CN101432418B

CN101432418B - 能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法

Info

Publication number: CN101432418B
Application number: CN200780014925XA
Authority: CN
Inventors: 浅原贵之; 松野洁; 森由起子
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2006-04-24
Filing date: 2007-04-17
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2027-04-17
Also published as: KR101173533B1; US20100047874A1; JPWO2007125783A1; BRPI0709635A2; EP2011861A8; WO2007125783A1; CN101432418A; EP2011861A4; EP2011861A1; JP5251505B2; KR20090005392A; US8236531B2

Abstract

嘌呤物质可如下生产：在培养基中培养芽孢杆菌属的细菌，其能够产生嘌呤物质且具有减少的转醛醇酶的酶活性从而在培养基或细菌的细胞中产生并积累嘌呤物质，和从所述培养基或细胞中收集嘌呤物质。

Description

能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法

技术领域

本发明涉及用于产生嘌呤衍生物质的方法，所述嘌呤衍生物质如嘌呤核苷酸(其通常包括5′-肌苷酸和5′-鸟苷酸)和嘌呤核苷(如肌苷和鸟苷)，它们作为合成嘌呤核苷酸的起始材料是重要的物质，等等，以及用于所述方法的属于芽孢杆菌属的细菌。嘌呤衍生物质用作调味品(seasoning)、药物(drug)、它们的原料等。

背景技术

已知通过发酵来产生肌苷和鸟苷的方法，其使用芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的腺嘌呤营养缺陷型菌株和其进一步被赋予对多种药物(如嘌呤类似物)的抗性的衍生株(derivative)(专利文件1至8)，和短杆菌属(genus Brevibacterium)这样的微生物(专利文件9和10、非专利文件1)，等。

通常通过如下获得这样的突变菌株：用紫外照射或亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理微生物，和使用合适的选择培养基选择目标突变体。

此外，还使用遗传工程技术在芽孢杆菌属细菌(专利文件11至20)、短杆菌属细菌(专利文件21)和埃希氏菌属(Escherichia)细菌(专利文件22)中培育产生嘌呤衍生物质的菌株。具体地，例如，公开了用芽孢杆菌属细菌有效地产生核酸衍生化合物如次黄嘌呤(hypoxanthine)、尿嘧啶(uracil)、鸟嘌呤(guanine)和腺嘌呤(adenine)的方法，所述细菌中将编码嘌呤操纵子阻抑物的基因(purR)破坏(专利文件23)。

在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中，已知如上所述的嘌呤操纵子阻抑物调节，除嘌呤操纵子(purine operon)的基因之外，purA基因，其涉及AMP生物合成(非专利文件2)；glyA基因，其涉及甲酰四氢叶酸(formyltetrahydrofolicacid)生物合成(非专利文件3)；pbuG基因，其编码次黄嘌呤/鸟嘌呤的转运物(transporter)(非专利文件4)；等。

此外，已公开了有效产生肌苷的微生物和使用该微生物产生肌苷的方法，所述微生物是通过除破坏purR基因之外破坏琥珀酰-AMP合酶基因(purA)来赋予腺嘌呤营养缺陷型，和通过破坏嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)来抑制肌苷分解成次黄嘌呤，从而衍生的(专利文件8)。

转醛醇酶是戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway)的酶中的一种，其催化由景天庚酮糖-7-磷酸(sedoheptulose-7-phosphate)和D-甘油醛-3-磷酸(D-glyceraldehyde-3-phosphate)产生D-赤藓糖-4-磷酸(D-erythrose-4-phosphate)和D-果糖-6-磷酸(D-fructose-6-phosphate)的可逆反应。关于此酶和嘌呤衍生物质的生物合成途径之间的关系只知晓很少，且已尝试通过降低此酶的活性来培育产生嘌呤衍生物质的细菌。

专利文件1：特公昭(KOKOKU)No.38-23099

专利文件2：特公昭No.54-17033

专利文件3：特公昭No.55-2956

专利文件4：特公昭No.55-45199

专利文件5：特公昭No.57-14160

专利文件6：特公昭No.57-41915

专利文件7：特开昭(KOKAI)No.59-42895

专利文件8：特开No.2004-242610

专利文件9：特公昭No.51-5075

专利文件10：特公昭No.58-17592

专利文件11：特开昭No.58-158197

专利文件12：特开昭No.58-175493

专利文件13：特开昭No.59-28470

专利文件14：特开昭No.60-156388

专利文件15：特开平No.1-27477

专利文件16：特开平No.1-174385

专利文件17：特开平No.3-58787

专利文件18：特开平No.3-164185

专利文件19：特开平No.5-84067

专利文件20：特开平No.5-192164

专利文件21：特开昭No.63-248394

专利文件22：国际专利公开WO99/03988

专利文件23：美国专利No.6,284,495

非专利文件1：Agric.Biol.Chem.，1978，42，399-405

非专利文件2：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，7455-7459

非专利文件3：J.Bacteriol.，2001，183，6175-6183

非专利文件4：J.Bacteriol.，2003，185，5200-5209

发明内容

待通过本发明实现的目的

本发明的目的是构建适用于发酵产生嘌呤衍生物质(如嘌呤核苷和/或嘌呤核苷酸)的芽孢杆菌属细菌，和提供使用这样的细菌产生嘌呤衍生物质的方法。

实现所述目的的手段

本发明的发明人进行了多项研究以实现上述目的。结果，他们发现如果在芽孢杆菌属细菌中减少戊糖磷酸途径的转醛醇酶的酶活性，则该细菌产生嘌呤核苷或嘌呤核苷酸的能力得到改进，并完成了本发明。

由此本发明提供如下。

(1)属于芽孢杆菌属的细菌，其具有产生嘌呤衍生物质的能力，其中所述细菌已被修饰使得转醛醇酶的酶活性减少。

(2)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种嘌呤核苷：肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

(3)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种嘌呤核苷酸：肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

(4)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中通过破坏编码转醛醇酶的基因或减少编码转醛醇酶的基因的表达量来减少所述转醛醇酶活性。

(5)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中编码转醛醇酶的基因是编码下列(A)或(B)的蛋白质的基因：

(A)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，

(B)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的蛋白质，其包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位并具有转醛醇酶活性。

(6)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得磷酸核糖焦磷酸合成酶活性增加。

(7)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得嘌呤操纵子的表达量增加。

(8)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其中通过破坏purR基因或缺失嘌呤操纵子的弱化子区的部分来增加嘌呤操纵子的表达量，所述purR基因是编码嘌呤操纵子的阻抑物的基因。

(9)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得嘌呤核苷磷酸化酶活性减少。

(10)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得果糖二磷酸酶活性减少。

(11)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其已被进一步修饰使得IMP脱氢酶活性减少。

(12)如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌，其为枯草芽孢杆菌。

(13)产生嘌呤衍生物质的方法，其包括在培养基中培养如上所述的属于芽孢杆菌属的细菌以在细菌的细胞或培养基中引起嘌呤衍生物质的积累，和从所述细胞或培养基中收集所述嘌呤衍生物质。

(14)如上所述的方法，其中所述嘌呤衍生物质是嘌呤核苷或嘌呤核苷酸。

(15)如上所述的方法，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种嘌呤核苷：肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

(16)如上所述的方法，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种嘌呤核苷酸：肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

(17)产生嘌呤核苷酸的方法，其包括通过如上所述的方法产生嘌呤核苷，将所述嘌呤核苷与磷酸盐供体，及微生物或酸性磷酸酶进行反应以产生嘌呤核苷酸，所述磷酸盐供体是选自下组的一种或多种：聚磷酸(polyphosphoricacid)、磷酸苯酯(phenyl phosphate)和氨甲酰磷酸(carbamyl phosphate)，所述微生物具有产生核苷-5′-磷酸酯的能力，和收集所述嘌呤核苷酸。

实施本发明的最佳方式

<1>本发明的芽孢杆菌属细菌

(I)赋予产生嘌呤衍生物质的能力

本发明的芽孢杆菌属细菌是具有产生嘌呤衍生物质的能力且已被修饰使得转醛醇酶的酶活性减少的芽孢杆菌属细菌。

术语“嘌呤衍生物质”(purine-derived substance)指具有嘌呤骨架(purineskeleton)的物质，且其实例包括嘌呤核苷、嘌呤核苷酸，等。嘌呤核苷包括肌苷、黄苷、鸟苷、腺苷等，而嘌呤核苷酸包括嘌呤核苷的5′-磷酸酯，例如，肌苷酸(肌苷-5′-磷酸，此后也称为″IMP″)、黄苷酸(黄苷-5′-磷酸，此后也称为″XMP″)、鸟苷酸(鸟苷-5′-单磷酸，此后也称为″GMP″)、腺苷酸(腺苷-5′-单磷酸，此后也称为″AMP″)，等。

短语“产生嘌呤衍生物质的能力”指本发明的芽孢杆菌属细菌在培养基中培养时，所述细菌在细菌细胞或培养基中产生、分泌嘌呤衍生物质或引起嘌呤衍生物质积累，其程度使得可从细胞或培养基中收集所述嘌呤衍生物质的能力。本发明的芽孢杆菌属细菌可具有产生两种或更多种前述嘌呤衍生物质的能力。

具有产生嘌呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌可为内在具有产生嘌呤衍生物质的能力的细菌，或通过如下方法可得到的细菌：使用诱变方法或重组DNA技术修饰如下所述的芽孢杆菌属细菌使得它们具有产生嘌呤衍生物质的能力。而且，它可为赋予了产生嘌呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌或以如稍后描述的方式通过修饰所述细菌使得转醛醇酶的酶活性减少来增强其产生嘌呤衍生物质的能力的细菌。

在本发明中，短语“酶活性减少”包括上述转醛醇酶或稍后描述的分解嘌呤衍生物质的酶(如肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶)等的酶活性低于在未修饰的菌株，例如芽孢杆菌属细菌的野生型菌株中的酶活性的状态，和所述活性基本上消除的状态。这也适用于稍后描述的嘌呤操纵子阻抑物的活性。

用于获得本发明的芽孢杆菌属细菌的芽孢杆菌属细菌的实例包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)等。

枯草芽孢杆菌的实例包括枯草芽孢杆菌168Marburg(ATCC6051)、枯草芽孢杆菌PY79(Plasmid，1984，12，1-9)等，而解淀粉芽孢杆菌的实例包括解淀粉芽孢杆菌T(ATCC23842)、解淀粉芽孢杆菌N(ATCC23845)等。短小芽孢杆菌的实例包括短小芽孢杆菌Gottheil No.3218(ATCC No.21005，美国专利No.3,616,206)，等。这些菌株可由美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)(地址：P.O.Box1549，Manassas，VA20108，United States ofAmerica)获得。

可通过如下获得具有产生嘌呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌：将例如，嘌呤核苷营养缺陷型或对药物(如嘌呤类似物)的抗性赋予如上所述的芽孢杆菌属细菌(特公昭Nos.38-23099，54-17033，55-45199，57-14160，57-41915和59-42895)。可通过如下获得具有营养缺陷型或药物抗性的芽孢杆菌属细菌：以用于常规诱变处理的诱变剂(mutagen)，如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或EMS(甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate))处理细菌。

产生嘌呤核苷的芽孢杆菌属细菌的实例包括如下。

作为属于芽孢杆菌属的产生肌苷的菌株的具体实例，可使用枯草芽孢杆菌KMBS16菌株。该菌株源自已知的枯草芽孢杆菌trpC2菌株(168Marburg)，其中破坏了编码嘌呤操纵子阻抑物的purR基因(purR::spc)、编码琥珀酰-AMP合酶的purA基因(purA::erm)、和编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD基因(deoD::kan)(特开昭No.2004-242610，US2004166575A1)。还可使用枯草芽孢杆菌AJ3772菌株(FERM P-2555，特开昭No.62-014794)等。

具有产生鸟苷的能力的芽孢杆菌属细菌的实例包括具有增加的IMP脱氢酶活性的芽孢杆菌属细菌(特开昭No.3-58787)、通过将包含如下基因的载体导入腺嘌呤营养缺陷的突变体而获得的芽孢杆菌属细菌，所述基因赋予对嘌呤类似物或德夸菌素(decoyinine)的抗性(特公昭No.4-28357)，等。

产生嘌呤核苷酸的芽孢杆菌属细菌的实例包括如下。

作为产生肌苷酸的芽孢杆菌属细菌，已报道了枯草芽孢杆菌的产生肌苷的菌株，其具有减弱的磷酸酶活性(Uchida，K.等，Agr.Biol.Chem.，1961，25，804-805；Fujimoto，M.，Uchida，K.，Agr.Biol.Chem.，1965，29，249-259)。产生鸟苷酸的芽孢杆菌属细菌的实例包括芽孢杆菌属细菌的如下突变体，其具有腺嘌呤营养缺陷型、对德夸菌素或蛋氨酸亚砜(methionine sulfoxide)的抗性和产生5′-鸟苷酸(鸟苷-5′-单磷酸，此后称为″GMP″)的能力(特公昭No.56-12438)。

此外，可通过用于培育棒状杆菌型细菌(其典型实例为产氨棒杆菌(Corynebacterium ammoniagenes))的方法构建产生黄苷酸的细菌。例如，可通过获得PRPP酰胺转移酶增强的菌株(特开昭No.8-168383)、脂肪族氨基酸抗性菌株(特开昭No.4-262790)或脱氢脯氨酸(dehydroproline)抗性菌株(韩国专利Unexamined Publication No.2003-56490)来构建产生黄苷酸的细菌。

而且，用于培育具有产生嘌呤衍生物质的能力的芽孢杆菌属细菌的方法实例还包括增强涉及嘌呤生物合成的酶的活性，所述酶是在细菌细胞中嘌呤核苷和嘌呤核苷酸的生物合成所共有的，即，嘌呤生物合成酶。细胞中所述酶的活性优选增加至大于芽孢杆菌属细菌的未修饰菌株(例如，野生型芽孢杆菌属细菌)的酶活性的水平。短语“活性增加”包括，例如，每个细胞的酶分子的数目增加的情况，和每个酶分子的比活性增加的情况，等。例如，可通过增加酶的基因的表达量来增加活性。

涉及嘌呤生物合成的酶的实例包括，例如，磷酸核糖基焦磷酸酰胺转移酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶(PRPP合成酶[EC：2.7.6.1])，等。

通过糖源(如流入戊糖磷酸途径的葡萄糖)的代谢产生的一些代谢物经由核酮糖-5-磷酸(ribulose-5-phosphate)转变为核糖-5-磷酸。由生物合成的核糖-5-磷酸，产生磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，其是用于嘌呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成不可缺少的前体。具体地，核糖-5-磷酸通过磷酸核糖焦磷酸合成酶转变为PRPP。因此，可通过修饰以使其磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加将产生嘌呤衍生物质的能力赋予芽孢杆菌属细菌。

短语“磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加”指磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性与未修饰的菌株如野生型菌株或亲本菌株的活性相比增加。可通过例如，Switzer等(Methods Enzymol.，1978，51，3-11)或Roth等(Methods Enzymol.，1978，51，12-17)的方法测量磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性。可通过如下方法来产生磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性增加的芽孢杆菌属细菌，例如，根据使用含有基因的质粒或将基因整合入染色体的方法在芽孢杆菌属细菌中增加编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因的表达，其可以以与在特开昭No.2004-242610所述方法相同的方式进行。尽管源自芽孢杆菌属细菌的SEQ ID NO：3的prs基因(Genbank登录号X16518)可作为可用于本发明的编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因提及，但可以使用源自其它细菌、动物或植物的编码具有磷酸核糖焦磷酸合成酶活性的蛋白质的任何基因。

此外，当用于嘌呤核苷、组氨酸和色氨酸生物合成所不可缺少的前体PRPP一旦产生时，其中一些通过涉及嘌呤生物合成的酶转变为嘌呤核苷酸和嘌呤核苷。编码这些酶的基因的实例包括来自枯草芽孢杆菌的嘌呤操纵子的基因，具体地，purEKB-purC(orf)QLF-purMNH(J)-purD操纵子的基因(EbboleD.J.和Zalkin H.，J.Biol.Chem.，1987，262，17，8274-87)(目前，也称为purEKBCSQLFMNHD，Bacillus subtilis and Its Closest Relatives，主编：A.LSonenshein，ASM Press，Washington D.C.，2002，Genbank登录号NC_000964)，和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的pur调节子的基因(Escherichia andSalmonella，第二版，主编：F.C.Neidhardt，ASM Press，Washington D.C.，1996)。

因此，增强这些基因的表达赋予或增强产生嘌呤衍生物质的能力。此外，可用于本发明的嘌呤操纵子的基因不限于这些，并且还可使用源自其它微生物、动物和植物的基因。

用于增加嘌呤操纵子的表达量的方法的实例包括通过使用含有基因的质粒或将基因整合入染色体等的方法在芽孢杆菌属细菌中增加嘌呤操纵子的基因的表达。

用于增加嘌呤操纵子的表达量的第二种方法包括用更强的启动子代替嘌呤操纵子的启动子，和用共有序列代替天然启动子的-35或-10区。

例如，在枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，ATCC6051)中，嘌呤操纵子的-35序列是共有序列(TTGACA)，但-10序列是TAAGAT，其不同于共有序列TATAAT(Ebbole，D.J.和H.Zalikn，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287)。因此，通过将-10序列(TAAGAT)改变为类似的共有序列TATAAT、TATGAT或TAAAAT，可增加嘌呤操纵子的转录活性。可通过下述与基因取代的方法相同的方法代替启动子序列。

用于增加嘌呤操纵子的表达量的第三种方法包括降低嘌呤操纵子阻抑物的表达量(美国专利No.6,284,495)。短语“嘌呤操纵子阻抑物的表达”包括嘌呤操纵子基因的转录和转录产物的翻译二者。此外，“表达量减少”包括表达量低于未修饰的菌株如野生型芽孢杆菌属细菌中的表达量的情况，和表达已基本上消除的情况。

可通过如下方法来减少嘌呤操纵子阻抑物(嘌呤阻抑物)的表达量：例如，可采用以紫外线照射或用于常规诱变处理的诱变剂如NTG或EMS处理芽孢杆菌属细菌并选择显示嘌呤阻抑物的表达量减少的突变体。

此外，显示嘌呤阻抑物的表达量减少的芽孢杆菌属细菌也可通过如下方法获得：例如，除诱变处理之外，通过使用基因重组技术的同源重组用相应的不正常发挥功能的基因(此后，也称为“破坏型基因”)代替在染色体上编码嘌呤阻抑物的基因(purR，GenBank登录号NC_000964，编码区对应于核苷酸号54439至55293，SEQ ID NO：5)(Experiments in Molecular Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1972)；Matsuyama，S.和Mizushima，S.，J.Bacteriol.，1985，162，1196-1202)。

例如，可用破坏型基因以如下所述的方式代替宿主染色体上的正常基因。在下文中，解释了purR基因的破坏。可类似地破坏其它基因，如purA、deoD、guaB、fbp和ywjH基因。

将具有与染色体上的序列同源的序列且不能在芽孢杆菌属细菌的细胞中复制的质粒等导入细胞中时，导致在具有同源性的序列的位点以一定频率的重组。然后将整个质粒重组入染色体中。其后，如果重组又在染色体上具有同源性的序列的位点发生，则将质粒从染色体中去除。此时，依赖于重组发生的位点，可将破坏型基因保留在染色体上，且可将原始的正常基因与质粒一起从染色体去除。通过选择这样的菌株，可能获得其染色体上正常的purR基因已被破坏型purR基因代替的菌株。

已经建立了这样的基于同源重组的基因破坏技术，且其包括使用线性DNA的方法、使用温度敏感型质粒的方法等。此外，还可通过使用如下质粒来破坏purR基因，所述质粒含有其中已插入标记基因(如药物抗性基因)的purR基因且其不能在目标细菌细胞中复制。即，在已用如上所述的质粒转化的转化体中，将标记基因并入染色体DNA并赋予药物抗性。由于通过将质粒上把标记基因夹在中间的purR基因序列与染色体上的purR基因进行同源重组将标记基因以高比率(high rate)并入染色体，因此可有效地选择purR基因破坏的菌株。

可通过如下获得用于基因破坏的破坏型purR基因：具体地，通过用限制酶消化和再连接(re-ligation)来缺失purR基因的某个区域，将另一个DNA片段(标记基因等)插入purR基因中，或在purR基因的编码区、启动子区等的核苷酸序列中引起一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、添加或倒位，其通过位点特异性诱变(Kramer，W.和Frits，H.J.，Methods in Enzymology，1987，154，350-367)或通过重组PCR(PCR Technology，Stockton Press(1989))或通过用化学试剂(如硫代硫酸钠(sodium hyposulfite)或羟胺(hydroxylamine))处理(Shortle，D.和Nathans，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1978，75，2170-2174)来进行，然后是选择其中由purR基因编码的阻抑物的活性减少或基因的转录减少的菌株。在这些方法中，考虑到可靠性和稳定性，通过用限制酶消化和再连接来缺失purR基因的某个区域或另一个DNA片段插入purR基因中是优选的。purR基因的待缺失的某个区域可为purR基因的5′端序列、内部序列或3′端序列。然而，如果该区域占purR基因全长的90％以上，更优选95％以上，特别是97％以上，则阻抑物活性降低的确定性增加。此外，当purR基因的编码区中核苷酸的缺失或插入引起移码突变时，考虑到确定地降低阻抑物活性，优选的是引起核苷酸在多个位点的缺失或插入和引起核苷酸在3’端侧上的缺失或插入。

也可通过如下得到嘌呤阻抑物活性的降低：除前述的基因破坏之外，基于常规的诱变方法将降低胞内嘌呤阻抑物活性的突变导入染色体上的purR基因。例如，可通过导入氨基酸取代(错义突变)、终止密码子(无义突变)或添加或缺失一个或两个核苷酸的移码突变，或通过部分地或全部地缺失基因来得到。此外，也可通过将转座子插入染色体上的purR基因来减少阻抑物的活性。

还可通过如下得到嘌呤阻抑物活性的降低：用较弱的表达控制序列代替purR基因的表达控制序列，如染色体DNA上的启动子。通过RNA合成的起始(initiation)的频率来定义启动子的强度。Goldstein等的文章(Prokaryoticpromoters in biotechnology，Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中描述了用于评价启动子强度的方法及强启动子的实例。此外，还可能在目标基因的启动子区域中导入几个核苷酸的核苷酸取代，并由此修饰待弱化的(to beweakened)启动子，如国际专利公开WO00/18935中所披露的。此外，已知核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区(spacer)，尤其是起始密码子紧邻上游的序列中几个核苷酸的取代极大地影响了mRNA的翻译效率。可将RBS的此修饰与减少目标基因的转录进行组合。

此外，可制备重组DNA并将其转化入宿主芽孢杆菌属细菌，在所述重组DNA中导入使由purR基因转录的信使RNA不稳定的突变。

也可以与上述相同的方式减少由稍后描述的purA、deoD、guaB、fbp和ywjH基因编码的酶的活性。

可使用基于purR基因的已知核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物通过PCR由具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA获得purR基因。还可使用基于purR基因的已知核苷酸序列制备的寡核苷酸作为探针通过杂交由具有嘌呤操纵子的微生物的染色体DNA文库获得purR基因。已报道了枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的purR基因的核苷酸序列(GenBank登录号D26185(编码区对应于核苷酸号118041至118898)，或NC_000964(编码区对应于核苷酸号54439至55296))。purR基因的核苷酸序列和由该基因编码的氨基酸序列示于序列表的SEQ ID NOS：5和6(特开昭No.2004-242610)。

用于获得purR基因的用于PCR的引物可为能够扩增purR基因的部分或全长的任何引物，而具体实例包括具有示于SEQ ID NO：17(GAAGTTGATGATCAAAA)和SEQ ID NO：18(ACATATTGTTGACGATAAT)的核苷酸序列的寡核苷酸。

用于制备破坏型基因的purR基因不一定需要是全长purR基因，而它可具有引起基因破坏所需的长度。而且，对用于获得各个基因的微生物没有特别的限制，只要微生物中的基因具有与用于构建基因破坏菌株的芽孢杆菌属细菌的purR基因的同源性，其程度使得它们引起同源重组。然而，通常优选使用源于与目的芽孢杆菌属细菌相同的芽孢杆菌属细菌中的基因。

上述标记基因的实例包括药物抗性基因，如大观霉素(spectinomycin)抗性基因、卡那霉素抗性基因和四环素抗性基因。可通过由大肠杆菌ECE101菌株(从芽孢杆菌属遗传原种中心(Bacillus Genetic Stock Center)(BGSC)商业上可得到的)制备质粒pDG1726并从质粒中作为盒(as a cassette)去除抗性基因来获得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的大观霉素抗性基因。可通过由大肠杆菌ECE91菌株(从芽孢杆菌属遗传原种中心(BGSC)商业上可得到的)制备质粒pDG646并从质粒中作为盒去除抗性基因来获得金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的红霉素抗性基因。可通过由大肠杆菌ECE94菌株(从芽孢杆菌属遗传原种中心(BGSC)商业上可得到的)制备质粒pDG783并从质粒中作为盒去除抗性基因来获得源自粪链球菌(Streptococcus faecalis)的卡那霉素抗性基因。此外，可通过由枯草芽孢杆菌1E17菌株(从芽孢杆菌属遗传原种中心(BGSC)商业上可得到的)制备质粒pC194并使用该质粒作为模板进行PCR以扩增该质粒来获得金黄色葡萄球菌的氯霉素抗性基因。可通过由大肠杆菌ECE99菌株制备质粒pDG1513并从质粒中作为盒去除抗性基因来获得无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的四环素抗性基因(Gene，1995，167:335-336)。

将药物抗性基因用作标记基因时，可通过如下来获得purR基因破坏的菌株：将药物抗性基因在适当的位点插入质粒中的purR基因，用得到的质粒转化微生物和选择变成药物抗性的转化体。可通过使用Southern印迹或PCR分析染色体上的标记基因或purR基因来确认染色体上的purR基因的破坏。可使用能够扩增这些基因的引物通过PCR来确认将前述的大观霉素抗性基因、红霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因并入染色体DNA。

还已知通过位于启动子下游的终止子-抗终止子(terminator-antiterminator)序列(此后称为弱化子(attenuator)序列)调节嘌呤操纵子的表达(Ebbole，D.J.和Zalkin，H.，J.Biol.Chem.，1987，262，8274-8287；Ebbole D.J.和Zalkin H.，J.Biol.Chem.，1988，263，10894-10902；Ebbole，D.J.和Zalkin，H.，J.Bacteriol.，1989，171，2136-2141)。因此，可通过将弱化子序列缺失来增加嘌呤操纵子的表达量。可通过与用于破坏purR的方法相同的方法得到弱化子序列的缺失。

为了进一步增加嘌呤操纵子的转录，可将上述方法进行组合。例如，可将purR基因破坏，并进一步，可使用质粒扩增其中弱化子序列缺失的嘌呤操纵子或可将这样的嘌呤操纵子的多个拷贝导入染色体。

也可通过如下方法来增强涉及嘌呤生物合成的酶的活性：使涉及嘌呤生物合成的酶对其调节脱敏，例如，根据使酶对反馈抑制脱敏的前述方法(WO99/03988)进行。

此外，还可通过减弱细胞对嘌呤衍生物质的摄取来增强产生嘌呤衍生物质的能力。例如，可通过将涉及细胞对嘌呤核苷的摄取的反应阻断来减弱细胞对嘌呤核苷的摄取。涉及细胞对嘌呤核苷的摄取的反应的实例包括通过核苷通透酶(nucleoside permease)催化的反应。

此外，当产生嘌呤核苷时，可减少分解嘌呤核苷的酶的活性以增强产生嘌呤核苷的能力。这样的酶的实例包括嘌呤核苷磷酸化酶。

将通过涉及嘌呤生物合成的酶由PRPP生物合成的嘌呤核苷酸脱磷酸化(dephosphorylate)并由此转变为嘌呤核苷。为了有效地引起嘌呤核苷的积累，优选降低嘌呤核苷磷酸化酶的活性，所述酶进一步将嘌呤核苷降解为次黄嘌呤等。即，优选减弱或消除利用嘌呤核苷(如肌苷)作为底物的嘌呤核苷磷酸化酶的活性。

具体地，可通过在芽孢杆菌属细菌中破坏编码嘌呤核苷磷酸化酶的deoD和pupG基因来减少嘌呤核苷磷酸化酶活性。可通过破坏deoD和pupG基因中的一种或两者来修饰本发明的芽孢杆菌属细菌。作为deoD和pupG基因，例如，可使用源自芽孢杆菌属细菌的那些基因(deoD：Genbank登录号NC_000964(SEQ ID NO：7)，pupG：Genbank登录号NC_000964(SEQ ID NO：9))，并且可以以与用于前述破坏purR基因相同的方式获得基因破坏的菌株。

也可通过减少琥珀酰-AMP合酶的活性来增强产生嘌呤衍生物质的能力。编码琥珀酰-AMP合酶的基因的实例包括purA基因。purA基因的实例包括，例如，具有登记为GenBank登录号NC_000964(编码区对应于互补链的核苷酸号4153460至4155749，SEQ ID NO：11)的核苷酸序列的那些。

也可通过减少肌苷单磷酸(IMP)脱氢酶的活性来增强产生嘌呤衍生物质的能力。编码IMP脱氢酶的基因的实例包括guaB基因。guaB基因的实例包括，例如，具有登记为GenBank登录号NC_000964(编码区对应于核苷酸号15913至17376，SEQ ID NO：13)的核苷酸序列的那些。

此外，还可通过减少果糖二磷酸酶的活性来增强产生嘌呤衍生物质的能力。编码果糖二磷酸酶的基因的实例包括fbp基因。fbp基因的实例包括，例如，具有登记为GenBank登录号NC_000964(编码区对应于核苷酸号4127053至4129065，SEQ ID NO：15)的核苷酸序列的那些。

而且，作为增强产生嘌呤衍生物质的能力的方法，可预期的是扩增编码如下蛋白质的基因，所述蛋白质具有分泌嘌呤衍生物质的活性。其中这样的基因已得到扩增的细菌的实例包括，其中rhtA基因得到扩增的芽孢杆菌属细菌(特开昭No.2003-219876)。

如上所述待破坏的purR、deoD、pupG、purA、guaB和fbp基因和其表达待增强的prs基因可为保守的变体，例如，编码分别具有SEQ ID NOS：6、8、10、12、14、16和4的氨基酸序列的蛋白质的DNA，其包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，且分别具有嘌呤阻抑物、嘌呤核苷磷酸化酶、琥珀酰-AMP合酶、IMP脱氢酶、果糖二磷酸酶或磷酸核糖焦磷酸合成酶的活性。前述术语“几个”所指的数目为，例如2至50，优选2至30，更优选2至10。

如上所述的氨基酸序列的这种变化通常是保守的变化，其保持蛋白质的活性。保守氨基酸取代的实例包括：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。

上述purR、deoD、pupG、purA、guaB和fbp基因和prs基因的保守变体的具体实例包括分别与具有SEQ ID NOS：5、7、9、11、13、15和3的核苷酸序列的DNA显示例如，70％以上，优选80％以上，更优选90％以上，特别优选95％以上的同源性的DNA。更具体地，保守变体的实例包括在严格条件下能够与具有与SEQ ID NOS：5、7、9、11、13、15和3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。严格条件的实例包括在60℃和1×SSC的盐浓度、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次，优选两次或三次的条件。

可通过BLAST检索、FASTA检索、CrustalW的计算方法等评价DNA的同源性。

BLAST(基本局部比对检索工具(basic local alignment search tool))是程序blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn和tblastx所使用的探索式的检索算法(heuristic search algorithm)，而且在使用Karlin、Samuel和Stephen F.Altschul的统计方法(″Methods for assessing the statistical significance of molecularsequence features by using general scoring schemes″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87:2264-68；″Applications and statistics for multiple high-scoring segmentsin molecular sequences″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90:5873-7)的基础上通过这些程序获得的结果被认为是显著的。W.R.Pearson描述了FASTA检索方法(″Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA″，Methods in Enzymology，1990183:63-98)。Thompson J.D.、Higgins D.G.和Gibson T.J.描述了Clustal W方法(″CLUSTAL W：Improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice″，Nucleic Acids Res.，1994，22:4673-4680)。

而且，用于制备破坏型基因的DNA也可为purR、deoD、pupG、purA或guaB基因的保守变体。

可以与稍后描述的用于编码转醛醇酶的基因相同的方式将目标基因并入芽孢杆菌属细菌的染色体DNA。

(II)用于减少转醛醇酶的酶活性的修饰

可通过如下获得本发明的芽孢杆菌属细菌：修饰具有产生嘌呤衍生物质的能力的菌株(如上述的那些)使得转醛醇酶的酶活性减少。对修饰的次序没有限制，且在修饰细菌使得其转醛醇酶的酶活性减少之后，可将产生嘌呤核苷酸的能力赋予细菌。

转醛醇酶是催化由景天庚酮糖-7-磷酸和D-甘油醛-3-磷酸可逆地产生D-赤藓糖-4-磷酸和D-果糖-6-磷酸的反应的酶，且此反应是戊糖磷酸途径的反应中的一个。“戊糖磷酸途径”指如下途径：其中将吸收入细胞中的葡萄糖通过葡萄糖激酶磷酸化以生物合成葡萄糖-6-磷酸，而葡萄糖-6-磷酸氧化转变为核糖-5-磷酸，和由通过差向异构酶、转酮醇酶(EC：2.2.1.1)和转醛醇酶(EC：2.2.1.2)的作用将丙糖、丁糖(tetrolose)、戊糖、己糖和庚糖的磷酸酯互相转换的可逆过程组成的途径。

可通过如下方法测量转醛醇酶的酶活性。例如，可通过用磷酸丙糖异构酶(phosphoglucoisomerase)将产生的D-甘油醛-3-磷酸转变为羟基丙酮磷酸并使用甘油-3-磷酸脱氢酶和NADH测量羟基丙酮磷酸来测量活性(Ochoa，T.和Horecker，B.L，1966，Methods Enzymol.，9，499-505)。

转醛醇酶的酶活性减少的这样的修饰可通过如下得到：例如，如上面用于破坏purR基因所说明的，通过同源重组用不正常发挥功能的相应基因(例如，通过将标记基因(如药物抗性基因)插入转醛醇酶基因所获得的破坏型基因)取代染色体上的转醛醇酶基因。此外，如用于purR基因所述，可通过常规诱变方法将降低胞内转醛醇酶的酶活性的突变导入染色体上的转醛醇酶基因。

枯草芽孢杆菌的转醛醇酶的实例包括由SEQ ID NO：2中所示的212个氨基酸残基组成的蛋白质，而且可将编码蛋白质的基因，优选具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因(ywjH基因，Genbank登录号NC_000964)用于修饰。ywjH基因存在于枯草芽孢杆菌染色体上的大约325°处。

编码转醛醇酶的基因还可像前述基因一样为ywjH基因的保守的变体。具体地，实例包括编码如下蛋白质的DNA，所述蛋白质具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列，包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并具有转醛醇酶的酶活性。实例还包括编码如下蛋白质的DNA，所述蛋白质与SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列显示50％以上，优选70％以上，更优选80％以上，特别优选90％以上，最优选95％以上的同源性，并具有转醛醇酶的酶活性。更具体地，实例包括在严格条件下能够与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。严格条件包括在60℃和1×SSC的盐浓度、0.1％SDS，优选60℃、0.1×SSC、0.1％SDS洗涤一次或多次，优选两次或三次的条件。

如上所述，这样的编码基本上与转醛醇酶相同的蛋白质的DNA可通过如下获得，例如，修饰编码所述酶的核苷酸序列使得特定部分的氨基酸残基通过位点特异性诱变进行取代、缺失、插入、添加或倒位。如上所述，也可通过常规已知的诱变处理获得这种修饰的DNA。诱变处理的实例包括体外处理DNA然后用羟胺诱变处理，和处理含有DNA的微生物如埃希氏菌属细菌然后用紫外照射或用于常规诱变处理的诱变剂(如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸)诱变处理。

例如，可使用芽孢杆菌属细菌的染色体DNA作为模板和基于目标基因的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物通过PCR方法(聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)，White，T.J.等，Trends Genet.，1989，5，185-189)获得目标基因。可通过，例如Saito和Miura的方法(H.Saito和K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，1963，72，619-629；Text for Bioengineering Experiments，Editedby the Society for Bioscience and Bioengineering，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)等由作为DNA供体的细菌制备染色体DNA。用于PCR的引物可基于芽孢杆菌属细菌的已知基因序列，或基于有关在其序列已知的其它细菌的基因中保守的区域的信息来制备。

用于将目标基因并入芽孢杆菌属细菌的染色体DNA的载体的实例包括具有温度敏感型复制起点的载体，如pHV1248(Prtit，M.-A.，等，J.Bacteriol.，1990，172，6736-6740)；用于大肠杆菌的载体，如pHSG398(Takara Shuzo)和pBluescript SK-(Stratagene)；等。

为了连接目的基因和携带在芽孢杆菌属细菌中发挥功能的标记物的载体以制备重组DNA，将载体用与目的基因的末端匹配的限制酶消化。通常使用连接酶如T4DNA连接酶进行连接。

为了将如上所述制备的重组DNA导入芽孢杆菌属细菌，可使用到目前为止已报道的任何公知的转化方法。实例包括，例如，由处于生长期的细胞制备感受态细胞，然后往其中导入DNA的方法(Dubunau D.和Davidoff-Abelson，R.，J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)和将宿主细胞制成可容易吸收(take up)重组DNA的原生质体或原生质球，然后将重组DNA导入DNA受体细胞的方法(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，1979，168，111-115)。

<2>用于产生嘌呤衍生物质的方法

本发明的芽孢杆菌属细菌有效地产生嘌呤衍生物质。因此，通过在适当的培养基中培养本发明的芽孢杆菌属细菌，可在细菌的细胞或培养基中产生并积累嘌呤衍生物质，如嘌呤核苷和嘌呤核苷酸。

至于用于本发明的培养基，可使用常规培养基以常规方式进行培养，所述培养基包含碳源、氮源和矿物盐以及有机痕量营养物如氨基酸和维生素，根据需要。可使用合成培养基或天然培养基。可使用任何种类的碳源和氮源，只要待培养的菌株可以使用它们。

作为碳源，使用糖如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、海藻糖、核糖、淀粉水解物和糖蜜，和醇如甘油和甘露醇，而且也可独立地使用或与其它碳源组合使用有机酸如葡糖酸、乙酸、柠檬酸、马来酸、富马酸和琥珀酸。

作为氮源，使用氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵、硝酸盐、有机氮如大豆水解物，等。

作为有机痕量营养物，使用氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含有这些物质的那些如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物等。当使用生长需要氨基酸等的营养缺陷型突变菌株时，需要补充所需的营养物。

作为矿物盐，使用磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等。

虽然培养条件可根据待使用的芽孢杆菌属细菌的类型而变化，但将枯草芽孢杆菌，例如，作为通气培养物培养，同时将发酵温度控制为20至50℃，将pH控制为4至9。在培养过程中当pH下降时，用碱如氨气中和培养基。在大约40小时至3天的如上所述方式的培养后，在培养基中积累嘌呤核苷。

培养完成后，可以常规的方式收集在培养基中积累的肌苷。例如，它可通过沉淀、离子交换层析等来分离。

此外，如果用于本发明的微生物缺少编码核苷酶或核苷酸酶的基因，则可积累相应的核苷或核苷酸。此外，如果赋予肌苷营养缺陷型，则可积累涉及其生物合成途径的相关物质或前体。

此外，通过将由本发明的方法制备的肌苷或鸟苷与嘌呤核苷磷酸化酶或磷酸核糖基转移酶反应，可获得5’-肌苷酸或5′-鸟苷酸。

而且，还可能通过使磷酸转移酶与嘌呤核苷反应将使用本发明的微生物产生的嘌呤核苷进行磷酸化以产生嘌呤核苷酸(核苷5′-磷酸酯)(特开昭No.2000-295996)。例如，可使用如下方法：使用埃希氏菌属细菌产生嘌呤核苷酸的方法，所述细菌中导入了编码大肠杆菌的肌苷鸟苷激酶的基因(WO91/08286)，和使用产氨棒杆菌产生嘌呤核苷酸的方法，所述细菌中导入了编码乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)的肌苷鸟苷激酶的基因(WO96/30501)。

而且，还可能通过将使用本发明的微生物产生的嘌呤核苷与磷酸盐供体，及微生物或酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)反应来产生嘌呤核苷酸(核苷5′-磷酸酯)，所述磷酸盐供体是选自下组的一种或多种：聚磷酸、磷酸苯酯和氨甲酰磷酸，所述微生物具有产生核苷5′-磷酸酯的能力。虽然对具有产生核苷5′-磷酸酯的能力的微生物没有特别的限制，只要选择了具有将嘌呤核苷转变为嘌呤核苷酸的能力的微生物，实例包括，例如，国际专利公开WO96/37603中披露的微生物。

而且，也可以使用蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)JCM1650、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)ATCC33105、植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)IFO14939(ATCC33531)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)IFO3318(ATCC8724)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)IFO14941(ATCC33257)、摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)IFO3168、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)IFO12010、产气肠杆菌IFO13534(ATCC13048)、河流色杆菌(Chromobacterium fluviatile)IAM13652、紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)IFO12614、拉氏西地西菌(Cedecea lapagei)JCM1684、戴氏西地西菌(Cedecea davisiae)JCM1685、奈氏西地西菌(Cedecea neteri)JCM5909、等，其公开于特开昭No.07-231793。

作为酸性磷酸酶，例如，可使用特开昭No.2002-000289中公开的酸性磷酸酶，而且可更优选地使用对核苷的亲和性增加的酸性磷酸酶(特开昭No.10-201481)、核苷酸酶活性减少的突变体酸性磷酸酶(WO96/37603)、磷酸酯水解活性减少的突变体酸性磷酸酶(特开昭No.2001-245676)等。

还可能通过将使用本发明的微生物产生的嘌呤核苷以化学方法进行磷酸化来获得嘌呤核苷酸(Bulletin of the Chemical Society of Japan，42，3505)。而且，还可以使用如下方法：通过将本发明的具有产生XMP的能力的微生物和使用微生物的ATP再生系统的XMP脱氨基酶(aminase)活性偶联来获得GMP的方法，和通过偶联肌苷激酶来获得IMP的方法(Biosci.Biotech.Biochem.，51，840(1997)；特开昭No.63-230094)。

通过本发明方法制备的用于前述嘌呤核苷酸制备的肌苷、鸟苷或嘌呤核苷可为纯化的产物或嘌呤核苷发酵液，或含有嘌呤核苷的粗产物。

实施例

此后，将参考实施例更具体地说明本发明。

实施例1

<构建在编码嘌呤核苷磷酸化酶的pupG和deoD基因中有缺陷的细菌菌株>

如下所述，由重组菌株KMBS310构建在嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)中有缺陷的菌株。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，ATCC6051)的KMBS310菌株(日本专利申请No.2005-280186)在嘌呤操纵子阻抑物基因(purR)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)中有缺陷，并具有减弱的IMP脱氢酶基因(guaB)，其中对PRPP合成酶基因(prs)的SD序列和嘌呤操纵子启动子区进行修饰(日本专利申请No.2005-280186)。通过分别修饰启动子区和SD序列增强了嘌呤操纵子和PRPP合成酶基因的表达。

将通过Fouet和Sonenshein的方法(J.Bacteriol.，1990，172，835-844)由KMBS16菌株(purR::spc purA::erm deoD::kan，特开昭No.2004-242610)制备的基因组DNA用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的感受态细胞，并获得在含有5μg/ml卡那霉素的LB琼脂平板上生长的菌落。从获得的菌落中选择未变成大观霉素抗性也不是红霉素抗性的菌落，并将它们之中的一个菌株命名为KMBS5(deoD::kan)。

将通过Fouet和Sonenshein的方法(J.Bacteriol.，1990，172，835-844)由KMBS5制备的基因组DNA用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的KMBS310菌株的感受态细胞，并获得在含有5μg/ml卡那霉素和20μg/ml鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从如上所述获得的菌落中选择几个菌落，并将一个转化体命名为KMBS321，所述转化体中可以证实用deoD::kan取代野生型deoD基因，且源自KMBS310的所有突变未被野生型序列代替。

实施例2

<构建在编码果糖二磷酸酶的fbp基因和编码转醛醇酶的ywjH基因的任一个或两者中有缺陷的细菌菌株、其培养及评价>

(1)制备fbp基因缺陷的菌株

如下所述，由前述的重组菌株KMBS321构建在果糖二磷酸酶基因(fbp)中有缺陷的菌株。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，ATCC6051)的KMBS321菌株在嘌呤操纵子阻抑物基因(purR)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)中有缺陷，并具有减弱的IMP脱氢酶基因(guaB)，其中对PRPP合成酶基因(prs)的SD序列和嘌呤操纵子启动子区进行修饰。

(i)通过PCR扩增fbp上游区

基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC_000964和V01277)制备具有如下核苷酸序列的28聚物(28-mer)和50聚物(50-mer)PCR引物。

TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA(SEQ ID NO：19)

cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA(SEQ ID NO：20，以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(cat)的启动子上游区)

使用枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的染色体DNA作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃1.5分钟，30个循环，Gene AmpPCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有fbp基因5’端区和大约1350bp上游区的扩增片段。

(ii)通过PCR扩增fbp下游区

基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC_000964和V01277)制备具有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和27聚物(27-mer)PCR引物。

acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG(SEQ ID NO：21，以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(cat)的结构基因的下游区)

TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA(SEQ ID NO：22)

使用枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的染色体DNA作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃1.5分钟，30个循环，Gene AmpPCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有fbp基因3’端区和大约1770bp下游区的扩增片段。

(iii)通过PCR扩增cat基因

基于基因数据库的信息(GenBank登录号V01277和NC_000964)制备具有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)PCR引物。

tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(SEQ ID NO：23，以小写字母表示的核苷酸对应于fbp基因的5’端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO：20的3’端区)

cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(SEQ ID NO：24，以小写字母表示的核苷酸对应于fbp基因的3’端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO：21的3’端区)

使用携带氯霉素抗性基因(cat)的质粒pC194作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃1.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有cat基因的大约980bp的扩增片段。

(iv)通过重组PCR扩增包含插入有cat基因的fbp区的片段

使用MicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化上述(i)至(iii)中扩增的DNA片段，然后将它们的混合物以适当的量用作模板，连同SEQ ID NOS：19和22的序列以进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃4.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)，并由此获得包含插入有cat基因的fbp区的片段。

(v)制备fbp破坏的产生肌苷的菌株

将(iv)中获得的包含其中已插入cat基因的fbp区的DNA片段(fbp::cat)进行琼脂糖凝胶电泳，并从该凝胶提取目标片段。将如上所述纯化的DNA片段用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的枯草芽孢杆菌KMBS321菌株的感受态细胞，并获得在含有2.5μg/ml氯霉素和20μg/ml鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落制备染色体DNA，通过(iv)所述的PCR方法鉴定如下菌株，其中通过双重组用其内部序列被氯霉素抗性基因代替的fbp区(fbp::cat)代替染色体上的fbp区，并将这些菌株中的一个命名为TABS133。

(2)制备ywjH基因缺陷的菌株

如下所述，由前述的重组菌株KMBS321构建在转醛醇酶基因(ywjH)中有缺陷的菌株。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，ATCC6051)的KMBS321菌株(日本专利申请No.2005-280186)在嘌呤操纵子阻抑物基因(purR)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)和嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)中有缺陷，并具有减弱的IMP脱氢酶基因(guaB)，其中对PRPP合成酶基因(prs)的SD序列和嘌呤操纵子启动子区进行修饰，和嘌呤核苷磷酸化酶基因(deoD)中有缺陷。

(i)通过PCR扩增ywjH上游区

ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA(SEQ ID NO：25)

cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC(SEQ ID NO：26，以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(cat)的启动子上游区)

使用枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的染色体DNA作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃1.5分钟，30个循环，Gene AmpPCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有ywjH基因5’端区和大约1420bp上游区的扩增片段。

(ii)通过PCR扩增ywjH下游区

基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC_000964和V01277)制备具有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和28聚物(28-mer)PCR引物。

acagctccagatccatatccttctTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG(SEQ ID NO：27，以小写字母表示的核苷酸对应于pC194中克隆的氯霉素抗性基因(cat)的结构基因的下游区)

GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT(SEQ ID NO：28)

使用枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的染色体DNA作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃1.5分钟，30个循环，Gene AmpPCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有ywjH基因3’端区和大约1370bp下游区的扩增片段。

(iii)通过PCR扩增cat基因

gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(SEQIDNO：29，以小写字母表示的核苷酸对应于ywjH基因的5’端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO：26的3’端区)

ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(SEQ ID NO：30，以小写字母表示的核苷酸对应于ywjH基因的3’端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO：27的3’端区)

(iv)通过重组PCR扩增包含插入有cat基因的ywjH区的片段

使用MicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化上述(i)至(iii)中扩增的DNA片段，然后将它们的混合物以适当的量用作模板，连同SEQ ID NOS：25和28的序列以进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃4分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)，并由此获得包含插入有cat基因的ywjH区的片段。

(v)制备ywjH破坏的产生肌苷的菌株

将(iv)中获得的包含其中已插入cat基因的ywjH区的DNA片段(ywjH::cat)进行琼脂糖凝胶电泳，并从该凝胶提取目标片段。将如上所述纯化的DNA片段用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的枯草芽孢杆菌KMBS321菌株的感受态细胞，并获得在含有2.5μg/ml氯霉素和20μg/ml鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落制备染色体DNA，通过(iv)所述的PCR方法鉴定如下菌株，其中通过双重组用其内部序列被氯霉素抗性基因代替的ywjH区(ywjH::cat)代替染色体上的ywjH区，并将这些菌株中的一个命名为TABS135。

(3)构建fbp和ywjH双缺陷的菌株

如下所述，由重组菌株TABS133构建在转醛醇酶基因(ywjH)中有缺陷的菌株。源自枯草芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌168Marburg菌株，ATCC6051)的TABS133菌株在嘌呤操纵子阻抑物基因(purR)、琥珀酰-AMP合酶基因(purA)、嘌呤核苷磷酸化酶基因(pupG)和果糖二磷酸酶基因(fbp)中有缺陷，并具有减弱的IMP脱氢酶基因(guaB)，其中对PRPP合成酶基因(prs)的SD序列和嘌呤操纵子启动子区进行修饰。

(i)通过PCR扩增ywjH上游区

基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC_000964和M29725)制备具有如下核苷酸序列的26聚物(26-mer)和50聚物(50-mer)PCR引物。

TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG(SEQ ID NO：31)

cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC(SEQ ID NO：32，以小写字母表示的核苷酸对应于pDG1513中克隆的四环素抗性基因(tet)的启动子上游区)

使用枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的染色体DNA作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃2.5分钟，30个循环，Gene AmpPCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有ywjH基因5’端区和大约2250bp上游区的扩增片段。

(ii)通过PCR扩增ywjH下游区

基于基因数据库的信息(GenBank登录号NC_000964和M29725)制备具有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)和26聚物(26-mer)PCR引物。

gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG(SEQ ID NO：33，以小写字母表示的核苷酸对应于pDG1513中克隆的四环素抗性基因(tet)的结构基因的下游区)

TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA(SEQ ID NO：34)

使用枯草芽孢杆菌168Marburg菌株的染色体DNA作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃2.5分钟，30个循环，Gene AmpPCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有ywjH基因3’端区和大约2280bp下游区的扩增片段。

(iii)通过PCR扩增tet基因

基于基因数据库的信息(GenBank登录号M29725和NC_000964)制备具有如下核苷酸序列的50聚物(50-mer)PCR引物。

gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAAAAAAGTCTTGCAATG(SEQ IDNO：35，以小写字母表示的核苷酸对应于ywjH基因的5’端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO：32的3’端区)

ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC(SEQ ID NO：36，以小写字母表示的核苷酸对应于ywjH基因的3’端区的序列，且对它们进行设计使其互补于SEQ ID NO：33的3’端区)

使用携带四环素抗性基因(tet)的质粒pDG1513作为模板和前述的引物进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃2.5分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)以获得含有tet基因的大约2070bp的扩增片段。

(iv)通过重组PCR扩增包含插入有tet基因的ywjH区的片段

使用MicroSpin Column S-400(Amersham Pharmacia Biotech)纯化上述(i)至(iii)中扩增的DNA片段，然后将它们的混合物以适当的量用作模板，连同SEQ ID NOS：31和34的序列以进行PCR(98℃10秒、55℃30秒、72℃7分钟，30个循环，Gene Amp PCR系统9600型，Perkin-Elmer)，并由此获得包含插入有tet基因的ywjH区的片段。

(v)制备fbp和ywjH破坏的产生肌苷的菌株

将(iv)中获得的包含其中已插入tet基因的ywjH区的DNA片段(ywjH::tet)进行琼脂糖凝胶电泳，并从该凝胶提取目标片段。将如上所述纯化的DNA片段用于转化通过Dubnau和Davidoff-Abelson的方法(J.Mol.Biol.，1971，56，209-221)制备的枯草芽孢杆菌TABS133菌株的感受态细胞，并获得在含有12.5μg/ml四环素和20μg/ml鸟嘌呤的LB琼脂平板上生长的菌落。从这些菌落制备染色体DNA，通过(iv)所述的PCR方法鉴定如下菌株，其中通过双重组用其内部序列被四环素抗性基因代替的ywjH区(ywjH::tet)代替染色体上的ywjH区，并将这些菌株中的一个命名为TABS174。

(4)通过在fbp基因和ywjH基因中的任一个或两者中有缺陷的产生肌苷的菌株产生嘌呤核苷。

fbp基因缺陷菌株TABS133、ywjH基因缺陷菌株TABS135、两基因缺陷菌株TABS174和对照菌株KMBS321各自均匀地涂布于含有20mg/L鸟嘌呤的LB培养基平板上，并在34℃培养过夜。将对应于平板的1/8的细胞接种入500-ml容积坂口烧瓶(Sakaguchi flask)中所含的20ml发酵培养基中，然后将50g/L碳酸钙加入培养基，并在34℃摇动培养细胞。培养开始后72小时，对培养基取样，并通过已知方法测量培养基中所含的肌苷和次黄嘌呤的量。以fbp基因缺陷菌株TABS133和ywjH基因缺陷菌株TABS135观察到的积累的肌苷量高于KMBS321菌株作为对照菌株观察到的肌苷量。此外，以在两个基因均有缺陷的菌株观察到的积累的肌苷量高于TABS133菌株或TABS135菌株观察到的肌苷量。

[发酵培养基的组成]

葡萄糖 30g/L

KH₂PO₄ 1g/L

NH₄Cl 32g/L

豆浓(Mameno)(T-N)^* 1.35g/L

DL-甲硫氨酸 0.4g/L

L-色氨酸 0.02g/L

腺嘌呤 0.1g/L

鸟苷 0.075g/L

MgSO₄ 0.4g/L

FeSO₄ 0.01g/L

MnSO₄ 0.01g/L

Adekanol(消泡剂) 0.5ml/L

(用KOH调节至pH7.0)

碳酸钙 50g/L

^*：大豆蛋白水解物

表1

枯草芽孢杆菌菌株	肌苷(g/L)
		KMBS321TABS133TABS135TABS174	5.35.86.06.5

[序列表的说明]

SEQ ID NO：1：ywjH基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：2：转醛醇酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：3：prs基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：4：磷酸核糖焦磷酸合成酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：5：purR基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：6：嘌呤阻抑物的氨基酸序列

SEQ ID NO：7：deoD基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：8：deoD基因产物(嘌呤核苷磷酸化酶)的氨基酸序列

SEQ ID NO：9：pupG基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：10：pupG基因产物(嘌呤核苷磷酸化酶)的氨基酸序列

SEQ ID NO：11：purA基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：12：琥珀酰-AMP合酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：13：guaB基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：14：IMP脱氢酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：15：fbp基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：16：果糖二磷酸酶的氨基酸序列

SEQ ID NO：17：用于purR基因扩增的引物

SEQ ID NO：18：用于purR基因扩增的引物

SEQ ID NO：19：用于fbp基因上游区扩增的引物

SEQ ID NO：20：用于fbp基因上游区扩增的引物

SEQ ID NO：21：用于fbp基因下游区扩增的引物

SEQ ID NO：22：用于fbp基因下游区扩增的引物

SEQ ID NO：23：用于cat基因扩增的引物

SEQ ID NO：24：用于cat基因扩增的引物

SEQ ID NO：25：用于ywjH基因上游区扩增的引物

SEQ ID NO：26：用于ywjH基因上游区扩增的引物

SEQ ID NO：27：用于ywjH基因下游区扩增的引物

SEQ ID NO：28：用于ywjH基因下游区扩增的引物

SEQ ID NO：29：用于cat基因扩增的引物

SEQ ID NO：30：用于cat基因扩增的引物

SEQ ID NO：31：用于ywjH基因上游区扩增的引物

SEQ ID NO：32：用于ywjH基因上游区扩增的引物

SEQ ID NO：33：用于ywjH基因下游区扩增的引物

SEQ ID NO：34：用于ywjH基因下游区扩增的引物

SEQ ID NO：35：用于tet基因扩增的引物

SEQ ID NO：36：用于tet基因扩增的引物

工业实用性

通过使用本发明的芽孢杆菌属细菌，可改进嘌呤核苷和/或嘌呤核苷酸的生产效率。

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>能够产生嘌呤物质的细菌和用于产生嘌呤物质的方法

<130>C757-C7064

<150>JP2006-119324

<151>2006-04-24

<160>36

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>636

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(636)

<400>1

atg tta ttc ttt gtt gat aca gcc aat atc gat gaa att aga gaa gcg 48

Met Leu Phe Phe Val Asp Thr Ala Asn Ile Asp Glu Ile Arg Glu Ala

1 5 10 15

aat gaa tta gga att ctc gcc ggt gta acg acg aat cct agt tta gta 96

Asn Glu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Leu Val

20 25 30

gca aag gaa gct aac gta tca ttc cac gac cgt ctt cgc gag atc aca 144

Ala Lys Glu Ala Asn Val Ser Phe His Asp Arg Leu Arg Glu Ile Thr

35 40 45

gac gtc gtg aaa ggg tct gta agc gca gag gtt att tct ttg aaa gct 192

Asp Val Val Lys Gly Ser Val Ser Ala Glu Val Ile Ser Leu Lys Ala

50 55 60

gag gaa atg atc gag gaa gga aaa gaa ctg gcg aag atc gct ccg aac 240

Glu Glu Met Ile Glu Glu Gly Lys Glu Leu Ala Lys Ile Ala Pro Asn

65 70 75 80

att acg gtg aaa atc cca atg acg tct gac ggt tta aaa gcg gta aga 288

Ile Thr Val Lys Ile Pro Met Thr Ser Asp Gly Leu Lys Ala Val Arg

85 90 95

gca ctt act ggc tta ggc atc aaa aca aac gtt aca ttg atc ttc aat 336

Ala Leu Thr Gly Leu Gly Ile Lys Thr Asn Val Thr Leu Ile Phe Asn

100 105 110

gcc aac cag gcg ctt ctt gct gcc aga gcg ggg gca aca tat gta tct 384

Ala Asn Gln Ala Leu Leu Ala Ala Arg Ala Gly Ala Thr Tyr Val Ser

115 120 125

cca ttc ctg gga cgt tta gat gac atc ggc cac aac ggg ctt gac ctg 432

Pro Phe Leu Gly Arg Leu Asp Asp Ile Gly His Asn Gly Leu Asp Leu

130 135 140

att tca gaa gtt aaa cag att ttt gac att cac ggc ctt gac acg caa 480

Ile Ser Glu Val Lys Gln Ile Phe Asp Ile His Gly Leu Asp Thr Gln

145 150 155 160

atc att gca gcg tca atc cgc cat ccg cag cac gtg aca gaa gct gct 528

Ile Ile Ala Ala Ser Ile Arg His Pro Gln His Val Thr Glu Ala Ala

165 170 175

ctt aga ggg gct cat atc ggc aca atg ccg ctg aaa gtc att cat gcg 576

Leu Arg Gly Ala His Ile Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Ile His Ala

180 185 190

ctc act aaa cac ccg tta aca gac aaa gga atc gaa caa ttc ctg gca 624

Leu Thr Lys His Pro Leu Thr Asp Lys Gly Ile Glu Gln Phe Leu Ala

195 200 205

gac tgg aac aaa 636

Asp Trp Asn Lys

210

<210>2

<211>212

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>2

Met Leu Phe Phe Val Asp Thr Ala Asn Ile Asp Glu Ile Arg Glu Ala

1 5 10 15

Asn Glu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Leu Val

20 25 30

Ala Lys Glu Ala Asn Val Ser Phe His Asp Arg Leu Arg Glu Ile Thr

35 40 45

Asp Val Val Lys Gly Ser Val Ser Ala Glu Val Ile Ser Leu Lys Ala

50 55 60

Glu Glu Met Ile Glu Glu Gly Lys Glu Leu Ala Lys Ile Ala Pro Asn

65 70 75 80

Ile Thr Val Lys Ile Pro Met Thr Ser Asp Gly Leu Lys Ala Val Arg

85 90 95

Ala Leu Thr Gly Leu Gly Ile Lys Thr Asn Val Thr Leu Ile Phe Asn

100 105 110

Ala Asn Gln Ala Leu Leu Ala Ala Arg Ala Gly Ala Thr Tyr Val Ser

115 120 125

Pro Phe Leu Gly Arg Leu Asp Asp Ile Gly His Asn Gly Leu Asp Leu

130 135 140

Ile Ser Glu Val Lys Gln Ile Phe Asp Ile His Gly Leu Asp Thr Gln

145 150 155 160

Ile Ile Ala Ala Ser Ile Arg His Pro Gln His Val Thr Glu Ala Ala

165 170 175

Leu Arg Gly Ala His Ile Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Ile His Ala

180 185 190

Leu Thr Lys His Pro Leu Thr Asp Lys Gly Ile Glu Gln Phe Leu Ala

195 200 205

Asp Trp Asn Lys

210

<210>3

<211>954

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(954)

<400>3

atg tct aat caa tac gga gat aag aat tta aag att ttt tct ttg aat 48

Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn

1 5 10 15

tcg aat cca gag ctt gca aaa gaa atc gca gat ata gtt gga gtt caa 96

Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln

20 25 30

tta ggg aaa tgt tct gtc aca aga ttt agt gac ggg gaa gtc caa att 144

Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile

35 40 45

aat atc gaa gaa agt att cgc gga tgt gat tgt tac atc atc cag tct 192

Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser

50 55 60

aca agt gac ccc gtt aac gag cat att atg gaa ctg ctg att atg gta 240

Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val

65 70 75 80

gat gcg tta aaa cgc gct tct gca aaa acg att aac att gtt att cct 288

Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro

85 90 95

tat tac ggt tat gcg cgt caa gac aga aaa gca aga tcc cgt gag cca 336

Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro

100 105 110

atc aca gct aaa ctt ttc gct aac ctg ctt gaa aca gcc ggt gcg act 384

Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr

115 120 125

cgt gtg att gca ctt gac ctg cat gcg ccg caa att caa gga ttc ttt 432

Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe

130 135 140

gat ata ccg att gac cac tta atg ggt gtt ccg att tta gga gaa tat 480

Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr

145 150 155 160

ttt gaa ggc aaa aat ctt gaa gat atc gtc att gtt tca cca gac cat 528

Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His

165 170 175

ggc ggt gtg aca cgt gcc cgc aaa ctg gct gac cga cta aaa gcg cca 576

Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro

180 185 190

att gcg att atc gat aaa cgc cgt ccg cgt cca aac gtg gcg gaa gtc 624

Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val

195 200 205

atg aat att gta ggt aac atc gaa ggg aag act gct atc ctc atc gat 672

Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp

210 215 220

gac att att gat act gca ggt acg att aca ctt gct gct aat gcg ctc 720

Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu

225 230 235 240

gtt gaa aac gga gcg aaa gaa gta tat gca tgc tgt aca cac cct gta 768

Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val

245 250 255

cta tca ggc cct gcg gtt gaa cgg att aat aat tca aca att aaa gag 816

Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu

260 265 270

ctt gtt gtg aca aac agc atc aag ctt cct gaa gaa aag aaa att gaa 864

Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu

275 280 285

cgc ttt aag cag ctt tca gtc gga ccg ctt ctg gcc gaa gcg att att 912

Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile

290 295 300

cgc gtt cat gag cag caa tca gtc agc tat ctg ttc agc taa 954

Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser

305 310 315

<210>4

<211>317

<212>PRT

<213>枯草芽孢杆菌

<400>4

Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn

1 5 10 15

Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln

20 25 30

Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile

35 40 45

Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser

50 55 60

Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val

65 70 75 80

Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro

85 90 95

Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro

100 105 110

Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr

115 120 125

Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe

130 135 140

Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr

145 150 155 160

Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His

165 170 175

Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro

180 185 190

Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val

195 200 205

Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp

210 215 220

Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu

225 230 235 240

Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val

245 250 255

Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu

260 265 270

Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu

275 280 285

Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile

290 295 300

Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser

305 310 315

<210>5

<211>858

<212>DNA

<213>枯草芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(858)

<400>5

atg aag ttt cgt cgc agc ggc aga ttg gtg gac tta aca aat tat ttg 48

Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu

1 5 10 15

tta acc cat ccg cac gag tta ata ccg cta acc ttt ttc tct gag cgg 96

Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg

20 25 30

tat gaa tct gca aaa tca tcg atc agt gaa gat tta aca att att aaa 144

Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys

35 40 45

caa acc ttt gaa cag cag ggg att ggt act ttg ctt act gtt ccc gga 192

Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly

50 55 60

gct gcc gga ggc gtt aaa tat att ccg aaa atg aag cag gct gaa gct 240

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65 70 75 80

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245 250 255

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Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu

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180 185 190

Gly Gln Gln Ile Lys Lys Tyr Val Cys Asp Thr Ser Val Val Leu Asn

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Asp Ala Leu Asp Glu Gly Arg Arg Val Leu Phe Glu Gly Ala Gln Gly

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Val Met Leu Asp Ile Asp Gln Gly Thr Tyr Pro Phe Val Thr Ser Ser

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Asn Pro Val Ala Gly Gly Val Thr Ile Gly Ser Gly Val Gly Pro Thr

245 250 255

Lys Ile Lys His Val Val Gly Val Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Arg Val

260 265 270

Gly Asp Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Lys Asp Glu Ile Gly Asp Gln

275 280 285

Ile Arg Glu Val Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Arg Pro Arg

290 295 300

Arg Val Gly Trp Phe Asp Ser Val Val Val Arg His Ala Arg Arg Val

305 310 315 320

Ser Gly Ile Thr Asp Leu Ser Leu Asn Ser Ile Asp Val Leu Ala Gly

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Ile Glu Thr Leu Lys Ile Cys Val Ala Tyr Arg Tyr Lys Gly Glu Ile

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gaa gaa gac cag aag ctt gtt gga att att aca aac cgt gac ctt cgt 432

Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg

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Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys

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165 170 175

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>33

gagagagttc aaaattgatc ctttttgacc tgatttcaga agttaaacag 50

<210>34

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>34

ttgcatatac atgtcaggag cattca 26

<210>35

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

gagaagcgaa tgaattagga attctgcttg gtgaaaaaag tcttgcaatg 50

<210>36

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

ctgtttaact tctgaaatca ggtcaaaaag gatcaatttt gaactctctc 50

Claims

1.产生嘌呤衍生物质的方法，其包括

在培养基中培养具有产生嘌呤衍生物质的能力的属于枯草芽孢杆菌的细菌以在细菌的细胞或培养基中引起嘌呤衍生物质的积累，和

从所述细胞或培养基中收集所述嘌呤衍生物质，

其中所述细菌已被修饰使得通过破坏编码转醛醇酶的基因或减少编码转醛醇酶的基因的表达量来减少转醛醇酶的酶活性，而且所述细菌已被进一步修饰使得编码嘌呤核苷磷酸化酶的基因、编码嘌呤操纵子的阻抑物的基因和编码琥珀酰-AMP合酶的基因被破坏，并且通过增加编码磷酸核糖焦磷酸合成酶的基因的表达而使得磷酸核糖焦磷酸合成酶活性相对于未修饰的菌株增加。

2.根据权利要求1的方法，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种嘌呤核苷：肌苷、黄苷、鸟苷和腺苷。

3.根据权利要求1的方法，其中所述嘌呤衍生物质是选自下组的一种或多种嘌呤核苷酸：肌苷酸、黄苷酸、鸟苷酸和腺苷酸。

4.根据权利要求1的方法，其中编码转醛醇酶的基因是编码由SEQ IDNO：2的氨基酸序列组成的蛋白质的基因。

5.根据权利要求1的方法，其中所述细菌已被进一步修饰使得果糖二磷酸酶活性减少。

6.根据权利要求1的方法，其中所述细菌已被进一步修饰使得IMP脱氢酶活性减少。

7.产生嘌呤核苷酸的方法，其包括

通过根据权利要求1-6中任一项的方法产生嘌呤核苷，

将所述嘌呤核苷与磷酸盐供体，及微生物或酸性磷酸酶进行反应以产生嘌呤核苷酸，所述磷酸盐供体是选自下组的一种或多种：聚磷酸、磷酸苯酯和氨甲酰磷酸，所述微生物具有产生核苷-5′-磷酸酯的能力，和

收集所述嘌呤核苷酸。