KR20090005392A - 퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 - Google Patents

퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법 Download PDF

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Abstract

퓨린계 물질 생산능을 갖고, 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하된 바실러스속 세균을 배양 배지 중에서 배양하여, 상기 배양 배지중 또는 세균의 세포내에 퓨린계 물질을 생성 및 축적시키고, 상기 배지 또는 세포로부터 퓨린계 물질을 회수함으로써 퓨린계 물질을 제조할 수 있다.
퓨린계 물질 생산균, 퓨린계 물질의 제조법, 바실러스속 세균, 트랜스알돌라제

Description

퓨린계 물질 생산균 및 퓨린계 물질의 제조법{Bacterium capable of producing purine substance, and process for production of purine substance}
본 발명은 5'-이노신산 및 5'-구아닐산으로 대표되는 퓨린 뉴클레오타이드, 및 이들의 합성 원료로서 중요한 물질인 이노신 및 구아노신 등의 퓨린 뉴클레오사이드 등의 퓨린계 물질의 제조법, 및 여기에 사용되는 바실러스(Bacillus)속 세균에 관한 것이다. 퓨린계 물질은 조미료, 의약 및 이들의 원료 등으로서 유용하다.
발효법에 의한 이노신 및 구아노신의 생산에 관해서는, 아데닌 요구 균주, 또는 여기에 퓨린 유사체를 비롯한 각종 약제에 대한 내성을 부여한 바실러스속의 미생물[참조: 특허문헌 1 내지 8], 및 브레비박테리움(Brevibacterium)속의 미생물[참조: 특허문헌 9, 10 또는 비특허문헌 1] 등을 사용하는 방법이 알려져 있다.
이러한 돌연변이주를 수득하기 위해서는, 종래, 미생물에 자외선 조사나 니트로소구아니딘(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 처리 등의 돌연변이유발 처리를 실시하여, 적당한 선별 배지를 사용하여 표적 돌연변이주를 수득하는 방법이 이루어져 왔다.
한편, 유전공학 기술을 사용한 퓨린계 물질 생산 균주의 육종도 바실러스속의 미생물[참조: 특허문헌 11 내지 20], 브레비박테리움속의 미생물[참조: 특허문헌 21], 및 에스케리키아(Escherichia)속의 미생물[참조: 특허문헌 22]로 이루어지고 있다. 구체적으로는, 예를 들면, 퓨린 오페론의 리프레서(repressor) 단백질 유전자(purR)가 파괴된 바실러스속 세균을 사용하여, 히포크산틴, 우라실, 구아닌 및 아데닌 등의 핵산계 물질을 효율적으로 제조하는 방법[참조: 특허문헌 23]이 개시되어 있다.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)에서, 상기 리프레서 단백질은 퓨린 오페론의 유전자군 외에도, AMP 생합성에 관여하는 purA 유전자[참조: 비특허문헌 2], 포르밀테트라하이드로엽산 생합성에 관여하는 glyA 유전자[참조: 비특허문헌 3] 및 히포크산틴/구아닌의 트랜스포터를 암호화하는 pbuG 유전자[참조: 비특허문헌 4] 등의 발현을 조절하는 것이 알려져 있다.
또한, purR 유전자 파괴 외에, 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA)를 파괴하여 아데닌 요구성을 부여함, 및 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD)를 파괴하여 이노신의 히포크산틴으로의 분해를 억제함에 의해, 이노신을 효율적으로 제조하는 미생물, 및 이를 사용한 이노신의 제조법이 개시되어 있다[참조: 특허문헌 8].
트랜스알돌라제는 펜토스 포스페이트 경로 효소의 하나이고, 세도헵툴로스-7-포스페이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트로부터 D-에리트로스-4-포스페이트 및 D-프럭토스-6-포스페이트를 생성하는 가역 반응을 촉매하는 효소이다. 당해 효소와 퓨린계 물질의 생합성 경로의 관계는 그다지 알려져 있지 않으며, 상기 효소 활성을 저하시켜 퓨린계 물질 생산균을 육종하려는 시도는 이루어지고 있지 않았다.
특허문헌 1: 일본 특허공보 제(소)38-23099호
특허문헌 2: 일본 특허공보 제(소)54-17033호
특허문헌 3: 일본 특허공보 제(소)55-2956호
특허문헌 4: 일본 특허공보 제(소)55-45199호
특허문헌 5: 일본 특허공보 제(소)57-14160호
특허문헌 6: 일본 특허공보 제(소)57-41915호
특허문헌 7: 일본 공개특허공보 제(소)59-42895호
특허문헌 8: 일본 공개특허공보 제2004-242610호
특허문헌 9: 일본 특허공보 제(소)51-5075호
특허문헌 10: 일본 특허공보 제(소)58-17592호
특허문헌 11: 일본 공개특허공보 제(소)58-158197호
특허문헌 12: 일본 공개특허공보 제(소)58-175493호
특허문헌 13: 일본 공개특허공보 제(소)59-28470호
특허문헌 14: 일본 공개특허공보 제(소)60-156388호
특허문헌 15: 일본 공개특허공보 제(평)1-27477호
특허문헌 16: 일본 공개특허공보 제(평)1-174385호
특허문헌 17: 일본 공개특허공보 제(평)3-58787호
특허문헌 18: 일본 공개특허공보 제(평)3-164185호
특허문헌 19: 일본 공개특허공보 제(평)5-84067호
특허문헌 20: 일본 공개특허공보 제(평)5-192164호
특허문헌 21: 일본 공개특허공보 제(소)63-248394호
특허문헌 22: 국제공개 제99/03988호
특허문헌 23: 미국특허 제6,284,495호
비특허문헌 1: Agric. Biol. Chem., 1978, 42, 399-405
비특허문헌 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7455-7459
비특허문헌 3: J. Bacteriol., 2001, 183, 6175-6183
비특허문헌 4: J. Bacteriol., 2003, 185, 5200-5209
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명은 발효법에 의해 퓨린 뉴클레오사이드 및/또는 퓨린 뉴클레오타이드 등의 퓨린계 물질을 제조하는데 적합한 바실러스속 세균을 작제하는 것과, 상기 세균을 사용한 퓨린계 물질의 제조법을 제공하는 것을 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 바실러스속 세균에 있어서, 펜토스 포스페이트 경로의 트랜스알돌라제의 효소 활성을 저하시킴으로써, 퓨린 뉴클레오사이드 또는 퓨린 뉴클레오타이드의 생산능이 향상되는 것을 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 다음과 같다.
(1) 퓨린계 물질 생산능을 갖고, 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형된 바실러스속 세균.
(2) 상기 퓨린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오사이드인 상기 바실러스속 세균.
(3) 상기 퓨린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오타이드인 상기 바실러스속 세균.
(4) 상기 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자를 파괴함, 또는 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자의 발현량을 저하시킴에 의해, 트랜스알돌라제 활성이 저하된 상기 바실러스속 세균.
(5) 상기 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자가 하기 (A) 또는 (B)의 단백질을 암호화하는 유전자인 상기 바실러스속 세균.
(A) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
(B) 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 트랜스알돌라제 활성을 갖는 단백질.
(6) 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제 활성이 상승하도록 추가로 변형된 상기 바실러스속 세균.
(7) 퓨린 오페론의 발현량이 상승하도록 추가로 변형된 상기 바실러스속 세균.
(8) 퓨린 오페론의 리프레서를 암호화하는 유전자인 purR 유전자를 파괴함, 또는 퓨린 오페론의 어테뉴에이터(attenuator) 영역의 일부를 결실시킴에 의해, 퓨린 오페론의 발현량이 상승된 상기 바실러스속 세균.
(9) 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 상기 바실러스속 세균.
(10) 프럭토스-비스포스파타제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 상기 바실러스속 세균.
(11) IMP 데하이드로게나제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 상기 바실러스속 세균.
(12) 바실러스속 세균이 바실러스 서브틸리스인 상기 바실러스속 세균.
(13) 상기 바실러스속 세균을 배지에 배양하여, 상기 세균의 세포내 또는 배지중에 퓨린계 물질을 축적시키고, 상기 세포 또는 배지로부터 퓨린계 물질을 회수함을 포함하는, 퓨린계 물질의 제조법.
(14) 퓨린계 물질이 퓨린 뉴클레오사이드 또는 퓨린 뉴클레오타이드인, 상기 퓨린계 물질의 제조법.
(15) 상기 퓨린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오사이드인, 상기 퓨린계 물질의 제조법.
(16) 상기 퓨린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오타이드인, 상기 퓨린계 물질의 제조법.
(17) 상기 제조법에 의해 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하고, 상기 퓨린 뉴클레오사이드에, 폴리인산, 페닐 포스페이트 및 카르바밀 포스페이트로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 포스페이트 공여체와, 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물 또는 산성 포스파타제를 작용시켜 퓨린 뉴클레오타이드를 생성시키고, 상기 퓨린 뉴클레오타이드를 회수함을 포함하는, 퓨린 뉴클레오타이드의 제조법.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
<1> 본 발명의 바실러스속 세균
(I) 퓨린계 물질 생산능의 부여
본 발명의 바실러스속 세균은 퓨린계 물질 생산능을 갖고, 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형된 바실러스속 세균이다.
「퓨린계 물질」이란 퓨린 골격을 포함하는 물질을 말하며, 퓨린 뉴클레오사이드, 퓨린 뉴클레오타이드 등을 예로 들 수 있다. 퓨린 뉴클레오사이드에는, 이노신, 크산토신, 구아노신, 아데노신 등이 포함되고, 퓨린 뉴클레오타이드에는, 퓨린 뉴클레오사이드의 5'-인산 에스테르, 예를 들면 이노신산(이노신-5'-포스페이트, 이하「IMP」라고도 한다), 크산틸산(크산토신-5'-포스페이트, 이하「XMP」라고도 한다), 구아닐산(구아노신-5'-모노포스페이트, 이하「GMP」라고도 한다), 아데닐산(아데노신-5'-모노포스페이트, 이하「AMP」라고도 한다) 등이 포함된다.
「퓨린계 물질 생산능」이란, 본 발명의 바실러스속 세균을 배지중에서 배양하였을 때에, 퓨린계 물질을 세포 또는 배지로부터 회수할 수 있을 정도로 세포내 또는 배지중에 생성, 분비, 축적할 수 있는 능력을 말한다. 또한, 본 발명의 바실러스속 세균은, 상기 퓨린계 물질중의 2종류 이상의 생산능을 가질 수 있다.
퓨린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균은, 본래 퓨린계 물질 생산능을 갖는 것일 수 있지만, 아래에 나타내는 것과 같은 바실러스속 세균을, 돌연변이유발 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 퓨린계 물질 생산능을 갖도록 변형함으로써 수득되는 것일 수 있다. 또한, 후술하는 바와 같이 하여 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형함으로써 퓨린계 물질 생산능이 부여 또는 증강된 바실러스속 세균일 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서, 「효소 활성이 저하된다」란, 상기 트랜스알돌라제, 또는 후술하는 퓨린계 물질을 분해하는 효소, 이노신모노포스페이트(IMP) 데하이드로게나제 등의 효소 활성이, 비변형 균주, 예를 들면 야생형의 바실러스속 세균에 있어서의 활성보다도 낮은 것, 및 활성이 실질적으로 소실되어 있는 것을 포함한다. 또한, 후술하는 퓨린 오페론 리프레서의 활성에 관해서도 동일하다.
본 발명의 바실러스속 세균을 수득하기 위해서 사용되는 바실러스속 세균으로서는, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀롤리케파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus) 등을 예로 들 수 있다.
바실러스 서브틸리스로서는, 바실러스 서브틸리스 168 마버그(Marburg) (ATCC 6051), 바실러스 서브틸리스 PY79[참조: Plasmid, 1984, 12, 1-9] 등을 예로 들 수 있고, 바실러스 아밀롤리케파시엔스로서는, 바실러스 아밀롤리케파시엔스 T (ATCC 23842) 및 바실러스 아밀롤리케파시엔스 N (ATCC 23845) 등을 예로 들 수 있다. 또한, 바실러스 푸밀러스로서는, 바실러스 푸밀러스 고트헤일(Gottheil) 3218번 (ATCC 21005)[참조: 미국특허 제3,616,206호] 등을 예로 들 수 있다. 이러한 균주는, 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)(주소: P.O.Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)부터 입수할 수 있다.
퓨린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균은 상기와 같은 바실러스속 세균에, 예를 들면, 퓨린 뉴클레오사이드 요구성, 또는 퓨린 유사체 등의 약제에 대한 내성을 부여함으로써, 수득할 수 있다[참조: 일본 특허공보 제(소)38-23099호, 일본 특허공보 제(소)54-17033호, 일본 특허공보 제(소)55-45199호, 일본 특허공보 제(소)57-14160호, 일본 특허공보 제(소)57-41915호, 일본 특허공보 제(소)59-42895호]. 영양 요구성 또는 약제 내성을 갖는 바실러스속 세균은, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 EMS(에틸메탄설포네이트) 등의 통상의 돌연변이유발에 사용되고 있는 돌연변이유발물질에 의한 처리에 의해서 수득할 수 있다.
퓨린 뉴클레오사이드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 예로 들 수 있다.
바실러스속에 속하는 이노신 생산 균주의 구체적인 예로서, 바실러스 서브틸리스 KMBS16 균주를 사용할 수 있다. 상기 균주는, 퓨린 오페론 리프레서를 암호화하는 purR 유전자의 결손(purR::spc), 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 purA 유전자의 결손(purA::erm) 및 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 암호화하는 deoD 유전자의 결손(deoD::kan)이 도입된, 기지의 바실러스 서브틸리스 trpC2 균주 (168 마버그)의 유도체이다[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호, US2004166575A1]. 또한, 바실러스 서브틸리스 균주 AJ3772(FERM P-2555)[참조: 일본 공개특허공보 제(소)62-014794호] 등을 사용할 수도 있다.
구아노신 생산능을 갖는 바실러스속 세균으로서는, IMP 데하이드로게나제의 활성이 상승된 바실러스속 세균[참조: 일본 공개특허공보 제(평)3-58787호], 퓨린 유사체 내성 또는 데코이닌 내성 유전자가 도입되어 있는 벡터를 아데닌 요구성 돌연변이주에 도입한 바실러스속 세균[참조: 일본 특허공보 제(평)4-28357호] 등을 예로 들 수 있다.
또한 퓨린 뉴클레오타이드를 생산하는 바실러스속 세균으로서는, 이하의 것을 예로 들 수 있다.
이노신산 생산균으로서는, 바실러스 서브틸리스의 포스파타제 활성이 약화된 이노신 생산 균주가 보고되어 있다[참조: Uchida, K. et al., Agr. Biol. Chem., 1961, 25, 804-805, Fujimoto, M. Uchida, K., Agr. Biol. Chem., 1965, 29, 249-259]. 구아닐산 생산균으로서는, 아데닌 요구성을 갖고, 또한 데코이닌 또는 메티오닌설폭사이드에 내성을 가지며, 5'-구아닐산(구아노신-5'-모노포스페이트, 이하「GMP」라고도 한다) 생산능을 갖는 바실러스속의 돌연변이주를 예로 들 수 있다[참조: 일본 특허공보 제(소)56-12438호].
또한, 크산틸산 생산균은, 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)를 중심으로 하는 코리네형 세균의 육종에 사용한 방법을 사용하여 작제할 수 있다. 예를 들면, PRPP 아미도트랜스퍼라제 강화 균주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-168383호], 지방족 아미노산 내성 균주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)4-262790호], 데하이드로프롤린 내성 균주[참조: 한국특허공개공보 2003-56490호]를 수득함으로써, 크산틸산 생산균을 작제할 수 있다.
또한, 퓨린계 물질 생산능을 갖는 바실러스속 세균을 육종하는 방법으로서, 이하의 방법을 예로 들 수 있다. 퓨린 뉴클레오사이드 및 퓨린 뉴클레오타이드에 공통의 퓨린 생합성에 관여하는 효소, 즉 퓨린 생합성 효소의 세포내에서의 활성을 상승시키는 방법을 예로 들 수 있다. 당해 효소의 세포내에서의 활성은, 바실러스속 세균의 비변형 균주, 예를 들면 야생형의 바실러스속 세균보다도 상승시키는 것이 바람직하다. 「활성이 상승한다」란, 예를 들면, 세포당 효소 분자의 수가 증가한 경우나, 효소 분자당 비활성이 상승된 경우 등이 해당한다. 예를 들면, 상기 효소의 유전자의 발현량을 상승시킴으로써 활성을 상승시킬 수 있다.
상기 퓨린 생합성에 관여하는 효소로서는, 예를 들면 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제, 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제(PRPP 신테타제[EC:2.7.6.1]) 등을 예로 들 수 있다.
펜토스 포스페이트 경로에 편입된 글루코스 등의 당원이 대사에 의해 생성된 대사산물의 일부는, 리불로스-5-포스페이트를 경유하여 리보스-5-포스페이트가 된다. 생합성된 리보스-5-포스페이트로부터 퓨린 뉴클레오사이드, 히스티딘 및 트립토판 생합성의 불가결한 전구 물질인 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP)가 생성된다. 구체적으로는, 리보스-5-포스페이트는 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제에 의해 PRPP로 전환된다. 따라서, 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 활성이 상승하도록 변형함으로써, 바실러스속 세균에 퓨린계 물질 생산능을 부여할 수 있다.
「포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 활성이 상승한다」란, 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 활성이 야생형 균주 또는 모 균주 등의 비변형 균주에 대하여 증가하는 것을 말한다. 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 활성은 예를 들면, Switzer 등의 방법[참조: Methods Enzymol., 1978, 51, 3-11], Roth 등의 방법[참조: Methods Enzymol., 1978, 51, 12-17]에 의해 측정할 수 있다. 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 활성이 상승된 바실러스속 세균은, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2004-242610호에 기재된 방법과 동일한 방식으로, 플라스미드를 사용하는 방법 또는 염색체상에 도입하는 방법 등에 의해, 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제를 암호화하는 유전자를 바실러스속 세균에서 고발현시킴으로써 제작할 수 있다. 본 발명에 이용할 수 있는 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제를 암호화하는 유전자는, 서열번호 3에 기재된 바실러스속 세균 유래의 prs 유전자(Genbank 등록번호 X16518)를 예로 들 수 있지만, 다른 세균 유래의 유전자, 동식물 유래의 유전자라도 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자이면, 어느 것이라도 사용할 수 있다.
한편, 퓨린 뉴클레오사이드, 히스티딘 및 트립토판 생합성에 불가결한 전구 물질인 PRPP가 생성되면, 이의 일부는 퓨린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 퓨린 뉴클레오타이드, 퓨린 뉴클레오사이드로 변환된다. 이와 같은 효소군을 암호화하는 유전자로서는, 바실러스 서브틸리스의 퓨린 오페론, 구체적으로는 purEKB-purC(orf) QLF-purMNH(J)-purD 오페론의 유전자[참조: Ebbole DJ and Zalkin H, J. Biol. Chem., 1987, 262, 17, 8274-87](현재는, purEKBCSQLFMNHD라고도 불린다: Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A. L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002. Genbank 등록번호 NC_000964], 및 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 pur 레귤론(regulon)의 유전자[참조: Escherichia and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996]가 예시된다.
따라서, 이러한 유전자의 발현을 증강시킴으로써, 퓨린계 물질 생산능을 부여 또는 증강시킬 수도 있다. 또한, 본 발명에 사용할 수 있는 퓨린 오페론 유전자는 이러한 것에는 한정되지 않고, 다른 미생물이나 동식물 유래의 유전자도 이용할 수도 있다.
퓨린 오페론의 발현량을 증대시키는 방법으로서는, 플라스미드를 사용하는 방법이나 염색체상에 도입하는 방법 등에 의해, 퓨린 오페론 유전자를 바실러스속 세균에서 고발현시키는 방법을 예로 들 수 있다.
퓨린 오페론의 발현량을 증대시키는 제2의 방법으로서, 퓨린 오페론 고유의 프로모터를 보다 강력한 프로모터로 치환하는 것이나, 고유의 프로모터의 -35, -10 영역을 컨센서스(consensus) 서열로 치환하는 것을 예로 들 수 있다.
예를 들면, 바실러스 서브틸리스(비.서브틸리스 168 마버그 균주; ATCC 6051)에서는, 퓨린 오페론의 -35 서열은 컨센서스 서열(TTGACA)이지만, -10 서열은 TAAGAT이고, 컨센서스 서열 TATAAT와는 상이하다[참조: Ebbole, D. J. and H. Zalikn, J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287]. 따라서, -10 서열(TAAGAT)을 컨센서스 서열 또는 컨센서스 서열에 가깝게 함으로써, TATAAT, TATGAT 또는 TAAAAT가 되도록 변형함으로써, 퓨린 오페론의 전사 활성을 상승시킬 수 있다. 또한, 프로모터 서열의 치환은 하기의 유전자 치환과 동일한 방법으로 실시할 수 있다.
퓨린 오페론의 발현량을 증대시키는 제3의 방법으로서, 퓨린 오페론의 리프레서의 발현량을 저하시키는 방법도 들 수 있다[참조: USP6,284,495호]. 「퓨린 오페론의 리프레서의 발현」은 퓨린 오페론 유전자의 전사 및 전사 산물의 해독을 포함한다. 또한, 「발현량을 저하시킨다」란, 발현량이 비변형 균주, 예를 들면 야생형의 바실러스속 세균에 있어서의 발현량보다도 낮은 것, 및 발현이 실질적으로 소실되어 있는 것을 포함한다.
퓨린 오페론의 리프레서(퓨린 리프레서)의 발현량을 저하시키기 위해서는, 예를 들면, 바실러스속 세균을 자외선 조사 또는 NTG 또는 EMS 등의 통상의 돌연변이유발에 사용되고 있는 돌연변이유발물질에 의해서 처리하여, 퓨린 리프레서의 발현량이 저하된 돌연변이주를 선택하는 방법을 사용할 수 있다.
또한, 퓨린 리프레서의 발현량이 저하된 바실러스속 세균은, 돌연변이유발 외에도, 예를 들면, 유전자 재조합 기술을 사용한 상동 재조합[참조: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press(1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. Bacteriol., 1985, 162, 1196-1202]에 의해, 염색체상의 퓨린 리프레서를 암호화하는 유전자(purR; Genbank 등록번호 NC_000964, 암호화 영역은 염기 번호 54439 내지 55293; 서열번호 5)를, 정상적으로 기능하지 않는 유전자(이하, 「파괴형 유전자」라고 하는 경우가 있다)로 치환함으로써 수득할 수 있다.
파괴형 유전자로 숙주 염색체상의 정상 유전자를 치환하기 위해서는, 예를 들면 이하와 같이 할 수 있다. 또한, 이하의 예에서는, purR 유전자를 예로서 설명하지만, 다른 유전자, 예를 들면 후술의 purA, deoD, guaB, fbp 및 ywjH 유전자에 관해서도, 동일한 방식으로 유전자 파괴를 실시할 수 있다.
염색체상의 서열과 상동성을 갖는 서열을 갖고, 바실러스속 세균내에서 복제할 수 없는 플라스미드 등이 세균내에 도입되면, 일정 빈도로 염색체상의 상동성을 갖는 서열의 부위에서 재조합을 일으키고, 도입된 플라스미드 전체가 염색체상에 도입된다. 이후 추가로 염색체상의 상동성을 갖는 서열의 부위에서 재조합을 일으키면, 다시 플라스미드가 염색체상으로부터 제거되지만, 이때 재조합이 일어나는 위치에 따라 파괴형 유전자가 염색체상에 고정되어, 원래의 정상 유전자가 플라스미드와 함께 염색체상으로부터 제거되는 경우가 있다. 이러한 균주를 선택함으로써, 염색체상의 정상 purR 유전자가 파괴형 purR 유전자로 치환된 균주를 수득할 수 있다.
이러한 상동 재조합에 의한 유전자 파괴 기술은 이미 확립되어 있으며, 직쇄 DNA를 사용하는 방법, 감온성 플라스미드를 사용하는 방법 등을 이용할 수 있다. 또한, 약제 내성 등의 마커 유전자가 내부에 삽입된 purR 유전자를 포함하고, 표적 미생물 세포내에서 복제할 수 없는 플라스미드를 사용함으로써도, purR 유전자의 파괴를 실시할 수 있다. 즉, 상기 플라스미드로 형질전환되어, 약제 내성을 획득한 형질전환체는, 염색체 DNA 중에 마커 유전자가 도입되어 있다. 당해 마커 유전자는 이의 양 말단의 purR 유전자 서열과 염색체상의 purR 유전자와의 상동 재조합에 의해서 도입될 가능성이 높기 때문에, 효율적으로 유전자 파괴 균주를 선택할 수 있다.
유전자 파괴에 사용하는 파괴형 purR 유전자는, 구체적으로는, 제한 효소 분해 및 재연결에 의해 purR 유전자의 일정 영역을 결실시키거나, purR 유전자에 다른 DNA 단편(마커 유전자 등)을 삽입하거나, 부위 특이적 돌연변이유발[참조: Kramer, W. and Fritz, H. J., Methods Enzymol., 1987, 154, 350-367] 또는 재조합 PCR[참조: PCR Technology, Stockton Press(1989)] 또는 차아황산나트륨, 하이드록실아민 등의 화학 제제에 의한 처리[참조: Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, 75, 2170-2174]에 의해서, purR 유전자의 암호화 영역 또는 프로모터 영역 등의 염기 서열 중에 1개 또는 수개의 염기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 일으키거나 하여, 암호화되는 리프레서의 활성이 저하되었거나 purR 유전자의 전사가 저하된 것을 선택함으로써 수득할 수 있다. 이러한 형태 중에서는, 제한 효소 분해 및 재연결에 의해 purR 유전자의 일정 영역을 결실시키는 방법, 또는 purR 유전자에 다른 DNA 단편을 삽입하는 방법이 확실성 및 안정성의 면에서 바람직하다. 결실시키는 purR 유전자의 일정 영역은, purR 유전자의 5' 말단, 내부, 3' 말단 중 어느 것일 수 있지만, purR 유전자의 전체 길이의 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상이면, 리프레서의 활성이 저하되는 확실성이 높아지게 된다. 또한, purR 유전자의 암호화 영역중에 염기를 결실 또는 삽입시켜 프레임시프트(frameshift) 돌연변이를 일으키는 경우는, 다수의 부위에서 염기의 결실 또는 삽입을 일으키는 것, 및 3' 말단에서 염기의 결실 또는 삽입을 일으키는 것이 리프레서의 활성을 확실히 저하시킬 수 있는 점에서 바람직하다.
또한, 퓨린 리프레서의 활성의 저하는, 상기의 유전자 파괴에 의한 것 이외에, 통상의 돌연변이유발법에 의해서, 염색체상의 purR 유전자에 세포중의 퓨린 리프레서의 활성이 저하되는 돌연변이를 도입시켜 달성할 수 있다. 예를 들면, 염색체상의 효소를 암호화하는 영역에 아미노산 치환(미스센스(missense) 돌연변이)을 도입하는 것, 종결 코돈을 도입하는 것(넌센스(nonsense) 돌연변이), 1개 또는 2개의 뉴클레오타이드를 부가 또는 결실시키는 프레임시프트 돌연변이를 도입하는 것, 유전자의 일부분 또는 전영역을 결실시키는 것에 의해서도 달성할 수 있다. 또한, 염색체상의 purR 유전자에 트랜스포존(transposon)을 삽입함으로써도, 리프레서의 활성을 저하시킬 수 있다.
또한, 퓨린 리프레서의 활성의 저하는, 염색체 DNA상의 purR 유전자의 프로모터 등의 발현 조절 서열을 약한 것으로 치환함으로써도 달성된다. 프로모터의 강도는 RNA 합성 개시의 빈도에 의해 정의된다. 프로모터의 강도의 평가법 및 강력한 프로모터의 예는, Goldstein 등의 논문[참조: Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128] 등에 기재되어 있다. 또한, 국제공개공보 제W000/18935호에 개시되어 있는 바와 같이, 표적 유전자의 프로모터 영역에 다수의 뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 치환을 도입하고, 보다 약한 것으로 변형하는 것도 가능하다. 또한, 리보솜 결합 부위(RBS)와 개시 코돈간의 스페이서(spacer), 특히 개시 코돈의 바로 상류의 서열에 있어서의 수개의 뉴클레오타이드의 치환이 mRNA의 해독 효율에 대단히 영향을 미치는 것이 알려져 있다. 이러한 RBS의 변형은, 표적 유전자의 전사를 감소시키는 것과 조합될 수 있다.
또한, purR 유전자로부터 전사된 메신저 RNA를 불안정화하는 돌연변이를 도입한 재조합 DNA를 제조하고, 이것을 바실러스 세균 숙주 속으로 형질전환시킬 수 있다.
후술의 purA, deoD, guaB, fbp 및 ywjH 유전자에 관해서도, 상기와 동일한 방식으로, 암호화되는 효소의 활성을 저하시킬 수 있다.
또한, purR 유전자는 퓨린 오페론을 갖는 미생물의 염색체 DNA로부터, 공지의 purR 유전자의 염기 서열에 기초하여 제조한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하는 PCR에 의해서 수득할 수 있다. 또한, 퓨린 오페론을 갖는 미생물의 염색체 DNA 라이브러리로부터, 공지의 purR 유전자의 염기 서열에 기초하여 제조한 올리고뉴클레오타이드를 프로브로 하는 하이브리드화에 의해 purR 유전자를 수득할 수 있다. 바실러스 서브틸리스 168 마버그 균주에서는, purR 유전자의 염기 서열이 보고되어 있다[참조: Genbank 등록번호 D26185(암호화 영역은 염기 번호 118041 내지 118898), NC_000964(암호화 영역은 염기 번호 54439 내지 55296)]. purR 유전자의 염기 서열 및 당해 유전자에 의해서 암호화되는 아미노산 서열을, 서열표의 서열번호 5 및 6에 나타낸다[참조: 일본 공개특허공보 2004-242610호].
purR 유전자를 수득하기 위한 PCR에 사용하는 프라이머는, purR 유전자의 일부 또는 전체 길이를 증폭시킬 수 있는 것일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 17(GAAGTTGATGATCAAAA) 및 서열번호 18(ACATATTGTTGACGATAAT)의 염기 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 등을 예로 들 수 있다.
파괴형 유전자의 제조에 사용하는 purR 유전자는, 반드시 전체 길이 purR 유전자일 필요는 없으며, 유전자 파괴를 일으키는데 필요한 길이를 갖고 있을 수 있다. 또한, 각 유전자의 수득에 사용하는 미생물은, 상기 유전자가 유전자 파괴된 균주의 작제에 사용하는 바실러스속 세균의 purR 유전자와 상동 재조합을 일으킬 정도의 상동성을 갖고 있으면 특별히 제한되지 않는다. 그러나, 통상적으로는 목적으로 하는 바실러스속 세균과 동일한 세균에서 유래하는 유전자를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 마커 유전자로서는, 스펙티노마이신 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자 및 테트라사이클린 내성 유전자를 예로 들 수 있다. 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) 유래의 스펙티노마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC; Bacillus Genetic Stock Center)로부터 시판되고 있는 에스케리키아 콜라이 ECE101 균주로부터, 플라스미드 pDG1726를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 내성 유전자를 카세트(cassette)로서 제거함으로써 수득할 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 에리트로마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에스케리키아 콜라이 ECE91 균주로부터, 플라스미드 pDG646를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 내성 유전자를 카세트로서 제거함으로써 수득할 수 있다. 스트렙토코커스 페칼리스(Streptococcus faecalis) 유래 카나마이신 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 에스케리키아 콜라이 ECE94 균주로부터, 플라스미드 pDG783를 제조하고, 당해 플라스미드로부터 내성 유전자를 카세트로서 제거함으로써 수득할 수 있다. 또한, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 클로람페니콜 내성 유전자는, 바실러스 제네틱 스톡 센터(BGSC)로부터 시판되고 있는 바실러스 서브틸리스 1E17 균주로부터, 플라스미드 pC194를 제조하고, 당해 플라스미드를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭시킴으로써 수득할 수 있다. 스트렙토코커스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae)의 테트라사이클린 내성 유전자는, 에스케리키아 콜라이 ECE99 균주로부터 플라스미드 pDG1513을 제조하고, 당해 플라스미드로부터 카세트로서 제거함으로써 수득할 수 있다[참조: Gene 1995 167: 335-336].
마커 유전자로서 약제 내성 유전자를 사용하는 경우는, 당해 유전자를 플라스미드중의 purR 유전자의 적당한 부위에 삽입하여, 수득되는 플라스미드로 미생물을 형질전환하고, 약제 내성으로 된 형질전환체를 선택하면, purR 유전자 파괴 균주가 수득된다. 염색체상의 purR 유전자가 파괴된 것은, 서던블로팅이나 PCR에 의해, 염색체상의 purR 유전자 또는 마커 유전자를 분석함으로써 확인할 수 있다. 상기 스펙티노마이신 내성 유전자, 에리트로마이신 내성 유전자 또는 카나마이신 내성 유전자가 염색체 DNA에 도입된 것의 확인은, 이러한 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 사용한 PCR에 의해 실시할 수 있다.
또한, 퓨린 오페론의 발현은 프로모터 하류에 위치하는 터미네이터-안티터미네이터(terminator-antiterminator) 서열(이하, 어테뉴에이터(attenuator) 서열이라고 칭한다)로 제어되는 것이 알려져 있다[참조: Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1987, 262, 8274-8287, Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Biol. Chem., 1988, 263, 10894-10902, Ebbole, D. J. and Zalkin, H., J. Bacteriol., 1989, 171, 2136-2141]. 따라서, 어테뉴에이터 서열을 결실시킴으로써, 퓨린 오페론의 발현량을 상승시킬 수 있다. 어테뉴에이터 서열의 결실은 purR 파괴와 동일한 방법으로 실시할 수 있다.
또한, 퓨린 오페론 전사를 더욱 증대시키기 위해서는, 상기 방법을 조합할 수 있으며, 예를 들면, purR 유전자를 파괴하고, 추가로 어테뉴에이터 서열을 결실시킨 퓨린 오페론을 플라스미드를 사용하여 증폭시키거나, 또는 이와 같은 퓨린 오페론의 다수의 카피를 염색체내로 도입시킬 수 있다.
또한, 퓨린 생합성에 관여하는 효소의 활성 증강은, 퓨린 생합성에 관여하는 효소의 조절을 해제하는 것, 예를 들면, 상기 효소의 피드백 저해를 해제하는 방법에 의해서도 실시할 수 있다[참조: WO99/03988].
또한, 퓨린계 물질의 세포내로의 흡수를 약화시킴으로써도, 퓨린계 물질 생산능을 강화할 수 있다. 예를 들면, 퓨린 뉴클레오사이드의 세포내로의 흡수는, 퓨린 뉴클레오사이드의 세포내로의 흡수에 관여하는 반응을 차단함으로써 약화시킬 수 있다. 상기 퓨린 뉴클레오사이드의 세포내로의 흡수에 관여하는 반응은, 예를 들면 뉴클레오사이드 퍼미아제로 촉매되는 반응이다.
또한, 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 경우에는, 퓨린 뉴클레오사이드 생산능을 증강시키기 위해서 퓨린계 물질을 분해하는 효소의 활성을 저하시킬 수 있다. 이러한 효소로서, 예를 들면, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 예로 들 수 있다.
PRPP로부터 퓨린 생합성에 관여하는 효소군에 의해 생합성된 퓨린 뉴클레오타이드는 탈인산화되어, 퓨린 뉴클레오사이드로 전환된다. 퓨린 뉴클레오사이드를 효율적으로 축적시키기 위해서는, 퓨린 뉴클레오사이드를 히포크산틴 등으로 더욱 분해시키는 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제의 활성을 저하시키는 것이 바람직하다. 즉, 이노신을 비롯한 퓨린 뉴클레오사이드를 기질로 하는 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 약화 또는 제거시키도록 변형하는 것이 바람직하다.
퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 활성의 저하는, 구체적으로는, 바실러스속 세균에서 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 암호화하는 deoD 유전자와 pupG 유전자를 파괴함으로써 달성할 수 있다. 본 발명의 바실러스속 세균은, 상기와 같은 deoD 유전자와 pupG 유전자를 단독으로 또는 동시에 파괴하도록 변형된 것일 수 있다. deoD 유전자, pupG 유전자는, 예를 들면 바실러스속 유래의 유전자(deoD; Genbank 등록번호 NC_000964(서열번호7), pupG; Genbank 등록번호 NC_000964(서열번호9))를 이용할 수 있고, 상기 purR 유전자 파괴와 동일한 방법으로 유전자 파괴 균주를 수득할 수 있다.
또한, 퓨린계 물질 생산능을 증강시키기 위해서, 석시닐-AMP 신타제의 활성을 저하시킬 수 있다. 석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 유전자로서는, purA 유전자를 예로 들 수 있다. purA 유전자로서는, 예를 들면, Genbank 등록번호 NC_000964(암호화 영역은 상보쇄의 염기 번호 4153460 내지 4155749)(서열번호 11)로 등록되어 있는 염기 서열을 갖는 것을 예로 들 수 있다.
또한, 퓨린계 물질 생산능을 증강시키기 위해서, 이노신모노포스페이트(IMP) 데하이드로게나제의 활성을 저하시킬 수 있다. IMP 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로서는, guaB 유전자를 예로 들 수 있다. guaB 유전자로서는, 예를 들면, Genbank 등록번호 NC_000964(암호화 영역은 15913 내지 17376)(서열번호 13)로 등록되어 있는 염기 서열을 갖는 것을 예로 들 수 있다.
또한, 퓨린계 물질 생산능을 증강시키기 위해서, 프럭토스-비스포스파타제의 활성을 저하시킬 수 있다. 프럭토스-비스포스파타제를 암호화하는 유전자로서는, fbp 유전자를 예로 들 수 있다. fbp 유전자로서는, 예를 들면, GenBank 등록번호 NC_000964(암호화 영역은 뉴클레오타이드 4127053번 내지 4129065번; 서열번호 15)로 등록되어 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것을 예로 들 수 있다.
또한, 퓨린계 물질 생산능을 증강시키는 방법으로서, 퓨린계 물질을 배출하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 증폭시키는 것을 고려할 수 있다. 이러한 유전자가 증폭된 세균으로서는, 예를 들면, rhtA 유전자를 증폭시킨 바실러스속 세균을 예로 들 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2003-219876호].
상기와 같이 하여 파괴되는 purR, deoD, pupG, purA, guaB 및 fbp 유전자, 또는 발현이 증강되는 prs 유전자는, 각각 보존적 변이체일 수 있으며, 예를 들면 각각 서열번호 6, 8, 10, 12, 14, 16 또는 4의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하고, 각각 퓨린 리프레서, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 석시닐-AMP 신타제, IMP 데하이드로게나제, 프럭토스 비스포스파타제 또는 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA일 수 있다. 상기「수개」는, 예를 들면 2 내지 50개, 바람직하게는, 2 내지 30개, 보다 바람직하게는 2 내지 10개이다.
상기와 같은 아미노산 서열에 대한 변경은, 통상적으로 단백질의 활성을 유지하는 보존적 변경이다. 보존적인 아미노산 치환으로서는, Ser 또는 Thr에 의한 Ala의 치환; Gln, His 또는 Lys에 의한 Arg의 치환; Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp에 의한 Asn의 치환; Asn, Glu 또는 Gln에 의한 Asp의 치환; Ser 또는 Ala에 의한 Cys의 치환; Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg에 의한 Gln의 치환; Asn, Gln, Lys 또는 Asp에 의한 Glu의 치환; Pro에 의한 Gly의 치환; Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr에 의한 His의 치환; Leu, Met, Val 또는 Phe에 의한 Ile의 치환; Ile, Met, Val 또는 Phe에 의한 Leu의 치환; Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg에 의한 Lys의 치환; Ile, Leu, Val 또는 Phe에 의한 Met의 치환; Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu에 의한 Phe의 치환; Thr 또는 Ala에 의한 Ser의 치환; Ser 또는 Ala에 의한 Thr의 치환; Phe 또는 Tyr에 의한 Trp의 치환; His, Phe 또는 Trp에 의한 Tyr의 치환; 및 Met, Ile 또는 Leu에 의한 Val을 예로 들 수 있다.
상기 purR, deoD, pupG, purA, guaB, fbp 유전자, 또는 prs 유전자의 보존적 변이체로서는 구체적으로는, 각각 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 3의 염기 서열을 갖는 DNA와, 예를 들면 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 예로 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 5, 7, 9, 11, 13, 15 또는 3의 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와, 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 DNA를 예로 들 수 있다. 엄격한 조건으로서는, 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도로 세정이 이루어지는 조건을 예로 들 수 있다. 세정의 회수는, 1회 또는 그 이상, 바람직하게는 2회 또는 3회이다.
DNA의 상동성의 평가는, BLAST 검색, FASTA 검색 및 Crustal W 등의 계산 방법에 의해서 실시할 수 있다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)은, 프로그램 blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 휴리스틱(heuristic) 검색 알고리듬이고, 이러한 프로그램은, Karlin, Samuel 및 Stephen F. Altschul의 통계학적 방법[참조: "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7]을 사용하여, 수득된 결과가 유의적이라고 간주한다. FASTA 검색 방법은, 문헌[참조: W. R. Pearson, "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990; 83: 63-98]에 기재되어 있다. Clustal W 방법은, 문헌[참조: Thompson J. D., Higgins D. G., and Gibson T. J., "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680]에 기재되어 있다.
또한, 파괴형 유전자의 제조에 사용되는 DNA는, purR, deoD, pupG, purA 또는 guaB 유전자의 보존적 변이체일 수 있다.
바실러스속 세균의 염색체 DNA에 표적 유전자를 도입하는 것은, 후술하는 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자와 동일한 방식으로 실시할 수 있다.
(II) 트랜스알돌라제의 효소 활성을 저하시키기 위한 변형
본 발명의 바실러스속 세균은, 상술과 같은 퓨린계 물질 생산능을 갖는 균주를 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형함으로써 수득할 수 있다. 단, 변형의 순서는 제한되지 않으며, 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형한 후에 퓨린 뉴클레오타이드 생산능을 부여할 수 있다.
여기에서 트랜스알돌라제란, 세도헵툴로스-7-포스페이트 및 D-글리세르알데히드-3-포스페이트로부터 D-에리트로스-4-포스페이트 및 D-프럭토스-6-포스페이트를 가역적으로 생성하는 반응을 촉매하는 효소이고, 이 반응은 펜토스 포스페이트 경로의 반응의 일부이다. 「펜토스 포스페이트 경로」란, 세포내에 흡수된 글루코스가 글루코스 키나제에 의해 인산화되어 글루코스-6-포스페이트가 생합성되고, 글루코스-6-포스페이트가 산화적으로 리보스-5-포스페이트로 전환되는 경로와 에피머라제, 트랜스케톨라제(EC:2.2.1.1) 및 트랜스알돌라제(EC:2.2.1.2)의 작용에 의해, 트리오스, 테트롤로스, 펜토스, 헥소스 및 헵토스의 포스페이트가 상호 전환되는 가역 과정으로 이루어지는 경로를 의미한다.
트랜스알돌라제의 효소 활성은, 이하와 같은 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 생성된 D-글리세르알데히드-3-포스페이트를 트리오스포스페이트 이소머라제에 의해 하이드록시아세톤 포스페이트로 전환시키고, 이것을 글리세롤-3-포스페이트 데하이드로게나제 및 NADH를 사용하여 측정하는 방법[참조: Ochoa, T., and Horecker, B. L., 1966, Methods Enzymol., 9, 499-505]으로 측정할 수 있다.
트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형하기 위해서는, 예를 들면, 상기의 purR 유전자의 파괴에서 나타낸 바와 같이, 상동 재조합에 의해, 염색체상의 트랜스알돌라제 유전자를, 정상적으로 기능하지 않는 유전자(예를 들면 약제 내성 등의 마커 유전자를 트랜스알돌라제 유전자 내부에 삽입한 파괴형 유전자)로 치환함으로써 달성할 수 있다. 또한, purR 유전자에 관해서 서술한 바와 같이, 통상의 돌연변이유발 방법에 의해서, 염색체상의 트랜스알돌라제 유전자에 트랜스알돌라제의 세포내 효소 활성이 저하되는 돌연변이를 도입할 수 있다.
바실러스 서브틸리스의 트랜스알돌라제는, 서열번호 2의 212개의 아미노산으로 구성되는 단백질을 예로 들 수 있으며, 당해 단백질을 암호화하는 유전자, 바람직하게는 서열번호 1(ywjH 유전자; Genbank 등록번호 NC_000964)의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자를 변형에 사용할 수 있다. 또한, ywjH 유전자는, 바실러스 서브틸리스 염색체에서 약 325°에 존재한다.
트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자도, 전술의 각 유전자와 동일하게, ywjH 유전자의 보존적 변이체일 수 있다. 구체적으로는, 서열번호 1의 아미노산 서열에 있어서, 1개 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하고, 트랜스알돌라제의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 예로 들 수 있다. 또는, 서열번호 2의 아미노산 서열과, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80%, 특히 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 가지며, 트랜스알돌라제의 효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 예로 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 DNA와, 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 DNA를 예로 들 수 있다. 엄격한 조건으로서는, 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도로 세정이 이루어지는 조건을 예로 들 수 있다. 세정의 회수는, 1회 또는 그 이상, 바람직하게는 2회 또는 3회이다.
상기와 같은 트랜스알돌라제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들면 부위 특이적 돌연변이유발에 의해서, 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하도록, 이들 효소를 암호화하는 염기 서열을 변형함으로써 수득된다. 또한, 상기와 같은 변형된 DNA는, 종래 알려져 있는 돌연변이유발에 의해서도 수득될 수 있다. 돌연변이유발로서는, 돌연변이유발 전의 DNA를 하이드록실아민 등으로 시험관내 처리하는 방법, 및 돌연변이유발 전의 DNA를 함유하는 미생물, 예를 들면 에스케리키아속 세균을, 자외선 조사 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상 돌연변이유발에 사용되고 있는 돌연변이유발물질에 의해서 처리하는 방법을 예로 들 수 있다.
표적 유전자는, 예를 들면, 바실러스속 세균의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 표적 유전자의 염기 서열에 기초하여 제조한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하는 PCR 방법[참조: PCR: polymerase chain reaction; White, T. J. et al, Trends Genet., 1989, 5, 185-189]에 의해서 수득할 수 있다. 염색체 DNA는, DNA 공여체인 세균으로부터, 예를 들면, 사이토(Saito) 및 미우라(Miura)의 방법[참조: H. Saito and K. Miura, Biochem. Biophys. Acta, 1963, 72, 619-629; 생물공학실험서, 일본생물공학회편, 97 내지 98페이지, 바이후칸, 1992년] 등에 의해 제조할 수 있다. PCR용 프라이머는, 바실러스속 세균의 공지의 유전자 서열에 기초하여, 또는 다른 세균 등에서 서열이 공지의 유전자간에서 보존되어 있는 영역의 정보에 기초하여, 제조할 수 있다.
바실러스속 세균의 염색체 DNA에 표적 유전자를 도입하기 위한 벡터로서는, pHV1248[참조: Prtit, M. -A., et. al., J. Bacteriol., 1990, 172, 6736-6740] 등의 감온성 복제 오리진을 갖는 벡터 또는 pHSG398[참조: 타카라슈조 가부시키가이샤 제조], pBluescript SK-[참조: Stratagene 제조] 등의 E.coli용 벡터 등을 예로 들 수 있다.
표적 유전자와 바실러스속 세균에서 기능하는 마커를 보유한 벡터를 연결하여 재조합 DNA를 제조하기 위해서는, 표적 유전자의 말단에 맞는 제한 효소로 벡터를 절단한다. 연결은 T4 DNA 리가제 등의 리가제를 사용하여 실시하는 것이 보통이다.
상기와 같이 제조한 재조합 DNA를 바실러스속 세균에 도입하기 위해서는, 지금까지 보고되어 있는 형질전환법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들면, 증식 단계의 세포로부터 컴피턴트(competent) 세포를 제조하여 DNA를 도입하는 방법[참조: Dubnau, D., and Davidoff-Abelson, R, J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221], 또는 숙주 세포를 재조합 DNA를 용이하게 편입하는 프로토플라스트(protoplast) 또는 스페로플라스트(spheroplast)의 상태로 하여 재조합 DNA를 DNA 수용 세포에 도입하는 방법[참조: Chang, S. and Cohen, S. N., Molec. Gen. Genet., 1979, 168, 111-115]을 예로 들 수 있다.
<2> 퓨린계 물질의 제조법
본 발명의 바실러스속 세균은 퓨린계 물질을 효율적으로 생산한다. 따라서, 본 발명의 바실러스속 세균을 적합한 배지에서 배양함으로써, 세균의 세포내 또는 배지중에 퓨린 뉴클레오사이드 및 퓨린 뉴클레오타이드 등의 퓨린계 물질을 생성 및 축적시킬 수 있다.
본 발명에 사용하는 배지로서는, 탄소원, 질소원, 무기염류, 기타 필요에 따라서 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 영양 배지를 사용하여 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지 중 어느 것이라도 사용 가능하다. 균주에 의해 이용 가능한 것이면 어떠한 종류의 탄소원 및 질소원이라도 사용될 수 있다.
탄소원으로서는 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 만노스, 갈락토스, 아라비노스, 크실로스, 트레할로스, 리보스, 전분 가수분해물, 당밀 등의 당류, 글리세롤이나 만니톨 등의 알콜류가 사용되고, 글루콘산, 아세트산, 시트르산, 말레산, 푸마르산, 석신산 등의 유기산 등도 단독 또는 다른 탄소원과 함께 사용될 수 있다.
질소원으로서는 암모니아, 황산암모늄, 탄산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 아세트산암모늄 등의 암모늄염, 질산염 또는 대두 가수분해물 등의 유기 질소 등이 사용된다.
유기 미량 영양소로서는, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또한 이러한 것을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물, 대두 단백 분해물 등이 사용되고, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 돌연변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보충하는 것이 필요하다.
무기 염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등이 사용된다.
배양 조건은, 사용하는 바실러스속 세균의 종류에 따라 달라지지만, 예를 들면 바실러스 서브틸리스에서는 발효 온도 20 내지 50℃, pH를 4 내지 9로 제어하면서 통기 배양을 실시한다. 배양중에 pH가 저하되는 경우에는 암모니아 가스 등의 알칼리로 중화한다. 이렇게 하여 40시간 내지 3일간 정도 배양함으로써, 배양액중에 퓨린 뉴클레오사이드가 축적된다.
배양 종료후, 배양액중에 축적된 이노신을 회수하는 방법으로서는 공지의 방법에 따라서 실시할 수 있다. 예를 들면, 침전법, 또는 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해서 분리할 수 있다.
또한, 본 발명에 사용하는 미생물은, 또한 뉴클레오시다제나 뉴클레오티다제를 암호화하는 유전자를 결손시키면, 각각에 대응하는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 축적시킬 수 있으며, 또한 이노신의 요구성을 부여하면, 이들의 생합성 경로상의 전구체 및 이의 관련 물질을 축적시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 이노신 또는 구아노신에, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 및 포스포리보실 트랜스퍼라제를 작용시킴으로써, 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산이 수득된다.
또한, 본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 퓨린 뉴클레오사이드에, 포스포트랜스퍼라제를 작용시킴으로써 인산화하고, 퓨린 뉴클레오타이드(뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르)를 생산하는 것도 가능하다[참조: 일본 공개특허공보 2000-295996호]. 예를 들면, 에스케리키아 콜라이의 이노신 구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 도입한 에스케리키아속 세균을 사용하는 퓨린 뉴클레오타이드의 제조법[참조: 국제공개공보 제WO91/08286호], 엑시구오박테리움 아세틸리쿰(Exiguobacterium acetylcum)의 이노신 구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 도입한 코리네박테리움 암모니아게네스를 사용한 퓨린 뉴클레오타이드의 제조법[참조: 국제공개공보 제WO96/30501호]을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 퓨린 뉴클레오사이드에, 폴리인산, 페닐 포스페이트, 카르바밀 포스페이트로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 포스페이트 공여체와, 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물이나, 산성 포스파타제(EC3.1.3.2)를 작용시킴으로써, 퓨린 뉴클레오타이드(뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르)를 생산하는 것도 가능하다. 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물은, 퓨린 뉴클레오사이드를 퓨린 뉴클레오타이드로 전환하는 능력을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 국제공개공보 제WO9637603호에 기재된 것과 같은 미생물을 예로 들 수 있다.
또한, 일본 공개특허공보 제(평)07-231793호에 개시되어 있는 것과 같은 에스케리키아 블라테(Escherichia blattae) JCM 1650, 세라티아 피카리아(Serratia ficaria) ATCC 33105, 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola) IFO 14939(ATCC 33531), 클렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae) IFO 3318(ATCC 8724), 클렙시엘라 테리게나(Klebsiella terrigena) IFO 14941(ATCC 33257), 모르가넬라 모르가니이(Morganella morganii) IFO 3168, 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) IFO 12010, 엔테로박터 아에로게네스 IFO 13534(ATCC 13048), 크로모박테리움 플루비아틸레(Chromobacterium fluviatile) IAM 13652, 크로모박테리움 비올라세움(Chromobacterium violaceum) IFO 12614, 세데세아 라파게이(Cedecea lapagei) JCM 1684, 세데세아 다비시에(Cedecea davisiae) JCM 1685, 세데세아 네테리(Cedecea neteri) JCM 5909 등을 사용할 수도 있다.
산성 포스파타제로서는, 예를 들면, 일본 공개특허공보 2002-000289호에 개시되어 있는 것과 같은 것을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 뉴클레오사이드에 대한 친화성이 상승된 산성 포스파타제[참조: 일본 공개특허공보 제(평)10-201481호]나 뉴클레오티다제 활성이 저하된 돌연변이 산성 포스파타제[참조: WO9637603], 인산 에스테르 가수분해 활성이 저하된 돌연변이 산성 포스파타제[참조: 일본 공개특허공보 2001-245676호] 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 미생물을 사용하여 생산된 퓨린 뉴클레오사이드를 화학적으로 인산화함으로써, 퓨린 뉴클레오타이드를 수득하는 것도 가능하다[참조: Bulletin of the Chemical Society of Japan 42, 3505]. 또한, 미생물이 갖고 있는 ATP 재생계를 이용하여, 본 발명의 XMP 생산능을 갖는 미생물과 XMP 아미나제 활성을 결합시킴으로써 GMP를 수득하는 방법, 이노신 키나제를 결합시킴으로써 IMP를 수득하는 방법도 사용할 수 있다[참조: Biosci. Biotech. Biochem., 51, 840(1997), 일본 공개특허공보 제(소)63-230094호].
상기 퓨린 뉴클레오타이드의 제조에 사용하는, 본 발명의 방법에 의해 제조된 이노신 또는 구아노신, 또는 퓨린 뉴클레오사이드는 정제된 산물일 수 있지만, 퓨린 뉴클레오사이드의 발효 브로쓰 또는 퓨린 뉴클레오사이드를 함유하는 조 산물일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
실시예 1
<퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 암호화하는 pupG 유전자 및 deoD 유전자를 결손시킨 균주의 작제>
바실러스 서브틸리스(비.서브틸리스 168 마버그 균주; ATCC6051) 유래로, 퓨 린 오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(pupG)를 결손시키고, IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)가 약화되고, 퓨린 오페론 프로모터 영역, PRPP 신테타제 유전자(prs)의 SD 서열을 변형한 재조합 균주 KMBS310[참조: 일본 특허출원 2005-280186호]를 사용하여, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD)를 결손시킨 균주의 작제를 이하와 같이 하여 실시하였다. 한편, 상기 퓨린 오페론 및 PRPP 신테타제 유전자는, 각각 프로모터 영역 및 SD 서열의 변형에 의해 발현이 강화되었다.
KMBS16 균주(purR::spc purA::erm deoD::kan; 일본 공개특허공보 2004-242610호)로부터, Fouet와 Sonenshein의 방법[참조: J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844]에 의해 제조한 게놈 DNA를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 비.서브틸리스 168 마버그 균주의 컴피턴트 세포를 형질전환하여, 5㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트 상에서 생육하는 콜로니를 수득하였다. 이렇게 하여 수득된 몇개의 콜로니 중에서 스펙티노마이신 내성 또는 에리트로마이신 내성으로 되지 않은 콜로니를 선택하여, 이 중의 하나의 균주를 KMBS5(deoD::kan)라고 명명하였다.
KMBS5로부터, Fouet와 Sonenshein의 방법[참조: J. Bacteriol., 1990, 172, 835-844]에 의해 제조한 게놈 DNA를 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 KMBS310 균주의 컴피턴트 세포를 형질전환하고, 5㎍/ml의 카나마이신과 20㎍/ml의 구아닌을 포함하는 LB 한천 플레이트상에서 생육하는 콜로니를 수득하였다. 이렇게 하여 수득된 몇개의 콜로니를 선택하여, 야생형 deoD 유전자가 deoD::kan로 치환되어 있고, KMBS310 유래의 모든 돌연변이가 야생형 서열과 치환되지 않은 것을 확인할 수 있었던 형질전환체 중의 하나를 KMBS321이라고 명명하였다.
실시예 2
<프럭토스-비스포스파타제를 암호화하는 fbp 유전자 및 트랜스알돌라제를 암호화하는 ywjH 유전자 중의 하나 또는 둘 모두를 결손시킨 균주의 작제, 배양 및 평가>
(1) fbp 유전자 결손 균주의 제작
상술의 바실러스 서브틸리스(비.서브틸리스 168 마버그 균주; ATCC6051) 유래로, 퓨린 오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(pupG)를 결손시키고, IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)가 약화되고, 퓨린 오페론 프로모터 영역, PRPP 신테타제 유전자(prs)의 SD 서열이 변형되고, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD)를 결손시킨 재조합 균주 KMBS321을 사용하여, 프럭토스-비스포스파타제 유전자(fbp)를 결손시킨 균주의 작제를 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) fbp 상류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank 등록번호 NC_000964 및 V01277)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 28량체, 50량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
TTCCCTTAGGGTTATTTTCGTTTCAAAA(서열번호 19)
cgtttgttgaactaatgggtgctTTTATGAGCATGTGCATGATAAGGTGA(서열번호 20; 소문자의 염기는 pC194상에 클로닝되어 있는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)의 프로모터상류 영역의 서열)
비.서브틸리스 168 마버그 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, fbp 유전자 5' 말단 영역과 상류의 약 1350 bp를 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) fbp 하류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank 등록번호 NC_000964 및 V01277)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50량체, 27량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
acagctccagatccatatccttcttTTTTAGAGAGTTTGCGGGAGTATCG(서열번호 21; 소문자의 염기는 pC194상에 클로닝되어 있는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)의 구조 유전자 하류 영역의 서열)
TAAAGGTTTTTCGGGATAAGATTGAAA(서열번호 22)
비.서브틸리스 168 마버그 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, fbp 유전자 3' 말단 영역과 하류의 약 1770 bp를 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) cat 유전자의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank 등록번호 V01277 및 NC_000964)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
tcaccttatcatgcacatgctcataaaAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(서열번호 23: 소문자의 염기는 fbp 유전자 5' 말단 영역의 서열로서 서열번호 20의 3' 말단 영역과 상보적이 되도록 설계되어 있다)
cgatactcccgcaaactctctaaaaAAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(서열번호 24; 소문자의 염기는 fbp 유전자 3' 말단 영역의 서열로서 서열번호 21의 3' 말단 영역과 상보적이 되도록 설계되어 있다)
클로람페니콜 내성 유전자(cat)를 보유하는 플라스미드 pC194를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, cat 유전자를 포함하는 약 980 bp의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) cat 유전자가 fbp 영역에 삽입된 단편의 재조합 PCR에 의한 증폭
(i) 내지 (iii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[판매원: Armersham Pharmacia Biotech]로 정제한 후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 19 및 22를 사용하여, PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 4.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, cat 유전자가 fbp 영역에 삽입된 증폭 단편을 수득하였다.
(v) fbp를 파괴한 이노신 생산 균주의 제작
(iv)에서 수득한 cat 유전자를 삽입한 fbp 영역(fbp::cat)의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동후, 표적 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 비.서브틸리스 KMBS321 균주의 컴피턴트 세포를 형질전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜과 20㎍/ml의 구아닌을 포함하는 LB 한천 플레이트상에서 생육하는 콜로니를 수득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, (iv)에 나타낸 PCR 방법에 의해, 염색체상의 fbp 영역이, 내부가 클로람페니콜 내성 유전자로 치환된 fbp 영역(fbp::cat)으로 이중 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하고, 이 중의 하나의 균주를 TABS133이라고 명명하였다.
(2) ywjH 유전자 결손 균주의 제작
상술의 바실러스 서브틸리스(비.서브틸리스 168 마버그 균주; ATCC6051) 유래로, 퓨린 오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(pupG)를 결손시키고, IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)가 약화되고, 퓨린 오페론 프로모터 영역, PRPP 신테타제 유전자(prs)의 SD 서열이 변형되고, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD)를 결손시킨 재조합 균주 KMBS321을 사용하여, 트랜스알돌라제 유전자(ywjH)를 결손시킨 균 주의 작제를 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) ywjH 상류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(GenBank 등록번호 NC_000964 및 V01277)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 28량체, 50량체의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
ATGGACGGAATCGAAATCTTAAAACGGA(서열번호 25)
cgtttgttgaactaatgggtgctttAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC(서열번호 26; 소문자의 염기는 pC194 위에 클로닝되어 있는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)의 프로모터 상류 영역의 서열)
비.서브틸리스 168 마버그 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, ywjH 유전자 5' 말단 영역과 상류의 약 1420 bp를 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) ywjH 하류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(GenBank 등록번호 NC_000964 및 V01277)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50량체, 28량체의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
acagctccagatccatatccttctTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG(서열번호 27; 소문자 의 염기는 pC194상에 클로닝되어 있는 클로람페니콜 내성 유전자(cat)의 구조 유전자 하류 영역의 서열)
GGATGACGTTATCGATAATGACTTCCTT(서열번호 28)
비.서브틸리스 168 마버그 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, ywjH 유전자 3' 말단 영역과 하류의 약 1370 bp를 포함하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) cat 유전자의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(Genbank 등록번호 V01277 및 NC_000964)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
gagaagcgaatgaattaggaattctAAAGCACCCATTAGTTCAACAAACG(서열번호 29: 소문자의 염기는 ywjH 유전자 5' 말단 영역의 서열로서 서열번호 26의 3' 말단 영역과 상보적이 되도록 설계되어 있다)
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAGAAGGATATGGATCTGGAGCTGT(서열번호 30; 소문자의 염기는 ywjH 유전자 3' 말단 영역의 서열로서 서열번호 27의 3' 말단 영역과 상보적이 되도록 설계되어 있다)
클로람페니콜 내성 유전자(cat)를 보유하는 플라스미드 pC194를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 1.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, cat 유전자를 포 함하는 약 980 bp의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) cat 유전자가 ywjH 영역에 삽입된 단편의 재조합 PCR에 의한 증폭
(i) 내지 (iii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[판매원: Armersham Pharmacia Biotech]로 정제한 후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 25 및 28을 사용하여, PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 4분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, cat 유전자가 ywjH 영역에 삽입된 증폭 단편을 수득하였다.
(v) ywjH를 파괴한 이노신 생산 균주의 제작
(iv)에서 수득한 cat 유전자를 삽입한 ywjH 영역(ywjH::cat)의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동후, 표적 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 비.서브틸리스 KMBS321 균주의 컴피턴트 세포를 형질전환하고, 2.5㎍/ml의 클로람페니콜과 20㎍/ml의 구아닌을 포함하는 LB 한천 플레이트상에서 생육하는 콜로니를 수득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, (iv)에 나타낸 PCR 방법에 의해, 염색체상의 ywjH 영역이, 내부가 클로람페니콜 내성 유전자로 치환된 ywjH 영역(ywjH::cat)으로 이중 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하고, 이 중의 하나의 균주를 TABS135라고 명명하였다.
(3) fbp 및 ywjH 이중 결손 균주의 작제
바실러스 서브틸리스(비.서브틸리스 168 마버그 균주; ATCC6051) 유래로, 퓨린 오페론 리프레서 유전자(purR), 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA), 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(pupG), 프럭토스-비스포스파타제 유전자(fbp)를 결손시키고, IMP 데하이드로게나제 유전자(guaB)가 약화되고, 퓨린 오페론 프로모터 영역, PRPP 신테타제 유전자(prs)의 SD 서열을 변형한 재조합 균주 TABS133을 사용하여, 트랜스알돌라제 유전자(ywjH)를 결손시킨 균주의 작제를 이하와 같이 하여 실시하였다.
(i) ywjH 상류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(GenBank 등록번호 NC_000964 및 M29725)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 26량체, 50량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
TAAAGCGTGATAGACATACAGTGCTG(서열번호 31)
cattgcaagacttttttcaccaagcAGAATTCCTAATTCATTCGCTTCTC(서열번호 32; 소문자의 염기는 pDG1513상에 클로닝되어 있는 테트라사이클린 내성 유전자(tet)의 프로모터 상류 영역의 서열)
비.서브틸리스 168 마버그 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 2.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, ywjH 유전자 5' 말단 영역과 상류 의 약 2250 bp를 함유하는 증폭 단편을 수득하였다.
(ii) ywjH 하류 영역의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(GenBank 등록번호 NC_000964 및 M29725)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50량체, 26량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
gagagagttcaaaattgatcctttTTGACCTGATTTCAGAAGTTAAACAG(서열번호 33; 소문자의 염기는 pDG1513 위에 클로닝되어 있는 테트라사이클린 내성 유전자(tet)의 구조 유전자 하류 영역의 서열)
TTGCATATACATGTCAGGAGCATTCA(서열번호 34)
비.서브틸리스 168 마버그 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 2.5분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, ywjH 유전자 3' 말단 영역과 하류의 약 2280 bp를 함유하는 증폭 단편을 수득하였다.
(iii) tet 유전자의 PCR에 의한 증폭
유전자 데이터 뱅크(GenBank 등록번호 M29725 및 NC_000964)의 정보에 근거하여, 이하의 염기 서열을 갖는 각각 50량체의 PCR용 프라이머를 제조하였다.
gagaagcgaatgaattaggaattctGCTTGGTGAA/AAAGTCTTGCAATG(서열번호 35; 소문자의 염기는 ywjH 유전자 5' 말단 영역의 서열로서 서열번호 32의 3' 말단 영역과 상 보적이 되도록 설계되어 있다)
ctgtttaacttctgaaatcaggtcaaAAAGGATCAATTTTGAACTCTCTC(서열번호 36; 소문자의 염기는 ywjH 유전자 3' 말단 영역의 서열로서 서열번호 33의 3' 말단 영역과 상보적이 되도록 설계되어 있다)
테트라사이클린 내성 유전자(tet)를 보유하는 pDG1513를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용하여 PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 2.5분; 30사이클: Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, cat 유전자를 함유하는 약 2070 bp의 증폭 단편을 수득하였다.
(iv) tet 유전자가 ywjH 영역에 삽입된 단편의 재조합 PCR에 의한 증폭
(i) 내지 (iii)에서 증폭된 DNA 단편을 MicroSpin Column S-400[판매원: Amersham Pharmacia Biotech]로 정제한 후, 적량을 혼합한 것을 주형으로 하고, 서열번호 31 및 34를 사용하여, PCR(98℃, 10초; 55℃, 30초; 72℃, 7분; 30 사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin-Elmer)을 실시하여, tet 유전자가 ywjH 영역에 삽입된 증폭 단편을 수득하였다.
(v) fbp 및 ywjH를 파괴한 이노신 생산 균주의 제조
(iv)에서 수득한 tet 유전자를 삽입한 ywjH 영역(ywjH::tet)의 DNA 단편을 아가로스겔 전기영동 후, 표적 단편을 겔로부터 추출하였다. 이렇게 하여 정제한 DNA 단편을 사용하여, Dubnau와 Davidoff-Abelson의 방법[참조: J. Mol. Biol., 1971, 56, 209-221]에 의해 제조한 비.서브틸리스 TABS133 균주의 컴피턴트 세포를 형질전환시키고, 12.5㎍/ml의 테트라사이클린과 20㎍/ml의 구아닌을 함유하는 LB 한천 플레이트 위에서 생육하는 콜로니를 수득하였다. 이러한 콜로니로부터 염색체 DNA를 제조하고, (iv)에 기술된 PCR 방법에 의해, 염색체상의 ywjH 영역이, 내부가 테트라사이클린 내성 유전자로 치환된 ywjH 영역(ywjH::tet)으로 이중 재조합에 의해 치환된 균주를 동정하고, 이 중의 하나의 균주를 TABS174라고 명명하였다.
(4) fbp 유전자 및 ywjH 유전자 중의 하나 또는 둘 모두를 결손시킨 이노신 생산 균주의 퓨린 뉴클레오사이드 생산
fbp 유전자 결손 균주 TABS133, ywjH 유전자 결손 균주 TABS135, 두 유전자를 모두 결손시킨 균주 TABS174, 및 대조군 균주인 KMBS321을, 구아닌 20mg/L을 함유하는 LB 배지 플레이트상에 균일하게 도포하고, 34℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트의 1/8에 상응하는 세포를, 500ml 용적의 Sakaguchi 플라스크중의 발효 배지 20ml에 접종하고, 그 후, 탄산칼슘을 50g/L이 되도록 가하고, 34℃에서 진탕 배양하였다. 배양 개시후 72시간째에 샘플링하여, 배양액중에 함유된 이노신 및 히포크산틴량을 공지의 방법으로 측정하였다. fbp 유전자 결손 균주 TABS133 및 ywjH 유전자 결손 균주 TABS135의 이노신의 축적은, 대조군 균주인 KMBS321 균주보다도 높았다. 또한, 두 유전자 모두를 결손시킨 균주의 이노신 축적은, TABS133 균주 또는 TABS135 균주보다도 높았다.
[발효 배지 조성]
글루코스 30g/L
KH2PO4 1g/L
NH4Cl 32g/L
두농(豆濃)(T-N)* 1.35g/L
DL-메티오닌 0.4g/L
L-트립토판 0.02g/L
아데닌 0.1g/L
구아노신 0.075g/L
MgS04 0.4g/L
FeSO4 0.01g/L
MnS04 0.01g/L
아데카놀(소포제) 0.5ml/L
(KOH로 pH 7.0로 조정)
탄산칼슘 50g/L
*: 대두 단백 가수분해물
비.서브틸리스 균주 이노신 (g/L)
KMBS321 TABS133 TABS135 TABS174 5.3 5.8 6.0 6.5
[서열표의 설명]
서열번호 1: ywjH 유전자의 염기 서열
서열번호 2: 트랜스알돌라제의 아미노산 서열
서열번호 3: prs 유전자의 염기 서열
서열번호 4: 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제의 아미노산 서열
서열번호 5: purR 유전자의 염기 서열
서열번호 6: 퓨린 리프레서의 아미노산 서열
서열번호 7: deoD 유전자의 염기 서열
서열번호 8: deoD 유전자 산물(퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제)의 아미노산 서열
서열번호 9: pupG 유전자의 염기 서열
서열번호 10: pupG 유전자 산물(퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제)의 아미노산 서열
서열번호 11: purA 유전자의 염기 서열
서열번호 12: 석시닐-AMP 신타제의 아미노산 서열
서열번호 13: guaB 유전자의 염기 서열
서열번호 14: IMP 데하이드로게나제의 아미노산 서열
서열번호 15: fbp 유전자의 염기 서열
서열번호 16: 프럭토스-비스포스파타제의 아미노산 서열
서열번호 17: purR 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 18: purR 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 19: fbp 유전자 상류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 20: fbp 유전자 상류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 21: fbp 유전자 하류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 22: fbp 유전자 하류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 23: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 24: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 25: ywjH 유전자 상류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 26: ywjH 유전자 상류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 27: ywjH 유전자 하류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 28: ywjH 유전자 하류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 29: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 30: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 31: ywjH 유전자 상류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 32: ywjH 유전자 상류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 33: ywjH 유전자 하류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 34: ywjH 유전자 하류 영역 증폭용 프라이머
서열번호 35: tet 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 36: tet 유전자 증폭용 프라이머
본 발명의 바실러스속 세균을 사용함으로써, 퓨린 뉴클레오사이드 및/또는 퓨린 뉴클레오타이드의 생산 효율을 향상시킬 수 있다.
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Bacterium capable of producing purine substance, and process for production of purine substance <130> C757-C7064 <150> JP 2006-119324 <151> 2006-04-24 <160> 36 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 636 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(636) <400> 1 atg tta ttc ttt gtt gat aca gcc aat atc gat gaa att aga gaa gcg 48 Met Leu Phe Phe Val Asp Thr Ala Asn Ile Asp Glu Ile Arg Glu Ala 1 5 10 15 aat gaa tta gga att ctc gcc ggt gta acg acg aat cct agt tta gta 96 Asn Glu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Leu Val 20 25 30 gca aag gaa gct aac gta tca ttc cac gac cgt ctt cgc gag atc aca 144 Ala Lys Glu Ala Asn Val Ser Phe His Asp Arg Leu Arg Glu Ile Thr 35 40 45 gac gtc gtg aaa ggg tct gta agc gca gag gtt att tct ttg aaa gct 192 Asp Val Val Lys Gly Ser Val Ser Ala Glu Val Ile Ser Leu Lys Ala 50 55 60 gag gaa atg atc gag gaa gga aaa gaa ctg gcg aag atc gct ccg aac 240 Glu Glu Met Ile Glu Glu Gly Lys Glu Leu Ala Lys Ile Ala Pro Asn 65 70 75 80 att acg gtg aaa atc cca atg acg tct gac ggt tta aaa gcg gta aga 288 Ile Thr Val Lys Ile Pro Met Thr Ser Asp Gly Leu Lys Ala Val Arg 85 90 95 gca ctt act ggc tta ggc atc aaa aca aac gtt aca ttg atc ttc aat 336 Ala Leu Thr Gly Leu Gly Ile Lys Thr Asn Val Thr Leu Ile Phe Asn 100 105 110 gcc aac cag gcg ctt ctt gct gcc aga gcg ggg gca aca tat gta tct 384 Ala Asn Gln Ala Leu Leu Ala Ala Arg Ala Gly Ala Thr Tyr Val Ser 115 120 125 cca ttc ctg gga cgt tta gat gac atc ggc cac aac ggg ctt gac ctg 432 Pro Phe Leu Gly Arg Leu Asp Asp Ile Gly His Asn Gly Leu Asp Leu 130 135 140 att tca gaa gtt aaa cag att ttt gac att cac ggc ctt gac acg caa 480 Ile Ser Glu Val Lys Gln Ile Phe Asp Ile His Gly Leu Asp Thr Gln 145 150 155 160 atc att gca gcg tca atc cgc cat ccg cag cac gtg aca gaa gct gct 528 Ile Ile Ala Ala Ser Ile Arg His Pro Gln His Val Thr Glu Ala Ala 165 170 175 ctt aga ggg gct cat atc ggc aca atg ccg ctg aaa gtc att cat gcg 576 Leu Arg Gly Ala His Ile Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Ile His Ala 180 185 190 ctc act aaa cac ccg tta aca gac aaa gga atc gaa caa ttc ctg gca 624 Leu Thr Lys His Pro Leu Thr Asp Lys Gly Ile Glu Gln Phe Leu Ala 195 200 205 gac tgg aac aaa 636 Asp Trp Asn Lys 210 <210> 2 <211> 212 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 2 Met Leu Phe Phe Val Asp Thr Ala Asn Ile Asp Glu Ile Arg Glu Ala 1 5 10 15 Asn Glu Leu Gly Ile Leu Ala Gly Val Thr Thr Asn Pro Ser Leu Val 20 25 30 Ala Lys Glu Ala Asn Val Ser Phe His Asp Arg Leu Arg Glu Ile Thr 35 40 45 Asp Val Val Lys Gly Ser Val Ser Ala Glu Val Ile Ser Leu Lys Ala 50 55 60 Glu Glu Met Ile Glu Glu Gly Lys Glu Leu Ala Lys Ile Ala Pro Asn 65 70 75 80 Ile Thr Val Lys Ile Pro Met Thr Ser Asp Gly Leu Lys Ala Val Arg 85 90 95 Ala Leu Thr Gly Leu Gly Ile Lys Thr Asn Val Thr Leu Ile Phe Asn 100 105 110 Ala Asn Gln Ala Leu Leu Ala Ala Arg Ala Gly Ala Thr Tyr Val Ser 115 120 125 Pro Phe Leu Gly Arg Leu Asp Asp Ile Gly His Asn Gly Leu Asp Leu 130 135 140 Ile Ser Glu Val Lys Gln Ile Phe Asp Ile His Gly Leu Asp Thr Gln 145 150 155 160 Ile Ile Ala Ala Ser Ile Arg His Pro Gln His Val Thr Glu Ala Ala 165 170 175 Leu Arg Gly Ala His Ile Gly Thr Met Pro Leu Lys Val Ile His Ala 180 185 190 Leu Thr Lys His Pro Leu Thr Asp Lys Gly Ile Glu Gln Phe Leu Ala 195 200 205 Asp Trp Asn Lys 210 <210> 3 <211> 954 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(954) <400> 3 atg tct aat caa tac gga gat aag aat tta aag att ttt tct ttg aat 48 Met Ser Asn Gln Tyr Gly Asp Lys Asn Leu Lys Ile Phe Ser Leu Asn 1 5 10 15 tcg aat cca gag ctt gca aaa gaa atc gca gat ata gtt gga gtt caa 96 Ser Asn Pro Glu Leu Ala Lys Glu Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Gln 20 25 30 tta ggg aaa tgt tct gtc aca aga ttt agt gac ggg gaa gtc caa att 144 Leu Gly Lys Cys Ser Val Thr Arg Phe Ser Asp Gly Glu Val Gln Ile 35 40 45 aat atc gaa gaa agt att cgc gga tgt gat tgt tac atc atc cag tct 192 Asn Ile Glu Glu Ser Ile Arg Gly Cys Asp Cys Tyr Ile Ile Gln Ser 50 55 60 aca agt gac ccc gtt aac gag cat att atg gaa ctg ctg att atg gta 240 Thr Ser Asp Pro Val Asn Glu His Ile Met Glu Leu Leu Ile Met Val 65 70 75 80 gat gcg tta aaa cgc gct tct gca aaa acg att aac att gtt att cct 288 Asp Ala Leu Lys Arg Ala Ser Ala Lys Thr Ile Asn Ile Val Ile Pro 85 90 95 tat tac ggt tat gcg cgt caa gac aga aaa gca aga tcc cgt gag cca 336 Tyr Tyr Gly Tyr Ala Arg Gln Asp Arg Lys Ala Arg Ser Arg Glu Pro 100 105 110 atc aca gct aaa ctt ttc gct aac ctg ctt gaa aca gcc ggt gcg act 384 Ile Thr Ala Lys Leu Phe Ala Asn Leu Leu Glu Thr Ala Gly Ala Thr 115 120 125 cgt gtg att gca ctt gac ctg cat gcg ccg caa att caa gga ttc ttt 432 Arg Val Ile Ala Leu Asp Leu His Ala Pro Gln Ile Gln Gly Phe Phe 130 135 140 gat ata ccg att gac cac tta atg ggt gtt ccg att tta gga gaa tat 480 Asp Ile Pro Ile Asp His Leu Met Gly Val Pro Ile Leu Gly Glu Tyr 145 150 155 160 ttt gaa ggc aaa aat ctt gaa gat atc gtc att gtt tca cca gac cat 528 Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His 165 170 175 ggc ggt gtg aca cgt gcc cgc aaa ctg gct gac cga cta aaa gcg cca 576 Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro 180 185 190 att gcg att atc gat aaa cgc cgt ccg cgt cca aac gtg gcg gaa gtc 624 Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val 195 200 205 atg aat att gta ggt aac atc gaa ggg aag act gct atc ctc atc gat 672 Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp 210 215 220 gac att att gat act gca ggt acg att aca ctt gct gct aat gcg ctc 720 Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu 225 230 235 240 gtt gaa aac gga gcg aaa gaa gta tat gca tgc tgt aca cac cct gta 768 Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val 245 250 255 cta tca ggc cct gcg gtt gaa cgg att aat aat tca aca att aaa gag 816 Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu 260 265 270 ctt gtt gtg aca aac agc atc aag ctt cct gaa gaa aag aaa att gaa 864 Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu 275 280 285 cgc ttt aag cag ctt tca gtc gga ccg ctt ctg gcc gaa gcg 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Glu Tyr 145 150 155 160 Phe Glu Gly Lys Asn Leu Glu Asp Ile Val Ile Val Ser Pro Asp His 165 170 175 Gly Gly Val Thr Arg Ala Arg Lys Leu Ala Asp Arg Leu Lys Ala Pro 180 185 190 Ile Ala Ile Ile Asp Lys Arg Arg Pro Arg Pro Asn Val Ala Glu Val 195 200 205 Met Asn Ile Val Gly Asn Ile Glu Gly Lys Thr Ala Ile Leu Ile Asp 210 215 220 Asp Ile Ile Asp Thr Ala Gly Thr Ile Thr Leu Ala Ala Asn Ala Leu 225 230 235 240 Val Glu Asn Gly Ala Lys Glu Val Tyr Ala Cys Cys Thr His Pro Val 245 250 255 Leu Ser Gly Pro Ala Val Glu Arg Ile Asn Asn Ser Thr Ile Lys Glu 260 265 270 Leu Val Val Thr Asn Ser Ile Lys Leu Pro Glu Glu Lys Lys Ile Glu 275 280 285 Arg Phe Lys Gln Leu Ser Val Gly Pro Leu Leu Ala Glu Ala Ile Ile 290 295 300 Arg Val His Glu Gln Gln Ser Val Ser Tyr Leu Phe Ser 305 310 315 <210> 5 <211> 858 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(858) <400> 5 atg aag ttt cgt cgc agc ggc aga ttg gtg gac tta aca aat tat ttg 48 Met Lys Phe Arg Arg Ser Gly Arg Leu Val Asp Leu Thr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 tta acc cat ccg cac gag tta ata ccg cta acc ttt ttc tct gag cgg 96 Leu Thr His Pro His Glu Leu Ile Pro Leu Thr Phe Phe Ser Glu Arg 20 25 30 tat gaa tct gca aaa tca tcg atc agt gaa gat tta aca att att aaa 144 Tyr Glu Ser Ala Lys Ser Ser Ile Ser Glu Asp Leu Thr Ile Ile Lys 35 40 45 caa acc ttt gaa cag cag ggg att ggt act ttg ctt act gtt ccc gga 192 Gln Thr Phe Glu Gln Gln Gly Ile Gly Thr Leu Leu Thr Val Pro Gly 50 55 60 gct gcc gga ggc gtt aaa tat att ccg aaa atg aag cag gct gaa gct 240 Ala Ala Gly Gly Val Lys Tyr Ile Pro Lys Met Lys Gln Ala Glu Ala 65 70 75 80 gaa gag ttt gtg cag aca ctt gga cag tcg ctg gca aat cct gag cgt 288 Glu Glu Phe Val Gln Thr Leu Gly Gln Ser Leu Ala Asn Pro Glu Arg 85 90 95 atc ctt ccg ggc ggt tat gta tat tta acg gat atc tta gga aag cca 336 Ile Leu Pro Gly Gly Tyr Val Tyr Leu Thr Asp Ile Leu Gly Lys Pro 100 105 110 tct gta ctc tcc aag gta ggg aag ctg ttt gct tcc gtg ttt gca gag 384 Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu 115 120 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100 105 110 Ser Val Leu Ser Lys Val Gly Lys Leu Phe Ala Ser Val Phe Ala Glu 115 120 125 Arg Glu Ile Asp Val Val Met Thr Val Ala Thr Lys Gly Ile Pro Leu 130 135 140 Ala Tyr Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Asn Val Pro Val Val Ile Val Arg 145 150 155 160 Lys Asp Asn Lys Val Thr Glu Gly Ser Thr Val Ser Ile Asn Tyr Val 165 170 175 Ser Gly Ser Ser Asn Arg Ile Gln Thr Met Ser Leu Ala Lys Arg Ser 180 185 190 Met Lys Thr Gly Ser Asn Val Leu Ile Ile Asp Asp Phe Met Lys Ala 195 200 205 Gly Gly Thr Ile Asn Gly Met Ile Asn Leu Leu Asp Glu Phe Asn Ala 210 215 220 Asn Val Ala Gly Ile Gly Val Leu Val Glu Ala Glu Gly Val Asp Glu 225 230 235 240 Arg Leu Val Asp Glu Tyr Met Ser Leu Leu Thr Leu Ser Thr Ile Asn 245 250 255 Met Lys Glu Lys Ser Ile Glu Ile Gln Asn Gly Asn Phe Leu Arg Phe 260 265 270 Phe Lys Asp Asn Leu Leu Lys Asn Gly Glu Thr Glu Ser 275 280 285 <210> 7 <211> 702 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(702) <400> 7 atg agt gta cat ata ggt gct gaa aaa gga caa att gcg gat act gtg 48 Met Ser Val His Ile Gly Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Asp Thr Val 1 5 10 15 ctt ttg ccg gga gat cct ctc aga gca aaa ttt att gca gaa acg tat 96 Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile Ala Glu Thr Tyr 20 25 30 ctt gaa aat gta gaa tgc tac aat gaa gtc aga ggc atg tat gga ttt 144 Leu Glu Asn Val Glu Cys Tyr Asn Glu Val Arg Gly Met Tyr Gly Phe 35 40 45 acg ggt aca tat aaa ggt aaa aaa atc tca gta caa ggc acg gga atg 192 Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met 50 55 60 gga gtt ccg tct att tca att tat gtg aat gaa tta att caa agc tac 240 Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln Ser Tyr 65 70 75 80 gat gtg caa aat cta ata aga gtc ggt tcc tgc ggc gct att cgt aaa 288 Asp Val Gln Asn Leu Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Ile Arg Lys 85 90 95 gat gtc aaa gtg cga gac gtc att ttg gcg atg acc tcc tca act gat 336 Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp 100 105 110 tca caa atg aac aga gtt gct ttc gga agc gtt gat ttt gcg cct tgc 384 Ser Gln Met Asn Arg Val Ala Phe Gly Ser Val Asp Phe Ala Pro Cys 115 120 125 gca gat ttc gag ctt tta aaa aat gcc tat gat gcc gca aag gat aaa 432 Ala Asp Phe Glu Leu Leu Lys Asn Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Asp Lys 130 135 140 ggt gtg ccg gtg act gta gga agc gta ttt aca gct gac cag ttc tac 480 Gly Val Pro Val Thr Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Gln Phe Tyr 145 150 155 160 aat gac gat tcg caa att gaa aaa ctt gca aaa tac ggt gtg ctt ggc 528 Asn Asp Asp Ser Gln Ile Glu Lys Leu Ala Lys Tyr Gly Val Leu Gly 165 170 175 gtt gaa atg gaa aca act gca ttg tat aca tta gca gcg aag cac gga 576 Val Glu Met Glu Thr Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys His Gly 180 185 190 aga aaa gcc ctg tca att ctc acc gtg agt gat cac gta tta aca gga 624 Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly 195 200 205 gaa gaa acg aca gcg gaa gag cgt caa acg aca ttt cat gat atg ata 672 Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile 210 215 220 gaa gtg gct tta cat tcc gta tca caa taa 702 Glu Val Ala Leu 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Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly 195 200 205 Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile 210 215 220 Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln 225 230 <210> 9 <211> 816 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(816) <400> 9 ttg aag gac aga att gaa cgc gca gcc gct ttt att aaa caa aac ctg 48 Leu Lys Asp Arg Ile Glu Arg Ala Ala Ala Phe Ile Lys Gln Asn Leu 1 5 10 15 ccg gaa tct cca aag atc ggc ctt att tta ggc tca ggt ctt ggc att 96 Pro Glu Ser Pro Lys Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ile 20 25 30 ttg gcg gac gaa atc gaa aat ccg gtc aag ctg aaa tat gaa gat ata 144 Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Val Lys Leu Lys Tyr Glu Asp Ile 35 40 45 cct gaa ttc ccg gta tct act gtt gaa ggg cat gcc gga cag ctt gtg 192 Pro Glu Phe Pro Val Ser Thr Val Glu Gly His Ala Gly Gln Leu Val 50 55 60 ctt ggc act ctt gaa gga gtt tcc gtc att gca atg cag ggc cgc ttt 240 Leu Gly Thr Leu Glu Gly Val Ser Val Ile Ala Met Gln Gly Arg Phe 65 70 75 80 cat ttt tat 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gca gaa gtc cgt ttc tta aga acg atg ggc tct gat gca gtc ggc 624 Pro Ala Glu Val Arg Phe Leu Arg Thr Met Gly Ser Asp Ala Val Gly 195 200 205 atg tct act gtt ccg gaa gtc att gta gcg aat cat gcg gga atg cgg 672 Met Ser Thr Val Pro Glu Val Ile Val Ala Asn His Ala Gly Met Arg 210 215 220 gtt ctt ggc att tcc tgc atc tct aac gcg gca gcc gga att ctg gat 720 Val Leu Gly Ile Ser Cys Ile Ser Asn Ala Ala Ala Gly Ile Leu Asp 225 230 235 240 cag cct tta agt cac gat gaa gtt atg gaa gtg acc gaa aaa gta aaa 768 Gln Pro Leu Ser His Asp Glu Val Met Glu Val Thr Glu Lys Val Lys 245 250 255 gct gga ttc tta aag ctt gtt aaa gcg atc gtc gct cag tac gaa taa 816 Ala Gly Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu 260 265 270 <210> 10 <211> 271 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 10 Leu Lys Asp Arg Ile Glu Arg Ala Ala Ala Phe Ile Lys Gln Asn Leu 1 5 10 15 Pro Glu Ser Pro Lys Ile Gly Leu Ile Leu Gly Ser Gly Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Ala Asp Glu Ile Glu Asn Pro Val Lys Leu Lys Tyr Glu Asp Ile 35 40 45 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Phe Leu Lys Leu Val Lys Ala Ile Val Ala Gln Tyr Glu 260 265 270 <210> 11 <211> 1293 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220> <221> CDS <222> (1)..(1293) <400> 11 atg tct tca gta gtt gta gta ggt acg caa tgg ggc gat gaa gga aaa 48 Met Ser Ser Val Val Val Val Gly Thr Gln Trp Gly Asp Glu Gly Lys 1 5 10 15 ggt aaa att aca gat ttc cta tca gaa aat gca gaa gtg atc gcc cgt 96 Gly Lys Ile Thr Asp Phe Leu Ser Glu Asn Ala Glu Val Ile Ala Arg 20 25 30 tat caa ggc gga aat aac gca ggg cat aca atc aag ttt gac gga atc 144 Tyr Gln Gly Gly Asn Asn Ala Gly His Thr Ile Lys Phe Asp Gly Ile 35 40 45 aca tat aag ctt cac tta atc ccg tct gga att ttc tat aag gat aaa 192 Thr Tyr Lys Leu His Leu Ile Pro Ser Gly Ile Phe Tyr Lys Asp Lys 50 55 60 acg tgt gta atc gga aac gga atg gtt gta gat ccg aaa gca tta gtc 240 Thr Cys Val Ile Gly Asn Gly Met Val Val Asp Pro Lys Ala Leu Val 65 70 75 80 aca gag ctt gcg tat ctt cat gag cgc aac gtg agt aca gat aac ctg 288 Thr Glu Leu Ala Tyr Leu His Glu Arg Asn Val Ser Thr Asp Asn Leu 85 90 95 aga atc agc aac aga gct cac gtc att ctg ccg tat cat ttg aaa ttg 336 Arg Ile Ser Asn Arg Ala His Val Ile Leu Pro Tyr His Leu Lys Leu 100 105 110 gat gaa gtg gaa gaa gag cgt aaa ggg gct aac aag atc ggc aca acg 384 Asp Glu Val Glu Glu Glu Arg Lys Gly Ala Asn Lys Ile Gly Thr Thr 115 120 125 aaa aaa gga atc ggc cct gct tac atg gat aaa gca gcc cgc atc gga 432 Lys Lys Gly Ile Gly Pro Ala Tyr Met Asp Lys Ala Ala Arg Ile Gly 130 135 140 att cgc atc gcg gat ctg tta gac cgt gac gcg ttt gcg gaa aag ctt 480 Ile Arg Ile Ala Asp Leu Leu Asp Arg Asp Ala Phe Ala Glu Lys Leu 145 150 155 160 gag cgc aat ctt gaa gaa aaa aac cgt ctt ctc gag aaa atg tac gag 528 Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu 165 170 175 aca gaa ggg ttt aaa ctt gag gat atc tta gac gaa tat tat gag tac 576 Thr Glu Gly Phe Lys Leu Glu Asp Ile Leu Asp Glu Tyr Tyr Glu Tyr 180 185 190 gga cag cag att aaa aag tat gtt tgc gat aca tct gtt gtc tta aac 624 Gly Gln Gln Ile Lys Lys Tyr Val Cys Asp Thr Ser Val Val Leu Asn 195 200 205 gat gct ctt gat gaa ggg cgc cgt gta tta ttt gaa ggc gca caa ggg 672 Asp Ala Leu Asp Glu Gly Arg Arg Val Leu Phe Glu Gly Ala Gln Gly 210 215 220 gtt atg ctc gat atc gac caa gga aca tac ccg ttt gtt acg tca tct 720 Val Met Leu Asp Ile Asp Gln Gly Thr Tyr Pro Phe Val Thr Ser Ser 225 230 235 240 aac ccg gtt gcc ggc ggt gtc acg atc ggt tct ggt gtc ggc ccg acc 768 Asn Pro Val Ala Gly Gly Val Thr Ile Gly Ser Gly Val Gly Pro Thr 245 250 255 aaa atc aag cac gtt gtc ggt gta tca aaa gca tat acg act cgt gtc 816 Lys Ile Lys His Val Val Gly Val Ser Lys Ala Tyr Thr Thr Arg Val 260 265 270 ggc gac ggt cct ttt ccg act gag ctg aaa gat gaa atc ggc gat caa 864 Gly Asp Gly Pro Phe Pro Thr Glu Leu Lys Asp Glu Ile Gly Asp Gln 275 280 285 atc cgt gaa gtc gga cgc gaa tat gga aca aca aca ggc cgc ccg cgc 912 Ile Arg Glu Val Gly Arg Glu Tyr Gly Thr Thr Thr Gly Arg Pro Arg 290 295 300 cgt gtc ggc tgg ttt gac agc gtt gtt gtc cgc cac gcc cgc cgt gtg 960 Arg Val Gly Trp Phe Asp Ser Val Val Val Arg 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Leu Arg Ser Val Tyr Arg Ala Asn 420 425 430 <210> 12 <211> 430 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 12 Met Ser Ser Val Val Val Val Gly Thr Gln Trp Gly Asp Glu Gly Lys 1 5 10 15 Gly Lys Ile Thr Asp Phe Leu Ser Glu Asn Ala Glu Val Ile Ala Arg 20 25 30 Tyr Gln Gly Gly Asn Asn Ala Gly His Thr Ile Lys Phe Asp Gly Ile 35 40 45 Thr Tyr Lys Leu His Leu Ile Pro Ser Gly Ile Phe Tyr Lys Asp Lys 50 55 60 Thr Cys Val Ile Gly Asn Gly Met Val Val Asp Pro Lys Ala Leu Val 65 70 75 80 Thr Glu Leu Ala Tyr Leu His Glu Arg Asn Val Ser Thr Asp Asn Leu 85 90 95 Arg Ile Ser Asn Arg Ala His Val Ile Leu Pro Tyr His Leu Lys Leu 100 105 110 Asp Glu Val Glu Glu Glu Arg Lys Gly Ala Asn Lys Ile Gly Thr Thr 115 120 125 Lys Lys Gly Ile Gly Pro Ala Tyr Met Asp Lys Ala Ala Arg Ile Gly 130 135 140 Ile Arg Ile Ala Asp Leu Leu Asp Arg Asp Ala Phe Ala Glu Lys Leu 145 150 155 160 Glu Arg Asn Leu Glu Glu Lys Asn Arg Leu Leu Glu Lys Met Tyr Glu 165 170 175 Thr Glu Gly Phe Lys Leu Glu Asp Ile Leu Asp Glu Tyr Tyr Glu Tyr 180 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gag cgc ggc gtt atc 288 Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile 85 90 95 aca aat ccc ttc ttt tta act cct gat cac caa gta ttt gat gcg gag 336 Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu 100 105 110 cat ttg atg ggg aaa tac aga att tcc ggt gtt ccg att gta aat aac 384 His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn 115 120 125 gaa gaa gac cag aag ctt gtt gga att att aca aac cgt gac ctt cgt 432 Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg 130 135 140 ttt att tct gac tac tca atg aaa atc agc gac gtc atg acg aaa gaa 480 Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu 145 150 155 160 gag cta gtt act gca tct gta gga act act ctg gat gaa gct gaa aag 528 Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys 165 170 175 att ttg caa aaa cat aaa att gaa aag ctt cct ctc gta gat gac cag 576 Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln 180 185 190 aat aaa tta aaa ggt ctt atc aca att 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cgt gtt gta gcc ggg gtg ggt gtt ccg caa 960 Gly Ser Ile Cys Thr Thr Arg Val Val Ala Gly Val Gly Val Pro Gln 305 310 315 320 att aca gca att tat gat tgt gcg act gaa gca aga aaa cac ggc aaa 1008 Ile Thr Ala Ile Tyr Asp Cys Ala Thr Glu Ala Arg Lys His Gly Lys 325 330 335 aca atc atc gcc gac ggt ggg att aaa ttc tct ggc gat atc act aaa 1056 Thr Ile Ile Ala Asp Gly Gly Ile Lys Phe Ser Gly Asp Ile Thr Lys 340 345 350 gca ttg gca gcc ggc gga cat gct gtt atg ctc gga agc ttg ctt gca 1104 Ala Leu Ala Ala Gly Gly His Ala Val Met Leu Gly Ser Leu Leu Ala 355 360 365 ggc aca tca gaa agc cct ggt gaa act gaa atc tac caa ggc aga aga 1152 Gly Thr Ser Glu Ser Pro Gly Glu Thr Glu Ile Tyr Gln Gly Arg Arg 370 375 380 ttt aag gta tac cgc ggc atg gga tca gtt gct gca atg gaa aaa gga 1200 Phe Lys Val Tyr Arg Gly Met Gly Ser Val Ala Ala Met Glu Lys Gly 385 390 395 400 agt aaa gac cgt tac ttc caa gaa gaa aac aaa aaa ttt gtt cct gaa 1248 Ser Lys Asp Arg Tyr Phe Gln Glu Glu Asn Lys Lys Phe Val Pro Glu 405 410 415 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Phe Asp Asp Val 1 5 10 15 Leu Leu Val Pro Ala Lys Ser Glu Val Leu Pro His Asp Val Asp Leu 20 25 30 Ser Val Glu Leu Thr Lys Thr Leu Lys Leu Asn Ile Pro Val Ile Ser 35 40 45 Ala Gly Met Asp Thr Val Thr Glu Ser Ala Met Ala Ile Ala Met Ala 50 55 60 Arg Gln Gly Gly Leu Gly Ile Ile His Lys Asn Met Ser Ile Glu Gln 65 70 75 80 Gln Ala Glu Gln Val Asp Lys Val Lys Arg Ser Glu Arg Gly Val Ile 85 90 95 Thr Asn Pro Phe Phe Leu Thr Pro Asp His Gln Val Phe Asp Ala Glu 100 105 110 His Leu Met Gly Lys Tyr Arg Ile Ser Gly Val Pro Ile Val Asn Asn 115 120 125 Glu Glu Asp Gln Lys Leu Val Gly Ile Ile Thr Asn Arg Asp Leu Arg 130 135 140 Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Met Lys Ile Ser Asp Val Met Thr Lys Glu 145 150 155 160 Glu Leu Val Thr Ala Ser Val Gly Thr Thr Leu Asp Glu Ala Glu Lys 165 170 175 Ile Leu Gln Lys His Lys Ile Glu Lys Leu Pro Leu Val Asp Asp Gln 180 185 190 Asn Lys Leu Lys Gly Leu Ile Thr Ile Lys Asp Ile Glu Lys Val Ile 195 200 205 Glu Phe Pro Asn Ser Ser Lys Asp Ile His Gly Arg Leu Ile Val Gly 210 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864 Asn Ile Ile Arg Ile Cys Ala Arg Tyr Asp Asn Leu Asp Ile Ile Glu 275 280 285 gac gtg tac ggc atc aac ctg aga ccg ctg ctg aac ctg gcc gaa aaa 912 Asp Val Tyr Gly Ile Asn Leu Arg Pro Leu Leu Asn Leu Ala Glu Lys 290 295 300 tat tat gat gat aat cca gcg ttc cgt cca aaa gca gac gaa aac agg 960 Tyr Tyr Asp Asp Asn Pro Ala Phe Arg Pro Lys Ala Asp Glu Asn Arg 305 310 315 320 cca gag gat gag att aag caa atc aca aaa atc cat caa gcg att gcc 1008 Pro Glu Asp Glu Ile Lys Gln Ile Thr Lys Ile His Gln Ala Ile Ala 325 330 335 atg atc caa ttc aag ctt gag agc ccg att atc aag aga cgg ccg aac 1056 Met Ile Gln Phe Lys Leu Glu Ser Pro Ile Ile Lys Arg Arg Pro Asn 340 345 350 ttt aat atg gaa gag cgg ctg tta tta gag aaa ata gac tat gac aaa 1104 Phe Asn Met Glu Glu Arg Leu Leu Leu Glu Lys Ile Asp Tyr Asp Lys 355 360 365 aat gaa atc acg ctg aac gga aaa aca tat caa ctg gaa aac acc tgc 1152 Asn Glu Ile Thr Leu Asn Gly Lys Thr Tyr Gln Leu Glu Asn Thr Cys 370 375 380 ttt gcg acg att aat ccg gag cag cca gat cag cta 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80 Gln His Val Leu Arg Asn Gly Ser Gly Arg Val Lys Glu Lys Ile Arg 85 90 95 Asp Ile Phe Ser Gly Val Ile Tyr Asp Arg Glu Ile Asp Glu Leu Ala 100 105 110 Ala Leu Val Tyr Tyr Pro Glu Asp Lys Leu Lys Leu Ile Lys His Asp 115 120 125 Phe Asp Ala Lys Glu Ala Leu Asn Glu Trp Tyr Lys Glu Thr Ile His 130 135 140 Arg Met Ile Lys Leu Val Ser Tyr Cys Ser Ser Lys Tyr Thr Arg Ser 145 150 155 160 Lys Leu Arg Lys Ala Leu Pro Ala Gln Phe Ala Tyr Ile Thr Glu Glu 165 170 175 Leu Leu Tyr Lys Thr Glu Gln Ala Gly Asn Lys Glu Gln Tyr Tyr Ser 180 185 190 Glu Ile Ile Asp Gln Ile Ile Glu Leu Gly Gln Ala Asp Lys Leu Ile 195 200 205 Thr Gly Leu Ala Tyr Ser Val Gln Arg Leu Val Val Asp His Leu His 210 215 220 Val Val Gly Asp Ile Tyr Asp Arg Gly Pro Gln Pro Asp Arg Ile Met 225 230 235 240 Glu Glu Leu Ile Asn Tyr His Ser Val Asp Ile Gln Trp Gly Asn His 245 250 255 Asp Val Leu Trp Ile Gly Ala Tyr Ser Gly Ser Lys Val Cys Leu Ala 260 265 270 Asn Ile Ile Arg Ile Cys Ala Arg Tyr Asp Asn Leu Asp Ile Ile Glu 275 280 285 Asp 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Thr Gly Glu Tyr Ser Ser Leu Phe Gly Lys Arg Ala Met Thr Thr 500 505 510 Phe Glu Arg Tyr Phe Ile Lys Glu Lys Glu Thr His Lys Glu Lys Lys 515 520 525 Asn Pro Tyr Tyr Tyr Leu Arg Glu Asp Glu Ala Thr Cys Arg Asn Ile 530 535 540 Leu Ala Glu Phe Gly Leu Asn Pro Asp His Gly His Ile Ile Asn Gly 545 550 555 560 His Thr Pro Val Lys Glu Ile Glu Gly Glu Asp Pro Ile Lys Ala Asn 565 570 575 Gly Lys Met Ile Val Ile Asp Gly Gly Phe Ser Lys Ala Tyr Gln Ser 580 585 590 Thr Thr Gly Ile Ala Gly Tyr Thr Leu Leu Tyr Asn Ser Tyr Gly Met 595 600 605 Gln Leu Val Ala His Lys His Phe Asn Ser Lys Ala Glu Val Leu Ser 610 615 620 Thr Gly Thr Asp Val Leu Thr Val Lys Arg Leu Val Asp Lys Glu Leu 625 630 635 640 Glu Arg Lys Lys Val Lys Glu Thr Asn Val Gly Glu Glu Leu Leu Gln 645 650 655 Glu Val Ala Ile Leu Glu Ser Leu Arg Glu Tyr Arg Tyr Met Lys 660 665 670 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 gaagttgatgatcaaaa 17 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 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50 <210> 27 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 acagctccag atccatatcc ttctttgacc tgatttcaga agttaaacag 50 <210> 28 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 ggatgacgtt atcgataatg acttcctt 28 <210> 29 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 gagaagcgaa tgaattagga attctaaagc acccattagt tcaacaaacg 50 <210> 30 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 ctgtttaact tctgaaatca ggtcaaagaa ggatatggat ctggagctgt 50 <210> 31 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 taaagcgtga tagacataca gtgctg 26 <210> 32 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 cattgcaaga cttttttcac caagcagaat tcctaattca ttcgcttctc 50 <210> 33 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 gagagagttc aaaattgatc ctttttgacc tgatttcaga agttaaacag 50 <210> 34 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 34 ttgcatatac atgtcaggag cattca 26 <210> 35 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 35 gagaagcgaa tgaattagga attctgcttg gtgaaaaaag tcttgcaatg 50 <210> 36 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 36 ctgtttaact tctgaaatca ggtcaaaaag gatcaatttt gaactctctc 50

Claims (17)

  1. 퓨린계 물질 생산능을 갖고, 트랜스알돌라제의 효소 활성이 저하되도록 변형된 바실러스(Bacillus)속 세균.
  2. 제1항에 있어서, 퓨린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오사이드인 바실러스속 세균.
  3. 제1항에 있어서, 퓨린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오타이드인 바실러스속 세균.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자를 파괴함, 또는 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자의 발현량을 저하시킴에 의해, 트랜스알돌라제 활성이 저하된 바실러스속 세균.
  5. 제4항에 있어서, 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자가 하기 (A) 또는 (B)의 단백질을 암호화하는 유전자인 바실러스속 세균.
    (A) 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질,
    (B) 1개 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 역위를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 트랜스알돌라제 활성을 갖는 단 백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 프럭토스-비스포스파타제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 바실러스속 세균.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제 활성이 상승하도록 추가로 변형된 바실러스속 세균.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 퓨린 오페론의 발현량이 상승하도록 추가로 변형된 바실러스속 세균.
  9. 제8항에 있어서, 퓨린 오페론의 리프레서(repressor)를 암호화하는 유전자인 purR 유전자를 파괴함에 의해, 퓨린 오페론의 발현량이 상승된 바실러스속 세균.
  10. 제1항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 바실러스속 세균.
  11. 제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, IMP 데하이드로게나제 활성이 저하되도록 추가로 변형된 바실러스속 세균.
  12. 제1항 내지 제11항 중의 어느 한 항에 있어서, 바실러스속 세균이 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)인 바실러스속 세균.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 바실러스속 세균을 배지에 배양하여, 상기 세균의 세포내 또는 배지중에 퓨린계 물질을 축적시키고,
    상기 세포 또는 배지로부터 퓨린계 물질을 회수함
    을 포함하는, 퓨린계 물질의 제조법.
  14. 제13항에 있어서, 퓨린계 물질이 퓨린 뉴클레오사이드 또는 퓨린 뉴클레오타이드인, 퓨린계 물질의 제조법.
  15. 제14항에 있어서, 퓨린계 물질이 이노신, 크산토신, 구아노신 및 아데노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오사이드인, 퓨린계 물질의 제조법.
  16. 제14항에 있어서, 퓨린계 물질이 이노신산, 크산틸산, 구아닐산 및 아데닐산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 퓨린 뉴클레오타이드인, 퓨린계 물질의 제조법.
  17. 제15항에 따르는 제조법에 의해 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하고,
    상기 퓨린 뉴클레오사이드에, 폴리인산, 페닐 포스페이트 및 카르바밀 포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 포스페이트 공여체와, 뉴클레오사이드-5'-인산 에스테르를 생성하는 능력을 갖는 미생물 또는 산성 포스파타제를 작용시켜 퓨린 뉴클레오타이드를 생성시키고,
    상기 퓨린 뉴클레오타이드를 회수함
    을 포함하는, 퓨린 뉴클레오타이드의 제조법.
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