CN101960005B - 5’-鸟苷酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
使IMP与经过修饰而增大了肌苷酸(IMP)脱氢酶和5’-鸟苷酸(GMP)合成酶的活性的细菌进行反应来获得GMP。
Description
技术领域
本发明涉及5’-鸟苷酸的生产方法以及在5’-鸟苷酸的生产中使用的新微生物。5’-鸟苷酸可以用作调味料、医药以及调味料、医药的原料。
背景技术
作为5’-鸟苷酸(鸟苷-5’-单磷酸,以下也称“GMP”)的工业制备方法,已知采用发酵法生产鸟苷,再采用酶法将所得的鸟苷磷酸化得到5’-鸟苷酸的方法(专利文献1~4)。
此外,还已知这样的生产方法:将增强了GMP合成酶活性的属于埃希氏菌属的微生物与具有高的腺苷-三磷酸(ATP)生物合成(以下也称“ATP再生”;ATP通过葡萄糖代谢生成且是从5’-黄苷酸(XMP)合成GMP所需要的)活性的产氨短杆菌在包含XMP和氨气或谷氨酰胺的培养基中进行培养,通过高效率地将XMP转化为GMP,使培养液中生成并蓄积GMP(非专利文献1)。
另一方面,提出了利用发酵法来生产GMP的方法。例如,专利文献5中公开了一种生产GMP的方法,该生产方法中培养具有腺嘌呤营养缺陷性、显示德夸菌素(decoyinine)或甲硫氨酸亚砜抗性、且具有GMP生产能力的芽孢杆菌属的突变株,并收集培养基中生成蓄积的GMP。此外,专利文献6公开了一种GMP的生产方法,该生产方法中培养具有肌苷酸(肌苷酸-5’-单磷酸,以下也称“IMP”)生产能力的属于埃希氏菌属细菌菌株,其中该菌株中2种5’-核苷酸酶基因缺失并且IMP脱氢酶和GMP合成酶基因扩增,并收集培养基中生成并蓄积的GMP。但是,一般而言,GMP的直接发酵收率不足,与前述的酶法相比较未必实用。
到目前为止,关于利用提高了IMP脱氢酶和GMP合成酶的活性的埃希氏菌属细菌来以IMP为原料生产GMP的例子尚无报导。
专利文献1:特开平07-231793号公报
专利文献2:特开平10-201481号公报
专利文献3:国际公开第96/37603号小册子
专利文献4:特开2001-245676号公报
专利文献5:特公昭56-12438号公报
专利文献6:特开2002-355087号公报
非专利文献1:TatsuroFujio等,Biosci.Biotech.Biochem.,1997年,第61卷,5号,840-845页
发明内容
本发明的课题是提供使用微生物从IMP生产GMP的方法,以及创造在所述方法中使用的、能够高效率地将IMP转化为GMP的新微生物。
本发明人为解决上述问题进行了深入研究,结果发现通过利用经过修饰而增强了IMP脱氢酶活性和GMP合成酶活性的属于埃希氏菌属的微生物,能够高效率、高速度地将IMP转化为GMP,并且成功创造出了能够将IMP高效率地转化为GMP的新微生物,从而完成了本发明。
本发明的一个方面提供5’-鸟苷酸的生产方法,该方法包括:
使肌苷酸与具有将肌苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物进行反应从而生成5’-鸟苷酸,和
收集5’-鸟苷酸,其中所述微生物经过修饰而增强了肌苷酸脱氢酶活性和5’-鸟苷酸合成酶活性。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,所述肌苷酸脱氢酶活性和5’-鸟苷酸合成酶活性是通过增加guaB基因和guaA基因的表达而增强的。
本发明的另一个方面提供所述方法,所述guaA基因编码选自下组的蛋白质:
(A)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质;和
(B)包含SEQIDNO:2所示的氨基酸序列但其中含有1个或数个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位,且具有5’-鸟苷酸合成酶活性的蛋白质。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,所述guaB基因编码选自下组的蛋白质:
(C)包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的蛋白质;和
(D)包含SEQIDNO:10所示的氨基酸序列但其中含有1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位,且具有肌苷酸脱氢酶活性的蛋白质。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,所述微生物还经过修饰而使得选自ushA基因和aphA基因中的1种或多种基因不能正常发挥功能。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,所述微生物还经过修饰而使得选自purR基因、add基因和purA基因中的1种或多种基因不能正常发挥功能。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,其中,所述微生物还经过修饰而使得nagD基因不能正常地发挥功能。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,所述微生物选自属于肠杆菌科的细菌、芽孢杆菌属细菌和棒状杆菌型细菌。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,所述微生物是埃希氏菌属细菌。
本发明的另一个方面提供如上所述的方法,其中,所述微生物是大肠杆菌。
本发明的另一个方面提供一种具有将肌苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物,该微生物经过修饰而增加了guaB基因和guaA基因的表达,从而增强了肌苷酸脱氢酶活性和5’-鸟苷酸合成酶活性,并且其还经过修饰而使得ushA基因、aphA基因和nagD基因不能正常发挥功能。
本发明的另一个方面提供如上所述的微生物,其中,该微生物还经过修饰而使得选自purR基因、add基因和purA基因中的1种或多种基因不能正常发挥功能。
本发明的另一个方面提供如上所述的微生物,其选自属于肠杆菌科的细菌、芽孢杆菌属细菌或棒状杆菌型细菌。
本发明的另一个方面提供如上所述的微生物,其是埃希氏菌属细菌。
本发明的另一个方面提供如上所述的微生物,其是大肠杆菌。
附图说明
[图1]显示使JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株与IMP反应时,IMP、XMP和GMP的浓度变化的图。
[图2]时显示使JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株和JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株与IMP反应时,IMP(A)和GMP(B)的浓度变化的图表。
[图3](A)显示使JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株与IMP反应时,IMP和GMP的浓度变化的图表。(B)显示使JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株与XMP反应时,XMP和GMP的浓度变化的图表。(C)显示使JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株与IMP或XMP反应时,GMP的蓄积量的图表。
[图4](A)显示使MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株与IMP反应时,IMP、XMP和GMP的浓度变化的图表。(B)显示使MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株与IMP或XMP反应时,GMP的蓄积量的图表。
发明的具体实施方式
以下,对本发明进行具体说明。
<I>在本发明的方法中使用的微生物
本发明的方法中使用的微生物已经过修饰而增强了IMP脱氢酶活性以及GMP合成酶活性,并且具有将IMP转化为GMP的能力。
所述微生物的实例包括属于肠杆菌科的细菌、棒状杆菌型细菌(Coryneformbacterium)、和芽孢杆菌属(Bacillus)细菌。
作为属于肠杆菌科的细菌,可以列举出:埃希氏菌属(Escherichia)细菌、泛菌属(Pantoea)细菌、肠杆菌属(Enterobacter)细菌、克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌、沙雷氏菌属(Serratia)细菌、欧文氏菌属(Erwinia)细菌、沙门氏菌属(Salmonella)细菌、和摩根氏菌属(Morganella)细菌等。对于埃希氏菌属细菌没有特殊限制,只要是属于埃希氏菌属的细菌即可,包括大肠杆菌等,具体地可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt,FR.C.etal.,EscherichiacoliandSalmonellaTyphimurium,AmericanSocietyforMicrobiology,WashingtonD.C.,1208,表1)中列举的埃希氏菌属细菌。此外,作为肠杆菌属细菌,可以列举出成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)等;作为泛菌属细菌,可以列举出Pantoeaananatis等。
作为棒状杆菌型细菌,可以列举出:按照微生物领域的技术人员已知的分类方法分类为棒状杆菌型细菌的细菌;传统上被分类为短杆菌属(Brevibacterium)而现在被重新分类为棒杆菌属(Corynebacterium)的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991));以及与棒杆菌属亲缘关系非常近的属于短杆菌属的细菌等。这样的棒状杆菌型细菌的例子可以列举如下。
嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)
醋谷棒杆菌(Corynebacteriumacetoglutamicum)
烷醇棒杆菌(Corynebacteriumalkanolyticum)
美棒杆菌(Corynebacteriumcallunae)
谷氨酸棒杆菌
百合花棒杆菌(Corynebacteriumlilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacteriummelassecola)
嗜热产氨棒杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)
力士棒杆菌(Corynebacteriumherculis)
二歧短杆菌(Brevibacteriumdivaricatum)
黄色短杆菌
Brevibacteriumimmariophilum
乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)
玫瑰色短杆菌(Brevibacteriumroseum)
解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)
生硫短杆菌(Brevibacteriumthiogenitalis)
产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)
白色棒杆菌(Brevibacteriumalbum)
蜡状短杆菌(Brevibacteriumcerinum)
嗜氨微杆菌(Microbacteriumammoniaphilum)
作为属于芽孢杆菌属的细菌,可以使用按照微生物领域的技术人员已知的分类方法分类在芽孢杆菌属的细菌,具体地,可以列举出枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)等,但不限于此。
下面说明对在诸如上述的微生物中增强IMP脱氢酶(guaB基因产物)和GMP合成酶(guaA基因产物)的活性的方法。“
在本发明中,“经过修饰而增强了IMP脱氢酶和GMP合成酶的活性”是指:与埃希氏菌属细菌等微生物的非修饰株、例如野生株相比,IMP脱氢酶和GMP合成酶的活性高。
IMP脱氢酶是催化下述反应的酶,“IMP脱氢酶活性”是指催化从IMP生成XMP的反应的活性。IMP脱氢酶活性可以采用例如Gilbert的方法来测定(Gilbert,H.J.,Lowe,C.R.andDrabble,W.T.,BiochemJ.,1979,Dec1,183(3),481-94)。
NAD++IMP+H2O→NADH+H++XMP
此外,GMP合成酶是催化下述反应的酶(EC6.3.4.1),“GMP合成酶的酶活性”是指催化从XMP生成GMP的反应的活性。
ATP+XMP+NH3→AMP+焦磷酸+GMP
GMP合成酶活性可以例如采用Spector的方法(Spector,T.,MethodsEnzymol.,1978,51,p219),通过考察NADH的减少速度来测定。
为了增强IMP脱氢酶活性和GMP合成酶活性,优选提高分别编码这些酶的guaB基因和guaA基因的表达量。提高表达量的方法包括提高编码IMP脱氢酶的DNA和编码GMP合成酶的DNA在细菌细胞内的拷贝数。为了提高细胞内的拷贝数,将分别编码IMP脱氢酶和GMP合成酶的DNA片段与在埃希氏菌属细菌等微生物中发挥功能的载体相连接,从而制作重组DNA,并将其导入宿主以进行转化。guaB基因和guaA基因两者的拷贝数可以同时提高,也可以各自独立地提高其拷贝数。对于大肠杆菌的情况,guaB基因与guaA基因形成操纵子(GenBank登录号No.M10101),因此可以将guaBA操纵子与载体连接制成重组DNA,并将其导入宿主进行转化。转化株细胞内编码IMP脱氢酶和GMP合成酶的基因(guaB基因以及guaA基因)的拷贝数提高,结果使得IMP脱氢酶和GMP合成酶的活性增强。
细胞内拷贝数的提高可以通过使IMP脱氢酶基因和GMP合成酶基因在上述宿主的染色体DNA上以多拷贝存在来实现。为了在属于埃希氏菌属的细菌的染色体DNA上以多拷贝导入IMP脱氢酶基因和GMP合成酶基因,可以利用染色体上以多拷贝存在的序列作为靶标进行同源重组。作为上述染色体DNA上以多拷贝存在的序列,可以利用重复DNA、存在于转移因子端部的反向重复序列、等等。或者,也可以如特开平2-109985号公报所公开的那样,将目的基因搭载在转座子上并使之转移来多拷贝导入到染色体DNA上。采用任何方法提高转化株内的IMP脱氢酶基因和GMP合成酶基因拷贝数,结果均使IMP脱氢酶和GMP合成酶的活性增强。
作为用于导入上述基因的载体,可以列举出pSTV29、pMW218、pUC19等质粒载体,和λ1059、λBF101、M13mp9等噬菌体载体。此外,作为转座子,可以列举出Mu、Tn10、Tn5。
编码IMP脱氢酶和GMP合成酶的DNA的碱基序列是公知的,因而可以基于这些序列来合成引物,以埃希氏菌属细菌等微生物的染色体DNA作为模板采用PCR法进行扩增来获取这些DNA。例如,作为大肠杆菌的guaA基因,可以列举出包含SEQIDNO:1的碱基序列的基因;作为大肠杆菌的guaB基因,可以列举出包含SEQIDNO:9的碱基序列的基因。所述基因也可以通过基于该碱基序列制备探针、通过从埃希氏菌属细菌的染色体DNA文库进行杂交选择目的DNA片段来获得。或者,可以基于已知的碱基序列来化学合成编码IMP脱氢酶和GMP合成酶的DNA片段。还可以使用SEQIDNO:31和32的引物克隆大肠杆菌的guaBA操纵子。
此外,也可以基于上述碱基序列从埃希氏菌属细菌以外的微生物获取编码具有与IMP脱氢酶和GMP合成酶等同的功能的蛋白质的基因。
作为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的GMP合成酶基因(guaA),可以列举出包含SEQIDNO:3的碱基序列的基因。该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO:4所示。作为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的GMP合成酶基因(guaA),可以列举出包含SEQIDNO:5的碱基序列的基因。该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO:6所示。
作为产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)的GMP合成酶基因(guaA),可以列举出包含SEQIDNO:7的碱基序列的基因。该碱基序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO:8所示。
作为枯草芽孢杆菌的IMP脱氢酶基因(guaB),可以列举出包含SEQIDNO:11的碱基序列的基因。该碱基序列所编码的氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。
作为谷氨酸棒杆菌的IMP脱氢酶基因(guaB),可以列举出包含SEQIDNO:13的碱基序列的基因。该碱基序列所编码的氨基酸序列如SEQIDNO:14所示。
作为产氨棒杆菌的IMP脱氢酶基因(guaB),可以列举出包含SEQIDNO:15的碱基序列的基因。该碱基序列所编码的氨基酸序列如SEQIDNO:16所示。如上述,因微生物所属的属、种或菌株不同,guaA基因以及guaB基因的碱基序列可能存在差异,因而,guaA基因以及guaB基因也可以是上述基因的变体。
guaA基因编码的蛋白质只要具有GMP合成酶活性即可,可以是相对于SEQIDNO:2的整个氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同一性的蛋白质。此外,guaB基因编码的蛋白质只要具有IMP脱氢酶活性即可,可以是相对于SEQIDNO:10的整个氨基酸序列具有80%以上、优选90%以上、更优选95%、特别优选98%以上的同一性的蛋白质。氨基酸序列和碱基序列的同一性可以使用例如Karlin和Altschul的算法BLAST(Pro.Natl.Acad.Sci.USA,90,5873(1993))或Pearson的FASTA(MethodsEnzymol.,183,63(1990))来确定。基于该算法BLAST,已经开发出称为BLASTN或BLASTX的程序(参照http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
此外,本发明中使用的guaA基因和guaB基因并非仅限于野生型基因,在不损害所编码的蛋白质的功能即GMP合成酶活性或IMP脱氢酶活性的前提下,所述基因也可以是突变体或人工修饰体,所述突变体或人工修饰体编码这样的蛋白质,其包含在SEQIDNO:2或10的氨基酸序列中的1个或者多个位置上含有1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位的序列。这里,所谓“数个”,因氨基酸残基的种类或其在蛋白质立体结构中的位置而异,具体地是指2~20个氨基酸、更优选2~10个氨基酸、更优选2~5个氨基酸。上述取代优选为保守取代。作为保守突变,当取代部位为芳族氨基酸时,是指在Phe、Trp、Tyr之间相互取代的突变,当取代部位为疏水性氨基酸时,是指在Leu、Ile、Val之间相互取代的突变,当取代部位为极性氨基酸时,是指在Gln、Asn之间相互取代的突变,当取代部位为碱性氨基酸时,是指在Lys、Arg、His之间相互取代的突变,当取代部位为酸性氨基酸时,是指在Asp、Glu之间相互取代的突变,当取代部位为带有羟基的氨基酸时,是指在Ser、Thr之间进行相互取代的突变。作为保守取代,具体地可以列举出:从Ala到Ser或Thr的取代,从Arg到Gln、His或Lys的取代,从Asn到Glu、Gln、Lys、His或Asp的取代,从Asp到Asn、Glu或Gln的取代,从Cys到Ser或Ala的取代,从Gln到Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的取代,从Glu到Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的取代,从Gly到Pro的取代,从His到Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的取代,从Ile到Leu、Met、Val或Phe的取代,从Leu到Ile、Met、Val或Phe的取代,从Lys到Asn、Glu、Gln、His或Arg的取代,从Met到Ile、Leu、Val或Phe的取代,从Phe到Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的取代,从Ser到Thr或Ala的取代,从Thr到Ser或Ala的取代,从Trp到Phe或Tyr的取代,从Tyr到His、Phe或Trp的取代,以及从Val到Met、Ile或Leu的取代。此外,如上所述的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于携带guaA基因或guaB基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。
此外,guaA基因可以是与SEQIDNO:1的碱基序列的互补序列或能够由该序列制备的探针在严格条件下杂交,且编码具有GMP合成酶活性的蛋白质的DNA;guaB基因可以是与SEQIDNO:9的碱基序列的互补序列或能够由该序列制备的探针在严格条件下杂交,且编码具有IMP脱氢酶活性的蛋白质的DNA。这里,“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。将该条件明确地数值化是困难的,举一实例,“严格条件”包括这样的条件:在该条件下,具有高同一性的DNA,例如具有80%以上,优选90%以上,更优选95%以上,特别优选具有98%以上同一性的DNA之间相互杂交,而同一性较之为低的DNA之间则不互相杂交;或者是例如这样的条件:在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃,1×SSC、0.1%SDS,优选0.1×SSC、0.1%SDS,更优选68℃,0.1×SSC、0.1%SDS相当的盐浓度和温度下,洗涤一次,更优选两次至三次的条件。
上述的关于基因的变体的描述对于后述的ushA基因、aphA基因、purR基因、add基因、purA基因以及其它基因也同样适用。
将DNA导入微生物可以通过C.T.chung的方法(C.T.chungetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,2172-2175(1989))、D.M.Morrison的方法(MethodsinEnzymology,68,326(1979))、或者用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法(Mandel,M.andHiga,A.,J.Mol.Biol.,53,159(1970))等来进行。
提高IMP脱氢酶基因和GMP合成酶基因的表达量,除了利用上述的基因扩增以外,还可以通过将染色体DNA上或质粒上的IMP脱氢酶基因和GMP合成酶基因的启动子等表达调节序列更换成强力的启动子等表达调节序列来实现。例如,lac启动子、trp启动子、trc启动子等是已知的强力启动子。此外,如国际公开WO00/18935所披露的,也可以在基因的启动子区域导入数个碱基的碱基取代,从而使其更强。通过所述启动子取代或修饰,IMP脱氢酶基因和GMP合成酶基因的表达得到强化,两种蛋白质的活性增强。guaB基因、guaA基因的表达量的增强可以采用Northern法、RT-PCR法等来检测。
编码IMP脱氢酶和GMP合成酶的guaBA操纵子和嘌呤操纵子的表达受到PurR蛋白质的抑制,因此,在用于本发明的细菌中,优选修饰编码PurR蛋白质的purR基因((GenBank登录号J04212:SEQIDNO:17)使之不能正常发挥功能,更优选降低该基因的表达。可以采用诸如以下的方法进行修饰而使得purR基因无法正常发挥功能。例如,可以通过采用利用基因重组法的同源重组法(ExperimentsinMolecularGenetics,ColdSpringHarborLaboratorypress(1972);Matsuyama,S.andMizushima,S.,J.Bacteriol.,162,1196(1985))将染色体上的purR基因替换成无法正常发挥功能的purR基因(以下也称为“破坏型purR基因”)来进行。在同源重组方面,如果将携带与染色体上的序列具有同源性的序列的质粒等导入菌体内,则重组在具有同源性的序列的位置上以一定频率发生,导入的质粒整体整合到染色体中。然后,如果在染色体上具有同源性的序列的位置上进一步发生重组,则质粒会脱落。此时,取决于发生重组的位置,被破坏的基因可能会被整合到染色体上,而原来的正常基因可能会与质粒一起从染色体上脱落。通过选择这样的菌株,可以获得染色体上的正常purR基因被破坏型purR基因取代的菌株。
此类利用同源重组的基因取代包括:组合使用称为“Red驱动整合(Red-drivenintegration)”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645)与λ噬菌体来源的切出系统(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3.)的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法,或者使用含温度敏感型复制起点的质粒的方法等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645,美国专利第6303383号,或特开平05-007491号公报)。
此外,基于利用如上所述的同源重组的基因取代的定点突变导入,也可以使用在宿主中不具有复制能力的质粒来进行。此外,也可以使用下述质粒进行purR基因的破坏,所述质粒包含内部插入有药物抗性等标记基因的purR基因,且不能在目的微生物内复制。即,用所述质粒转化后获得了药物抗性的转化体在染色体DNA中导入了标记基因。该标记基因很可能是通过其两端的purR基因序列与染色体上的所述基因之间的同源重组而导入的,因此能够有效地选择基因破坏株。
用于基因破坏的破坏型purR基因具体地可以这样获取:利用限制酶消化和再连接使purR基因的一定区域缺失,或者在所述基因中插入其它DNA片段(标记基因等),或者利用定点突变法(Kramer,W.andFrits,H.J.,MethodsinEnzymology,154,350(1987))或利用次氯酸钠、羟胺等化学药物进行处理(Shortle,D.andNathans,D.,Proc.,Natl.,Acad.,Sci.,U.S.A.,75,270(1978))来在purR基因的编码区域或启动子区域等的碱基序列中引发1个或多个碱基取代、缺失、插入、添加或倒位,从而使所编码的PurR蛋白质的活性降低或消失,或者使purR基因的转录降低或消失。
purR基因的序列本身是公知的,基于这些序列,能够容易地通过PCR法或杂交法等获得purR基因。例如,大肠杆菌的purR基因的一个例子是编码SEQIDNO:18的氨基酸序列的基因。purR基因例如可以从大肠杆菌的染色体DNA通过使用SEQIDNO:19和20所示的引物进行PCR来获得。
其它微生物的purR基因也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的purR基因之间的序列同源性来获取,并用于微生物的修饰。
purR基因只要是编码与SEQIDNO:18的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的氨基酸序列即可。
目的基因被破坏的事实可以通过采用Southern印迹、PCR法对染色体上的基因进行解析来确认。
此外,对微生物进行紫外线照射或者使用N-甲基-N’-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等常规突变处理中使用的突变剂进行处理,也可以获得不产生有功能的PurR蛋白质的突变株。此外,通过在位于guaBA操纵子启动子上游的PurR结合序列(M.I.Hutchings,W.T.Drabble,FEMSMicrobiologyLetters187(2000)115-122)中导入1个或多个碱基取代、缺失、插入、添加或倒位,可以使PurR蛋白发生修饰而不能像通常那样发生结合。
本发明的方法所使用的细菌优选还经过修饰而使得ushA基因和/或aphA基因不能正常地发挥功能。所述基因的突变株或基因重组株可以通过对基因进行修饰而使得所述基因编码的5’-核苷酸酶的活性降低或消失,或者使得所述基因的转录降低或消失而获得。这样的突变株或基因重组株可以采用与前述的purR基因无法正常发挥功能的突变株或基因重组株相同的方法来获得。
ushA基因的序列自身是公知的,可以容易地基于这些序列采用PCR法或杂交法等获得ushA基因。例如,作为大肠杆菌的ushA基因,可以列举出编码SEQIDNO:22的氨基酸序列的基因。
也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的ushA基因之间的序列同源性来获取其它微生物的ushA基因,并用于修饰。
而且,ushA基因可以是编码与SEQIDNO:22的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的氨基酸序列的基因。
aphA基因的序列自身是公知的,可以容易地基于这些序列采用PCR法或杂交法等获得aphA基因。例如,作为大肠杆菌的aphA基因,可以列举出编码SEQIDNO:24的氨基酸序列的基因。
也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的aphA基因之间的序列同源性来获取其它微生物的aphA基因,并用于修饰。
aphA基因可以是编码与SEQIDNO:24的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的氨基酸序列的基因。
在本发明的方法所使用的细菌中,优选还经过修饰而使得add基因和/或purA基因不能正常地发挥功能。所述基因的突变株或基因重组株可以通过对所述基因进行修饰而使所述基因编码的腺苷脱氨酶和/或琥珀酰-AMP合酶的活性降低或消失或者这些基因的转录降低或消失来获得。这样的突变株或基因重组株可以像前述的purR基因不能正常地发挥功能的突变株或基因重组株那样来获得。add基因的序列自身是公知的,可以容易地基于这些序列采用PCR法或杂交法等获得add基因。例如,作为大肠杆菌的add基因,可以列举出编码SEQIDNO:38的氨基酸序列的基因。
也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的add基因之间的序列同源性来获取其它微生物的add基因,并用于修饰。
add基因可以是编码与SEQIDNO:38的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的氨基酸序列的基因。
purA基因的序列自身是公知的,可以容易地基于这些序列采用PCR法或杂交法等获得purA基因。例如,作为大肠杆菌的purA基因,可以列举出编码SEQIDNO:34的氨基酸序列的基因。也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的purA基因之间的序列同源性来获取其它微生物的purA基因,并用于修饰。
purA基因可以是编码与SEQIDNO:34的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的氨基酸序列的基因。
在本发明的方法所使用的微生物中,优选还经过修饰而使得nagD基因不能正常地发挥功能。nagD基因的突变株或基因重组株可以通过对该基因进行修饰而使得该基因编码的蛋白质的活性降低或消失,或者所述基因的转录降低或消失来获得。这样的突变株或基因重组株可以像前述的purR基因不能正常地发挥功能的突变株或基因重组株那样来获得。
nagD基因的序列本身是公知的,基于这些序列,能够容易地通过PCR法或杂交法等获得nagD基因。例如,作为大肠杆菌的nagD基因,可以列举出编码SEQIDNO:42的氨基酸序列的基因。
已知大肠杆菌(E.coli)的nagD基因存在于与N-乙酰葡糖胺代谢有关的nagBACD操纵子内,且该nagBACD操纵子基因的表达可以通过在培养基中添加N-乙酰葡糖胺(一种构成细菌细胞壁的主要成分的糖)来诱导(PlumbridgeJA.,Mol.Micobiol.(1989)3.505-515)。大肠杆菌的nagD所编码的NagD蛋白质从保守结构上的特征来看可知其属于卤酸脱卤酶(HAD)家族。有报告称其在体外实验中具有针对GMP和5’-尿苷酸(尿苷-5’-单磷酸,以下也称“UMP”)的核苷酸酶活性(TremblayLW.,Biochemistry,(2006)45.1183-1193)。但是,大肠杆菌的基因组上存在23种HAD家族蛋白质,它们的底物特异性范围非常广泛(Kuznetsovaetal.,J.Biol.Chem.,(2006)281.,36149-36161),因此并不清楚nagD基因在细胞内的生理作用。
在本发明中发现:通过在经过修饰而增加了guaB基因和guaA基因的表达、且使ushA基因和aphA基因无法正常发挥功能的微生物中,进一步进行修饰而使nagD基因无法正常地发挥功能,可以高效率地从肌苷酸生产5’-鸟苷酸。
因此,本发明提供了一种新的具有将肌苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物,其经过修饰而增加了guaB基因和guaA基因的表达、从而增强了肌苷酸脱氢酶和5’-鸟苷酸合成酶的活性,还经过修饰而使得ushA基因、aphA基因和nagD基因不能正常地发挥功能。在该微生物中,优选还进行修饰而使选自purR基因、add基因和purA基因中的1种或1种以上基因无法正常地发挥功能。
而且,nagD基因不限于大肠杆菌的nagD基因,也可以基于公知序列或与上述大肠杆菌的nagD基因之间的序列同源性来获取其它微生物的nagD基因,并用于修饰。即,nagD基因可以是编码与SEQIDNO:42的氨基酸序列具有70%以上、优选80%以上、更优选90%以上、特别优选95%以上的同一性的氨基酸序列的基因。
<II>GMP的生产方法
通过使IMP与上述的经过修饰而增强了IMP脱氢酶活性和GMP合成酶活性的微生物反应,而将IMP转化为GMP,能够获得GMP。
IMP脱氢酶反应需要NAD+,GMP合成酶反应而需要ATP。IMP脱氢酶反应产生的NADH可通过氧化磷酸化途径重新转化为NAD+。此时会生成ATP。因此,可以推定:通过同时增强IMP脱氢酶活性和GMP合成酶活性,能够高效率地进行从IMP到GMP的反应。
在本发明中,“使......反应”包括两方面含义:使上述微生物菌体存在于添加有IMP的培养基中,使用该微生物作为所谓的“微生物酶”来将IMP转化为GMP;和通过向培养着上述微生物的培养基中加入IMP来生成GMP。
优选地,通过将培养上述微生物后而得的菌体添加到含IMP的反应液中,或者在含上述微生物的溶液中添加IMP,可以高效率地将IMP转化为GMP,从而生成并蓄积GMP。
作为进行该微生物的培养时的碳源,只要是上述微生物能够同化的碳源即可,可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、废糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物,乙醇、甘油、山梨糖醇等醇类,丙酮酸、乳酸、乙酸等有机酸,甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作为氮源,可以使用氨气、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、碳酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机以及有机铵盐,尿素、各种氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化物等。作为无机物,可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、碳酸钙等。当所使用的微生物的生长需要氨基酸、核酸、维生素等特定营养物质时,可以在培养基中适量添加所述物质。培养可以在pH5.0~8.5、15℃~45℃的适宜范围内在需氧条件下进行约5小时~72小时。而且,pH调整可以使用无机或有机的酸性或者碱性物质,还可以使用氨气等。
从IMP到GMP的转化可以直接将该微生物的培养液接种于含IMP的反应液中来进行,或者可以离心后仅将菌体接种于含IMP的反应液中,或者将菌体悬浮于适当的溶液中再接种于含IMP的反应液中来进行。而且,在本发明的GMP的生产方法中,还可以使用上述微生物的菌体处理物。作为菌体的处理物,可以列举出例如将菌体用丙烯酰胺、角叉藻聚糖等固定化而得到的固定化菌体等。
作为反应液的碳源,只要是上述微生物能够同化的碳源即可,可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜、废糖蜜、淀粉水解物等碳水化合物,乙醇、甘油、山梨糖醇等醇类,丙酮酸、乳酸、乙酸等有机酸,甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸等。作为氮源,可以使用氨气、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、碳酸铵、乙酸铵、磷酸铵等各种无机以及有机铵盐,尿素、各种氨基酸、蛋白胨、NZ胺、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、鱼粉或其消化物等。作为无机物,可以使用磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、磷酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸锌、碳酸钙等。当所使用的微生物的生长需要氨基酸、核酸、维生素等特定营养物质时,可以在培养基中适量添加所述物质。
而且,反应液中优选加入有机溶剂来激活核苷酸的细胞透过性。
作为核苷酸的膜透过性激活剂的有机溶剂优选利用二甲苯、甲苯、苯、脂肪酸醇、乙酸乙酯等,并通常优选以0.1~30ml/L的浓度使用。反应可以在pH5.0~8.5、15℃~45℃的适宜范围以需氧条件或厌氧条件进行1小时~7天左右。而且,pH调整可以使用无机或有机的酸性或碱性物质,还可以使用氨气等。而且,原料IMP可以使用化学合成品、市售品和通过发酵法(WO96/30501、特开2002-355087、特开2003-325182等)生产的IMP等。
从反应液收集GMP,通常通过组合离子交换树脂法、沉淀法、其它公知方法来实施。
实施例
以下,通过实施例对本发明进行具体说明。
实施例1
<1-1>JM109株来源的编码5’-核苷酸酶的ushA,aphA基因破坏株的构建
以通常用作DNA克隆用宿主的大肠杆菌JM109株为亲本株,首先进行了5’-核苷酸酶非产生株的构建。5’-核苷酸酶由ushA基因(Genbank登录号X03895SEQIDNO:21)和aphA基因(Genbank登录号X86971,SEQIDNO:23)编码。
编码5’-核苷酸酶的ushA、aphA基因的缺失通过Datsenko和Wanner最先开发的称为“Red驱动整合(Red-drivenintegration)”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645)以及λ噬菌体来源的切出系统(J.Bacteriol.2002Sep;184(18):5200-3.Interactionsbetweenintegraseandexcisionaseinthephagelambdaexcisivenucleoproteincomplex.ChoEH,GumportRI,GardnerJF.)来进行。根据“Red驱动整合”方法,使用将目的基因的一部分设计在合成寡核苷酸的5′侧、将抗生素抗性基因的一部分设计在3′侧而得到的合成寡核苷酸作为引物来获得PCR产物,使用该PCR产物能够一步式地构建基因破坏株。而且,通过组合使用λ噬菌体来源的切出系统,能够将整合入基因破坏株的抗生素抗性基因除去。
(1)ushA基因的破坏
使用质粒pMW118-attL-Cm-attR作为PCR模板。pMW118-attL-Cm-attR(WO2006078039)是在pMW118(宝生物公司制造)中插入作为λ噬菌体附着位点的attL和attR基因、以及抗生素抗性基因cat基因而得到的质粒,其中按attL-cat-attR的顺序插入。
使用SEQIDNO:25和26所示的合成寡核苷酸引物进行了PCR,其中,引物的3′末端具有与attL和attR的两端对应的序列,引物的5′末端具有与作为目的基因的ushA基因的一部分对应的序列。
将扩增得到的PCR产物用琼脂糖凝胶纯化后,通过电穿孔将其导入大肠杆菌JM109株中;JM109株包含具有温度敏感型的复制能力的质粒pKD46。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645)包含λ噬菌体的总计2154个碱基的DNA片段(GenBank/EMBL登录号J02459,第31088位~33241位),该DNA片段中包含受阿拉伯糖诱导型ParaB启动子调控的编码λRed同源重组系统的Red重组酶的基因(γ、β、exo基因)。质粒pKD46对于将PCR产物整合到JM109株的染色体上是必要的。
如下述制备电穿孔用感受态细胞。即,将在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中30℃培养过夜的大肠杆菌JM109株用含氨苄青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL的SOB培养基(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,Sambrook,J等,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989年))稀释100倍。使所得稀释物于30℃通气条件下生长至OD600约0.6后,浓缩100倍,再用10%甘油洗涤3次,从而使得其能够在电穿孔中使用。电穿孔使用70μL的感受态细胞和约100ng的PCR产物来进行。在电穿孔后的杯子中加入1mL的SOC培养基(MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版,Sambrook,J.等,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989年)),37℃培养2.5小时后,于37℃在包含Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养,选择出Cm抗性重组体。然后,为了除去pKD46质粒,在含Cm的L-琼脂培养基上于42℃传代2次,测试所得菌落的氨苄青霉素抗性,获得了pKD46脱落的氨苄青霉素敏感型株。
采用PCR确认了通过氯霉素抗性基因甄别出的突变体的ushA基因的缺失。将所得ushA缺损株命名为JM109ΔushA::att-cat株。
然后,为了除去导入ushA基因内的att-cat基因,使用了辅助质粒即上述的pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts是一种具有温度敏感型的复制能力的质粒,携带编码λ噬菌体的整合酶(Int)的基因和编码切除酶(Xis)的基因。通过导入pMW-intxis-ts,识别染色体上的attL或attR并引发重组,从而将attL与attR之间的基因切出,染色体上形成仅残留attL或attR序列的结构。
按照常规方法制作了上述所得的JM109ΔushA::att-cat株的感受态细胞,用辅助质粒pMW-intxis-ts进行转化,于30℃在含50mg/L氨苄青霉素的L-琼脂培养基上进行平板培养,选择出氨苄青霉素抗性株。然后,为了除去pMW-intxis-ts质粒,在L-琼脂培养基上于42℃传代2次,测试所得菌落的氨苄青霉素抗性以及氯霉素抗性,获得了att-cat和pMW-intxis-ts脱落的ushA破坏株,即氯霉素与氨苄青霉素敏感型株。将该株命名为JM109ΔushA。
(2)JM109ΔushA株的aphA基因的缺失
JM109ΔushA株中aphA基因的缺失是采用上述方法,使用SEQIDNO:27、28的引物作为aphA破坏用引物来进行的。由此获得了ushAaphA破坏株JM109ΔushAΔaphA。
<1-2>JM109ΔushAΔaphA株来源的purR基因(编码嘌呤操纵子和guaBA操纵子的阻遏物的基因)破坏株的构建
接下来,以JM109ΔushAΔaphA株为亲本株来构建不产生guaBA操纵子阻遏物PurR的菌株。PurR由purR基因(Genbank登录号J04212SEQIDNO:17)编码。构建按照前述的ushA、aphA基因破坏方法,使用SEQIDNO:29、30的引物作为purR破坏用引物。由此,得到了JM109ΔushAΔaphAΔpurR。
<1-3>IMP脱氢酶和GMP合成酶表达质粒pUC18-guaBA的构建以及将该质粒导入JM109ΔushAΔaphAΔpurR株
IMP脱氢酶和GMP合成酶表达质粒pUC18-guaBA的构建如下进行。已知在大肠杆菌中编码这两个酶的guaB、guaA基因构成操纵子(guaBA)。因而,使用SEQIDNO:31以及SEQIDNO:32所示的引物进行PCR,扩增了大肠杆菌的guaBA操纵子。对扩增片段进行纯化后,将形成于两端的限制酶位点用SacI和KpnI切割。将切割片段与同样用SacI和KpnI切割的pUC18相连接,选择出导入了guaBA基因而形成的质粒pUC18-guaBA。将该质粒导入所述JM109ΔushAΔaphAΔpurR株,从而得到了JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株。
<1-4>利用JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株菌体进行从IMP到GMP的转化反应
对于上述菌株,实施了从IMP到GMP的转化反应的评价。用于进行从IMP到GMP的转化反应评价的菌体制备方法、反应方法、反应溶液组成、分析方法如下所示。
[菌体的制备方法]
在LB培养基平板上均匀涂布JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株,37℃培养过夜。第二天,将1/32平板量的菌体接菌在装有LB培养基20ml的500ml容量坂口烧瓶中,37℃培养过夜。将LB600ml量的培养液经离心后而得的菌体用于60ml的反应溶液。
[反应方法]
用药匙刮取前述的LB600ml量的培养后菌体,将其接种于后述的反应液60ml中,开始反应。反应于42℃在添加氢氧化钠维持pH为7.2的条件下实施。
[反应溶液组成]
60mMIMP
50g/L葡萄糖
9.2g/L六偏磷酸钠
5g/LMgSO4·7H2O
6.6g/L(NH4)2SO4
10g/LKH2PO4
5ml/L二甲苯
[分析方法]
随时间取样反应液500μl,15,000rpm离心5分钟,将上清液用NaOH稀释以终止反应。将所得溶液过滤,将300μl滤液用于HPLC分析。分析条件如下。
柱:AsahipakGS-220(直径7.6mm,50cm),2根相连
洗脱液:0.2MNaH2PO4(pH3.98)
温度:55℃
流速:1ml/分钟
检测:紫外线(254nm)吸收
结果如图1所示。显示使用JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA进行12小时反应,反应液中蓄积了最大约16.2g/L的GMP。
实施例2
<2-1>JM109ΔushAΔaphAΔpurR株构建nagD基因破坏株
以实施例1的<1-2>中获得的JM109ΔushAΔaphAΔpurR株作为亲本株,进行了NagD非产生株的构建。NagD由nagD基因(Genbank登录号X14135SEQIDNO:41)编码。按照前述的ushA、aphA、purR基因破坏方法,使用SEQIDNO:43、44的引物作为nagD破坏用引物,进行了nagD基因破坏。由此,得到了JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD。
[<2-2>将IMP脱氢酶和GMP合成酶表达强化质粒pUC18-guaBA导入JM109ΔushAΔaphAΔpurR株和JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD株
将质粒pUC18-guaBA导入所述JM109ΔushAΔaphAΔpurR株和JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD株,得到了JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株和JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株。
<2-3>利用JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株和JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株菌体进行从IMP到GMP的转化反应
对于上述菌株,实施了从IMP到GMP的转化反应的评价。用于进行从IMP到GMP的转化反应评价的菌体制备方法、反应方法、反应溶液组成、分析方法如下所示。
[菌体的制备方法]
在LB培养基平板上均匀涂布JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株或JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株,37℃培养过夜。第二天,将1/32平板量的菌体接菌在装有LB培养基20ml的500ml容量坂口烧瓶中,37℃培养过夜。
[反应方法]
将前述培养液离心,将相当于干重0.8g的菌体接种于反应液60ml中,开始反应。反应于42℃在通过添加氢氧化钠维持pH为7.2的条件下实施。
[从IMP到GMP的转化反应的反应溶液组成]
50mMIMP
50g/L葡萄糖
9.2g/L六偏磷酸钠
5g/LMgSO4·7H2O
6.6g/L(NH4)2SO4
10g/LKH2PO4
3ml/L二甲苯
[分析方法]
随时间取样反应液500μl,用NaOH稀释,从而终止反应。将所得溶液过滤,取300μl滤液用于HPLC分析。分析条件如下。
柱:AsahipakGS-220(直径7.6mm,50cm),2根相连
洗脱液:0.2MNaH2PO4(pH3.98)
温度:55℃
流速:1ml/分钟
检测:紫外线(254nm)吸收
结果如图2所示。显示使用JM109ΔushAΔaphAΔpurR/pUC18-guaBA株时,反应液中蓄积了最大约12.5g/L的GMP;而使用JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株时,反应液中蓄积了最大约14.81g/L的GMP
实施例3
利用实施例2所述的JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株菌体进行从IMP到GMP的转化反应和从XMP到GMP的转化反应,及其比较
对于实施例2所述的JM109ΔushAΔaphAΔpurRΔnagD/pUC18-guaBA株,进行从IMP到GMP的转化反应以及从XMP到GMP的转化反应的评价。用于转化反应评价的菌体制备方法、反应方法、从IMP到GMP的转化反应溶液组成、以及用于评价转化反应的分析方法与实施例2相同。对于从XMP到GMP的转化反应,使用等浓度的XMP替代从IMP到GMP的转化反应溶液组成中的IMP。
结果如图3所示。在从IMP到GMP的转化反应中,反应4小时,反应液中蓄积了最大约16.9g/L的GMP;在从XMP到GMP的转化反应中,反应7.5小时,反应液中蓄积了最大约24.4g/L的GMP。这显示,与以XMP作为基质的反应相比,在以IMP作为基质的反应中GMP的生成速度更快。
实施例4
<4-1>从MG1655株构建编码5’-核苷酸酶的ushA和aphA基因破坏株
以大肠杆菌野生型株MG1655株作为亲本株,构建5’-核苷酸酶UshA,AphA非产生株。编码5’-核苷酸酶的ushA、aphA基因的缺失按照实施例1所述,利用称为“Red驱动整合”的方法与λ噬菌体来源的切出系统进行。所制得的菌株命名为MG1655ΔushAΔaphA。
<4-2>从MG1655ΔushAΔaphA株构建编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因破坏株
接下来,以MG1655ΔushAΔaphA株为亲本株,进行了琥珀酰-AMP合酶非产生株的构建。大肠杆菌的琥珀酰-AMP合酶由purA基因(Genbank登录号J04199SEQIDNO:33)编码。采用实施例1所示的ushA、aphA、purR基因破坏方法,使用SEQIDNO:35、36的引物作为purA破坏用引物来进行。由此,得到了MG1655ΔushAΔaphAΔpurA。
<4-3>MG1655ΔushAΔaphAΔpurA株来源的编码嘌呤操纵子、guaBA操纵子的阻遏物的purR基因破坏株的构建
接下来,以MG1655ΔushAΔaphAΔpurA株为亲本株,构建不产生guaBA操纵子的阻遏物PurR的菌株。purR基因的破坏按照实施例1,使用SEQIDNO:29和30的引物作为purR破坏用引物来进行。由此,得到了MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurR。
<4-4>MG1655ΔushAΔaphAΔpurR株来源的编码腺苷脱氨酶的add基因破坏株的构建
接下来,以MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurR株为亲本株,进行了腺苷脱氨酶非产生株的构建。大肠杆菌的腺苷脱氨酶由add基因(Genbank登录号No.M59033SEQIDNO:37)编码。按照实施例1所示的ushA、aphA、purR基因破坏方法,使用SEQIDNO:39、40的引物作为add破坏用引物来进行。由此,得到了MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd株。
<4-5>将IMP脱氢酶和GMP合成酶表达质粒pUC18-guaBA导入MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd株
将实施例1所示的pUC18-guaBA导入所述MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd株,从而得到了MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株。
<4-6>利用MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株菌体进行从IMP或XMP到GMP的转化反应
对于上述菌株,实施了从IMP或XMP到GMP的转化反应评价。用于转化反应评价的菌体制备方法、反应方法、反应溶液组成、分析方法如下所示。
[菌体的制备方法]
在LB培养基平板上均匀涂布MG1655ΔushAΔaphAΔpurAΔpurRΔadd/pUC18-guaBA株,37℃培养过夜。第二天,将1/32平板量的菌体接菌在装有20mlLB培养基的500ml容量坂口烧瓶中,37℃培养过夜。将600mlLB培养液经离心后而得的菌体用于60ml的反应溶液。
[反应方法]
用药匙刮取前述的来自600mlLB的经培养后的菌体,将其接种于后述的反应液60ml中,开始反应。反应于42℃在通过添加氢氧化钠维持pH为7.2的条件下实施。
[反应溶液组成]
50mMIMP或50mMXMP
50g/L葡萄糖
9.2g/L六偏磷酸钠
5g/LMgSO4·7H2O
6.6g/L(NH4)2SO4
10g/LKH2PO4
5ml/L二甲苯
[分析方法]
随时间取样反应液500μl,用NaOH稀释,从而终止反应。所得溶液过滤,取300μl滤液用于HPLC分析。分析条件如下。
柱:AsahipakGS-220(直径7.6mm,50cm),2根相连
洗脱液:0.2MNaH2PO4(pH3.98)
温度:55℃
流速:1ml/分钟
检测:紫外线(254nm)吸收
结果如图4所示。显示与以XMP作为基质的反应相比,以IMP作为基质的反应中GMP的生成速度更快。
工业实用性
根据本发明,能够高效率地生产作为调味料、医药及其原料而有用的GMP。
〔序列表说明〕
SEQIDNO:1:大肠杆菌GMP合成酶(GMPS)基因(guaA)碱基序列
SEQIDNO:2:大肠杆菌GMPS氨基酸序列
SEQIDNO:3:枯草芽孢杆菌GMPS基因(guaA)碱基序列
SEQIDNO:4:枯草芽孢杆菌GMPS氨基酸序列
SEQIDNO:5:谷氨酸棒杆菌GMPS基因(guaA)碱基序列
SEQIDNO:6:谷氨酸棒杆菌GMPS氨基酸序列
SEQIDNO:7:产氨棒杆菌GMPS基因(guaA)碱基序列
SEQIDNO:8:产氨棒杆菌GMPS氨基酸序列
SEQIDNO:9:大肠杆菌IMP脱氢酶(IMPDH)基因(guaB)碱基序列
SEQIDNO:10:大肠杆菌IMPDH氨基酸序列
SEQIDNO:11:枯草芽孢杆菌IMPDH基因(guaB)碱基序列
SEQIDNO:12:枯草芽孢杆菌IMPDH氨基酸序列
SEQIDNO:13:谷氨酸棒杆菌IMPDH基因(guaB)碱基序列
SEQIDNO:14:谷氨酸棒杆菌IMPDH氨基酸序列
SEQIDNO:15:产氨棒杆菌IMPDH基因(guaB)碱基序列
SEQIDNO:16:产氨棒杆菌IMPDH氨基酸序列
SEQIDNO:17:大肠杆菌purR碱基序列
SEQIDNO:18:大肠杆菌PurR氨基酸序列
SEQIDNO:19:大肠杆菌purR克隆用引物序列
SEQIDNO:20:大肠杆菌purR克隆用引物序列
SEQIDNO:21:大肠杆菌ushA碱基序列
SEQIDNO:22:大肠杆菌UshA氨基酸序列
SEQIDNO:23:大肠杆菌aphA碱基序列
SEQIDNO:24:大肠杆菌AphA氨基酸序列
SEQIDNO:25:大肠杆菌ushA基因破坏用引物序列
SEQIDNO:26:大肠杆菌ushA基因破坏用引物序列
SEQIDNO:27:大肠杆菌aphA基因破坏用引物序列
SEQIDNO:28:大肠杆菌aphA基因破坏用引物序列
SEQIDNO:29:大肠杆菌purR基因破坏用引物序列
SEQIDNO:30:大肠杆菌purR基因破坏用引物序列
SEQIDNO:31:大肠杆菌guaBA克隆引物序列
SEQIDNO:32:大肠杆菌guaBA克隆引物序列
SEQIDNO:33:大肠杆菌purA碱基序列
SEQIDNO:34:大肠杆菌PurA氨基酸序列
SEQIDNO:35:大肠杆菌purA基因破坏用引物序列
SEQIDNO:36:大肠杆菌purA基因破坏用引物序列
SEQIDNO:37:大肠杆菌add碱基序列
SEQIDNO:38:大肠杆菌Add氨基酸序列
SEQIDNO:39:大肠杆菌add基因破坏用引物序列
SEQIDNO:40:大肠杆菌add基因破坏用引物序列
SEQIDNO:41:大肠杆菌nagD碱基序列
SEQIDNO:42:大肠杆菌NagD氨基酸序列
SEQIDNO:43:大肠杆菌nagD基因破坏用引物序列
SEQIDNO:44:大肠杆菌nagD基因破坏用引物序列
Claims (4)
1.一种生产5’-鸟苷酸的方法,该方法包括:
在反应液中使肌苷酸与具有将肌苷酸转化为5’-鸟苷酸的能力的微生物进行反应从而生成5’-鸟苷酸,其中通过向反应液中添加有机溶剂来激活核苷酸的微生物细胞透过性,和
收集5’-鸟苷酸,
其中所述微生物经过修饰而增强了肌苷酸脱氢酶活性和5’-鸟苷酸合成酶活性,其中所述微生物还经过修饰而使得
1)ushA基因和aphA基因被破坏,
2)选自purR基因、add基因和purA基因中的一种或多种基因被破坏,和
3)nagD基因被破坏,其中所述微生物是大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述肌苷酸脱氢酶活性和5’-鸟苷酸合成酶活性是通过增加guaB基因和guaA基因的表达而增强的。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述guaA基因编码SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。
4.根据权利要求2所述的方法,其中,所述guaB基因编码SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的蛋白质。
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