동염기 서열에 기초하여 프로브를 조제하고, 에스케리키아속 세균의 염색체 DNA 라이브러리로부터 하이브리드화에 의해 목적의 DNA 단편을 선택할 수도 있다. 또는 IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제를 암호화하는 DNA 단편을, 기지의 염기 서열에 기초하여 화학적으로 합성해도 된다. 또한, 에스케리키아 콜라이의 guaBA 오페론은, 서열번호 31과 32의 프라이머를 사용하여 클로닝할 수 있다.
또한, 에스케리키아속 세균 이외의 미생물로부터도, 상기 염기 서열에 기초하여, IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제와 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 취득할 수 있다.
바실러스 서브틸리스의 GMP 신테타제 유전자(guaA)로서는, 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 4에 나타낸다. 코리네박테리움 글루타미쿰의 GMP 신테타제 유전자(guaA)로서는 서열번호 5의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이러한 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 6에 나타낸다.
코리네박테리움 암모니아게네스의 GMP 신테타제 유전자(guaA)로서는 서열번호 7의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 8에 나타낸다.
바실러스 서브틸리스의 IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)로서는, 서열번호 11의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 10에 나타낸다.
코리네박테리움 글루타미쿰의 IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)로서는, 서열번호 13의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 14에 나타낸다.
코리네박테리움 암모니아게네스의 IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)로서는, 서열번호 15의 염기 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 이 염기 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 16에 나타낸다. 상기한 바와 같이, 미생물이 속하는 속, 종 또는 균주에 의해, guaA 유전자 및 guaB 유전자의 염기 서열에 차이가 존재하는 경우가 있기 때문에, guaA 유전자 및 guaB 유전자는, 상기 유전자의 변이(variant)라도 양호하다.
guaA 유전자에 의해 암호화되는 단백질은, GMP 신테타제 활성을 갖는 한, 서열번호 2의 아미노산 서열 전체에 대해, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 것이라도 양호하다. 또한, guaB 유전자에 의해 암호화되는 단백질은, IMP 데하이드로게나제 활성을 갖는 한, 서열번호 10의 아미노산 서열 전체에 대해, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 것이라도 양호하다. 아미노산 서열 및 염기 서열의 동일성은, 예를 들면 Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]이나 Pearson에 의한 FASTA[참조: Methods Enzymol., 183, 63(1990)]을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov].
또한, 본 발명에 사용하는 guaA 유전자 및 guaB 유전자는, 야생형 유전자에는 한정되지 않고, 암호화되는 단백질의 기능, 즉, GMP 신테타제 활성 또는 IMP 데하이드로게나제 활성이 손상되지 않는 한, 서열번호 2 또는 10의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 복수의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 서열을 갖는 단백질을 암호화하는, 변이체 또는 인위적인 개변체라도 양호하다. 여기에서, 「수개」란, 아미노산 잔기의 단백질의 입체구조에 있어서의 위치나 종류에 따라서도 다르지만, 구체적으로는 2 내지 20개, 바람직하게는 2 내지 10개, 보다 바람직하게는 2 내지 5개를 의미한다. 상기 치환은 보존적 치환이 바람직하고, 보존적 변이란, 치환 부위가 방향족 아미노산일 경우에는, Phe, Trp, Tyr간에, 치환 부위가 소수성 아미노산일 경우에는, Leu, Ile, Val간에, 극성 아미노산일 경우에는, Gln, Asn간에, 염기성 아미노산일 경우에는, Lys, Arg, His간에, 산성 아미노산일 경우에는, Asp, Glu간에, 하이드록실기를 갖는 아미노산일 경우에는, Ser, Thr간에 서로 치환하는 변이이다. 보존적 치환으로서는, Ala로부터 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg로부터 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn로부터 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp으로부터 Asn, Glu 또는 Gln로의 치환, Cys로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln으로부터 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu로부터 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly로부터 Pro로의 치환, His로부터 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile로부터 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu로부터 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys로부터 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met로부터 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe로부터 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser로부터 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr로부터 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp로부터 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr로부터 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및, Val로부터 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는, guaA 유전자, 또는 guaB 유전자를 보지하는 미생물의 개체차, 종의 차이에 기초하는 경우 등의 천연적으로 발생하는 변이(mutant 또는 variant)에 의해 발생하는 것도 포함된다.
또한, guaA 유전자 및 guaB 유전자는, 각각, 서열번호 1 또는 9의 염기 서열에 상보적인 염기 서열 또는 당해 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA로서, GMP 신테타제 활성 또는 IMP 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA라도 양호하다. 여기에서, 「엄격한 조건」이란, 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 이 조건을 명확히 수치화하는 것은 곤란하지만, 일례를 나타내자면, 동일성이 높은 DNA끼리, 예를 들면 80%, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95%, 특히 바람직하게는 98% 이상의 동일성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 그것보다 동일성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도, 온도에서, 1회보다 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
상기의 유전자의 변이에 관한 기재는, 후술하는 ushA 유전자, aphA 유전자, purR 유전자, add 유전자, purA 유전자, 및 그 밖의 유전자에도 동일하게 적용된다.
미생물로의 DNA의 도입은, C. T. chung의 방법[참조: C. T. chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2172-2175(1989)], D. M. Morrison의 방법[참조: Methods in Enzymology, 68, 326(1979)], 또는 수용균 세포를 염화칼슘으로 처리하여 DNA의 투과성을 증대시키는 방법[참조: Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159(1970)] 등에 의해 실시할 수 있다.
IMP 데하이드로게나제 유전자 및 GMP 신테타제 유전자의 발현량의 상승은, 상기의 유전자 증폭에 의한 것 이외에, 염색체 DNA 위 또는 플라스미드 위의 IMP 데하이드로게나제 유전자 및 GMP 신테타제 유전자의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 강력한 것으로 치환함으로써도 달성된다. 예를 들면, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터 등이 강력한 프로모터로서 알려져 있다. 또한, 국제공개 WO00/18935에 개시되어 있는 바와 같이, 유전자의 프로모터 영역에 수 염기의 염기 치환을 도입하고, 보다 강력한 것으로 개변하는 것도 가능하다. 이러한 프로모터 치환 또는 개변에 의해 IMP 데하이드로게나제 유전자 및 GMP 신테타제 유전자의 발현이 강화되어, 양 단백질의 활성이 증대된다. guaB 유전자, guaA 유전자의 발현량의 증대는, 노던법(Northern method), RT-PCR법 등에 의해 검출할 수 있다.
IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제를 암호화하는 guaBA 오페론, 및 퓨린 오페론은, PurR 단백질에 의해 그 발현이 억제되고 있기 때문에, 본 발명의 방법에 있어서 사용하는 세균에 있어서는, PurR 단백질을 암호화하는 purR 유전자(GenBank accession J04212: 서열번호 17)를 정상적으로 기능하지 않도록 개변하는 것이 바람직하고, 그 발현을 저하시키는 것이 보다 바람직하다. purR 유전자를 정상적으로 기능하지 않도록 개변하는 것은, 이하와 같은 방법으로 달성할 수 있다. 예를 들면, 유전자 재조합법을 사용한 상동 재조합법[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press(1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J Bacteriol., 162, 1196(1985)]에 의해, 염색체 위의 purR 유전자를, 정상적으로 기능하지 않는 purR 유전자(이하, 「파괴형 purR 유전자」라고 하는 경우가 있다)로 치환함으로써 실시할 수 있다. 상동 재조합은, 염색체 위의 서열과 상동성을 갖는 서열을 가진 플라스미드 등이 균체 내에 도입되면, 일정 빈도로 상동성을 갖는 서열의 개소에서 재조합을 일으키고, 도입된 플라스미드 전체가 염색체 위에 도입된다. 이 이후, 또한 염색체 위의 상동성을 갖는 서열의 개소에서 재조합을 일으키면, 다시 플라스미드가 누락되지만, 이 때, 재조합을 일으키는 위치에 따라, 파괴된 유전자쪽이 염색체 위에 고정되어, 원래의 정상적인 유전자가 플라스미드와 함께 염색체로부터 누락되는 경우도 있다. 이러한 균주를 선택함으로써, 염색체 위의 정상적인 purR 유전자가 파괴형 purR 유전자와 치환된 균주를 취득할 수 있다.
이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환은, 「Red 드리븐 인테그레이션(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645]과 λ파지 유래의 절취 시스템[참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3.]과 조합한 방법[참조: WO2005/010175호] 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 오리진을 포함하는 플라스미드를 사용하는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645, 미국 특허 제6303383호, 또는 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호] 등이 있다.
또한, 상기한 바와 같은 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 부위 특이적 변이 도입은, 숙주 위에서 복제능을 갖지 않는 플라스미드를 사용해도 실시할 수 있다. 또한, 약제 내성 등의 마커 유전자가 내부에 삽입된 purR 유전자를 포함하고, 목적으로 하는 미생물 내에서 복제할 수 없는 플라스미드를 사용함으로써도, purR 유전자의 파괴를 실시할 수 있다. 즉, 상기 플라스미드로 형질전환되어, 약제 내성을 획득한 형질전환체는, 염색체 DNA 중에 마커 유전자가 도입되어 있다. 이러한 마커 유전자는, 그 양 말단의 purR 유전자 서열과 염색체 위의 이러한 유전자와의 상동 재조합에 의해 도입될 가능성이 높기 때문에, 효율적으로 유전자 파괴주를 선택할 수 있다.
유전자 파괴에 사용하는 파괴형 purR 유전자는, 구체적으로는, 제한 효소 소화 및 재결합에 의한 이들 유전자의 일정 영역의 결실, 이들 유전자로의 다른 DNA 단편(마커 유전자 등)의 삽입, 또는 부위 특이적 변이법[참조: Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350(1987)]이나 차아염소산나트륨, 하이드록실아민 등의 화학 약제에 의한 처리[참조: Shortle, D. and Nathans, D., Proc., Natl., Acad., Sci., U.S.A., 75, 270(1978)]에 의해, purR 유전자의 암호화 영역 또는 프로모터 영역 등의 염기 서열 중에 1개 또는 복수개의 염기 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 일으킴으로써, 암호화되는 리프레서의 활성을 저하 또는 소실시키거나, 또는 purR 유전자의 전사를 저하 또는 소실시킴으로써, 취득할 수 있다.
purR 유전자는, 서열 자체는 공지이며, 이들의 서열에 기초하여, PCR법 또는 하이브리드화법 등에 의해 용이하게 취득할 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 purR 유전자로서 서열번호 18의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 들 수 있다. purR 유전자는, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이의 염색체 DNA로부터, 서열번호 19 및 20에 나타내는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 취득할 수 있다.
그 밖의 미생물의 purR 유전자도, 공지의 서열 또는 상기 이.콜라이의 purR 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 취득하고, 미생물의 개변에 사용할 수 있다.
purR 유전자는, 서열번호 18의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것이면 양호하다.
목적으로 하는 유전자가 파괴된 것은, 서던 블롯팅이나 PCR법에 의해, 염색체 위의 유전자를 해석함으로써 확인할 수 있다.
또한, 미생물을 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상 변이 처리에 사용되는 변이제에 의해 처리함으로써도, 기능을 갖는 PurR 단백질이 생산되지 않도록 된 변이주를 취득할 수 있다. 또한, guaBA 오페론 프로모터 상류에 위치하는 PurR 결합 서열[참조: M. I. Hutchings, W. T. Drabble, FEMS Microbiology Letters 187(2000) 115-122]에, 1개 또는 복수개의 염기 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 일으키게 함으로써, PurR 단백질이 통상과 같이 결합하지 않게 되도록 개변할 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서 사용하는 세균에 있어서는, 또한, ushA 유전자 및/또는 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 유전자의 변이주 또는 유전자 재조합주는, 이들 유전자가, 이들 유전자에 의해 암호화되는 5'-뉴클레오티다제의 활성이 저하 또는 소실되거나, 또는 이들 유전자의 전사가 저하, 또는 소실되도록, 개변함으로써 수득된다. 이러한 변이주 또는 유전자 재조합주는, 상기의 purR 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 변이주 또는 유전자 재조합주와 같이 하여 수득할 수 있다.
ushA 유전자는, 서열 자체는 공지이며, 이들의 서열에 기초하여, PCR법 또는 하이브리드화법 등에 의해 용이하게 취득할 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 ushA 유전자로서 서열번호 22의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 들 수 있다.
그 밖의 미생물의 ushA 유전자도, 공지의 서열 또는 상기 이.콜라이의 ushA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 취득하고, 개변에 사용할 수 있다.
한편, ushA 유전자는, 서열번호 22의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것이면 양호하다.
aphA 유전자는, 서열 자체는 공지이며, 이들의 서열에 기초하여, PCR법 또는 하이브리드화법 등에 의해 용이하게 취득할 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 aphA 유전자로서 서열번호 24의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 들 수 있다.
그 밖의 미생물의 aphA 유전자도, 공지의 서열 또는 상기 이.콜라이의 aphA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 취득하고, 개변에 사용할 수 있다.
aphA 유전자는, 서열번호 24의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것이면 양호하다.
본 발명의 방법에 있어서 사용하는 세균에 있어서는, 또한, add 유전자 및/또는 purA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 유전자의 변이주 또는 유전자 재조합주는, 이러한 유전자가, 이러한 유전자에 의해 암호화되는 아데노신 데아미나제 및/또는 석시닐-AMP 신타제의 활성이 저하 또는 소실되거나, 또는 이러한 유전자의 전사가 저하, 또는 소실되도록, 개변함으로써 수득된다. 이러한 변이주 또는 유전자 재조합주는, 상기의 purR 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 변이주 또는 유전자 재조합주와 같이 하여 수득할 수 있다. add 유전자는, 서열 자체는 공지이며, 이들의 서열에 기초하여, PCR법 또는 하이브리드화법 등에 의해 용이하게 취득할 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 add 유전자로서 서열번호 38의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 들 수 있다.
그 밖의 미생물의 add 유전자도, 공지의 서열 또는 상기 이.콜라이의 add 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 취득하고, 개변에 사용할 수 있다.
add 유전자는, 서열번호 38의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것이면 양호하다.
purA 유전자는, 서열 자체는 공지이며, 이들의 서열에 기초하여, PCR법 또는 하이브리드화법 등에 의해 용이하게 취득할 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 purA 유전자로서 서열번호 34의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 들 수 있다. 그 밖의 미생물의 purA 유전자도, 공지의 서열 또는 상기 이.콜라이의 purA 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 취득하고, 개변에 사용할 수 있다.
purA 유전자는, 서열번호 34의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것이면 양호하다.
본 발명의 방법에 있어서 사용하는 세균에 있어서는, 또한, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변되어 있는 것이 바람직하다. nagD 유전자의 변이주 또는 유전자 재조합주는, 당해 유전자가, 당해 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 활성이 저하 또는 소실되거나, 또는 이러한 유전자의 전사가 저하, 또는 소실되도록, 개변함으로써 수득된다. 이러한 변이주 또는 유전자 재조합주는, 상기의 purR 유전자가 정상적으로 기능하지 않는 변이주 또는 유전자 재조합주와 같이 하여 수득할 수 있다.
nagD 유전자는, 서열 자체는 공지이며, 이들의 서열에 기초하여, PCR법 또는 하이브리드화법 등에 의해 용이하게 취득할 수 있다. 예를 들면, 이.콜라이의 nagD 유전자로서 서열번호 42의 아미노산 서열을 암호화하는 유전자를 들 수 있다.
이.콜라이의 nagD 유전자는, N-아세틸글루코사민의 자화에 관여하는 nagBACD 오페론 내에 존재하고, 이러한 nagBACD 오페론 유전자의 발현은 배지 중에 세균의 세포벽의 주성분을 구성하는 당의 일종인 N-아세틸글루코사민을 첨가함으로써 유도되는 것이 밝혀지고 있다[참조: Plumbridge JA., Mol. Micobiol. (1989) 3. 505-515]. 이.콜라이의 nagD에 암호화되는 NagD 단백질은, 보존적인 구조상의 특징으로부터 할로산 데할로게나제(HAD) 패밀리에 속하는 것을 알고 있으며, 시험관 내의 실험에 의하면 GMP 및 5'-우리딜산(우리딘-5'-모노인산, 이하 「UMP」라고도 한다)에 대해 뉴클레오티다제 활성을 갖는 것이 보고되어 있다[참조: Tremblay LW., Biochemistry, (2006)45. 1183-1193]. 단, 이.콜라이의 게놈 위에는 23종의 HAD패밀리 단백질이 존재하고, 이들의 기질 특이성의 범위는 매우 넓기[참조: Kuznetsova et al., J. Biol. Chem., (2006) 281., 36149-36161] 때문에, nagD 유전자의 세포 내에서의 생리적인 역할에 관해서는 알려져 있지 않다.
본 발명에 있어서는, guaB 유전자 및 guaA 유전자의 발현을 증가시켜, ushA 유전자 및 aphA 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물에 있어서, 또한 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변함으로써 이노신산으로부터 효율적으로 5'-구아닐산을 생산하는 것이 밝혀내졌다.
따라서, 본 발명은 신규 미생물로서, guaB 유전자 및 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성이 증대되도록 개변되고, 또한 ushA 유전자, aphA 유전자 및 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된, 이노신산을 5'-구아닐산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물을 제공한다. 이러한 미생물에 있어서는, 또한, purR 유전자, add 유전자 및 purA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변되는 것이 바람직하다.
또한, nagD 유전자는 이.콜라이의 것에 한정되지 않고, 그 밖의 미생물의 nagD 유전자도, 공지의 서열 또는 상기 이.콜라이의 nagD 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 취득하고, 개변에 사용할 수 있다. 즉, nagD 유전자는, 서열번호 42의 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 것이면 양호하다.
<II> GMP의 제조법
상기한 IMP 데하이드로게나제 활성 및 GMP 신테타제 활성이 증대되도록 개변된 미생물에 IMP를 반응시켜 IMP를 GMP로 변환함으로써, GMP를 수득할 수 있다.
IMP 데하이드로게나제 반응은 NAD+을, GMP 신테타제 반응은 ATP를, 각각 필요로 한다. IMP 데하이드로게나제 반응에 의해 생성된 NADH는 산화적 인산화 경로에 의해 다시 NAD+으로 변환되지만, 그 때에 ATP가 생성된다. 따라서, IMP 데하이드로게나제 활성 및 GMP 신테타제 활성을 동시에 증대시킴으로써, IMP로부터 GMP로의 반응이 효율적으로 진행되는 것으로 추정된다.
본 발명에 있어서, 「반응시킨다」란, 상기 미생물 균체를 IMP가 첨가된 배지에 존재시키고, 당해 미생물을 소위 미생물 촉매로서 사용하여 IMP를 GMP로 변환하는 것, 및 상기 미생물을 배양하면서 IMP를 배지에 더해서 GMP를 생성시키는 것 양자를 포함한다.
바람직하게는, 상기 미생물의 배양후의 균체를, IMP를 포함하는 반응액 중에 첨가하는 것, 또는 상기 미생물을 포함하는 용액 중에 IMP를 첨가함으로써, IMP를 효율적으로 GMP로 변환하고, GMP를 생성 축적시킬 수 있다.
당해 미생물의 배양을 실시할 때의 탄소원으로서는, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 당밀, 폐당밀, 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 에탄올, 글리세린, 소르비톨 등의 알콜류, 피루브산, 락트산, 아세트산 등의 유기산, 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴산 등의 아미노산 등, 상기 미생물이 자화 가능하면 모두 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 염화암모니아, 황산암모늄, 질산암모늄, 탄산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄염, 요소, 각종 아미노산, 펩톤, NZ 아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지여액, 카세인 가수분해물, 피쉬밀 또는 그 소화물 등을 사용할 수 있다. 무기물로서는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 인산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산아연, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 사용하는 미생물이 아미노산, 핵산, 비타민 등 특정한 영양 물질을 생육에 요구하는 경우에는, 배지에 이러한 물질을 적량 첨가한다. 배양은 pH 5.0 내지 8.5, 15 내지 45℃의 적절한 범위에서 호기적 조건으로 약 5시간 내지 72시간 정도 실시하면 양호하다. 또한, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다.
당해 미생물의 배양액을 직접, 또는 원심한 후에 균체만을, 또는 균체를 적당한 용액에 현탁한 것을, IMP를 포함하는 반응액에 접종하여 IMP로부터 GMP로의 변환을 실시할 수 있다. 또한, 본 발명의 GMP의 제조법에 있어서는, 상기 미생물의 균체 처리물을 사용할 수도 있다. 균체의 처리물로서는, 예를 들면, 균체를 아크릴아미드, 카라기난 등으로 고정화한 고정화 균체 등을 들 수 있다.
반응액의 탄소원으로서는, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 당밀, 폐당밀, 전분 가수분해물 등의 탄수화물, 에탄올, 글리세린, 소르비톨 등의 알콜류, 피루브산, 락트산, 아세트산 등의 유기산, 글리신, 알라닌, 글루탐산, 아스파라긴산 등의 아미노산 등, 상기 미생물이 자화 가능하면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 암모니아, 염화암모니아, 황산암모늄, 질산암모늄, 탄산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 각종 무기 및 유기 암모늄염, 요소, 각종 아미노산, 펩톤, NZ아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 옥수수 침지여액, 카세인 가수분해물, 피쉬밀 또는 그 소화물 등을 사용할 수 있다. 무기물로서는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 황산마그네슘, 인산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산아연, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다. 사용하는 미생물이 아미노산, 핵산, 비타민 등 특정한 영양 물질을 생육에 요구하는 경우에는, 배지에 이러한 물질을 적량 첨가한다.
또한, 반응액에는 유기 용제를 첨가하여 뉴클레오타이드의 세포 투과성을 활성화시키는 것이 바람직하다.
뉴클레오타이드의 막 투과성 활성화제인 유기 용제로서는, 크실렌, 톨루엔, 벤젠, 지방산 알콜, 아세트산에틸 등을 이용할 수 있고, 통상 0.1 내지 30ml/L의 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 반응은 pH 5.0 내지 8.5, 15 내지 45℃의 적절한 범위에서 호기적 조건 또는 혐기적 조건으로 약 1시간 내지 7일 정도 실시하면 양호하다. 또한, pH 조정에는 무기 또는 유기의 산성 또는 알칼리성 물질, 또한 암모니아 가스 등을 사용할 수 있다. 또한, 원료의 IMP는, 화학 합성된 것, 시판중인 것, 및 발효법[참조: WO96/30501, 일본 공개특허공보 2002-355087호, 일본 공개특허공보 2003-325182호] 등에 의해 제조된 것 등을 사용할 수 있다.
반응액으로부터의 GMP의 채취는 통상, 이온 교환 수지법, 침전법, 그 밖의 공지의 방법을 조합함으로써 실시할 수 있다.
[실시예]
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1
<1-1> JM109주 유래로 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA, aphA 유전자 파괴주의 구축
일반적인 DNA 클로닝용 숙주로서 이용되고 있는 에스케리키아 콜라이 JM109주를 친주로 하고, 우선 5'-뉴클레오티다제 비생산주의 구축을 실시하였다. 5'-뉴클레오티다제는, ushA 유전자(Genbank Accession X03895 서열번호 21), aphA 유전자(Genbank Accession X86971 서열번호 23)에 의해 암호화되어 있다.
5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA, aphA 유전자의 결실은, Datsenko와 Wanner에 의해 최초로 개발된 「Red-driven integration」이라고 불리는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645]과 λ파지 유래의 절취 시스템[참조: J. Bacteriol. 2002 Sep; 184(18): 5200-3. Interactions between integrase and excisionase in the phage lambda excisive nucleoprotein complex. Cho EH, Gumport RI, Gardner JF.]에 의해 실시하였다. 「Red-driven integration」방법에 의하면, 목적으로 하는 유전자의 일부를 합성 올리고뉴클레오타이드의 5'측에, 항생 물질 내성 유전자의 일부를 3'측에 디자인한 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여 수득된 PCR 산물을 사용하고, 1단계에서 유전자 파괴주를 구축할 수 있다. 또한 λ파지 유래의 절취 시스템을 조합함으로써, 유전자 파괴주에 도입한 항생 물질 내성 유전자를 제거할 수 있다.
(1) ushA 유전자의 파괴
PCR의 주형으로서, 플라스미드 pMW118-attL-Cm-attR을 사용하였다. pMW118-attL-Cm-attR[참조: WO2006078039]은, pMW118[타카라바이오사 제조]에 λ파지의 부착 부위인 attL 및 attR 유전자와 항생 물질 내성 유전자인 cat 유전자를 삽입한 플라스미드이며, attL-cat-attR의 순으로 삽입되어 있다.
이러한 attL과 attR의 양 말단에 대응하는 서열을 프라이머의 3' 말단에, 목적 유전자인 ushA 유전자의 일부에 대응하는 프라이머의 5'말단에 갖는 서열번호 25 및 26에 나타내는 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머에 사용하여 PCR을 실시하였다.
증폭된 PCR 산물을 아가로스겔로 정제하고, 온도 감수성의 복제능을 갖는 플라스미드 pKD46을 포함하는 에스케리키아 콜라이 JM109주에 전기천공에 의해 도입하였다. 플라스미드 pKD46[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol.97, No.12, p6640-6645]은, 아라비노스 유도성 ParaB 프로모터로 제어되는 λRed 상동 재조합 시스템의 Red 레콤비나제를 암호화하는 유전자(γ, β, exo 유전자)를 포함하는 λ파지의 합계 2154 염기의 DNA 단편(GenBank/EMBL Accession number J02459, 제31088번째 내지 제33241번째 뉴클레오타이드)를 포함한다. 플라스미드 pKD46은 PCR 산물을 JM109주의 염색체에 도입하기 위해서 필요하다.
전기천공용의 컴피턴트 세포(competent cell)는 다음과 같이 하여 조제하였다. 즉, 100mg/L의 암피실린을 포함한 LB 배지 중에서 30℃, 밤새 배양한 에스케리키아 콜라이 JM109주를, 암피실린(20mg/L)과 L-아라비노스(1mM)를 포함한 5mL의 SOB 배지[참조: Molecular cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]로 100배 희석하였다. 수득된 희석물을 30℃에서 통기하면서 OD600이 약 0.6이 될 때까지 생육시킨 후, 100배로 농축하고, 10% 글리세롤로 3회 세정함으로써 전기천공에 사용할 수 있게 하였다. 전기천공은 70μL의 컴피턴트 세포와 약 100ng의 PCR 산물을 사용하여 실시하였다. 전기천공후의 세포는 1mL의 SOC 배지[참조: Molecular cloning: Laboratory Manual, Second Edition, Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)]을 더하여 37℃에서 2.5시간 동안 배양한 후, 37℃에서 Cm(클로람페니콜)(25mg/L)을 포함하는 L-한천 배지 위에서 평판 배양하고, Cm 내성 재조합체를 선택하였다. 다음에, pKD46 플라스미드를 제거하기 위해서, Cm을 포함하는 L-한천 배지 위, 42℃에서 2회 계대하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성을 시험하여 pKD46이 탈락되어 있는 암피실린 감수성주를 취득하였다.
클로람페니콜 내성 유전자에 의해 식별할 수 있었던 변이체의 ushA 유전자의 결실을, PCR에 의해 확인하였다. 수득된 ushA 결손주를 JM109ΔushA::att-cat주라고 명명하였다.
다음에, ushA 유전자 내에 도입된 att-cat 유전자를 제거하기 위해서, 헬퍼 플라스미드로서 상기의 pMW-intxis-ts를 사용하였다. pMW-intxis-ts는, λ파지의 인테그라제(Int)를 암호화하는 유전자, 절제효소(excisionase)(Xis)를 암호화하는 유전자를 탑재하고, 온도 감수성의 복제능을 갖는 플라스미드이다. pMW-intxis-ts 도입에 의해, 염색체 위의 attL 또는 attR을 인식하여 재조합을 일으켜 attL과 attR간의 유전자를 잘라 내어, 염색체 위에는 attL 또는 attR 서열만 남는 구조가 된다.
상기에서 수득된 JM109ΔushA::att-cat주의 컴피턴트 세포를 통상적인 방법에 따라서 제작하고, 헬퍼 플라스미드 pMW-intxis-ts로 형질전환하고, 30℃에서 50mg/L의 암피실린을 포함하는 L-한천 배지 위에서 평판 배양하고, 암피실린 내성주를 선택하였다. 다음에, pMW-intxis-ts 플라스미드를 제거하기 위해서, L-한천 배지 위, 42℃에서 2회 계대하고, 수득된 콜로니의 암피실린 내성, 및 클로람페니콜 내성을 시험하여, att-cat, 및 pMW-intxis-ts가 탈락되어 있는 ushA 파괴주인 클로람페니콜, 암피실린 감수성주를 취득하였다. 이 주를 JM109ΔushA라고 명명하였다.
(2) JM109ΔushA주의 aphA 유전자의 결실
JM109ΔushA주에 있어서의 aphA 유전자의 결실은, 상기 방법에 준하여, aphA파괴용 프라이머로서, 서열번호 27, 28의 프라이머를 사용하여 실시하였다. 이것에 의해, ushA aphA 파괴주인 JM109ΔushAΔaphA를 수득하였다.
<1-2> JM109ΔushAΔaphA주 유래로 퓨린 오페론이나 guaBA 오페론의 리프레서를 암호화하는 purR 유전자 파괴주의 구축
계속해서, JM109ΔushAΔaphA주를 친주로 하여, guaBA 오페론의 리프레서 PurR 비생산주의 구축을 실시하였다. purR은, purR 유전자(Genbank Accession J04212 서열번호 17)에 의해 암호화되어 있다. 상기의 ushA, aphA 유전자 파괴 방법에 준하여, purR 파괴용 프라이머로서, 서열번호 29, 30의 프라이머를 사용하여 실시하였다. 이것에 의해, JM109ΔushAΔaphAΔpurR을 수득하였다.
<1-3> IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 발현 강화 플라스미드 pUC18-guaBA의 구축 및 당해 플라스미드의 JM109ΔushAΔaphAΔpurR주로의 도입
IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 발현 강화 플라스미드 pUC18-guaBA를 이하와 같이 하여 실시하였다. 양 효소를 암호화하는 guaB, guaA 유전자는, 에스케리키아 콜라이에서는 오페론(guaBA)을 구성하고 있는 것이 알려져 있다. 그래서, 서열번호 31 및 서열번호 32에 나타낸 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하고, 에스케리키아 콜라이의 guaBA 오페론을 증폭시켰다. 증폭 단편을 정제한 후, 양 말단에 형성된 제한 효소 부위를 SacI 및 KpnI로 절단하였다. 절단 단편을, 동일하게 SacI 및 KpnI로 절단한 pUC18과 연결하고, guaBA 유전자가 도입된 플라스미드 pUC18-guaBA를 선택하였다. 이 플라스미드를 상기 JM109ΔushAΔaphAΔpurR주에 도입하여, JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주를 수득하였다.
<1-4> JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주 균체를 이용한 IMP로부터 GMP로의 변환 반응
상기 균주에 관해서, IMP로부터 GMP로의 변환 반응 평가를 실시하였다. 이하에, IMP로부터 GMP로의 변환 반응 평가를 위한, 균체의 조제 방법, 반응 방법, 반응 용액 조성, 분석 방법을 나타낸다.
[균체의 조제 방법]
LB 배지 플레이트 위에 JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주를 남김없이 도포하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 1/32 플레이트분의 균체를, LB 배지 20ml을 가득 채워 넣은 500ml용의 판구 플라스크에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. LB 600ml분의 배양액의 원심후 균체를, 60ml의 반응 용액에 사용하였다.
[반응 방법]
상기의 LB 600ml분의 배양후 균체를 약숟가락으로 긁어 모아 후술하는 반응액 60ml에 접종하여 반응을 개시하였다. 반응은 42℃에서, pH를 7.2로 유지하도록, 수산화나트륨을 더하면서 실시하였다.
[반응 용액 조성]
60mM IMP
50g/L 글루코스
9.2g/L 헥사메타인산나트륨
5g/L MgSO4·7H2O
6.6g/L (NH4)2SO4
10g/L KH2PO4
5ml/L 크실렌
[분석 방법]
반응액 500㎕을 경시적으로 샘플링하고, 15,000rpm으로 5분간 원심한 상청액을 NaOH로 희석하여 반응을 정지하였다. 반응 정지액을 필터 여과하고, 통상 300㎕을 HPLC 분석에 제공하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
칼럼: Asahipak GS-220(직경 7.6mm, 50cm)을 2개 연결
용리액: 0.2M NaH2PO4(pH 3.98)
온도: 55℃
유속: 1ml/분
검출: 자외선(254nm) 흡수
결과를 도 1에 도시한다. JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA에서는 반응 12시간으로 최대 약 16.2g/L의 GMP를 반응액 중에 축적하는 것이 나타났다.
실시예 2
<2-1> JM109ΔushAΔaphAΔpurR주 유래의 nagD 유전자 파괴주의 구축
실시예 1의 <1-2>에서 수득된 JM109ΔushAΔaphAΔpurR주를 친주로 하여, NagD 비생산주의 구축을 실시하였다. NagD는 nagD 유전자(Genbank Accession X14135 서열번호 41)에 의해 암호화되어 있다. 상기의 ushA, aphA, purR 유전자 파괴 방법에 준하여, nagD 파괴용 프라이머로서 서열번호 43, 44의 프라이머를 사용하여 nagD 유전자 파괴를 실시하였다. 이것에 의해, JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD를 수득하였다.
<2-2> IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 발현 강화 플라스미드 pUC18-guaBA의 JM109ΔushAΔaphAΔpurR주 및 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD주로의 도입
플라스미드 pUC18-guaBA를 상기 JM109ΔushAΔaphAΔpurR주 및 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD주에 도입하고, JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주 및 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주를 수득하였다.
<2-3> JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주 및 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주 균체를 이용한 IMP로부터 GMP로의 변환 반응
상기 균주에 관해서, IMP로부터 GMP로의 변환 반응 평가를 실시하였다. 이하에, IMP로부터 GMP로의 변환 반응을 위한, 균체의 조제 방법, 반응 방법, 반응 용액 조성, 분석 방법을 나타낸다.
[균체의 조제 방법]
LB 배지 플레이트 위에 JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주 또는 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주를 남김없이 도포하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 1/32 플레이트분의 균체를, LB 배지 20ml을 가득 채운 500ml용의 판구 플라스크에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양하였다.
[반응 방법]
상기의 배양액을 원심하여, 건조 중량으로 0.8g 상당의 균체를 반응액 60ml에 접종하여 반응을 개시하였다. 반응은 42℃에서, pH를 7.2로 유지되도록, 수산화나트륨을 가하면서 실시하였다.
[IMP로부터 GMP로의 변환 반응의 반응 용액 조성]
50mM IMP
50g/L 글루코스
9.2g/L 헥사메타인산나트륨
5g/L MgSO4·7H2O
6.6g/L (NH4)2SO4
10g/L KH2PO4
3ml/L 크실렌
[분석 방법]
반응액 500㎕를 경시적으로 샘플링하고, NaOH로 희석하여 반응을 정지하였다. 반응 정지액을 필터 여과하고, 통상 300㎕을 HPLC 분석에 제공하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
칼럼: Asahipak GS-220(직경 7.6mm, 50cm)을 2개 연결
용리액: 0.2M NaH2PO4(pH 3.98)
온도: 55℃
유속: 1ml/분
검출: 자외선(254nm) 흡수
결과를 도 2에 도시한다. JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA주에서는 최대 약 12.5g/L의 GMP를, JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주에서는 최대 약 14.81g/L의 GMP를 반응액 중에 축적하는 것이 나타났다.
실시예 3
실시예 2에 기재된 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주 균체를 이용한 IMP로부터 GMP로의 변환 반응 및 XMP로부터 GMP로의 변환 반응과 그 비교
실시예 2에 기재된 JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA주에 관해서, IMP로부터 GMP로의 변환 반응 및 XMP로부터 GMP로의 변환 반응을 평가하였다. 변환 반응 평가를 위한, 균체의 조제 방법, 반응 방법, IMP로부터 GMP로의 변환 반응 용액 조성, 분석 방법에 관해서는 실시예 2에 따랐다. XMP로부터 GMP로의 변환 반응에서는, IMP로부터 GMP로의 변환 반응 용액 조성의 IMP 대신에 등농도의 XMP를 사용하였다.
결과를 도 3에 도시한다. IMP로부터 GMP로의 변환 반응에서는 반응 4시간으로 최대 약 16.9g/L의 GMP를, XMP로부터 GMP로의 변환 반응에서는 반응 7.5시간으로 최대 약 24.4g/L의 GMP를 반응액 중에 축적하고, XMP를 기질로 한 반응보다도 IMP를 기질로 한 반응쪽이 GMP의 생성 속도가 빠른 것이 나타났다.
실시예 4
<4-1> MC1655주 유래로 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA, aphA 유전자 파괴주의 구축
에스케리키아 콜라이 야생주 MG1655주를 친주로 하여, 5'-뉴클레오티다제 UshA, AphA 비생산주의 구축을 실시하였다. 5'-뉴클레오티다제를 암호화하는 ushA, aphA 유전자의 결실은, 실시예 1에 따라, 「Red-driven integration」이라고 불리는 방법과 λ파지 유래의 절취 시스템에 의해 실시하였다. 제작한 주를 MG1655ΔushAΔaphA라고 명명하였다.
<4-2> MG1655ΔushAΔaphA주 유래로 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 purA 유전자 파괴주의 구축
계속해서, MG1655ΔushAΔaphA주를 친주로 하여, 석시닐-AMP 신타제 비생산주의 구축을 실시하였다. 이.콜라이의 석시닐-AMP 신타제는 purA 유전자(Genbank Accession J04199 서열번호 33)에 의해 암호화되어 있다. 실시예 1에 나타낸 ushA, aphA, purR 유전자 파괴 방법에 준하여, purA 파괴용 프라이머로서, 서열번호 35, 36의 프라이머를 사용하여 실시하였다. 이것에 의해, MG1655ΔushAΔaphAΔpurA를 수득하였다.
<4-3> MG1655ΔushAΔaphAΔpurA주 유래로 퓨린 오페론이나 guaBA 오페론의 리프레서를 암호화하는 purR 유전자 파괴주의 구축
계속해서, MG1655ΔushAΔaphAΔpurA주를 친주로 하여, guaBA 오페론의 리프레서 PurR 비생산주의 구축을 실시하였다. purR 유전자의 파괴는, 실시예 1에 따라, purR 파괴용 프라이머로서, 서열번호 29, 30의 프라이머를 사용하여 실시하였다. 이것에 의해, MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurR을 수득하였다.
<4-4> MG1655ΔushAΔaphAΔpurR주 유래로 아데노신 데아미나제를 암호화하는 add 유전자 파괴주의 구축
계속해서, MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurR주를 친주로 하여, 아데노신 데아미나제 비생산주의 구축을 실시하였다. 이.콜라이의 아데노신 데아미나제는 add 유전자(Genbank Accession No. M59033 서열번호 37)에 의해 암호화되어 있다. 실시예 1에 나타낸 ushA, aphA, purR 유전자 파괴 방법에 준하여, add 파괴용 프라이머로서, 서열번호 39, 40의 프라이머를 사용하여 실시하였다. 이것에 의해, MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd주를 수득하였다.
<4-5> IMP 데하이드로게나제 및 GMP 신테타제 발현 강화 플라스미드 pUC18-guaBA의 MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd주로의 도입
실시예 1에 나타낸 pUC18-guaBA를 상기 MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd주에 도입하고, MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA주를 수득하였다.
<4-6> MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA주 균체를 이용한 IMP 또는 XMP로부터 GMP로의 변환 반응
상기 균주에 관해서, IMP 또는 XMP로부터 GMP로의 변환 반응 평가를 실시하였다. 변환 반응 평가를 위한 균체의 조제 방법, 반응 방법, 반응 용액 조성, 분석 방법에 관해서 이하에 나타낸다.
[균체의 조제 방법]
LB 배지 플레이트 위에 MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA주를 남김없이 도포하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날, 1/32 플레이트분의 균체를, LB 배지 20ml을 가득 채운 50Oml용의 판구 플라스크에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. LB 600ml분의 배양액의 원심후 균체를, 60ml의 반응 용액에 사용하였다.
[반응 방법]
상기의 LB 600ml분의 배양후 균체를 약숟가락으로 긁어 모아 후술하는 반응액 60ml에 접종하여 반응을 개시하였다. 반응은 42℃에서, pH를 7.2로 유지되도록, 수산화나트륨을 더하면서 실시하였다.
[반응 용액 조성]
50mM IMP 또는 50mM XMP
50g/L 글루코스
9.2g/L 헥사메타인산나트륨
5g/L MgSO4·7H2O
6.6g/L (NH4)2SO4
10g/L KH2PO4
5ml/L 크실렌
[분석 방법]
반응액 500㎕을 경시적으로 샘플링하고, NaOH로 희석하여 반응을 정지시켰다. 반응 정지액을 필터 여과하고, 통상 300㎕을 HPLC 분석에 제공하였다. 분석 조건은 이하와 같다.
칼럼: Asahipak GS-220(직경 7.6mm, 50cm)을 2개 연결
용리액: 0.2M NaH2PO4(pH 3.98)
온도: 55℃
유속: 1ml/분
검출: 자외선(254nm) 흡수
결과를 도 4에 도시한다. XMP를 기질로 한 반응보다도 IMP를 기질로 한 반응이 GMP의 생성 속도가 빠른 것이 나타났다.
본 발명에 의하면, 조미료, 의약 및 이들의 원료로서 유용한 GMP를 효율적으로 제조할 수 있다.
〔서열 표의 설명〕
서열번호 1: 이.콜라이 GMP 신테타제(GMPS) 유전자(guaA) 염기 서열
서열번호 2: 이.콜라이 GMPS 아미노산 서열
서열번호 3: 비.서브틸리스 GMPS 유전자(guaA) 염기 서열
서열번호 4: 비.서브틸리스 GMPS 아미노산 서열
서열번호 5: 씨.글루타미쿰 GMPS 유전자(guaA) 염기 서열
서열번호 6: 씨.글루타미쿰 GMPS 아미노산 서열
서열번호 7: 씨.암모니아게네스 GMPS 유전자(guaA) 염기 서열
서열번호 8: 씨.암모니아게네스 GMPS 아미노산 서열
서열번호 9: 이.콜라이 IMP 데하이드로게나제(IMPDH) 유전자(guaB) 염기 서열
서열번호 1O: 이.콜라이 IMPDH 아미노산 서열
서열번호 11: 비.서브틸리스 IMPDH 유전자(guaB) 염기 서열
서열번호 12: 비.서브틸리스 IMPDH 아미노산 서열
서열번호 13: 씨.글루타미쿰 IMPDH 유전자(guaB) 염기 서열
서열번호 14: 씨.글루타미쿰 IMPDH 아미노산 서열
서열번호 15: 씨.암모니아게네스 IMPDH 유전자(guaB) 염기 서열
서열번호 16: 씨.암모니아게네스 IMPDH 아미노산 서열
서열번호 17: 이.콜라이 purR 염기 서열
서열번호 18: 이.콜라이 PurR 아미노산 서열
서열번호 19: 이.콜라이 purR 클로닝용 프라이머 서열
서열번호 20: 이.콜라이 purR 클로닝용 프라이머 서열
서열번호 21: 이.콜라이 ushA 염기 서열
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<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Process for production of 5'-guanylic acid <130> C992-C8350 <150> JP 2008-043136 <151> 2008-02-25 <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1578 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1)..(1575) <400> 1 atg acg gaa aac att cat aag cat cgc atc ctc att ctg gac ttc ggt 48 Met Thr Glu Asn Ile His Lys His Arg Ile Leu Ile Leu Asp Phe Gly 1 5 10 15 tct cag tac act caa ctg gtt gcg cgc cgc gtg cgt gag ctg ggt gtt 96 Ser Gln Tyr Thr Gln Leu Val Ala Arg Arg Val Arg Glu Leu Gly Val 20 25 30 tac tgc gaa ctg tgg gcg tgg gat gtg aca gaa gca caa att cgt gac 144 Tyr Cys Glu Leu Trp Ala Trp Asp Val Thr Glu Ala Gln Ile Arg Asp 35 40 45 ttc aat cca agc ggc att att ctt tcc ggc ggc ccg gaa agt act act 192 Phe Asn Pro Ser Gly Ile Ile Leu Ser Gly Gly Pro Glu Ser Thr Thr 50 55 60 gaa gaa aac agt ccg cgt gcg ccg cag tat gtc ttt gaa gca ggc gta 240 Glu Glu Asn Ser Pro Arg Ala Pro Gln Tyr Val Phe Glu Ala Gly Val 65 70 75 80 ccg gta ttc ggc gtt tgc tat ggc atg 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tac aag cgt tac cgc ggc atg 1200 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Gly Lys Gln Tyr Lys Arg Tyr Arg Gly Met 385 390 395 400 ggc tcc atg ggc gct atg cag ggc cgt gga ctt agt ggt gag aag cgt 1248 Gly Ser Met Gly Ala Met Gln Gly Arg Gly Leu Ser Gly Glu Lys Arg 405 410 415 tcc tac tcc aag gac cgt tac ttc cag tct gac gtt aag agc gaa gac 1296 Ser Tyr Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Ser Asp Val Lys Ser Glu Asp 420 425 430 aag ctc gtt cca gaa ggc atc gaa ggt cgc gtg cct ttc cgc ggt ccc 1344 Lys Leu Val Pro Glu Gly Ile Glu Gly Arg Val Pro Phe Arg Gly Pro 435 440 445 atc gga gac atc att cac cag cag gtc ggt gga ctt cgt gca gca atg 1392 Ile Gly Asp Ile Ile His Gln Gln Val Gly Gly Leu Arg Ala Ala Met 450 455 460 ggc tac acc ggt tcc tcc acc att gaa gag ctg cac aac gct cgt ttc 1440 Gly Tyr Thr Gly Ser Ser Thr Ile Glu Glu Leu His Asn Ala Arg Phe 465 470 475 480 gtg cag atc acc agc gcg ggt ctg aag gaa tcc cac ccg cac cac atc 1488 Val Gln Ile Thr Ser Ala Gly Leu Lys Glu Ser His Pro His His Ile 485 490 495 cag cag act 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tcg tcg ctc gac gat atc gac agt atg cct ttc cgc ccc agc tgg att 720 Ser Ser Leu Asp Asp Ile Asp Ser Met Pro Phe Arg Pro Ser Trp Ile 225 230 235 240 tac ccg tca gtc gct gaa atc gac gtt atc tga 753 Tyr Pro Ser Val Ala Glu Ile Asp Val Ile 245 250 <210> 42 <211> 250 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 42 Met Thr Ile Lys Asn Val Ile Cys Asp Ile Asp Gly Val Leu Met His 1 5 10 15 Asp Asn Val Ala Val Pro Gly Ala Ala Glu Phe Leu His Gly Ile Met 20 25 30 Asp Lys Gly Leu Pro Leu Val Leu Leu Thr Asn Tyr Pro Ser Gln Thr 35 40 45 Gly Gln Asp Leu Ala Asn Arg Phe Ala Thr Ala Gly Val Asp Val Pro 50 55 60 Asp Ser Val Phe Tyr Thr Ser Ala Met Ala Thr Ala Asp Phe Leu Arg 65 70 75 80 Arg Gln Glu Gly Lys Lys Ala Tyr Val Val Gly Glu Gly Ala Leu Ile 85 90 95 His Glu Leu Tyr Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Asp Val Asn Pro Asp 100 105 110 Phe Val Ile Val Gly Glu Thr Arg Ser Tyr Asn Trp Asp Met Met His 115 120 125 Lys Ala Ala Tyr Phe Val Ala Asn Gly Ala Arg Phe Ile Ala Thr Asn 130 135 140 Pro Asp Thr His Gly Arg Gly Phe Tyr Pro Ala Cys Gly Ala Leu Cys 145 150 155 160 Ala Gly Ile Glu Lys Ile Ser Gly Arg Lys Pro Phe Tyr Val Gly Lys 165 170 175 Pro Ser Pro Trp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Asn Lys Met Gln Ala His 180 185 190 Ser Glu Glu Thr Val Ile Val Gly Asp Asn Leu Arg Thr Asp Ile Leu 195 200 205 Ala Gly Phe Gln Ala Gly Leu Glu Thr Ile Leu Val Leu Ser Gly Val 210 215 220 Ser Ser Leu Asp Asp Ile Asp Ser Met Pro Phe Arg Pro Ser Trp Ile 225 230 235 240 Tyr Pro Ser Val Ala Glu Ile Asp Val Ile 245 250 <210> 43 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer1 for disrupting nagD <400> 43 tgggtagtcc atgaccatta aaaatgtaat ttgcgacgct caagttagta taaa 54 <210> 44 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer2 for disrupting nagD <400> 44 aacgtcgatt tcagcgactg acgggtaaat ccagcttgaa gcctgctttt ttat 54

Claims (15)

  1. 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성이 증대되도록 개변된, 이노신산을 5'-구아닐산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물에, 이노신산을 작용시켜서 5'-구아닐산을 생성시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 5'-구아닐산의 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 미생물이, guaB 유전자 및 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성을 증대시키도록 개변된 미생물인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  3. 제2항에 있어서, guaA 유전자가 하기 (A) 또는 (B)의 단백질을 암호화하는, 5'-구아닐산의 제조 방법:
    (A) 서열번호 2에 기재한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (B) 서열번호 2에 기재한 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 5'-구아닐산 신테타제 활성을 갖는 단백질.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, guaB 유전자가 하기 (C) 또는 (D)의 단백질을 암호화하는, 5'-구아닐산의 제조 방법:
    (C) 서열번호 10에 기재한 아미노산 서열을 갖는 단백질.
    (D) 서열번호 10에 기재한 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위를 포함하는 아미노산 서열을 갖고, 이노신산 데하이드로게나제 활성을 갖는 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, 또한, ushA 유전자 및 aphA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, 또한, purR 유전자, add 유전자 및 purA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, 또한, nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된 미생물인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이, 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 세균, 바실러스속(Bacillus) 세균, 또는 코리네형(Coryneform) 세균인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 미생물이, 에스케리키아속(Escherichia) 세균인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 미생물이, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 5'-구아닐산의 제조 방법.
  11. guaB 유전자 및 guaA 유전자의 발현을 증가시킴으로써 이노신산 데하이드로게나제 및 5'-구아닐산 신테타제의 활성이 증대되도록 개변되고, 또한 ushA 유전자, aphA 유전자 및 nagD 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된, 이노신산을 5'-구아닐산으로 변환하는 능력을 갖는 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 또한, purR 유전자, add 유전자 및 purA 유전자로부터 선택되는 1종 또는 그 이상의 유전자가 정상적으로 기능하지 않도록 개변된, 미생물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 장내세균과에 속하는 세균, 바실러스속 세균, 또는 코리네형 세균인, 미생물.
  14. 제13항에 있어서, 에스케리키아속 세균인, 미생물.
  15. 제14항에 있어서, 에스케리키아 콜라이인, 미생물.
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