KR20010021986A - 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법 - Google Patents

발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에스케리키아 콜라이 purF에 의해 암호화되는 PRPP 아미도트랜스퍼라제 중 아미노산 잔기 1개 또는 2개를 치환시킴으로써 피드백 억제가 실질적으로 완화된 효소를 암호화하는 유전자, purR에 의해 암호화된 퓨린 뉴클레오티드 생합성 시스템중 리프레서가 불활성화된 단백질을 암호화하는 유전자 및 deoD에 의해 암호화되는 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제가 불활성화된 효소를 암호화하는 유전자, purA에 의해 암호화된 석시닐-AMP 신타제가 불활성화된 효소를 암호화하는 유전자, add에 의해 암호화된 6-포스포글루코네이트 데하이드라타제가 불활성화된 효소를 암호화하는 유전자 및 pgi에 의해 암호화되는 포스포글루코스 이소머라제가 불활성화된 효소를 암호화하는 유전자 등을 갖는 미생물을 육종하여 배양시킴을 포함하는 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법{Process for producing purine nucleosides via fermentation}
발효에 의한 이노신 및 구아노신의 제조의 경우, 아데닌 영양요구주 또는 바실러스(Bacillus) 속[참조: 일본 특허 공보 제38-23039호(1963), 제54-17033호(1979), 제55-2956호(1980) 및 제55-45199호(1980), 일본 공개 특허 공보 제56-162998호(1981), 일본 특허 공보 제57-14160호(1982) 및 제57-41915호(1982) 및 일본 공개 특허 공보 제59-42895호(1984)], 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속[참조: 일본 특허 공보 제51-5075호(1976) 및 제58-17592호(1972) 및 Agric. Biol. Chem., 42, 399(1978)] 등에 속하는 퓨린 유사체와 같은 여러가지 약물에 대한 약물 내성을 추가로 부여한 균주를 이용하는 방법이 공지되어 있다.
상기와 같은 돌연변이 균주의 통상적인 획득 방법은 미생물을 UV 조사 및 니트로소구아니딘(N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘) 처리와 같은 돌연변이 처리하고 적합한 선택 배지를 사용하여 목적하는 균주를 선택하는 것이다. 한편, 유전공학 기술을 이용하여 상기와 같은 돌연변이 균주를 육종하는 것이 또한 바실러스 속[참조: 일본 공개 특허 공보 제58-158197호(1983호), 제58-175493호(1983), 제59-28470호(1984), 제60-156388호(1985), 제1-27477호(1989), 제1-174385호(1989), 제3-58787호(1991), 제3-164185호(1991), 제5-84067호(1993) 및 제5-192164호(1993)] 및 브레비박테리움 속[참조: 일본 공개 특허 공보 제63-248394호(1988)]에 속하는 균주에 대해 실시되었다.
본 발명은 각각 5'-이노신산 및 5'-구아닐산의 합성용 원료로서 중요한 이노신 및 구아노신과 같은 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법, 및 상기 제조에 사용되는 신규한 미생물에 관한 것이다.
도 1은 pMAN997의 작제를 나타낸다.
도 2는 상동성 재조합용 유전자의 구조를 나타낸다. 도면에서 숫자는 수득한 단편의 길이(bp)와 5' 말단으로부터의 위치를 나타낸다.
도 3은 상동성 재조합용 유전자의 구조를 나타낸다. 도면에서 숫자는 수득한 단편의 길이(bp) 및 5' 말단으로부터의 위치를 나타낸다.
본 발명의 목적은 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조에 적합한 미생물을 개발하는 것이다.
전술한 목적을 성취하기 위하여, 본 발명자들은 지금까지 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 생산에 사용되던 미생물 속과 상이한, 에스케리키아(Escherichia) 속의 세균 균주에게 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 부여할 것을 착안하여, 이를 성공적으로 실현하였다. 따라서, 본 발명이 완성되었다.
따라서, 본 발명은 에스케리키아 속에 속하며 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 갖는 미생물을 제공하는 것이다.
상세하게는, 본 발명은 미생물의 세포내 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성이 증가됨으로써 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자의 발현량의 증가로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물, 및 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어의 탈조절로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물을 제공한다.
퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소는, 예를 들어, 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 아미도트랜스퍼라제 및 포스포리보실 피로포스페이트(PRPP) 신테타제일 수 있다.
퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어를 탈감작시키는 수단으로서는, 예를 들어, 퓨린 리프레서(repressor)의 결실을 언급할 수 있다.
본 발명은 또한 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응의 차단으로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물을 제공한다.
퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응의 예로는, 석시닐-아데노신 모노포스페이트(AMP) 신테타제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 아데노신 데아미나제, 이노신-구아노신 키나제, 구아노신 모노포스페이트(GMP) 리덕타제, 5-포스포글루코네이트 데하이드라제, 포스포글루코스 이소머라제, 아데닌 데아미나제 및 크산토신 포스포릴라제로부터 선택된 효소에 의해 촉매되는 것들이 있다.
본 발명은 또한 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입의 약화로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물을 제공한다.
미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입은 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입에 관련된 반응을 차단시킴으로써 약화시킬 수 있다. 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입에 관련된 반응의 예는 뉴클레오사이드 퍼미아제에 의해 촉매되는 반응이다.
본 발명은 또한 전술한 미생물을 배양 배지내에서 배양시켜 배지내에 퓨린 뉴클레오사이드를 축적시키고, 상기 퓨린 뉴클레오사이드를 수집함을 포함하는, 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법을 제공한다.
이후 본 발명을 상세하게 설명한다.
(1) 에스케리키아 속에 속하며 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 갖는 미생물
본 발명에서 사용되는 에스케리키아 속에 속하는 미생물의 예로서는, 에스케리키아 콜라이(E. coli) 등을 언급할 수 있다. 이. 콜라이 균주를 유전 공학 기술에 의해 육종할 경우, 이. 콜라이 K12 균주를 이용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퓨린 뉴클레오사이드"는, 예를 들어, 이노신, 구아노신 및 아데노신이 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "퓨린 뉴클레오사이드-생산능"은 배지내에 퓨린 뉴클레오사이드를 생산하여 축적시키는 능력을 의미한다. 용어 "퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 갖는"이란 에스케리키아 속에 속하며 배지내에 퓨린 뉴클레오사이드를 W3110 균주와 같은 야생형 이. 콜라이보다 더 다량으로 축적시키는 미생물을 의미하며, 바람직하게는, 하기 실시예 1에 기재된 조건하에서 이노신을 배지내에 50㎎/L 이상의 양, 보다 바람직하게는 100㎎/L 이상의 양, 보다 더 바람직하게는 200㎎/L 이상의 양, 가장 바람직하게는 500㎎/L 이상의 양으로 생산하여 축적시키는 미생물을 의미한다.
에스케리키아 속에 속하며 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 갖는 미생물을 육종하기 위해서, 미생물의 세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성을 증가시키는 방법에 의한 육종법, 예를 들어, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자의 발현량을 증가시키는 방법에 의한 육종법을 채택할 수 있다. 별법으로, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어를 탈감작시키는 방법에 의한 육종법을 채택할 수 있다.
또한, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응을 차단시키는 방법에 의한 육종법 및 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입을 약화시키는 방법에 의한 육종법이 있다.
(2) 미생물의 세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성이 증가된 미생물
퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 모든 효소 및 에스케리키아 속에 속하는 미생물내에서 상기 효소에 의해 촉매되는 모든 반응은 이미 밝혀져 있다[참조: Escherichia coli and Salmonella, CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, Second Edition vol. 1 and vol. 2, ASM PRESS, WASHINGTON D.C.]. 퓨린 뉴클레오사이드-생산능은 효소 중 효소 촉매 속도-제한 반응의 활성을 증가시킴으로써 부여할 수 있다. 속도-제한 단계의 반응을 촉매시키는 효소의 예는 PRPP 아미도트랜스퍼라제 또는 PRPP 신테타제이다.
세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성을 증가시키는 방법의 예가 이후 설명되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성을 증가시키는 방법으로서는, 상기 효소에 대한 유전자의 발현량을 증가시키는 방법을 언급할 수 있다.
상기 유전자의 발현량을 증가시키는 방법의 예로는 상기 유전자의 조절 영역의 개선 및 상기 유전자의 복제수의 증가가 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
조절 영역의 개선은 유전자의 전사량이 증가되도록 하는 개질을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는, 예를 들어, 프로모터내로 돌연변이를 도입시켜 프로모터의 다운스트림에 위치하는 유전자의 전사량을 증가시킴으로써 증강시킬 수 있다. 프로모터내로 돌연변이를 도입시키는 방법외에, lac, trp, tac, trc 및 PL과 같이 미생물내에서 작용하는 다른 프로모터를 새롭게 도입시킬 수 있다. 또한, 인핸서를 새로이 도입시켜 유전자의 전사량을 증가시킬 수 있다. 염색체 DNA내로의 프로모터와 같은 유전자의 도입은, 예를 들어, 일본 공개 특허 공보 제1-215280(1989)에 기재되어 있다.
상세하게는, 유전자의 복제수는 유전자를 다중-복제 벡터에 연결시켜 재조합 DNA를 형성시키고, 미생물이 상기 재조합 DNA를 갖도록 함으로써 증가시킬 수 있다. 상기 벡터로는 플라스미드 및 파아지와 같이 널리 사용되는 것들이 있으며, 이들외에, 트랜스포손[참조: Berg, D.E. 및 Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)] 및 Mu 파아지[참조: 일본 공개 특허 공보 제2-109985호(1990)]가 있다. 또한, 상동성 재조합용 플라스미드 등을 이용하여 유전자의 복제수를 증가시키는 방법에 의해 염색체내로 유전자를 통합시킬 수 있다.
에스케리키아 속에 속하며 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자의 발현량이 증가된 미생물을 육종하기 위해서, 주로 이. 콜라이 유전자에 대해 이미 입수가능한 정보를 기초로 하며, 미생물의 육종법에 사용되는 PCR(폴리머라제 쇄 반응)에 의한 증폭법으로 유전자의 필수 영역을 수득할 수 있다.
예를 들어, PRPP 아미도트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자인 purF는 PCR 기술을 사용하여 이. 콜라이 K12 W3110 균주(ATCC27325)의 염색체 DNA로부터 클로닝시킬 수 있다. 이에 사용되는 염색체 DNA는 이. 콜라이 균주로부터 유도된 것일 수 있다. purF는 PRPP 아미도트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 의미하며, 이는 아데노신 모노포스페이트(AMP) 또는 구아노신 모노포스페이트(GMP)에 의해 피드백 억제시킨 것이며, 유전자 다형태 등으로 인해 발생된 돌연변이체를 포함한다. 유전자 다형태란 단백질의 아미노산 서열이 유전자에 대한 천연 발생 돌연변이로 인하여 부분적으로 변형되는 현상을 의미한다.
세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성을 증가시키는 방법으로서, 상기 효소의 구조 유전자내로 돌연변이를 도입시켜 효소 자체의 효소 활성을 증강시키는 것이 바람직하다.
세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성을 증가시키는 방법으로서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어를 탈감작시키는 것이 가능하다.
퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어는 상기 효소의 활성을 네가티브하게 제어하는 메카니즘을 의미하며, 생합성 경로 중에서의 중간체 또는 최종 산물에 의한 피드백 억제, 감쇠, 전사 억제 등이 있다. 미생물에 의해 생산된 퓨린 뉴클레오사이드는 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성을 억제시키거나 제어를 통하여 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 억제시킨다. 따라서, 미생물이 퓨린 뉴클레오사이드를 생산하도록 하기 위해서는, 상기 제어를 탈감작시키는 것이 바람직하다.
조절되는, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소로는 PRPP 아미도트랜스퍼라제가 있으며, 이를 아데노신 디포스페이트(ADP)에 의해 피드백 억제되는 AMP 또는 GMP 및 PRPP 신테타제에 의해 피드백 억제시킨다. 그외에, 이노신 모노포스페이트 데히드로게나제(guaB) 및 GMP 신테타제(guaA)를 GMP에 의해 피드백 억제시킨다. 또한, 퓨린 오페론, guaBA를 억제시킨다.
제어를 탈감작시키는 방법으로서는, 상기 효소 또는 이의 조절 영역을 암호화하는 유전자내로 돌연변이를 도입시키는 방법을 언급할 수 있다. 돌연변이법으로는 구조 유전자내에서의 통상적인 돌연변이인, 피드백 억제를 탈감작시키는 돌연변이가 있다. 돌연변이법으로는 또한 감쇠기에서의 통상적인 돌연변이인, 감쇠를 탈감작시키는 돌연변이가 있다. 돌연변이법으로는 또한 리프레서로 명명된 조절 단백질을 암호화하는 유전자에서의 통상적인 돌연변이, 또는 오퍼레이터 영역에서의 돌연변이인, 억제를 탈감작시키는 돌연변이가 있다.
억제를 탈감작시키는 돌연변이로는 퓨린 리프레서를 불활성화시키는 돌연변이가 있다. 퓨린 리프레서는 퓨린 뉴클레오사이드가 다량으로 존재하는 조건하에서 퓨린 오페론의 오퍼레이터 영역에 결합하여, 오페론의 전사를 억제시킨다. 리프레서의 불활성화로 억제를 탈감작시킨다.
유전자내로 돌연변이를 도입시키기 위하여, 부위-특이적 돌연변이[참조: Kramer, W. 및 Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350(1987)], 재조합 PCR 기술[참조: PCR Technology, Stockton Press(1989)], DNA의 특정 영역의 화학적 합성, 당해 유전자의 하이드록실아민 처리, UV 조사 또는 니트로소구아니딘 또는 아질산 등과 같은 화학적 시약으로 당해 유전자를 갖는 미생물 균주를 처리하는 방법을 사용할 수 있다. 유전자의 기능이 완전히 불활성화되지 않은 경우, 적합한 제한 부위에 DNA 첨가 또는 결실을 도입시킬 수 있다.
퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어를 탈감작시킨 미생물은 효소 활성 검정법을 통하여 효소의 발현량을 측정하거나, 항체를 사용하여 선택할 수 있다. 효소의 제어가 탈감작된 돌연변이 균주를 수득하기 위한 방법의 예로서는, 8-아자아데닌 및 8-아자구아닌과 같은 퓨린 유사체를 함유하는 최소 배지내에서 생육하는 균주를 선택하고, 효소의 발현량 또는 활성의 변화를 측정함을 포함하는 방법이 있다.
(3) 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응의 차단으로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물
에스케리키아 속에 속하는 미생물의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성 경로는 이미 밝혀져 있으며, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 모든 효소 및 이들 효소에 의해 촉매시키는 반응 또한 밝혀져 있다(Escherichia coli and Salmonella, CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, Second Edition, vol. 1 and vol. 2, ASM PRESS WASHINGTON D.C.). 또한, 다른 대사물질을 발생시키는 반응의 일부가 또한 밝혀져 있다.
다른 대사물질을 발생시키는 반응이 차단된 미생물은 상기 대사물질을 요구하게 될 수 있다. 대사물질을 필요로 하게 된 미생물을 배양시키기 위해서는, 상기 대사물질 또는 이의 중간물질(전구체)을 영양원으로서 배양 배지에 가하는 것이 필수적이다. 따라서, 차단될 경우 상기 대사물질의 과량 첨가를 필요로 하지 않는 반응을 차단시킬 반응으로서 선택하여야 하는 것이 바람직하다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능은 다른 대사물질을 발생시키는 반응 중 어느 하나를 차단시킴으로써 항상 개선될 수 있는 것은 아니다. 퓨린 뉴클레오사이드 중간체 또는 퓨린 뉴클레오사이드를 다른 대사물질로 전환시키는 반응이 미생물에 의한 퓨린 뉴클레오사이드 제조 동안 진행될 경우, 상기와 같은 반응을 차단시키면 퓨린 뉴클레오사이드 생산성을 개선시킬 수 있다.
반응을 차단시키면 퓨린 뉴클레오사이드-생산능이 실질적으로 향상될 수 있는 반응은 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 이미 밝혀진 퓨린 뉴클레오사이드 생합성 도식을 기본으로 하는 다른 대산물질의 생산을 유발하는 반응 중에서 예측할 수 있다.
퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응을 차단시키는 방법으로서는, 상기 반응 등을 촉매시키는 효소를 결실시키거나 불활성화시키는 방법을 언급할 수 있다. 상기 효소는, 예를 들어, 상기 효소를 암호화하는 유전자를 결실시킴으로써 결실시킬 수 있다. 상기 효소는, 예를 들어, 상기 효소를 암호화하는 유전자내에 돌연변이를 도입시키는 방법, 상기 효소를 특이적으로 불활성화시키는 시약을 첨가하는 방법 등으로 불활성화시킬 수 있다.
차단시키면 퓨린 뉴클레오사이드-생산능이 실질적으로 향상될 수 있는, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응의 예는 석시닐-AMP 신타제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 아데노신 데아미나제, 이노신-구아노신 키나제, GMP 리덕타제, 6-포스포글루코네이트 데하이드라제, 포스포글루코스 이소머라제, 아데닌 데아미나제 및 크산토신 포스포릴라제로부터 선택된 효소에 의해 촉매되는 반응을 포함한다.
예를 들어, IMP로부터 석시닐-AMP로의 분기 및 이노신으로부터 하이포크산틴으로의 전환을 차단시킬 경우, IMP는 AMP로 전환되지 않으며 이노신은 하이포크산틴으로 전환되지 않는다. 따라서, 이노신이 축적될 것으로 예측된다. 상기와 같은 차단의 효과를 평가하기 위하여, 상기 목적에 따라 수득한 돌연변이주를 배양할 수 있으며, 이의 이노신 생산성을 측정할 수 있다.
이후의 실시예에 기재되는 바와 같이, 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA 유전자)를 파괴시켜 이. 콜라이를 아데닌 영양요구성으로 만들 경우, 아데닌 및 아데노신과 같은 AMP 물질을 이. 콜라이의 아데닌 영양요구주의 성장용 배양 배지에 가하는 것이 필수적으로 된다. 그러나, 이. 콜라이에서 첨가된 물질이 즉시 이노신 또는 하이포크산틴으로 전환되고, AMP 물질의 소실로 인하여 특정 시점에서 이의 성장이 중단됨을 발견하게 된다. 따라서, 이. 콜라이의 대사 경로로부터 판단할 경우, 이의 성장을 유지시키는 방법으로서 아데노신의 이노신으로의 전환에 관련된 아데노신 데아미나제 또는 아데닌의 하이포크산틴으로의 전환에 관련된 아데닌 데아미나제를 불활성화시키는 것이 필수적인 것으로 판단된다. 따라서, 아데노신 데아미나제 또는 아데닌 데아미나제의 불활성화 효과가 확인되며, 이노신 축적이 관찰된다.
GMP 내성은 GMP의 IMP로의 전환에 관련된다. 구아노신 생산성은 GMP 리덕타제를 불활성화시킴으로써 향상되는 것으로 예상된다. 하기 실시예에 제시된 바와 같이, 구아노신 축적에 있어서 일정 수준의 증진이 관찰된다.
글루코스와 같은 탄소원을 퓨린 뉴클레오사이드 생산에 사용한다. 사용되는 탄소원 또는 배양 조건에 따라서 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로 이끄는 당 대사 시스템에 있어서 차이가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 대한 대사 시스템을 유리하게 진행시키기 위해서는, 펜토스 포스페이트 경로가 우선되도록 펜토스 포스페이트 경로외의 분지 경로를 차단하는 것이 고려된다. 이의 방법으로서는, 6-포스포글루코네이트 데하이드라제 또는 포스포글루코스 이소머라제의 불활성화가 시험되어 이의 효과가 확인되었다.
(4) 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입을 약화시킴으로써 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물
세포로부터 외부로 방출된 퓨린 뉴클레오사이드가 다시 세포로 혼입되는 것이 퓨린 뉴클레오사이드 축적용 에너지 관점에서 타당치 않은 것으로 간주되기 때문에, 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입을 약화시키는 것이 효과적이다.
세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입을 약화시키는 수단으로서는, 퓨린 뉴클레오사이드의 막 투과성에 관련된 반응의 차단을 언급할 수 있다. 상기 반응의 차단은 상기 (3)에 대해 기재된 바와 동일한 방법으로 수행할 수 있다.
예를 들어, 세포내로 퓨린 뉴클레오사이드 혼입에 관련된 퍼미아제 중 하나인 뉴클레오사이드 퍼미아제를 불활성화시킴으로써, 이노신 축적에서의 개선이 관찰된다.
(5) 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법
퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 갖는 미생물을 사용한 발효에 의해 퓨린 뉴클레오사이드를 제조하는 방법을 이후 설명한다.
사용될 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 배양 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 경우에 따라 기타 유기 성분을 함유하는 통상의 배지일 수 있다. 탄소원으로서는, 전분, 예를 들어, 글루코스, 락토스, 갈락토스, 프럭토스, 아라비노스, 말토스, 크실로스, 트레할로스, 리보스 및 전분의 가수분해물; 알콜, 예를 들어, 글리세롤, 만니톨 및 솔비톨; 유기산, 예를 들어, 글루콘산, 푸마르산, 시트르산 및 석신산 등을 사용할 수 있다. 질소원으로서는, 무기 암모늄, 예를 들어, 황산암모늄, 염화암모늄 및 인산암모늄; 유기 질소, 예를 들어, 대두 가수분해물; 암모니아 기체; 수성 암모니아 등을 사용할 수 있다. 비타민 B1과 같은 비타민, 요구되는 물질, 예를 들어, 아데닌 및 RNA와 같은 핵산, 또는 효모 추출물 등이 미량의 유기 영양원으로서 적절한 양으로 함유된다. 이들외에, 소량의 인산칼슘, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온 등을 경우에 따라 가할 수 있다.
배양은 호기성 조건하에서 16 내지 72시간 동안 수행하는 것이 바람직하며, 배양 동안 배양 온도는 30 내지 45℃내에서 조정하며 pH는 5 내지 8내에서 조정한다. pH는 무기 또는 유기산 또는 알칼리성 물질뿐만 아니라 암모니아 기체를 사용하여 조정할 수 있다.
퓨린 뉴클레오사이드는 발효액으로부터 이온 교환 수지를 이용하는 기술 및 침전법과 같은 통상의 방법으로 또는 조합하여 회수할 수 있다.
(6) 퓨린 뉴클레오사이드-생산 세균의 구체적인 예
먼저, purF(PRPP 아미도트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자), purR(퓨린 리프레서를 암호화하는 유전자), deoD(퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제를 암호화하는 유전자), purA(석시닐-AMP 신타제를 암호화하는 유전자), add(아데노신 데아미나제를 암호화하는 유전자), gsk(이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자), guaC(GMP 리덕타제를 암호화하는 유전자), edd(6-포스포글루코네이트 데하이드라제를 암호화하는 유전자), pgi(포스포글루코스 이소머라제를 암호화하는 유전자), yicP(아데닌 데아미나제를 암호화하는 유전자), prs(PRPP 신테타제를 암호화하는 유전자), xapA(크산토신 포스포릴라제를 암호화하는 유전자) 및 nupG(뉴클레오사이드 퍼미아제를 암호화하는 유전자)를 에스케리키아 콜라이 K12 균주 W3110(ATCC27325)의 염색체 DNA로부터 PCR 기술을 사용하여 클로닝시키고, 이들을 이들의 목적에 따라 돌연변이시킬 수 있다. 이 공정에서 사용되는 염색체 DNA는 이. 콜라이의 어떠한 균주로부터도 수득할 수 있다.
purF내로 도입시킨 돌연변이는 purF를 파괴시키기 위한 돌연변이 또는 PRPP 아미도트랜스퍼라제의 피드백 억제를 탈감작시키기 위한 돌연변이이다. purR내로 도입시킨 돌연변이는 purR을 파괴시키기 위한 돌연변이이다. deoD내로 도입시킨 돌연변이는 deoD를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. purA주으로 도입시킨 돌연변이는 purA를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. add내로 도입시킨 돌연변이는 add를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. gsk내로 도입시킨 돌연변이는 gsk를 파괴시키기 위한 돌연변이이다.
guaC내로 도입시킨 돌연변이는 guaC를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. edd내로 도입시킨 돌연변이는 edd를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. pgi내로 도입시킨 돌연변이는 pgi를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. yicP내로 도입시킨 돌연변이는 yicP를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. prs내로 도입시킨 돌연변이는 PRPP 신테타제의 피드백 억제를 탈감작시키기 위한 돌연변이이다. xapA내로 도입시킨 돌연변이는 xapA를 파괴시키기 위한 돌연변이이다. nupG내로 도입시킨 돌연변이는 nupG를 파괴시키기 위한 돌연변이이다.
유전자내로 돌연변이를 도입시키기 위하여, 부위-특이적 돌연변이유발[참조: Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350(1987)], 재조합 PCR 기술[참조: PCR Technology, Stockton Press(1989)], DNA의 특정 영역의 화학적 합성, 당해 유전자의 하이드록실아민 처리, 당해 유전자를 갖는 미생물 균주의 UV 조사 또는 니트로소구아니딘 또는 질산과 같은 화학적 시약에 의한 처리 등을 사용할 수 있다. 유전자의 기능이 완전히 불활성화되어야 할 경우, DNA의 첨가 또는 결실을 적합한 제한 부위에 도입시킬 수 있다.
이어서, PRPP 아미도트랜스퍼라제 및 PRPP 신테타제의 피드백 억제를 탈감작시키기 위한 돌연변이가 각각 첨가된 purF 및 prs를 재조합 DNA로서 적합한 미생물내로 도입시켜 이들 유전자를 발현시킴으로써, 피드백 억제가 실질적으로 탈감작된, PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF) 및 PRPP 신테타제 유전자(prs)를 함유하는 미생물을 수득한다. 상기 수득한 재조합 DNA는 피드백 억제가 실질적으로 탈감작된 PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF) 및 PRPP 신테타제(prs)와 같은 유용한 유전자가 패신저로서 통합되어 있는, 플라스미드 및 파아지와 같은 벡터를 의미한다. 벡터는 lac, trp, tac, trc 및 PL과 같이, 미생물내에서 작동가능한 프로모터를 함유할 수 있어, 유용한 유전자의 효율적인 발현을 수득할 수 있다.
본원에서 사용되는 재조합 DNA는 트랜스포손[참조: Berg, D.E. 및 Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)], Mu 파아지[참조: 일본 공개 특허 공보 제2-109985호(1990)], 상동성 재조합용 플라스미드 등을 사용하여 염색체내로 유용한 유전자를 통합시켜 수득한 것들 중 하나를 포함한다.
상동성 재조합용 플라스미드로서는, 온도-감응성 복제 기원을 갖는 플라스미드를 사용할 수 있다. 온도-감응성 복제 기원을 갖는 플라스미드는, 예를 들어, 30℃ 주변의 허용 온도에서 복제할 수 있지만, 비-허용 온도, 예를 들어, 37 내지 42℃에서는 복제할 수 없다. 온도-감응성 복제 기원을 갖는 플라스미드를 사용하는 상동성 재조합법에서는, 플라스미드가 허용 온도에서 복제될 수 있거나, 경우에 따라 비-허용 온도에서 소실될 수 있다. 이후 기술된 실시예에서는, VspI-HindIII 단편이 pUC19(Takara Shuzo)의 것으로 대체된 pMAN031[참조: J. Bacteriol., 162, 1196(1985)]에 상응하는 pMAN997(도 1)를 상동성 재조합용 플라스미드로서 사용한다.
염색체에 대한 특정 유전자 기능을 상동성 재조합법[참조: Experiments in Moleculargenetics, Cold Spring Habor Lab.(1972)]으로 불활성화시켜 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 향상시킨다. 불활성화시킬 유전자는 불활성화로 인해 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자의 발현량이 증가되는 유전자이다. 상세하게는, 염색체 상의 퓨린 리프레서 유전자(purR)를 파괴시켜 PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF)를 포함한 퓨린 뉴클레오티드 생합성 유전자의 발현 조절 메카니즘을 제거한다.
또한, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응을 촉매시키는 효소를 암호화하는 유전자를 파괴시킨다. 상세하게는, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD)를 파괴시켜 이노신 및 구아노신이 각각 하이포크산틴 및 구아닌으로 분해되는 것을 억제시킨다. 또한, 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA)를 파괴시켜 아데닌 영양요구성을 부여한다. 또한, 아데노신 데아미나제 유전자(add)를 파괴시켜 아데노신의 이노신으로의 전환을 억제시킨다. 최종적으로, 이노신-구아노신 키나제 유전자(gsk)를 파괴시켜 이노신 및 구아노신이 각각 IMP 및 GMP로 전환되는 것을 억제시킨다. GMP 리덕타제 유전자(guaC)를 파괴시켜 GMP의 IMP로의 전환을 억제시킨다. 6-포스포글루코네이트 데하이드라제 유전자(edd)를 파괴시켜 엔트너-도우도로프(Entner-Doudoroff) 경로를 통한 당의 대사를 억제시킨다. 포스포글루코스 이소머라제 유전자(pgi)를 파괴시켜 해당 경로를 통한 당의 대사를 억제시켜 펜토스 포스페이트 경로 중으로의 유동을 촉진시킨다. 아데닌 데아미나제 유전자(yicP)를 파괴시켜 아데닌의 하이포크산틴으로의 전환을 억제시킨다. 크산토신 포스포릴라제 유전자(xapA)를 파괴시켜 크산토신이 크산틴으로 분해되는 것을 억제시키고 이노신 및 구아노신이 각각 하이포크산틴 및 구아닌으로 분해되는 것을 억제시킨다. 표적 유전자의 불활성화는 또한 물론 상기 유전자를 갖는 미생물 균주의 UV 조사 또는 니트로소구아니딘 및 질산과 같은 화학적 시약으로의 처리에 의해 수행할 수 있다.
재조합 DNA를 갖는 미생물로서는, PRPP 아미도트랜스퍼라제와 같은 표적 효소를 암호화하는 유전자를 발현시키는 에스케리키아 속에 속하는 미생물을 사용한다.
PRPP 아미도트랜스퍼라제(purF)를 효율적으로 이용하기 위하여, 다른 유용한 유전자, 예를 들어, purF외에 PRPP로부터 IMP 생합성에 관련된 유전자(purD, purT, purL, purM, purK, purE, purC, purB, purH), IMP 데히드로게나제 유전자(guaB), GMP 신테타제 유전자(guaA), PRPP 신테타제 유전자(prs) 등과 함께 사용하는 것이 바람직하다. PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF)와 같이, 이들 유용한 유전자는 숙주 염색체 상에, 또는 플라스미드 또는 파아지에 존재할 수 있다.
purA(석시닐-AMP 신타제 유전자) 결실 및/또는 deoD(퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자) 결실 및/또는 purR(퓨린 리프레서 유전자) 및/또는 탈감작형 purF(PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자) 결실 및/또는 add(아데노신 데아미나제 유전자) 결실 및/또는 gsk(이노신-구아노신 키나제 유전자) 결실 및/또는 guaC(GMP 리덕타제 유전자) 결실 및/또는 edd(6-포스포글루코네이트 데하이드라제 유전자) 결실 및/또는 pgi(포스포글루코스 이소머라제 유전자)의 결실 및/또는 yicP(아데닌 데아미나제 유전자) 결실 및/또는 xapA(크산토신 포스포릴라제 유전자) 결실 및/또는 nupG(뉴클레오사이드 퍼미아제 유전자) 결실을 갖는 미생물, 또는 상기한 바와 같이 수득한 탈감작형 PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF) 및/또는 탈감작형 prs(PRPP 신테타제 유전자)를 갖는 재조합 DNA로 형질전환시킨 미생물을 배양시켜 이노신 및 구아노신과 같은 표적 퓨린 뉴클레오사이드를 배양 배지내에 축적시키고, 축적된 뉴클레오사이드를 수집한다.
실시예 1
1) PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF)가 결실된 균주의 육종
주형으로서의 이. 콜라이 K12 균주 W3110(ATCC27325)의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG(서열 1) 및 CTCAAGCTTTCATCCTTCGTTATGCATTTCG(서열 2)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(GenBank 수탁 번호 M26893)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 및 31-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), SD-ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 purF 구조 유전자 영역의 약 1530bp의 증폭된 단편을 pCRTMII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝시킨다. 상기 PCR 생성물의 증폭된 단편을 상기 벡터내로 그대로 클로닝시킬 수 있다. 상기 벡터는 클로닝 부위의 양측 간극에 제한 부위로서 EcoRI 부위를 갖는다. PstI 부위와 HindIII 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다.
클로닝된 1530bp purF 단편은 5' 말단으로부터 약 880bp에 BglII 부위 1개를 함유하며, pCRTMII 벡터 자체가 또한 BglII 부위 1개를 갖는다. 따라서, 상기 플라스미드를 BglII로 부분적으로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제로 평활-말단화시킨 다음, T4 DNA 리가제로 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB(1% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 0.1% NaCl, 0.1% 글루코스, pH 7) 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 18개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, EcoRI 분해에 의해 약 1550bp의 단편(이 단편은 BglII로 분해되지 않는다)을 제공하는 플라스미드 DNA(pCRTMIIpurF'#14)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드 DNA에 함유된 purF는 BglII 부위에서 프레임 쉬프트를 가지며, 따라서, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 2).
이후, pCRTMIIpurF'#14를 EcoRI로 분해하여 purF를 포함하는 약 1.6kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 VspI-HindIII 단편이 pUC19의 것으로 대체된 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(Takara Shuzo)인 pMAN997의 EcoRI 부위내로 삽입하여, 플라스미드 pMAN997purF'#14를 수득한다. 이. 콜라이 W3110(야생형)을 30℃에서 상기 pMAN997purF'#14로 형질전환시키고, 수득한 콜로니 중 일부를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 상기 배양시킨 세균 세포를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트에 단일 콜로니가 수득되도록 플레이팅시켜, 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 상기 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이후, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)에 접종하여, 진탕시키면서 42℃에서 3 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하여, 각각을 LB 아가 플레이트 및 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장하는 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론 중에서, 최소 배지(Na2HPO46.8g, KH2PO43g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, MgSO4·7H2O 0.5g, CaCl2·2H2O 15㎎, 티아민·HCl 2㎎, 글루코스 0.2g/1L)에서는 성장하지 않지만, 하이포크산틴 50㎎/L가 보충된 최소 배지내에서 성장하는 클론을 추가로 선택한다. 또한, purF를 포함하는 약 1.5kb의 단편을 상기 수득한 표적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시켜, BglII에 의해 분해되지 않았음을 확인한다. 상기 조건을 만족시키는 클론은 purF가 결실된 균주로 간주되며, F-2-51 및 F-1-72로 표시한다.
2) 석시닐-AMP 신타제 유전자(purA)가 결실된 균주의 육종
주형으로서의 이. 콜라이 K12 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC(서열 3) 및 CTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC(서열 4)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(GenBank 수탁 번호 J04199)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 31-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 purA 구조 유전자 영역의 약 1300bp의 증폭된 단편을 pUC18 벡터(Takara Shuzo)의 SacI와 SalI 부위 사이에 클로닝시킨다. 상기 PCR 생성물내에 SacI 부위와 SalI 부위가 각각 제공된다. 약 1300bp의 상기 클로닝된 purA 단편은 5' 말단으로부터 약 520bp 및 710bp에 각각 HpaI 부위 1개와 SnaBI 부위 1개를 함유하며, 따라서 상기 플라스미드를 HpaI 및 SnaBI로 분해하고, T4 DNA 리가제로 연결시켜 약 190bp의 단편이 제거된 플라스미드를 수득한다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 18개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, FspI로 분해되지만 SacI 및 SalI 분해에 의해 약 1100bp의 단편을 제공하는 플라스미드 DNA(pUC18purA'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드 DNA에 함유된 purA는 HpaI와 SnaBI 부위 사이의 결실을 가지며, 따라서, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 2).
이후, pUCpurA'#1을 SacI 및 SalI로 분해하여 purA를 포함하는 약 1.1kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 SacI 부위 및 SalI 부위 사이에 삽입하여, 플라스미드 pMAN997purA'#1을 수득한다. 균주 F-2-51(purF-)을 30℃에서 상기 pMAN997purA'#1로 형질전환시키고, 수득한 콜로니 중 일부를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 상기 배양시킨 세균 세포를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트에 단일 콜로니가 수득되도록 플레이팅시켜, 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 상기 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이후, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)에 접종하여, 진탕시키면서 42℃에서 3 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하여, 각각을 LB 아가 플레이트 및 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장하는 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론 중에서, 하이포크산틴 50㎎/L가 보충된 최소 배지에서는 성장하지 않지만, 아데닌 50㎎/L가 보충된 최소 배지에서는 성장하는 클론을 추가로 선택한다. 또한, purA를 포함하는 약 1.1kb의 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR로 증폭시켜, 야생형보다 더 작으며(약 1.3kb) FspI에 의해 분해되지 않았음을 확인한다. 상기 조건을 만족시키는 클론은 purA가 결실된 균주로 간주되며, FA-31로 표시한다.
3) 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 유전자(deoD)가 결실된 균주의 육종
주형으로서의 이. 콜라이 K12 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGTCGACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC(서열 5) 및 CTCGCATGCCCGTGCTTTACCAAAGCGAATC(서열 6)를 가지며, 주요 단어로서 "deoD"를 사용한 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 조사를 통하여 수득한 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 30-mer 및 31-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), SD-ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 deoD 구조 유전자 영역을 포함하는 약 1350bp의 증폭된 단편을 pCRTMII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝시킨다. 상기 벡터는 클로닝 부위의 양측 간극에 제한 부위로서 EcoRI 부위를 갖는다. SalI 부위와 SphI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다. 약 1350bp의 상기 클로닝된 deoD 단편은 5' 말단으로부터 약 680bp에 HpaI 부위 1개를 함유하며, 따라서 상기 플라스미드를 HpaI로 분해하고, 상기 분해된 플라스미드와 10-mer ClaI 링커의 혼합물을 T4 리가제 반응에 적용시킨다. 그 결과, ClaI 부위가 HpaI 부위에 삽입된다. 이. 콜라이 HB101의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 16개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, HpaI로 분해되지 않지만 ClaI로 분해되는 플라스미드 DNA(pCRTMIIdeoD'#16)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드 DNA에 함유된 deoD는 HpaI 부위에서 프레임 쉬프트를 가지며, 따라서, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 2).
이후, pCRTMIIdeoD'#16을 EcoRI로 분해하여 deoD를 포함하는 약 1.35kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 EcoRI 부위내로 삽입하여, 플라스미드 pMAN997deoD'#16을 수득한다. 균주 F-1-72(purF-) 및 균주 FA-31(purF-, purA-)을 30℃에서 상기 pMAN997deoD'#16으로 형질전환시키고, 수득한 콜로니 중 일부를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 상기 배양시킨 세균 세포를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트에 단일 콜로니가 수득되도록 플레이팅시켜, 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 상기 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이후, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)에 접종하여, 진탕시키면서 42℃에서 3 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하여, 각각을 LB 아가 플레이트 및 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장하는 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론을 이노신 1g/L가 보충된 LB 배지상에서 성장시키고, 이노신을 하이포크산틴으로 분해하지 않는 클론을 배양 배지의 박층 크로마토그래피를 통하여 선택한다. 또한, deoD를 포함하는 약 1.35kb의 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR로 증폭시켜, ClaI에 의해 분해되지만 HpaI에 의해 분해되지 않았음을 확인한다. 상기 조건을 만족시키는 클론은 deoD가 결실된 균주로 간주되며, 균주 F-1-72(purF-) 및 균주 FA-31(purF-, purA-)로부터 유도된 클론을 각각 FD-6 및 FAD-25로 표시한다.
4) 퓨린 리프레서 유전자(purR)가 결실된 균주의 육종
주형으로서의 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGTCGACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG(서열 7) 및 CTCGCATGCTTAACGACGATAGTCGCGG(서열 8)를 가지며, 주요 단어로서 "purR"을 사용하여 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 조사를 통하여 수득한 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 및 28-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 purR 구조 유전자 영역 및 ATG의 5' 업스트림 영역 약 800bp를 포함하는 약 1.8kb의 증폭된 단편을 pUC19 벡터(Takara Shuzo)의 SalI 부위 및 SphI 부위 사이에 클로닝시킨다. 상기 PCR 프라이머내에 SalI 부위와 SphI 부위가 각각 제공되며, 이들 부위는 클로닝용으로 사용된다. 약 1.8kb의 상기 클로닝된 purR 단편은 5' 말단으로부터 약 810bp(purR 구조 유전자 영역 중 N-말단의 간극)에 PmaCI 부위 1개를 함유하며, 따라서 상기 플라스미드를 PmaCI로 분해한다. 분해된 플라스미드와 8-mer BglII 링커의 혼합물을 T4 DNA 리가제 반응시킨다. 그 결과, BglII 부위가 PmaCI 부위에 삽입된다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, PmaCI로 분해되지 않지만 BglII로 분해되는 플라스미드 DNA(pUC19purR'#2)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드 DNA에 함유된 purR은 PmaCI 부위에서 프레임 쉬프트를 가지며, 따라서, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 2).
이후, pUC19purR'#2를 SacI 및 SphI로 분해하여 purR을 포함하는 약 1.8kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 SacI 부위 및 SphI 부위 사이에 삽입하여, 플라스미드 pMAN997purR'#2를 수득한다. 균주 FD-6(purF-, deoD-) 및 균주 FAD-25(purF-, purA-, deoD-)을 30℃에서 상기 pMAN997purR'#2로 형질전환시키고, 수득한 콜로니 중 일부를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 상기 배양시킨 세균 세포를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트에 단일 콜로니가 수득되도록 플레이팅시켜, 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 상기 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이후, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)에 접종하여, 진탕시키면서 42℃에서 3 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하여, 각각을 LB 아가 플레이트 및 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장하는 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론으로부터 10개의 클론을 임의로 선택하고, purR을 포함하는 약 1.8kb의 단편을 이들 클론의 염색체 DNA로부터의 PCR로 증폭시키고, BglII로 분해되지만 PmacI로 분해되지 않는 클론을 선택한다. 이들 클론은 purR이 결실된 균주로 간주되며, 균주 FD-6(purF-, deoD-) 및 균주 FAD-25(purF-, purA-, deoD-)로부터 유도된 클론을 각각 FDR-18 및 균주 FADR-8로 표시한다. purR이 파괴된 균주에서의 PRPP 아미도트랜스퍼라제 활성은 deoD가 결실된 purF+균주와 purA, deoD 및 purR가 결실된 purR 또는 purF+균주를 사용하여 파괴시킨 균주와 비교하여 증가한 것으로 확인되었다. PRPP 아미도트랜스퍼라제 활성은 하기 문헌에 기재된 방법에 따라서 측정한다[참조: L. J. Messenger et al., J. Biol. Chem., 254, 3382(1979)].
5) 탈감작형 PRPP 아미도트랜스퍼라제 유전자(purF)의 작제
purF 단편을 PstI 및 HindIII로 분해하여 섹션 1)에서 pCRTMII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝시킨 약 1530bp의 purF를 포함하는 플라스미드로부터 절단하여 돌연변이 도입용 플라스미드, pKF18(Takara Shuzo)의 다중-클로닝 부위의 PstI 및 HindIII 부위 사이에 삽입하여 표적 클론(pKFpurF)을 수득한다. 문헌[참조: G. Zhou et al. J. Biol. Chem., 269, 6784(1994)]에는 326번 위치에서의 Lys(K)가 Gln(Q)로 대체되어 있는 PRPP 아미도트랜스퍼라제(PurF) 및 410번 위치의 Pro(P)가 또한 Trp(W)로 대체되어 있는 PRPP 아미도트랜스퍼라제는 각각 GMP 및 AMP에 의해 피드백 억제에 대해 탈감작된다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, PRPP 아미도트랜스퍼라제(PurF)의 326번 위치에서의 Lys(K) 및 410번 위치에서의 Pro(P) 각각의 Gln(Q) 및 Trp(W)로의 돌연변이를 실현시키는 유전자 치환을 위해 다음 합성 DNA 프라이머를 제조하고, pKFpurF를 부위-지시된 돌연변이 시스템 Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo)의 프로토콜에 따라서 부위-지시 돌연변이시켜 부위-지시된 돌연변이를 pKFpurF내로 도입시킨다.
K326Q 돌연변이용 프라이머:
5'-GGGCTTCGTT CAG AACCGCTATGTTGG-3'(서열 9)
P410W 돌연변이용 프라이머:
5'-TATGGTATTGATATG TGG AGCGCCACGGAAC-3'(서열 10)
돌연변이 후, 발생된 각각의 형질전환체로부터 6개의 클론을 선택하고, 이들로부터 플라스미드를 제조한다. 돌연변이가 도입된 위치 근처의 플라스미드를 뉴클레오티드 서열화하여, 표적 돌연변이주가 수득되었는지 확인한다. 수득한 플라스미드를 각각 pKFpurFKQ 및 pKFpurFPW로 표시한다. 돌연변이 P410W(410Pro→Trp)를 또한 동일한 방법으로 pKFpurFKQ내로 도입시켜 동시에 2개의 돌연변이를 갖는 돌연변이 플라스미드 pKFpurFKQPW를 제조한다. 각각의 플라스미드 pKFpurFKQ, pKFpurFPW 및 pKFpurFKQPW는 pKF18로부터 유도된 lacp/o(락토스 오페론의 프로모터)의 삽입된 돌연변이체 purF 다운스트림을 가지며, purF는 상기 프로모터의 제어하에서 발현된다.
이. 콜라이 JM109 세포를 상기 플라스미드로 형질전환시켜 수득한 재조합 세균을 LB 액체 배지내에서 8시간 동안 배양시켜, 수집하고, 조 효소 추출물을 이들로부터 제조한다. 상기 추출물의 PRPP 아미도트랜스퍼라제 활성 및 AMP 및 GMP에 의한 억제 정도를 문헌[참조: L. J. Messenger, J. Biol. Chem., 254, 3382(1979)]의 방법에 따라서 측정한다. 결과는 표 1에 제시한다.
PRPP 아미도트랜스퍼라제 활성 및 AMP 및 GMP에 의한 억제
숙주 플라스미드 PRPP 아미도트랜스퍼라제 활성(μmole/min/㎎)
없음 10 mM AMP 10 mM GMP
JM109 - 0.001 - -
JM109 pKFpurF 0.68 0.48 0.10
JM109 pKFpurFKQ 0.34 0.32 0.33
JM109 pKFpurFKQPW 0.18 0.16 0.17
6) 돌연변이체 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW를 섹션 4)에서 제조한 균주 FDR-18(purF-, deoD-, purR-) 및 균주 FADR-8(purF-, purA-, deoD-, purR-)내로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다.
기본 배지 및 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 배양법 및 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가를 이후 설명한다.
1. 기본 배지: MS 배지
최종 농도
글루코스 40g/L(각각 멸균)
(NH4)2SO416g/L
KH2PO41g/L
MgSO4·7H2O 1g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·4H2O 0.01g/L
효모 추출물 2g/L
CaCO330g/L(각각 멸균)
2. 배양법
리프레쉬(refresh) 배양; 보관 세균 접종
LB 아가 배지(경우에 따라 약물을 보충)
37℃, 밤새 배양
종균 배양; 상기 리프레쉬 배양된 세균 접종
LB 액체 배지(경우에 따라 약물 보충)
37℃, 밤새 배양
본 배양; 상기 종균 배양액으로부터 접종된 2%
MS 배지(경우에 따라 아데닌 및 약물 보충)
37℃, 20ml/500-ml 용적 사카구치(Sakaguchi)의 배양 플라스크
3. 분석법
상기 배양 배지의 샘플(500㎕)을 시간 경과에 따라 반복해서 채취하고, 15,000rpm에서 5분간 원심분리시키고, 상등액을 H2O로 4배 희석하여 HPLC로 분석한다. 달리 표시되지 않는 한, 3일간 배양시킨 후 배지 용적당 퓨린 뉴클레오사이드의 축적량을 기준으로 하여 평가한다.
분석 조건:
컬럼: Asahipak GS-220(7.6㎜ ID x 500㎜ L)
완충액: pH는 0.2M NaH2PO4(pH 3.98) 및 인산으로 조정
온도: 55℃
유속: 1.5ml/분
검출: UV 254㎚
체류 시간(분)
이노신 16.40
하이포크산틴 19.27
구아노신 20.94
구아닌 23.55
아데닌 24.92
아데노신 26.75
purA-의 균주(아데닌 영양요구주)의 경우, 아데닌 5㎎/L를 MS 배지에 가한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 2에 제시한다. 미량의 생산이 관찰된 균주 W3110(야생형 균주)와 대조적으로 돌연변이체 purF 플라스미드-도입된 균주의 경우 우수한 이노신 생산이 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(㎎/L) 구아노신(㎎/L)
W3110 - 미량 0
FDR-18 pKFpurFKQ 115 0
FDR-18 pKFpurFKQPW 110 0
FADR-8 pKFpurFKQ 66 0
FADR-8 pKFpurFKQPW 62 0
실시예 2
1) 아데노신 데아미나제 유전자(add)가 결실된 균주의 육종
주형으로서의 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGTCGACGGCTGGATGCCTTACGCATC(서열 11) 및 CTCGCATGCAGTCAGCACGGTATATCGTG(서열 12)를 가지며, 주요 단어로서 "add"를 사용하여 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 조사를 통하여 수득한 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 add 구조 유전자 영역, ATG의 5' 업스트림 영역 약 420bp 및 종결 코돈의 다운스트림 영역 약 370bp를 포함하는 약 1.8kb의 증폭된 단편을 pUC19 벡터(Takara Shuzo)의 SalI 부위 및 SphI 부위 사이에 클로닝시킨다. 상기 PCR 프라이머내에 SalI 부위와 SphI 부위가 각각 제공되며, 이들 부위는 클로닝용으로 사용된다. 약 1.8kb의 상기 클로닝된 add 단편은 5' 말단으로부터 약 880bp에 StuI 부위 1개를 함유하며, 따라서 상기 플라스미드를 StuI로 분해하고, 상기 분해된 플라스미드와 8-mer BglII 링커의 혼합물을 T4 DNA 리가제 반응시킨다. 그 결과, BglII 부위가 StuI 부위에 삽입된다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, StuI로 분해되지 않지만 BglII로 분해되는 플라스미드 DNA(pUC19add'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드 DNA에 함유된 add는 StuI 부위에서 프레임 쉬프트를 가지며, 따라서, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 2).
이후, pUC19add'#1을 SacI 및 SphI로 분해하여 add를 포함하는 약 1.8kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 SacI 및 SphI 부위 사이에 삽입하여, 플라스미드 pMAN997add'#1을 수득한다. 균주 FDR-18(purF-, deoD-, purR-) 및 균주 FADR-8(purF-, purA-, deoD-, purR-)을 30℃에서 상기 pMAN997add'#1로 형질전환시키고, 수득한 콜로니 중 일부를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 상기 배양시킨 세균 세포를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트에 단일 콜로니가 수득되도록 플레이팅시켜, 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 상기 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이후, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)에 접종하여, 진탕시키면서 42℃에서 3 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(10-5내지 10-6희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하여, 각각을 LB 아가 플레이트 및 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장하는 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론을 아데노신 1.5g/L가 보충된 LB 배지내에서 성장시키고, 아데노신을 이노신으로 전환시키지 않는 클론을 배양 배지의 박층 크로마토그래피 분석을 통하여 선택한다. 또한, 약 1.8kb의 add 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터의 PCR로 증폭시키고, BglII로 분해되지만 StuI로 분해되지 않았음을 확인한다. 이들 클론은 add가 결실된 균주로 간주되며, 균주 FDR-18(purF-, deoD-, purR-) 및 균주 FADR-8(purF-, purA-, deoD-, purR-)로부터 유도된 클론을 각각 FDRadd-18-1 및 균주 FADRadd-8-3으로 표시한다.
2) 탈감작형 purF-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW를 섹션 1)에서 육종한 균주 FDR-18(purF-, deoD-, purR-) 및 균주 FADR-8(purF-, purA-, deoD-, purR-)중에 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 균주 FADRadd-8-3의 경우, 야생형 purF 플라스미드(pKFpurF)를 갖는 형질전환체를 또한 제조하고, pKFpurFKQ를 갖는 형질전환체 및 pKFpurFKQPW를 갖는 형질전환체를 비교한다. 기본 배지와 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 배양법 및 분석법은 실시예 1에서와 동일하다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 3에 제시한다. 균주 W3110(야생형 균주)와 비교하여 탁월한 이노신 생산이 관찰된다. 탈감작형 purFKQ 및 purFKQPW의 효과는 야생형 purF와 비교함으로써 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(㎎/L) 구아노신(㎎/L)
W3110 - 미량 0
FDRadd-18-1 pKFpurFKQ 220 0
FDRadd-18-1 pKFpurFKQPW 215 0
FADRadd-8-3 pKFpurFKQ 1080 0
FADRadd-8-3 pKFpurFKQPW 1030 0
FADRadd-8-3 pKFpurF 805 0
실시예 3
1) 상동성 재조합용 탈감작형 purF 플라스미드의 작제
실시예 1, 섹션 1)에서 제조한 purF-균주를 사용함으로써 염색체내에 탈감작형 purF 치환을 도입시키기 위하여, 이미 수득한 purF 단편(약 1.6kb)보다 3'측의 경우 약 0.5kb 더 긴 다른 purF 단편을 제조한다. 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG(서열 1) 및 CTCAAGCTTGTCTGATTTATCACATCATC(서열 13)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 정보를 기초로 하여 제조된 양쪽 말단에 대한 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Modep 9600, Perkin Elmer), SD-ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 purF 구조 유전자 영역을 포함하는 약 2.1kb의 증폭된 단편을 pCRTMII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝시킨다. 상기 클론에 함유된 플라스미드를 pCRTMIIpurFL로 표시한다. pCRTMIIpurFL은 클로닝 부위의 양측 간극에 제한 부위로서 EcoRI 부위를 갖는다. PCR 프라이머내에 PstI 부위 및 HindIII 부위가 각각 제공된다.
이후, pCRTMIIpurFL을 SnaBI 및 HindIII로 분해하여 purF 암호화 영역의 C-말단의 다운스트림에 존재하는 약 0.65kb의 단편을 수득한다. 이 단편을 실시예 1, 섹션 5)에서 수득한 pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW의 SnaBI 부위 및 HindIII 부위 사이에 삽입하여 pKFpurFLKQ 및 pKFpurFLKQPW를 수득한다.
이어서, pKFpurFLKQ 및 pKFpurFLKQPW를 EcoRI 및 HindIII로 분해하여 purFLKQ 및 purFLKQPW를 함유하는 약 2.1kb의 단편을 수득한다. 이들 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터인 pMAN997의 EcoRI 및 HindIII 부위 사이에 삽입하여 각각 플라스미드 pMAN997purFLKQ 및 pMAN997purFLKQPW를 수득한다.
2) 염색체내에 통합된 탈감작형 purF를 갖는 균주의 육종
균주 FDRadd-18-1(purF-, deoD-, purR-, add-) 및 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)을 각각 30℃에서 플라스미드 pMAN997purFLKQ 및 pMAN997purFLKQPW로 형질전환시키고, 수득한 콜로니 중 일부를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이어서, 상기 배양시킨 세균 세포를 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트에 단일 콜로니가 수득되도록 플레이팅시켜, 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 상기 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이후, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)에 접종하여, 진탕시키면서 42℃에서 3 내지 4시간 동안 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(10-5내지 10-6희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하여, 각각을 LB 아가 플레이트 및 암피실린 25㎍/ml를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장하는 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론 중에서, 최소 배지상에서 성장하는 클론을 균주 FDRadd-18-1(purF-, deoD-, purR-, add-)용으로 선택하고, L-히스티딘 100㎎/L 및 아데닌 50㎎/L가 보충된 최소 배지상에서 성장하는 클론을 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)용으로 선택한다.
purF를 포함하는 약 1.8kb의 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 증폭시키고, 상동성 재조합 치환에 의해 돌연변이가 도입된 위치 근처의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 그 결과, 이들이 각각 K326Q(326Lys→Gln)의 돌연변이, K326Q(326Lys→GLn) + P410W(410Pro→Trp) 돌연변이를 함유하는 것으로 확인되었다.
균주 FDRadd-18-1(purF-, deoD-, purR-, add-)로부터 유도된 것들을 균주 FDRADD-18-1::KQ(purFKQ, deoD-, purR-, add-) 및 균주 FDRadd-18-1::KQPW(purFKQPW, deoD-, purR-, add-)로 표시하고, 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)로부터 유도된 것들을 균주 FADRadd-8-3::KQ(purFKQ, purA-, deoD-, purR-, add-) 및 균주 FADRadd-8-3::KQPW(purFKQPW, purA-, deoD-, purR-, add-)로 표시한다.
3) 염색체내에 통합된 탈감작형 purF를 갖는 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
섹션 2)에서 제조된 균주 FDRADD-18-1::KQ(purFKQ, deoD-, purR-, add-), 균주 FDRadd-18-1::KQPW(purFKQPW, deoD-, purR-, add-), 균주 FADRadd-8-3::KQ(purFKQ, purA-, deoD-, purR-, add-) 및 균주 FADRadd-8-3::KQPW(purFKQPW, purA-, deoD-, purR-, add-)의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 기본 배지와 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 배양법 및 분석법은 실시예 1에서와 동일하다. purA-의 균주(아데닌 영양요구성)의 경우, 아데닌 5㎎/L를 MS 배지에 가한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 4에 제시한다. 균주 W3110(야생형 균주)와 비교하여 탁월한 이노신 생산이 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
균주 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(㎎/L) 구아노신(㎎/L)
W3110 미량 0
FDRadd-18-1::KQ 110 0
FDRadd-18-1::KQPW 105 0
FADRadd-8-3::KQ 635 0
FADRadd-8-3::KQPW 620 0
실시예 4
1) 이노신-구아노신 키나제 유전자(gsk)가 결실된 균주의 육종
균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGAGCTCATGAAATTTCCCGG(서열 14) 및 CTCGGATCCGGTACCATGCTG(서열 15)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(GenBank 수탁 번호 제D00798호)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 23-mer와 21-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 gsk 구조 유전자 영역을 포함하는 약 1.5kb의 증폭된 단편을 pUC18 벡터(Takara Shuzo)의 SacI 부위 및 BamHI 부위 사이에 클로닝시킨다. SacI 부위 및 BamHI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다.
1.5kb의 클로닝된 gsk 단편은 5' 말단으로부터 약 830bp에 1개의 BglII 부위를 함유하므로, 상기 플라스미드를 BglII로 분해하고, T4 DNA 리가제 반응을 수행하여, 카나마이신 내성(Kmr) 유전자 GenBlock(BamHI 분해, Pharmacia Biotech)을 삽입한다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 50㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 4개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 2.8kb의 단편이 EcoRI 및 SalI 분해에 의해 절단되는 BglII에 의해 분해되지 않는 플라스미드 DNA(pUCgsk'#2)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 gsk는 BglII 부위에 삽입된 이종 유전자를 가지므로, 암호화된 효소는 이의 기능이 소실될 것으로 예상된다(도 2).
이어서, pUCgsk'#2를 SacI, SphI 및 DraI로 분해하여 gsk 및 Kmr유전자를 포함하는 약 2.8kb의 단편을 제조한다. DraI 분해를 사용하여 SacI-SphI 단편의 제조를 용이하게 한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 SacI 및 SphI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pMAN997gsk'#2를 수득한다. 균주 FDR-18(purF-, deoD-, purR-) 및 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)을 30℃에서 플라스미드 pMAN997gsk'#2로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 및 20㎍/ml의 카나마이신을 각각 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장되지 않았지만, 20㎍/ml의 카나마이신을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서는 성장된 클론을 선택한다. 또한, gsk 유전자를 포함하는 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 약 1.5kb의 원래 단편이 아닌, Kmr유전자를 포함하는 약 2.8kb의 단편이 증폭되는 것으로 확인되었다. 또한, 이노신-구아노신 키나제 활성은 이들 중에서 검출되지 않는 것으로 확인되었다. 이노신-구아노신 키나제 활성은 우스다(Usuda) 등의 방법[참조: Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206(1997)]에 따라 측정한다. 이들 클론을 gsk가 결실된 균주로 간주되며, 균주 FDR-18(purF-, deoD-, purR-) 및 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)을 각각 균주 FDRG-18-13 및 균주 FADRaddG-8-3로 표시한다.
2) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
플라스미드 pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW는 약물 선택 마커로서 Kmr유전자를 가지며, 섹션 1)에서 제조된 숙주 균주 FDRG-18-13(purF-, deoD-, purR-, gsk-) 및 FADRaddG-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)은 카나마이신 내성이 되도록 제조되었기 때문에, 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가하기 위하여 pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW를 균주 FDRG-18-13 및 FADRaddG-8-3으로 도입시킴으로써 형질전환체를 수득하기는 어렵다. 따라서, 플라스미드 pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW의 약물 선택 마커 유전자의 교환은 암피실린 내성 유전자를 갖는 pUC18 벡터(Takara Shuzo)를 사용하여 수행한다. lac 프로모터 및 다중 클로닝 부위 사이의 위치적 관계가 pKF18 및 pUC18에 대해 공통적이므로, purFKQ 및 purFKQPW 단편을 PstI 및 HindIII을 사용하여 pKFpurFKQ 및 pKFpurFKQPW로부터 절단하고, 이들을 pUC18의 PstI 및 HindIII 사이에 삽입하여 pUCpurFKQ 및 pUCpurFKQPW를 제조한다. 숙주인, 균주 FDRG-18-13 및 FADRaddG-8-3을 pUCpurFKQ 및 pUCpurFKQPW로 형질전환시키고, 재조합체의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하다. purA-균주(아데닌 영양요구성)의 경우, 5㎎/L의 아데닌을 MS 배지에 가한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 5에 제시한다. 이들 결과로부터, gsk의 결실시, 미생물에 이노신뿐만 아니라, 구아노신이 축적되는 것으로 밝혀졌다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 구아노신(mg/L)
W3110 - 미량 0
FDRG-18-13 pUCpurFKQ 105 139
FDRG-18-13 pUCpurFKQPW 108 93
FADRaddG-8-3 pUCpurFKQ 126 52
FADRaddG-8-3 pUCpurFKQPW 222 49
3) 염색체내에 통합된 탈감작형 purF를 갖는 균주의 육종 및 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
균주 FDRG-18(purF-, deoD-, purR-, gsk-) 및 균주 FADRaddG-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)을 30℃에서 플라스미드 pMAN997purFLKQ 및 pMNA997purFLKQPW로 각각 형질전환시킨다. 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, 단지 LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 암피실린-감응성 클론으로부터, 최소 배지내에서 성장한 클론을 균주 FDRG-18-13(purF-, deoD-, purR-, gsk-)에 대해 추가로 선택하고, 100㎎/L의 L-히스티딘 및 50㎎/L의 아데닌이 보충된 최소 배지내에서 성장한 클론을 균주 FADRaddG-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)에 대해 선택한다.
이들 표적 클론의 염색체 DNA를 제조하고, purF를 포함하는 약 1.5kb의 단편을 PCR에 의해 증폭시키고, 돌연변이가 상동성 재조합에 의한 치환을 통하여 도입되는 위치 주위에서 서열화시킨다. 그 결과, 이들은 각각 K326Q(326Lys→Gln) 및 K326Q(326Lys→Gln) + P410W(410Pro→Trp)의 돌연변이를 갖는 것으로 확인되었다.
균주 FDRG-18-13(purF-, deoD-, purR-, gsk-)으로부터 유도된 균주를 균주 FDRG-18-13::KQ(purFKQ, deoD-, purR-, gsk-) 및 균주 FDRG-18-13::KQPW(purFKQPW, deoD-, purR-, gsk-)로 표시하며, 균주 FADRaddG-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)으로부터 유도된 것을 균주 FADRaddG-8-3::KQ(purFKQ, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-) 및 균주 FADRaddG-8-3::KQPW(purFKQPW, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)로 표시한다.
균주 FADRaddG-8-3::KQ(purFKQ, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)는 개별 번호 AJ13334로 제공된다. 이 균주는 부다페스트 조약하의 국제 기탁물로서 1997년 6월 24일자로 수탁 번호 제FERM BP-5993호로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술 연구소(National Institute of Bioscience and Human-Technology of Ministry of International Trade and Industry: 일본 이바라키켄 305-0046 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반 3고 소재)에 기탁되어 있다.
염색체내에 통합된 탈감작형 purF를 갖는 이들 4종류의 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하다. purA-균주(아데닌 영양요구성)의 경우, 5㎎/L의 아데닌을 MS 배지에 가한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 6에 제시한다. 이들 결과로부터, gsk의 결실시, 미생물에 이노신뿐만 아니라, 구아노신이 축적되는 것으로 밝혀졌다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
균주 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 구아노신(mg/L)
W3110 미량 0
FDRG-18-13::KQ 150 140
FDRG-18-13::KQPW 145 125
FADRaddG-8-3::KQ 550 135
FADRaddG-8-3::KQPW 530 130
실시예 5
1) 상동성 재조합용 야생형 purR 플라스미드의 작제 및 염색체내에 통합된 역 purR+를 갖는 균주의 육종
실시예 1, 섹션 4)에서, pUC19 벡터(Takara Shuzo)의 SalI 부위 및 SphI 부위 사이에 약 1.8kb의 purR 단편을 갖는 플라스미드(pUCpurR)를 수득한다. pUCpurR을 SacI 및 SphI로 분해하여 야생형 purR을 포함하는 약 1.8kb의 단편을 제조한다. 이 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 SacI 부위 및 SphI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pMNA997purR을 수득한다. 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)을 30℃에서 플라스미드 pMAN997purR로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, 단지 LB 아가 플레이트 상에서만 성장된 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 10개의 클론을 암피실린-감응성 클론으로부터 임의로 선택하고, 약 1.8kb의 purR 단편을 이들 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 증폭된 단편이 BglII에 의해서가 아니라, PmaCI에 의해 분해되는 클론을 선택한다. 상기 클론은 purR+역 균주로 간주되며, FADadd-8-3-2(purF-, purA-, deoD-, add-)로 표시한다.
2) 탈감작형 purF-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 균주 FADadd-8-3-2(purF-, purA-, deoD-, add-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 균주 FADRadd-8-3의 경우, pKFpurKQ를 갖는 형질전환체가 또한 제조되며, purR 결실 효과를 비교로 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하다. 5㎎/L의 아데닌을 MS 배지에 보충한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 7에 제시한다. FADadd(purR 야생형)와 비교하여 우수한 이노신 생산이 FADRadd(purR-형)에서 관찰되며, purR 결실 효과가 확인된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 구아노신(mg/L)
W3110 - 미량 0
FADRadd-8-3 pKFpurFKQ 1080 0
FADadd-8-3-2 pKFpurFKQ 930 0
실시예 6
1) 이노신-구아노신 키나제 유전자(gsk)가 결실된 균주의 재육종
균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGGTACCCTGTTGCGTTAAGCCATCCCAGA(서열 16) 및 CTCGCATGCCAACGTACGGCATTAACCTA(서열 17)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(GenBank 수탁 번호 제D00798호)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 32-mer와 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 gsk 구조 유전자 영역(800bp)을 포함하는 약 3.0kb의 증폭된 단편을 pUC19 벡터(Takara Shuzo)의 KpnI 부위 및 SphI 부위 사이에 클로닝시킨다. KpnI 부위 및 SphI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다.
3.0kb의 클로닝된 gsk 단편은 5' 말단으로부터 약 900bp와 1030bp에 2개의 Aro51HI 부위 및 약 1640bp에 1개의 BglII 부위를 함유하므로, 상기 플라스미드를 Aro51HI 및 BglII로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활-말단화시킨다. 이어서, Aro51HI-BglII 단편을 제거하고, 벡터의 DNA를 T4 DNA 리가제에 의해 자가-연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 2.3kb의 단편이 KpnI 및 SphI 분해에 의해 절단되는 Aro51HI 또는 BglII에 의해 분해되지 않는 플라스미드 DNA(pUC19gsk'#10)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 gsk는 Aro51HI 부위 및 BglII 부위 사이에 구조 유전자가 결실되어 있으므로, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 3).
이어서, pUC19gsk'#10을 KpnI 및 SphI로 분해하여 gsk 유전자를 포함하는 약 2.3kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 KpnI 및 SphI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pMAN997gsk'#10을 수득한다. 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)을 30℃에서 플라스미드 pMAN997gsk'#10으로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. 또한, 10개의 클론을 암피실린-감응성 클론으로부터 임의로 선택하고, gsk 유전자를 포함하는 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 상기 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 약 3.0kb의 원래 단편이 아닌, 약 2.3kb의 단편이 증폭된 클론을 선택한다. 또한, 이노신-구아노신 키나제 활성은 이들 중에서 검출되지 않는 것으로 확인되었다. 이노신-구아노신 키나제 활성은 우스다 등의 방법[참조: Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206(1997)]에 따라 측정한다. 상기 클론은 gsk가 결실된 신규 균주로 간주되며, 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)으로부터 유도된 클론을 FADRaddgsk(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)로 표시한다.
2) GMP 리덕타제 유전자(guaC)가 결실된 균주의 육종
균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCAAGCTTACGGCTCTGGTCCACGCCAG(서열 18) 및 CTCCTGCAGCAGCGTTGGGAGATTACAGG(서열 19)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), SD-ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 guaC 구조 유전자 영역을 포함하는 약 2.2kb의 증폭된 단편을 pUC18 벡터(Takara Shuzo)의 HindIII 부위 및 PstI 부위 사이에 클로닝시킨다. HindIII 부위 및 PstI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다.
2.2kb의 클로닝된 guaC 단편은 5' 말단으로부터 약 1.1kb에 1개의 BglII 부위를 함유하므로, 상기 플라스미드를 BglII로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활-말단화시킨 다음, T4 DNA 리가제에 의해 연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 18개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 2.2kb의 단편이 HindIII 및 PstI 분해에 의해 절단되고, BglII에 의해 분해되지 않는 플라스미드 DNA(pUC18guaC'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 guaC는 BglII 부위에서 프레임 쉬프트를 가지므로, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 3).
이어서, pUC18guaC'#1을 HindIII 및 PstI로 분해하여 guaC를 포함하는 약 2.2kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 HindIII 및 PstI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pMAN997guaC'#1을 수득한다. 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-) 및 균주 FADRaddgsk(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-)를 30℃에서 플라스미드 pMAN997guaC'#1로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. guaC를 포함하는 약 2.2kb의 단편을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 PCR에 의해 증폭시키고, 상기 단편은 BglII로 분해되지 않는 것으로 확인되었다. 상기 조건을 만족하는 클론은 guaC가 결실된 균주로 간주되며, 균주 FADRadd-8-3 및 FADRaddgsk로부터 유도된 클론을 각각 FADRaddguaC(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, guaC-) 및 FADRaddgskguaC(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-, guaC-)로 표시한다. 또한, GMP 리덕타제 활성은 이들 중에서 검출되지 않는 것으로 확인되었다. GMP 리덕타제 활성은 비. 비. 가버(B.B.garber) 등의 방법[참조: J. Bacteriol., 43, 105(1980)]에 따라 측정한다.
3) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 섹션 2)에서 제조한 균주 FADRaddguaC(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, guaC-) 및 FADRaddgskguaC(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, gsk-, guaC-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하다. 5㎎/L의 아데닌을 MS 배지에 보충한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 8에 제시한다. 구아노신 생산에 있어서의 특정 수준의 개선은 guaC의 결실에 의해 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 구아노신(mg/L)
FADRadd-8-3 pKFpurFKQ 1080 0
FADRaddguaC pKFpurFKQ 670 20
FADRaddgsk pKFpurFKQ 920 140
FADRaddgskguaC pKFpurFKQ 750 180
실시예 7
1) 6-포스포글루코네이트 데하이드라제 유전자(edd)가 결실된 균주의 육종
균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGAATTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG(서열 20) 및 CTCAAGCTTGGAATAGTCCCTTCGGTAGC(서열 21)를 가지며, 주요 단어로서 "edd"를 사용하여 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 조사를 통하여 수득한 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 edd 구조 유전자 영역, ATG의 5' 업스트림 영역 약 810bp 및 해독 종결 코돈의 다운스트림 영역 약 360bp를 포함하는 약 3.0kb의 증폭된 단편을 pCRTMII 벡터(Invitrogen)로 그대로 클로닝시킨다. PCR 생성물의 증폭된 단편을 상기 벡터내로 그대로 클로닝시킬 수 있다. 벡터는 클로닝 부위의 양측에 근접한 제한 부위로서 EcoRI 부위를 갖는다. BamHI 부위 및 HindIII 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다. 3.0kb의 클로닝된 edd 단편은 5' 말단으로부터 약 660bp 및 1900bp에 2개의 StuI 부위를 함유하므로, 상기 플라스미드를 StuI로 분해한다. 이어서, 약 1.25kb의 StuI 단편을 제거하고, 벡터의 DNA를 T4 DNA 리가제에 의해 자가-연결시킨다. 이. 콜라이 HB101의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 1.25kb의 단편이 StuI에 의해 절단되지 않는 플라스미드 DNA(pCRTMIIedd'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 edd는 프로모터 영역을 포함하는 단백질 암호화 영역이 결실되어 있으므로, 효소는 형성되지 않으리라 예상된다(도 3).
이어서, pCRTMIIedd'#1을 EcoRI로 분해하여 edd의 일부 및 이의 플랭킹 영역을 포함하는 약 1.75kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 EcoRI 부위로 삽입하여 플라스미드 pMAN997edd'#1을 수득한다. 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-)을 30℃에서 플라스미드 pMAN997edd'#1로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시킨 다음, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시켜, LB 아가 플레이트 상에서만 성장된 암피실린-감응성 클론을 선택한다. edd 영역을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 상기 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편의 크기가 약 3.0kb의 야생형이 아닌, 약 1.75kb의 결실 형태인 클론을 선택한다. 상기 클론은 edd가 결실된 균주로 간주되며, FADRaddedd(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-)로 표시한다.
2) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 섹션 1)에서 육종된 균주 FADRaddedd(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하다. 5㎎/L의 아데닌을 MS 배지에 보충한다. edd에 의해 암호화되는 6-포스포글루코네이트 데하이드라제는 글루콘산에 의해 유도되고, 글루코네이트를 피루베이트로 대사시키는 엔트너-도우더로프 경로의 제1 단계에 위치하는 효소이다. 글루코네이트는 이 효소의 결실에 의해 단지 펜토스 포스페이트 경로로 유동하는 것으로 여겨지기 때문에, 글루코스 이외의 탄소원으로서 글루콘산(48g/L 첨가)을 사용하여 평가를 수행한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 9에 제시한다. 이노신 생산에 있어서의 현저한 개선은 글루콘산을 탄소원으로서 사용하는 경우에 edd의 결실에 의해 관찰된다. 또한, 효과는 글루코스를 탄소원으로서 사용하는 경우에 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 탄소원 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 구아노신(mg/L)
FADRadd-8-3 pKFpurFKQ 글루코스 1080 0
FADRaddedd pKFpurFKQ 글루코스 1340 0
FADRadd-8-3 pKFpurFKQ 글루콘산 1050 0
FADRaddedd pKFpurFKQ 글루콘산 2600 0
실시예 8
1) 포스포글루코스 이소머라제 유전자(pgi)가 결실된 균주의 육종
균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGTCGACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC(서열 22) 및 CTCGCATGCGTCGCATCAGGCATCGGTTG(서열 23)를 가지며, 주요 단어로서 "pgi"를 사용하여 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 조사를 통하여 수득한 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 pgi 구조 유전자 영역을 포함하는 약 2.2kb의 증폭된 단편을 pUC18 벡터(Takara Shuzo)의 SalI 부위 및 SphI 부위 사이에 클로닝시킨다. SalI 부위 및 SphI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다. 2.2kb의 클로닝된 pgi 단편은 5' 말단으로부터 약 1170bp 및 1660bp에 1개의 BssHII 부위 및 1개의 MluI 부위를 각각 함유하므로, 상기 플라스미드를 BssHII 및 MluI로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제에 의해 평활-말단화시킨다. 이어서, BssHII 부위 및 MluI 부위 사이의 약 500bp의 단편을 제거하고, 벡터의 DNA를 T4 DNA 리가제에 의해 자가-연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 1.7kb의 단편이 SalI 및 SphI 분해에 의해 절단되는 플라스미드 DNA(pUC18pgi'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 pgi는 BssHII 부위와 MluI 부위 사이에 결실을 가지므로, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 3).
이어서, pUC18pgi'#1을 SalI 및 SphI로 분해하여 pgi를 포함하는 약 1.7kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 SalI 및 SphI 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pMAN997pgi'#1을 수득한다. 균주 FADRadd-8-3(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-) 및 균주 FADRaddedd(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-)를 30℃에서 플라스미드 pMAN997pgi'#1로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. pgi 영역을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 상기 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편의 크기가 약 2.2kb의 야생형이 아닌, 약 1.7kb의 결실형인 클론을 선택한다. 상기 클론은 pgi가 결실된 균주로 간주되며, FADRadd-8-3 및 FADRaddedd로부터 유도된 클론은 각각 FADRaddpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, pgi-) 및 FADRaddeddpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, pgi-)로 표시한다.
2) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 섹션 1)에서 육종된 균주 FADRaddpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, pgi-) 및 균주 FADRaddeddpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, pgi-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하나, 단 생산능 평가에 사용되는 배지인 MS 배지(기본 배지)에서 효모 추출물의 양을 0.8%로 증가시킨다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 10에 제시한다. pgi의 결실에 의해, 성장은 상기 실시예에 사용된 5㎎/L의 아데닌이 보충된 MS 배지에서 상당히 저하된다. 따라서, 효모 추출물의 양을 0.8%로 증가시킨 배지를 사용한다. 이 배지에서, pgi+모균주는 성장률의 증가를 나타냄으로써, 이노신의 생산 및 하이포크산틴의 부생산을 저하시킨다. 반면에, 이노신 생산에 있어서의 현저한 개선은 pgi가 결실된 균주에서 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 하이포크산틴(mg/L)
FADRadd-8-3 pKFpurFKQ 450 260
FADRaddpgi pKFpurFKQ 2770 100
FADRaddedd pKFpurFKQ 780 210
FADRaddeddpgi pKFpurFKQ 3080 120
실시예 9
1) 아데닌 데아미나제 유전자(yicP)가 결실된 균주의 육종
유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)에서, yicP는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터의 아데닌 데아미나제와의 상동성이 높은 ORF(오픈 리딩 프레임: open reading frame, 구조 유전자)로서 등록되어 있다. 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCCTGCAGCGACGTTTTCTTTTATGACA(서열 24) 및 CTCAAGCTTCGTAACTGGTGACTTTTGCC(서열 25)를 가지며, 주요 단어로서 "yicP"를 사용하는 조사를 통하여 수득한 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 yicP 구조 유전자 영역, ATG의 5' 업스트림 영역 약 50bp 및 해독 종결 코돈의 다운스트림 영역 약 40bp를 포함하는 약 1.9kb의 단편을 증폭시킨다. PstI 부위 및 HindIII 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다. PCR 생성물을 PstI 및 HindIII으로 분해하고, pUC18 벡터(Takara Shuzo)의 PstI 부위 및 HindIII 부위 사이에 클로닝시킨다. 1.9kb의 클로닝된 yicP 단편은 5' 말단으로부터 약 540bp 및 590bp에 1개의 HapI 부위 및 1개의 EcoRV 부위를 각각 함유하므로, 상기 플라스미드를 HapI 및 EcoRV로 분해한다. 이어서, 47bp의 HapI-EcoRV 단편을 제거하고, 벡터의 DNA를 T4 DNA 리가제에 의해 자가-연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, HapI 또는 EcoRV로 분해되지 않는 플라스미드 DNA(pUC18yicP'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 yicP는 47bp의 HapI-EcoRV 부위의 결실로 인하여 프레임 쉬프트를 가지며, 이에 따라, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 3).
이어서, pUC18yicP'#1을 PstI 및 HindIII으로 분해하여 yicP 유전자를 포함하는 약 1.9kb의 단편을 제조한다. 상기 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997의 PstI 부위 및 HindIII 부위 사이에 삽입하여 플라스미드 pMAN997yicP'#1을 수득한다. 균주 FADRaddedd(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-)를 30℃에서 플라스미드 pMAN997yicP'#1로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. yicP 영역을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 상기 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편의 크기가 HapI 또는 EcoRV로 분해되지 않는 클론을 선택한다. 아데닌 데아미나제 활성은 이들 클론에서 검출되지 않는 것으로 확인되었다. 아데닌 데아미나제 활성은 퍼 니가드(Per Nygaard) 등의 방법[참조: J. Bacteriol., 178, 846-853(1996)]에 따라 측정한다. 상기 클론은 yicP가 결실된 균주로 간주되며, FADRaddeddyicP(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-)로 표시한다.
2) 아데닌 데아미나제 유전자(yicP)가 결실된 균주로부터의 포스포글루코스 이소머라제 유전자(pgi)가 결실된 균주의 육종
pgi의 결실을 균주 FADRaddeddyicP(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-)에 또한 부가한다. 실시예 8에서 작제된 pMNA997gpi'#1을 사용하여, 실시예 8과 동일한 방법으로 균주 FADRaddeddyicPpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-)를 수득한다.
3) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 섹션 1) 및 2)에서 육종된 균주 FADRaddeddyicP(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-) 및 균주 FADRaddeddyicPpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 아데닌 양에 대한 성장 속도 및 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하나, 단 사용되는 배지는 아데닌이 0 내지 50㎎/L의 양으로 첨가된 MS 배지이다.
아데닌에 대한 성장 반응 및 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 11에 제시한다. yicP의 결실에 의해, 아데닌에 대한 성장률이 개선되고, yicP의 결실 효과는 아데닌이 50㎎/L 및 20㎎/L의 양으로 첨가된 경우에 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 아데닌 첨가량(mg/L) 성장률(OD) 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 하이포크산틴(mg/L)
FADRaddedd pKFpurFKQ 050 2.23.2 870650 00
FADRaddeddyicP pKFpurFKQ 050 2.46.8 8701100 040
FADRaddeddpgi pKFpurFKQ 520 2.23.4 14201760 2848
FADRaddeddyicPpgi pKFpurFKQ 520 2.13.7 13802350 719
실시예 10
1) PRPP 신테타제 유전자(prs)의 제조
균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGTCGACTGCCTAAGGATCTTCTCATGCCTGATATG(서열 26) 및 CTCGCATGCGCCGGGTTCGATTAGTGTTC(서열 27)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 38-mer 및 29-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하고(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), SD-ATG 및 해독 종결 코돈을 포괄하는 prs 구조 유전자 영역을 포함하는 약 1kb의 증폭된 단편을 pUC18 벡터(Takara Shuzo)내로 클로닝시킨다. SalI 부위와 SphI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다. PCR 생성물을 SalI 및 SphI로 분해하고, pUC18 벡터(pUCprs)의 SalI 부위 및 SphI 부위 사이에 클로닝시킨다.
2) 탈감작형 prs의 작제
prs 단편을 SalI 및 SphI 분해에 의해 섹션 1)에서 클로닝된 약 1kb의 prs를 포함하는 플라스미드로부터 절단하고, 돌연변이 도입용 플라스미드인 pKF19K(Takara Shuzo)의 다중 클로닝 부위의 SalI 및 SphI 부위 사이로 삽입하여, 표적 클론(pKFprs)을 수득한다. 에스. 지. 바우어(S.g. Bower)[참조: J. Biol. Chem., 264, 10287(1989)] 등은 PRPP 신테타제(prs)를 AMP 및 ADP에 의한 피드백 억제에 적용시키는 것을 제안하였다. 128번 위치의 Asp(D)가 Ala(A)로 돌연변이된 효소를 부분적으로 탈감작시키는 것을 또한 기술하고 있다. 따라서, 다음의 합성 DNA 프라이머를 128번 PRPP 신테타제(prs)위치에서 Asp(D)를 Ala(A)로 돌연변이시키는 유전자 치환용으로 제조하고, pKFprs는 부위-지시된 Mutagenesis System Mutan-Super Express Km(Takara Shuzo)의 방법에 따라 부위-지시된 돌연변이유발에 적용시켜 부위-지시된 돌연변이를 pKFprs로 도입시킨다.
D128A 돌연변이용 프라이머:
5'-GCGTGCAGAGCCACTATCAGC-3'(서열 28)
돌연변이유발 후에, 12개의 클론을 생성된 형질전환체로부터 임의로 선택하고, 플라스미드를 이들로부터 제조한다. 돌연변이가 도입된 위치 주위의 플라스미드의 뉴클레오티드 서열화에 의해, 표적 돌연변이체의 9개 클론이 수득되는 것으로 확인되었다. prs 단편을 돌연변이형 prs를 갖는 pKFprsDA로부터 SalI 및 SphI로 절단하고, pUC18 및 pSTV18(Takara Shuzo)의 SalI 부위와 SphI 부위 사이에 삽입한다. 야생형 prs를 대조군으로 사용하는 경우에, prs 단편을 위에서 작제된 pUCprs로부터 SalI 및 SphI로 절단하고, pSTV18(Takara Shuzo)의 SalI 부위와 SphI 부위 사이에 삽입한다. 각각의 플라스미드 pUCprsDA 및 pSTVprsDA와 플라스미드 pUCprs 및 pSTVprs는 pUC18 및 pSTV18로부터 각각 유도된 lacp/o(락토스 오페론의 프로모터)의 삽입된 돌연변이체 prs 또는 야생형 prs 다운스트림을 가지며, prs는 이 프로모터의 제어하에 발현된다.
이. 콜라이 JM109 세포를 상기 4개의 플라스미드로 형질전환시켜 수득한 재조합형 세균을 8시간 동안 LB 액체 배지내에서 배양시키고 수집하여, 조 효소 추출물을 이들로부터 제조한다. 상기 추출물의 PRPP 신테타제 활성 및 ADP에 의한 억제도는 부분적으로 변형된 케이. 에프. 젠슨(K. F. Jensen) 등의 방법[참조: Analytical Biochemistry, 98, 254-263(1979)]에 따라 측정한다. 구체적으로는, [a-32P]ATP를 기질로서 사용하고, 반응에 의해 생성된 [32P]AMP를 측정한다. 결과는 표 12에 제시한다.
PRPP 신테타제(Prs) 활성
숙주 플라스미드 특성 특이적 활성(nmol/mim/조 효소 추출물 mg)
없음 5mM ADP
JM109 pUC18 대조군 2.9 측정되지 않음
JM109 pUCprs 고복제율야생형 75.9 측정되지 않음
JM109 pUCprsDA 고복제율돌연변이체형 80.8 20.2
JM109 pSRVprs 중간 복제율야생형 11.5 측정되지 않음
JM109 pSTVprsDA 중간 복제율돌연변이체형 10.6 2.7
3) 탈감작형 prs 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
2개의 플라스미드를 동시에 갖는 균주를 각각 pKFpurFKQ를 실시예 9, 섹션 3)에서 육종된 균주 FADRaddeddyicPpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-)로 도입시켜 형질전환체를 수득하고, 또한 prs 및 prsDA 유전자를 포함하는 pSTVprs 및 pSTVprsDA를 형질전환체로 각각 도입시킴으로써 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하나, 단 MS 배지에서 효모 추출물의 양을 0.4%로 증가시킨다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 13에 제시한다. 플라스미드로서 돌연변이체 prsDA를 도입시킴으로써, 이노신 생산에 있어서의 개선 효과가 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 하이포크산틴(mg/L)
FADRaddeddyicPpgi pKFpurFKQ 1600 8
pKFpurFKQ+pSTVprs 1450 3
pKFpurFKQ+pSTVprsDA 1815 10
실시예 11
1) 크산토신 포스포릴라제 유전자(xapA)가 결실된 균주의 육종
주요 단어로서 "xapA"를 사용하여 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 조사를 통하여 수득된 정보를 기초로 하여 제조된 4개의 프라이머를 사용하여 크로스-오버(Cross-over) PCR에 의한 1단계로 돌연변이에 의해 불활성화된 유전자를 작제한다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
N-out: 5'-CGCGGATCCGCGACATAGCCGTTGTCGCC-3'(서열 29)
N-in: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-3'(서열 30)
C-in: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-3'(서열 31)
C-out: 5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3'(서열 32)
먼저, 균주 W3110의 염색체 DNA 및 양쪽 말단에 대한 프라이머 C-in(39-mer) 및 C-out(29-mer)뿐만 아니라, 프라이머 N-out(29-mer) 및 N-in(39-mer)을 사용하여 PCR을 수행하여(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), 각각 2개의 PCR 생성물(둘다 약 850bp의 단편임)을 수득한다. 이어서, 주형으로서의 2개의 PCR 생성물 및 양쪽 말단에 대한 프라이머 N-out과 C-out의 혼합물을 사용하여 PCR을 다시 수행함으로써 xapA 구조 유전자 영역을 포함하는 유전자 영역이 약 2.4kb(야생형 크기)의 단편으로부터 약 1.7kb의 단편으로 단축된 유전자 단편을 증폭시킨다. BamHI 부위와 HindIII 부위가 각각 PCR 프라이머 N-out 및 C-out에 제공된다. 이러한 PCR 생성물을 BamHI 및 HindIII으로 분해하고, 수득된 단편을 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997을 BamHI 및 HindIII으로 분해하여 수득한 플라스미드와 T4 DNA 리가제에 의해 연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 1.7kb의 단편이 BamHI 및 HindIII 분해에 의해 절단되는 플라스미드 DNA(pMAM997xapA'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드에 함유된 xapA는 구조 유전자에서 약 700bp가 결실되므로, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 3).
균주 FADRaddeddyicPpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-)를 30℃에서 플라스미드 pMAN997xapA'#1로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 이들 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 이들 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. xapA 영역을 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 상기 PCR 프라이머 N-out 및 C-out을 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편의 크기가 약 1.7kb인 클론을 선택한다. 상기 클론은 xapA가 결실된 균주로 간주되며, FADRaddeddyicPpgixapA(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-, xapA-)로 표시한다. xapA가 결실된 균주에 있어서, 배지에서의 크산틴 생산은 보충된 크산토신과의 배양에 의해 관찰되지 않으며, 크산토신 포스포릴라제는 유도되지 않는 것으로 확인되었다. 크산토신 포스포릴라제 활성은 케이. 햄머 제스퍼슨(K. Hammer Jespersen) 등의 방법[참조: Molec.gen.genet., 179, 341-348(1980)]에 따라 측정한다.
2) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 섹션 1)에서 육종된 균주 FADRaddeddyicPpgixapA(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-, xapA-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하나, 단 효모 추출물의 양이 0.8%로 증가된 MS 배지를 사용한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 14에 제시한다. MS 배지에서 효모 추출물의 양이 증가될 경우에, 배양의 후반 과정에서 당의 소비 후에 현저히 유발되는 하이포크산틴의 부생산은 xapA의 결실에 의해 감소되고, 이노신 생산의 개선이 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 배양 기간(일) 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 하이포크산틴(mg/L)
FADRaddeddyicPpgi pKFpurFKQ 3 4640 146
6 1850 1500
FADRaddeddyicPpgixapA pKFpurFKQ 3 5870 57
6 3810 915
실시예 12
1) 뉴클레오사이드 퍼미아제 유전자(nupG)가 결실된 균주의 육종
주형으로서의 균주 W3110의 염색체 DNA, 및 뉴클레오티드 서열 CTCGAATTCATGGTGCCGAACCACCTTGATAAACG(서열 33) 및 CTCGTCGACATGCCGAAACCGGCGAATATAGCGAC(서열 34)를 가지며, 유전자 데이터 뱅크(E. coli Gene Bank)의 정보를 기초로 하여 제조된, 양쪽 말단에 대한 35-mer 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여(94℃, 30초; 55℃, 1분; 72℃, 2분; 30사이클; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), SD-ATG 및 해독 종결 코돈을 포함하는 nupG 구조 유전자 영역의 약 2.7kb의 단편을 증폭시킨다. EcoRI 부위 및 SalI 부위가 각각 PCR 프라이머내에 제공된다. 증폭된 단편을 EcoRI, SalI 및 AflII로 분해한다. PCR-증폭된 단편은 2개의 AflII 부위를 함유하기 때문에, 약 750bp, 820bp 및 1130bp인 3개의 단편이 형성된다. 약 820bp의 AflII 단편외에 약 720bp 및 1130bp인 2개의 단편을 수집하고, pUC18 벡터(Takara Shuzo)를 EoRI 및 salI로 분해하여 수득한 DNA와 T4 DNA 리가제에 의해 연결시킨다. 이. 콜라이 HB101의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 플라스미드 DNA를 발현된 콜로니 중 16개로부터 제조하고, EcoRI 및 SalI로 분해된 단편이 약 1.9kb인 플라스미드 DNA(pUC18nupG'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. pUC18nupG'#1을 EcoRI 및 SalI로 분해하고, 생성된 약 1.9kb의 단편을, 온도-감응성 복제 기원(tsori)을 갖는 상동성 재조합용 벡터(상기한 것)인 pMAN997을 EcoRI 및 SalI로 분해하여 수득한 플라스미드와 T4 DNA 리가제에 의해 연결시킨다. 이. 콜라이 JM109의 경쟁 세포를 상기 연결 용액으로 형질전환시키고, 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 성장한 형질전환체를 수득한다. 플라스미드 DNA를 10개의 클론의 형질전환체로부터 제조하고, 약 1.9kb의 단편이 EcoRI 및 SalI 분해에 의해 절단된 플라스미드 DNA(pMAM997nupG'#1)를 상기 플라스미드 DNA로부터 선택한다. 상기 플라스미드 DNA에 함유된 nupG는 구조 유전자에서 약 820bp가 결실되므로, 암호화된 효소는 이의 기능을 상실한 것으로 예측된다(도 3).
균주 FADRaddeddyicPpgi(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-)를 30℃에서 플라스미드 pMAN997nupG'#1로 형질전환시키고, 수득된 콜로니 중 일부를 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨다. 이후, 배양된 세균 세포를 단일 콜로니가 수득되도록 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시켜 42℃에서 성장한 콜로니를 수득한다. 42℃에서 성장한 단일 콜로니를 수득하기 위한 공정을 1회 반복하고, 전체 플라스미드가 상동성 재조합을 통하여 염색체내에 통합된 클론을 선택한다. 상기 클론은 이들의 세포질내에 플라스미드를 갖지 않는 것으로 확인되었다. 이어서, 상기 클론 중 수개의 클론을 LB 아가 플레이트 상에 스트리킹시켜, 30℃에서 밤새 배양시킨 다음, LB 액체 배지(3ml/시험관)로 접종하여, 42℃에서 3 내지 4시간 동안 교반하에 배양시킨다. 배양액을 단일 콜로니가 수득되도록 적합하게 희석(약 10-5내지 10-6배 희석)시켜, LB 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨 다음, 42℃에서 밤새 배양시켜 콜로니를 수득한다. 발현된 콜로니로부터 100개의 콜로니를 임의로 선택하고, 각각을 LB 아가 플레이트 및 25㎍/ml의 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 각각 성장시키고, LB 아가 플레이트 상에서만 성장한 암피실린-감응성 클론을 선택한다. nupG 영역은 이들 표적 클론의 염색체 DNA로부터 상기 PCR 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고, 증폭된 단편의 크기가 약 1.9kb인 클론을 선택한다. 상기 클론은 nupG가 결실된 균주로 간주되며, FADRaddeddyicPpginupG(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-, nupG-)로 표시한다.
2) 탈감작형 purF 플라스미드-도입된 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
pKFpurFKQ를 섹션 1)에서 육종된 균주 FADRaddeddyicPpginupG(purF-, purA-, deoD-, purR-, add-, edd-, yicP-, pgi-, nupG-)로 도입시켜 형질전환체를 제조하고, 이들 균주의 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 평가한다. 퓨린 뉴클레오사이드 생산용 기본 배지 및 배양법과 분석법은 실시예 1과 동일하나, 단 효모 추출물의 양이 1.2%로 증가된 MS 배지를 사용한다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가 결과는 표 15에 제시한다. MS 배지에서 효모 추출물의 양이 증가될 경우에, 배양의 후반에 당의 소비 후에 현저히 유발되는 하이포크산틴의 부생산은 감소하며, 이노신 생산의 개선이 nupG의 결실에 의해 관찰된다.
퓨린 뉴클레오사이드-생산능의 평가
숙주 플라스미드 퓨린 뉴클레오사이드 축적
이노신(mg/L) 하이포크산틴(mg/L)
FADRaddeddyicPpgi pKFpurFKQ 1190 835
FADRaddeddyicPpginupG pKFpurFKQ 3390 315
본 발명에 따라, 퓨린 뉴클레오사이드-생산 세균을 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에서의 제어에 적용되는 효소의 탈억제 및 탈감작화, 및 추가로 분해 시스템 및 전환 시스템의 차단에 의해 개발한다. 개발된 퓨린 뉴클레오사이드-생산 세균은 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조에 적합하게 사용할 수 있다.

Claims (13)

  1. 에스케리키아 속에 속하며 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 갖는 미생물.
  2. 제1항에 있어서, 미생물의 세포내에서의 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 활성 증가로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물.
  3. 제1항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소에 대한 유전자의 발현량 증가로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물.
  4. 제1항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어의 탈조절로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어가 피드백 억제의 탈감작화에 의해 탈감작된 미생물.
  6. 제3항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소가 포스포리보실 피로포스페이트 아미도트랜스퍼라제인 미생물.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소가 포스포리보실 피로포스페이트 신테타제인 미생물.
  8. 제4항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성에 관련된 효소의 제어가 퓨린 리프레서의 불활성화에 의해 억제된 미생물.
  9. 제1항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응의 차단으로 인해 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 획득한 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 퓨린 뉴클레오사이드 생합성으로부터 분기되며 다른 대사물질을 발생시키는 반응이 석시닐-아데노신 모노포스페이트 신타제, 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제, 아데노신 데아미나제, 이노신-구아노신 키나제, 구아노신 모노포스페이트 리덕타제, 6-포스포글루코네이트 데하이드라제, 포스포글루코스 이소머라제, 아데닌 데아미나제, 및 크산토신 포스포릴라제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소에 의해 촉매되는 반응인 미생물.
  11. 제1항에 있어서, 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입을 약화시킴으로써 퓨린 뉴클레오사이드-생산능을 향상시킨 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드의 혼입이 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드 혼입에 관련된 반응의 차단에 의해 약화되고, 미생물의 세포내로의 퓨린 뉴클레오사이드 혼입에 관련된 반응이 뉴클레오사이드 퍼미아제에 의해 촉매되는 반응인 미생물.
  13. 제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 정의된 바와 같은 미생물을 배양 배지내에서 배양시켜 배지내에 퓨린 뉴클레오사이드를 생산하여 축적시키도록 하고, 상기 퓨린 뉴클레오사이드를 수집함을 포함하는, 발효에 의한 퓨린 뉴클레오사이드의 제조 방법.
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