DE69837041T2 - Verfahren und Mikroorganismus zur Herstellung von Purin-Nukleosiden durch Fermentation - Google Patents

Verfahren und Mikroorganismus zur Herstellung von Purin-Nukleosiden durch Fermentation Download PDF

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von Purinnucleosiden, wie Inosin und Guanosin, die als Ausgangsmaterialien für die Synthese von 5'-Inosinsäure beziehungsweise 5'-Guanylsäure wichtig sind, und ein für die Herstellung eingesetzter neuer Mikroorganismus.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Für die Herstellung von Inosin und Guanosin durch Fermentation gibt es bekannte Verfahren unter Einsatz von Adeninauxotrophen Stämmen oder solchen Stämmen, denen Resistenz gegen verschiedene Arzneimittel, wie Purinanaloga, verliehen worden sind und die zu der Gattung Bacillus gehören (Japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980) und 55-45199 (1980), offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 56-162998 (1981), Japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 57-14160 (1982) und 57-41915 (1982), und offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 59-42895 (1984)), oder zu der Gattung Brevibacterium (Japanische Patentveröffentlichungen Nrn. 51-5075 (1976) und 58-17592 (1972), und Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) und dergleichen gehören.
  • Die herkömmliche Bereitstellung solcher mutierten Stämme umfasst die Mutagenesebehandlung solcher Mikroorganismen, beispielsweise mit UV-Strahlen und Nitrosoguanidin (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin), und das Selektieren eines gewünschten Stammes unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmediums. Andererseits ist auch das Züchten solcher mutierten Stämme unter Verwendung von gentechnologischen Verfahren für Stämme der Gattung Bacillus (offengelegte Japanische Patent anmeldung Nrn. 58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993) und 5-192164 (1993)) und der Gattung Brevibacterium durchgeführt worden (offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 63-248394 (1988)).
  • Offenbarung der Erfindung
  • Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen für die Produktion von Purinnucleosid durch Fermentation geeigneten Mikroorganismus zu erzeugen.
  • Um dieses Ziel zu erreichen, hatten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die Idee, die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosiden auf Bakterienstämme der Gattung Escherichia zu übertragen, wobei sich diese Gattung von den bislang für die Herstellung von Purinnucleosiden durch Fermentation eingesetzten Mikroorganismen unterscheiden, und sie haben dieses Ziel erreicht. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
  • Somit stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid, wie in den Ansprüchen definiert, bereit.
  • Im Speziellen stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus bereit, der die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Deregulation der Kontrolle eines Enzyms, das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt ist, erworben hat.
  • Das in der Purinnucleosidbiosynthese eingesetzte Enzym kann beispielsweise Phosphoribosylpyrophosphat(PRPP)-Amidotransferase und Phosphoribosylpyrophospaht(PRPP)-Synthetase sein.
  • Als Mittel zum Aufheben der Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms kann beispielsweise die Defizienz eines Purinrepressors genannt werden.
  • In einer Ausführungsform hat der Mikroorganismus die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Blockierung einer Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu einem anderen Metaboliten führt, erworben.
  • Beispiele für Reaktionen, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigen und zu einem anderen Metaboliten führen, umfassen solche, die von einem Enzym katalysiert werden, das unter Succinyladenosinmonophosphat(AMP)-Synthase, Purinnucleosidphosphorylase, Adenosindeaminase, Inosinguanosinkinase, Guanosinmonophosphat(GMP)-Reduktase, 5-Phosphogluconatdehydrase, Phosphoglucoseisomerase, Adenindeaminase und Xanthosinphosphorylase ausgewählt ist.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird der Mikroorganismus bezüglich der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Verringerung der Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus verbessert.
  • Die Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus kann durch Blockierung einer Reaktion, die an der Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus beteiligt ist, verringert werden. Ein Beispiel der an der Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus beteiligten Reaktion ist die von Nucleosidpermease katalysierte Reaktion.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zur Produktion eines Purinnucleosids durch Fermentation bereit, welches die Kultivierung des vorstehend genannten Mikroorganismus in einem Kulturmedium unter Produktion und Anhäufung des Purinnucleosids in dem Medium und das Gewinnen des Purinnucleosids umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden eingehend beschrieben.
  • (1) Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
  • Als Beispiel des Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der in der vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann Escherichia coli (E. coli) und dergleichen genannt werden. Wenn E. coli-Stämme durch gentechnologische Verfahren gezüchtet werden, kann der Stamm E. coli K12 eingesetzt werden.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Purinnucleosid" umfasst beispielsweise Inosin, Guanosin und Adenosin.
  • Der hier verwendete Ausdruck "Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid" bedeutet die Fähigkeit, ein Purinnucleosid in einem Medium zu produzieren und anzuhäufen. Der Ausdruck "mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid" bedeutet, dass der Mikroorganismus der Gattung Escherichia ein Purinnucleosid in einem Medium in einer größeren Menge als ein Wildtypstamm von E. coli, beispielsweise der Stamm W3110, produziert und anhäuft, und er bedeutet vorzugsweise, dass der Mikroorganismus Inosin in einem Medium in einer Menge von nicht weniger als 50 mg/l, stärker bevorzugt nicht weniger als 100 mg/l, noch stärker bevorzugt nicht weniger als 200 mg/l, am stärksten bevorzugt nicht weniger als 500 mg/l unter den in dem nachstehenden Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen produziert und anhäuft.
  • Um einen Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid zu züchten, kann die Züchtung durch Aufheben der Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms eingesetzt werden.
  • Außerdem kann ein Züchten durch Blockieren einer Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu einem anderen Metaboliten führt, und die Züchtung durch Verringern der Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus durchgeführt werden.
  • (2) Mikroorganismus, worin eine Aktivität eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms in Zellen des Mikroorganismus erhöht ist
  • Alle Enzyme, die an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt sind, und alle Reaktionen, die durch diese Enzyme in Mikroorganismen der Gattung Escherichia katalysiert werden, sind bereits aufgeklärt worden (Escherichia coli and Salmonella, CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, Second Edition, Vol. 1 und Vol. 2, ASM PRESS, WASHINGTON D.C.). Die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid kann durch Erhöhen einer Aktivität eines Enzyms, das unter den Enzymen eine Geschwindigkeits-bestimmende Reaktion katalysiert, übertragen werden. Ein Beispiel des Enzyms, das eine Geschwindigkeits-bestimmende Stufe katalysiert, ist die PRPP-Amidotransferase oder die PRPP-Synthetase.
  • Beispiele der Vorgehensweisen zur Erhöhung der Aktivität eines Enzyms, das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt ist, in den erfindungsgemäßen Zellen werden nachstehend beschrieben, wobei die Erfindung jedoch nicht darauf beschränkt ist.
  • Als Mittel zum Erhöhen der Aktivität eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms in erfindungsgemäßen Zel len ist es möglich, die Kontrolle des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms aufzuheben.
  • Die Kontrolle des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms bedeutet einen Mechanismus, der die Aktivität des Enzyms negativ kontrolliert, und umfasst die Rückkopplungshemmung durch ein Intermediat in dem Biosyntheseweg oder ein Endprodukt, die Attenuation, die Transkriptionssuppression und dergleichen. Ein durch einen Mikroorganismus hergestelltes Purinnucleosid inhibiert die Aktivität des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms oder reprimiert die Expression eines dieses Enzym codierenden Gens durch die Kontrolle. Um zuzulassen, dass der Mikroorganismus das Purinnucleosid produziert, ist es deshalb bevorzugt, die Kontrolle aufzuheben.
  • Das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligte Enzym, das einer Kontrolle unterliegt, umfasst PRPP-Amidotransferase, die einer Rückkopplungshemmung durch AMP oder GMP unterliegt, und PRPP-Synthetase, die einer Rückkopplungshemmung durch Adenosindiphosphat (ADP) unterliegt. Daneben unterliegen Inosinmonophosphatdehydrogenase (guaB) und GMP-Synthetase (guaA) einer Rückkopplungshemmung durch GMP. Daneben wird das Purinoperon guaBA auch reprimiert.
  • (Beispielsweise kann purF, welches ein für PRPP-Amidotransferase codierendes Gen ist, aus der chromosomalen DNA des Stammes E. coli K12 W3110 (ATCC27325) unter Verwendung der PCR-Technologie kloniert werden. Die dafür eingesetzte chromosomale DNA kann von einem beliebigen Stamm von E. coli stammen. Das Gen purF ist ein für PRPP-Amidotransferase codierendes Gen, das einer Rückkopplungshemmung durch Adenosinmonophosphat (AMP) oder Guanosinmonophosphat (GMP) unterliegt, und umfasst Mutanten, die durch genetischen Poly morphismus oder dergleichen erzeugt werden. Genetischer Polymorphismus bedeutet ein Phänomen, das eine Aminosäuresequenz eines Proteins aufgrund natürlich auftretender Mutationen in dem Gen teilweise verändert ist.)
  • Als ein Verfahren zum Aufheben der Kontrolle kann ein Verfahren zum Einführen einer Mutation in ein dieses Enzym codierende Gen oder in eine regulatorische Region dafür erwähnt werden. Die Mutation umfasst die Mutation zum Aufheben der Rückkopplungshemmung, die üblicherweise eine Mutation in einem Strukturgen ist. Die Mutation umfasst auch die Aufhebung der Attenuation, die üblicherweise eine Mutation in einem Attenuator ist. Die Mutation umfasst auch die Aufhebung der Repression, die üblicherweise eine Mutation in einem Gen, das für ein regulatorisches Protein, das Repressor genannt wird, codiert, oder eine Mutation in einer Operatorregion ist.
  • Die Mutation zur Aufhebung der Repression umfasst die Mutation zur Inaktivierung eines Purinrepressors. Der Purinrepressor bindet an eine Operatorregion eines Purinoperons unter den Bedingungen, dass ein Purinnucleosid in großer Menge vorhanden ist, was zu einer Reprimierung der Transkription des Operons führt. Die Inaktivierung des Repressors führt zu einer Aufhebung der Repression.
  • Um eine Mutation in ein Gen einzuführen, können ortsgerichtete Mutagenese (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), die rekombinante PCR-Technologie (PCR Technology, Stockton Press (1989)), die chemische Synthese eines spezifischen Abschnitts einer DNA, die Hydroxylaminbehandlung eines gewünschten Gens, die Behandlung von mikrobiellen Stämmen, die ein Zielgen enthalten, durch UV-Bestrahlung oder ein chemisches Mittel, wie Nitrosoguanidin oder salpetrige Säure, und dergleichen eingesetzt werden.
  • Wenn die Funktion eines Gens vollständig inaktiviert werden soll, kann die Addition oder Deletion einer DNA an einer geeigneten Restriktionsschnittstelle durchgeführt werden.
  • Ein Mikroorganismus, in dem die Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms aufgehoben ist, kann durch Bestimmen der Expressionsmenge des Enzyms durch einen enzymatischen Aktivitätstest oder unter Verwendung von Antikörpern selektiert werden. Als ein Beispiel eines Verfahrens zum Bereitstellen eines mutierten Stammes, in dem die Kontrolle eines Enzyms aufgehoben ist, kann ein Verfahren genannt werden, bei dem ein Stamm, der in einem Minimalmedium, das ein Purinanalogon, wie 8-Azaadenin und 8-Azaguanidin enthält, wachsen kann, selektiert wird und die Änderung der Expressionsmenge oder die Aktivität des Enzyms bestimmt wird.
  • (3) Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Blockierung einer Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu einem anderen Metaboliten führt, erworben hat
  • Der Purinnucleosidbiosyntheseweg von Mikroorganismen der Gattung Escherichia ist bereits aufgeklärt worden, und alle Enzyme, die an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt sind, und Reaktionen, die durch diese Enzyme katalysiert werden, sind bereits aufgeklärt worden (Escherichia coli and Salmonella, CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, Second Edition, Vol. 1 und Vol. 2, ASM PRESS WASHINGTON D.C.). Daneben sind einige der Reaktionen, die zu anderen Metaboliten führen, aufgeklärt worden.
  • Ein Mikroorganismus, worin eine Reaktion, die zu einem anderen Metaboliten führt, blockiert ist, kann durch diese Blockierung den Metaboliten benötigen. Um einen solchen Mikroor ganismus, der diesen Metaboliten benötigt, zu kultivieren, ist es erforderlich, den Metaboliten oder ein Intermediat (Vorläufer) davon zu einem Kulturmedium als Nährstoff zuzugeben. Deshalb ist es wünschenswert, dass eine Reaktion, die keine zusätzliche Zugabe von Metaboliten erfordert, wenn sie blockiert wird, als Reaktion ausgewählt wird, die blockiert werden soll.
  • Die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid kann durch Blockieren einer Beliebigen der Reaktionen, die zu anderen Metaboliten führt, nicht immer verbessert werden. Wenn eine Reaktion, die ein Purinnucleosidintermediat oder ein Purinnucleosid in einem anderen Metaboliten umwandelt, während der Produktion des Purinnucleosids durch den Mikroorganismus fortschreitet, kann die Blockierung einer solchen Reaktion die Purinnucleosidproduktivität verbessern.
  • Eine Reaktion, deren Blockierung die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid tatsächlich verbessert, kann unter den Reaktionen, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigen und zur Herstellung eines anderen Metaboliten führen, auf der Grundlage des für die Purinnucleosidbiosynthese bereits aufgeklärten Schemas vorhergesagt werden.
  • Als ein Verfahren zur Blockierung der Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu einem anderen Metaboliten führt, kann ein Verfahren zum Entfernen oder Inaktivieren eines die Reaktion katalysierenden Enzyms oder dergleichen erwähnt werden. Das Enzym kann beispielsweise durch Entfernen eines für dieses Enzym codierenden Gens entfernt werden. Das Enzym kann beispielsweise durch Einführen einer Mutation in ein für dieses Enzym codierendes Gen, durch Zugeben eines Mittels, welches das Enzym spezifisch inaktiviert, oder dergleichen inaktiviert werden.
  • Beispiele der Reaktionen, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigen und zu einem anderen Metaboliten führen, deren Blockierung die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid tatsächlich verbessern kann, umfassen eine Reaktion, die von einem Enzym katalysiert wird, das unter Succinyl-AMP-Synthase, Purinnucleosidphosphorylase, Adenosindeaminase, Inosinguanosinkinase, GMP-Reduktase, 6-Phosphogluconatdehydrase, Phosphoglucoseisomerase, Adenindeaminase und Xanthosinphosphorylase ausgewählt ist.
  • Wenn beispielsweise die Verzweigung von IMP zu Succinyl-AMP und die Umwandlung von Inosin zu Hypoxanthin blockiert werden, wird IMP nicht in AMP umgewandelt, und Inosin wird nicht in Hypoxanthin umgewandelt. Dementsprechend wird erwartet, dass Inosin angehäuft wird. Um die Effektivität einer solchen Blockierung abzuschätzen, kann eine Mutante, die für den gewünschten Zweck erhalten wurde, kultiviert werden, und ihre Inosin-Produktivität kann bestimmt werden.
  • Wie in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird, wurde es, wenn E. coli durch Zerstören des Succinyl-AMP-Synthasegens (purA-Gen) Adenin auxotroph gemacht wurde, erforderlich, eine AMP-Substanz, wie Adenin und Adenosin, zu einem Kulturmedium zuzugeben, damit die Adenin-auxotrophen Zellen von E. coli wachsen konnten. Es wurde jedoch in E. coli gefunden, dass eine solche zugegebene Substanz unmittelbar in Inosin oder Hypoxanthin umgewandelt wurde, und das Wachstum hörte aufgrund des Verlusts der AMP-Substanz an einem gewissen Punkt auf. Deshalb wird angesichts des metabolischen Weges von E. coli erwartet, dass es erforderlich ist, die Adenosindeaminase, die an der Umwandlung von Adenosin zu Inosin beteiligt ist, oder die Adenindeaminase, die an der Umwandlung von Adenin zu Hypoxanthin beteiligt ist, zu inakti vieren, um ein nachhaltiges Wachstum zu ermöglichen. Deshalb wurde die Effektivität der Inaktivierung von Adenosindeaminase oder Adenindeaminase bestätigt, und die Anhäufung von Inosin wurde überwacht.
  • GMP-Reduktase ist an der Umwandlung von GMP zu IMP beteiligt. Es wird erwartet, dass die Guanosinproduktivität durch Inaktivieren der GMP-Reduktase verbessert wird. Wie in den nachstehenden Beispielen gezeigt wird, wurde ein bestimmtes Maß der Verbesserung der Guanosinanhäufung beobachtet.
  • Eine Kohlenstoffquelle, wie Glucose, wird für die Produktion eines Purinnucleosids eingesetzt. Es ist bekannt, dass in dem Zuckermetabolismussystem, der zu der Purinnucleosidbiosynthese führt, in Abhängigkeit von der eingesetzten Kohlenstoffquelle oder den Kulturbedingungen Unterschiede bestehen. Deshalb wird für das vorteilhafte Leiten des Metabolismussystems zu der Purinnucleosidbiosynthese in Betracht gezogen, Abzweigungen, mit Ausnahme des Pentosephosphatweges, zu blockieren, um dem Pentosephosphatweg den Vorzug zu geben. Um dies durchzuführen, wurde die Inaktivierung von 6-Phosphogluconatdehydrase oder Phosphoglucoseisomerase untersucht, und die Wirksamkeit dieser Inaktivierung wurde bestätigt.
  • (4) Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid erworben hat, indem die Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus abgeschwächt wurde
  • Da die Einverleibung eines Purinnucleosids, das aus den Zellen ausgeschieden wurde, in die Zellen hinein im Hinblick auf die für die Anhäufung des Purinnucleosids erforderlichen Energie unzweckmäßig ist, ist ein Abschwächen der Einverleibung eines Purinnucleosids wirksam.
  • Als Mittel zum Abschwächen der Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen kann die Blockierung einer Reaktion genannt werden, die an der Membrandurchlässigkeit für Purinnucleoside beteiligt ist. Die Blockierung der Reaktion kann auf dieselbe Weise wie vorstehend in (3) beschrieben durchgeführt werden.
  • Beispielsweise wurde durch Inaktivierung von Nucleosidpermease, die eine der Permeasen ist, die an der Einverleibung von Purinnucleosiden in Zellen beteiligt sind, eine Verbesserung der Anhäufung von Inosin beobachtet.
  • (5) Verfahren zur Produktion eines Purinnucleosids
  • Das Verfahren zur Produktion eines Purinnucleosids durch Fermentation unter Verwendung des Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid wird im Folgenden beschrieben.
  • Ein einzusetzendes Kulturmedium für die Purinnucleosidproduktion kann ein übliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und andere organische Komponenten bei Bedarf enthält. Als Kohlenstoffquelle können Saccharide, wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Arabinose, Maltose, Xylose, Trehalose, Ribose und Hydrolysate von Stärke; Alkohole, wie Glycerin, Mannitol und Sorbitol; organische Säuren, wie Gluconsäure, Fumarsäure, Citronensäure und Bernsteinsäure, und dergleichen eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle können anorganische Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat; organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysate; Ammoniakgas; wässriges Ammoniak und dergleichen eingesetzt werden. Es ist wünschenswert, dass Vitamine, wie Vitamin B1, erforderliche Substanzen, beispielsweise Nucleinsäuren, wie Adenin und RNA, oder Hefeextrakt und dergleichen in geeigneten Mengen als organische Spurennährstoffe enthalten sind. Daneben können bei Bedarf kleine Mengen Calciumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen, Manganionen und dergleichen zugegeben werden.
  • Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16 bis 72 Stunden durchgeführt, und die Kulturtemperatur während der Kultivierung wird innerhalb 30 bis 45°C und einem pH-Wert von 5 bis 8 gehalten. Der pH-Wert kann durch Einsatz einer anorganischen oder organischen, sauren oder alkalischen Substanz sowie Ammoniakgas eingestellt werden.
  • Ein Purinnucleosid kann aus der Fermentationsflüssigkeit durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren oder eine beliebige Kombination davon, beispielsweise durch Techniken unter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes und Ausfällung, gewonnen werden.
  • (6) Spezifische Beispiele von Purinnucleosid-produzierenden Bakterien
  • Zuerst werden purF (ein Gen, das für PRPP-Amidotransferase. codiert), purR (ein Gen, das für einen Purinrepressor codiert), deoD (ein Gen, das für Purinnucleosidephosphorylase codiert), purA (ein Gen, das für Succinyl-AMP-Synthase codiert), add (ein Gen, das für Adenosindeaminase codiert), gsk (ein Gen, das für Inosinguanosinkinase codiert), guaC (ein Gen, das für GMP-Reduktase codiert), edd (ein Gen, das für 6-Phosphogluconatdehydrase codiert), pgi (ein Gen, das für Phosphoglucoseisomerase codiert), yicP (ein Gen, das für Adenindeaminase codiert), prs (ein Gen, das für PRPP-Synthetase codiert), xapA (ein Gen, das für Xanthosinphosphorylase codiert) und nupG (ein Gen, das für Nucleosidpermease codiert) aus einer chromosomalen DNA von Escherichia coli (E. coli) K12 Stamm W3110 (ATCC27325) unter Verwendung der PCR-Technologie kloniert, und sie können in Abhängigkeit vom Verwendungszweck mutiert werden. Die für dieses Verfahren eingesetzte chromosomale DNA kann von einem beliebigen Stamm von E. coli erhalten werden.
  • Die in purF eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der purF zerstört wird, oder eine Mutation zum Aufheben der Rückkopplungshemmung der PRPP-Amidotransferase. Die in purR eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der purR zerstört wird. Die in deoD eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der deoD zerstört wird. Die in purA eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der purA zerstört wird. Die in add eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der add zerstört wird. Die in gsk eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der gsk zerstört wird.
  • Die in guaC eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der guaC zerstört wird. Die in edd eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der edd zerstört wird. Die in pgi eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der pgi zerstört wird. Die in yicP eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der yicP zerstört wird. Die in prs eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der die Rückkopplungshemmung von PRPP-Synthetase aufgehoben wird. Die in xapA eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der xapA zerstört wird. Die in nupG eingeführte Mutation ist eine Mutation, bei der nupG zerstört wird.
  • Um eine Mutation in ein Gen einzuführen können ortsgerichtete Mutagenese (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), die rekombinante PCR-Technologie (PCR Technology, Stockton Press (1989)), die chemische Synthese spezifischer DNA-Abschnitte, die Hydroxylaminbehandlung eines interessierenden Genes, die Behandlung von mikrobiellen Stämmen mit einem interessierenden Gen durch UV-Bestrahlung oder mit einem chemischen Mittel, wie Nitrosoguanidin oder salpetrige Säure, und dergleichen eingesetzt werden. Wenn die Funktion eines Gens vollständig inaktiviert werden soll, kann eine Addition oder Deletion von DNA an einer geeigneten Restriktionsschnittstelle durchgeführt werden.
  • Dann werden purF und prs, auf die eine Mutation zum Aufheben der Rückkopplungshemmung von PRPP-Amidotransferase beziehungsweise PRPP-Synthetase übertragen wird, als rekombinante DNA in einen geeigneten Mikroorganismus eingeführt, um die Gene zu exprimieren, wodurch ein Mikroorganismus erhalten wird, der das PRPP-Amidotransferasegen (purF) und das PRPP-Synthetasegen (prs), deren Rückkopplungshemmung im Wesentlichen aufgehoben ist, enthält. Die vorstehend erhaltene rekombinante DNA bedeutet einen Vektor, wie ein Plasmid oder einen Phagen, in den ein nützliches Gen, wie PRPP-Amidotransferasegen (purF) und das PRPP-Synthetasegen (prs), deren Rückkopplungshemmung im Wesentlichen aufgehoben worden ist, als Passagier integriert ist. Der Vektor kann einen Promotor enthalten, der in dem Mikroorganismus operabel ist, wie lac, trp, tac, trc und PL, sodass eine effiziente Expression des nützlichen Gens erzielt werden kann.
  • Die hier eingesetzte rekombinante DNA umfasst beliebige solcher DNAs, die durch Integrieren eines nützlichen Gens in ein Chromosom unter Einsatz eines Transposons (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)), eines Mu-Phagen (offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 2-109985 (1990)) und eines Plasmids für die homologe Rekombination oder dergleichen erhalten werden.
  • Als Plasmid für die homologe Rekombination kann ein Plasmid mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung eingesetzt werden. Das Plasmid mit dem temperaturempfindlichen Replikationsursprung kann bei einer permissiven Temperatur, beispielsweise etwa 30°C replizieren, es kann jedoch bei einer nicht-permissiven Temperatur, beispielsweise 37°C bis 42°C nicht replizieren. Bei dem homologen Rekombinationsverfahren unter Verwendung des Plasmids mit dem temperatursensitiven Replikationsursprung kann das Plasmid bei einer permissiven Temperatur repliziert werden oder bei Bedarf bei einer nicht-permissiven Temperatur abgestoßen werden. In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurde pMAN997, welches pMAN031 (J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) entspricht, dessen VspI-HindIII-Fragment durch das von pUC19 (Takara Shuzo) ersetzt worden ist (1), als Plasmid für die homologe Rekombination eingesetzt.
  • Eine spezifische genetische Funktion auf dem Chromosom wurde durch die homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)) inaktiviert, um die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid zu verbessern. Das zu inaktivierende Gen ist ein Gen, bei dem die Inaktivierung zu einer Erhöhung der Expressionsmenge eines Gens für ein Enzym, das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt ist, führt. Im Speziellen wurde das Purinrepressorgen (purR) auf dem Chromosom zerstört, um den Expressionsregulationsmechanismus der Purinnucleotidbiosynthesegene, einschließlich des PRPP-Amidotransferasegens (purF), auszuschalten.
  • Außerdem wurde ein Gen, das für ein Enzym codiert, welches eine von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigende und zu einem anderen Metaboliten führende Reaktion katalysiert, zerstört. Im Speziellen wurde das Purinnucleosidphosphorylasegen (deoD) zerstört, um die Zersetzung von Inosin und Guanosin zu Hypoxanthin beziehungsweise Guanin zu unterdrücken. Außerdem wurde das Succinyl-AMP-Synthasegen (purA) zerstört, um Adeninauxotrophie zu verleihen. Überdies wurde das Adenosindeaminasegen (add) zerstört, um die Umwandlung von Adenosin zu Inosin zu unterdrücken. Schließlich wurde das Inosinguanosinkinasegen (gsk) zerstört, um die Umwandlung von Inosin und Guanosin zu IMP beziehungsweise GMP zu unterdrücken. Das GMP-Reduktasegen (guaC) wurde zerstört, um die Umwandlung von GMP zu IMP zu unterdrücken. Das 6-Phosphogluconatdehydrasegen (edd) wurde zerstört, um den Metabolismus von Zuckern durch den Entner-Doudoroff-Weg zu unterdrücken. Das Phosphoglucoseisomerasegen (pgi) wurde zerstört, um den Metabolismus von Zuckern über den Glycolyseweg zu unterdrücken, wodurch der Fluss in den Pentosephosphatweg gefördert wurde. Das Adenindeaminasegen (yicP) wurde zerstört, um die Umwandlung von Adenin zu Hypoxanthin zu unterdrücken. Das Xantosinphosphorylasegen (xapA) wurde zerstört, um die Zersetzung von Xanthosin zu Xanthin zu unterdrücken und den Abbau von Inosin und Guanosin zu Hypoxanthin beziehungsweise Guanin zu unterdrücken. Die Inaktivierung eines Zielgens kann natürlich auch durch Behandlung eines die Gene enthaltenden mikrobiellen Stammes mit UV-Strahlen oder mit einem chemischen Mittel, wie Nitrosoguanidin und salpetriger Säure, durchgeführt werden.
  • Als der Mikroorganismus mit der rekombinanten DNA wurde ein Mikroorganismus der Gattung Escherichia eingesetzt, worin ein Gen exprimiert wurde, das für ein Zielenzym, wie PRPP-Amidotransferase, codiert.
  • Um das PRPP-Amidotransferasegen (purF) effizient einzusetzen, wird es vorzugsweise zusammen mit anderen nützlichen Genen eingesetzt, beispielsweise mit Genen, die an der IMP- Biosynthese von PRPP beteiligt sind (purD, purT, purL, purM, purK, purE, purC, purB, purH), das IMP-Dehydrogenasegen (guaB), das GMP-Synthetasegen (guaA), das PRPP-Synthetasegen (prs) und dergleichen. Wie bei dem PRPP-Amidotransferasegen (purF) können solche nützlichen Gene auf einem Wirtschromosom oder einem Plasmid oder Phagen vorhanden sein.
  • Ein Mikroorganismus, dem purA (das Succinyl-AMP-Synthasegen) fehlt und/oder deoD (Purinnucleosidphosphorylasegen) fehlt und/oder purR (Purinrepressorgen) fehlt und/oder purF (PRPP-Amidotransferasegen) unempfindlich gemacht worden ist und/oder add (Adenosindeaminasegen) fehlt und/oder gsk (Inosinguanosinkinasegen) fehlt und/oder guaC (GMP-Reduktasegen) fehlt und/oder edd (6-Phosphogluconatdehydrasegen) fehlt und/oder pgi (Phosphoglucoseisomerasegen) fehlt und/oder yicP (Adenindeaminasegen) fehlt und/oder xapA (Xanthosinphosphorylasegen) fehlt und/oder nupG (Nucleosidpermeasegen) fehlt, oder ein Mikroorganismus, der mit einer rekombinanten DNA, die ein desensibilisiertes PRPP-Amidotransferasegen (purF) und/oder ein desensibilisiertes prs (PRPP-Synthetasegen), das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, trägt, wird kultiviert, sodass das Ziel-Purinnucleosid, wie Inosin und Guanosin, in dem Kulturmedium angehäuft wird und das angehäufte Nucleosid gewonnen wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Konstruktion des Plasmids pMAN997.
  • 2 zeigt die Strukturen von Genen für die homologe Rekombination. Die Zahlen in der Figur stellen die Längen (bp) der erhaltenen Fragmente und die Positionen von den 5'-Enden an dar.
  • 3 zeigt die Strukturen von Genen für die homologe Rekombination. Die Zahlen in der Figur stellen die Längen (bp) der erhaltenen Fragmente und die Positionen von den 5'-Enden an dar.
  • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Beispiel 1
  • 1) Züchten eines Stammes, dem das PRPP-Amidotransferasegen (purF) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung von chromosomaler DNA von E. coli K12 Stamm W3110 (ATCC27325) als Matrize und 29-mer und 31-mer Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG (SEQ ID Nr: 1) und CTCAAGCTTTCATCCTTCGTTATGCATTTCG (SEQ ID Nr: 2), präpariert auf der Grundlage der Information einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr. M26893) durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1530 bp der purF-Strukturgenregion, einschließlich SD-ATG und Translationsterminationscodon, wurde in einen pCRTMII-Vektor (Invitrogen) kloniert. Das amplifizierte Fragment des PCR-Produkts kann als solches in diesen Vektor kloniert werden. Der Vektor hat EcoRI-Schnittstellen in der Nähe der beiden Seiten der Klonierungsstelle. In den PCR-Primern wird eine PstI-Schnittstelle beziehungsweise eine HindIII-Schnittstelle bereitgestellt.
  • Das klonierte 1530 bp purF-Fragment enthielt eine BglII-Schnittstelle bei etwa 880 bp von dem 5'-Ende entfernt, und der Vektor pCRTMII hatte selbst auch eine BglII-Schnittstelle. Deshalb wurde das Plasmid mit BglII teilweise verdaut, mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft und dann mit T4-DNA- Ligase ligiert. Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und Transformanten, die auf LB (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1% NaCl, 0,1% Glucose, pH 7) Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsen waren, wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 18 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, die ein Fragment von etwa 1550 bp durch EcoRI-Verdauung bereitstellte, wobei das Fragment mit BglII nicht verdaut worden war (pCRTMIIpurF'#14), wurde aus den Plasmid-DNAs selektiert. Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene purF hatte eine Leserahmenverschiebung an der BglII-Schnittstelle, sodass vorhergesagt wurde, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
  • Dann wurde pCRTMIIpurF'#14 mit EcoRI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,6 kb, welches purF enthielt, herzustellen. Dieses Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstelle von pMAN997 eingeführt, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) ist (wie 1 zeigt, pMAN031 (J. Bacteriol., 162, 1196(1985)), worin das VspI-HindIII-Fragment mit demjenigen von pUC19 (Takara Shuzo) ersetzt ist), wobei das Plasmid pMAN997purF'#14 erhalten wurde. E. coli W3110 (Wildtyp) wurde bei 30°C mit pMAN997purF'#14 transformiert, und einige der erhaltenen Klone wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wodurch bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C gewachsen waren, wurde einmal wiederholt, und Klone, worin das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war, wurden selektiert. Es wurde bestätigt, dass diese Klone kein Plasmid in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine etwa 10–5- bis 10–6-Verdünnung), auf LB-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und auf LB-Agarplatten und LB-Agarplatten, die 25 μg/ml Ampicillin enthielten, jeweils gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen wurden Klone, die in Minimalmedium (Na2HPO4 6,8 g, KH2PO4 3 g, NaCl 0,5 g, NH4Cl 1 g, MgSO4·7H2O 0,5 g, CaCl2·2H2O 15 mg, Thiamin·HCl 2 mg, Glucose 0,2 g pro 1 l) nicht wuchsen, jedoch auf Minimalmedium, das mit 50 mg/l Hypoxanthin supplementiert war, wuchsen, selektiert. Außerdem wurde das Fragment von etwa 1,5 kb, welches purF enthielt, durch PCR aus der chromosomalen DNA der vorstehend erhaltenen Zielklone amplifiziert, und bestätigt, dass sie mit BglII nicht verdaut werden können. Die Klone, die die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllen, wurden als Stämme vermutet, denen purF fehlt, und wurden als Stämme F-2-51 und F-1-72 bezeichnet.
  • 2) Züchten von Stämmen, denen das Succinyl-AMP-Synthasegen (purA) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als Matri ze und den 31-mer Primern für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC (SEQ ID Nr: 3) und CTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC (SEQ ID Nr: 4), präpariert auf der Grundlage der Information einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr. J04199), durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1300 bp der purA-Strukturgenregion, die ATG und das Translationsterminationscodon einschließt, wurde zwischen der SacI- und SalI-Schnittstelles des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. In den Primern wird eine SacI-Schnittstelle beziehungsweise eine SalI-Schnittstelle bereitgestellt. Das klonierte purA-Fragment von etwa 1300 bp enthielt eine HpaI-Schnittstelle und eine SnaBI-Schnittstelle bei etwa 520 bp beziehungsweise 710 bp vom 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit HpaI und SnaBI verdaut und mit T4-DNA-Ligase ligiert, wobei das Plasmid erhalten wurde, von dem ein Fragment mit etwa 190 entfernt wurde. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und Transformanten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wuchsen, wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 18 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, die mit FspI nicht verdaut war, jedoch ein Fragment von etwa 1100 bp durch SacI- und SalI-Verdauung bereitstellte (pUC18purA'#1), wurde aus den Plasmid-DNAs selektiert. Das Gen purA, das in diesem Plasmid enthalten war, wies eine Deletion zwischen der HpaI- und Sna-BI-Schnittstelle auf, und es wurde deshalb vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
  • Dann wurde pUC18purA'#1 mit SacI und SalI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,1 kb, welches purA umfasst, herzustellen. Dieses Fragment wurde zwischen den SacI- und SalI-Schnittstellen von pMAN997 eingeführt, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, wobei das Plasmid pMAN997purA'#1 erhalten wurde. Der Stamm F-2-51 (purF–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997purA'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei die Kolonien bei 42°C gezüchtet wurden. Die Vorgehensweise zur Bereitstellung einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und Kolonien, worin das gesamte Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert war, wurden selektiert. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden mehrere Klone unter diesen Klonen auf LB-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten und LB-Agarplatten, die 25 μg/ml Ampicillin enthielten, gezüchtet, und Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen, wurden selektiert. Unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen wurden Klone, die auf Minimalmedium, das mit 50 mg/l Hypoxanthin supplementiert war, nicht wuchsen, jedoch auf Minimalmedium, das mit 50 mg/l Adenin supplementiert war, wuchsen, selektiert. Außerdem wurde das purA-Fragment von etwa 1,1 kb durch PCR aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestä tigt, dass es kleiner ist als dasjenige vom Wildtyp (etwa 1,3 kb) und mit FspI nicht verdaut werden kann. Der Klon, der die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllte wurde als ein Klon betrachtet, dem purA fehlt, und wurde als Stamm FA-31 bezeichnet.
  • 3) Züchten eines Stammes, den das Purinnucleosidphosphorylasegen (deoD) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als Matrize und der 30-mer- und 31-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC (SEQ ID Nr: 5) und CTCGCATGCCCGTGCTTTACCAAAGCGAATC (SEQ ID Nr: 6), präpariert auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter dem Schlüsselwort "deoD" erhalten wurde, durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1350 bp, welches die deoD-Strukturgenregion, einschließlich SD-ATG und Translationsterminationscodon, einschließt, wurde in den Vektor pCRTMII (Invitrogen) kloniert. Der Vektor hat EcoRI-Schnittstellen in der Nähe beider Seiten der Klonierungsstelle. In den PCR-Primern wurde eine SalI-Schnittstelle beziehungsweise eine SphI-Schnittstelle bereitgestellt. Das klonierte deoD-Fragment von etwa 1350 bp enthielt eine HpaI-Schnittstelle von etwa 680 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit HpaI verdaut, und ein Gemisch des verdauten Plasmids und eines 10-mer-ClaI-Linkers wurde einer T4-DNA-Ligasereaktion unterworfen. Als Ergebnis wurde eine ClaI-Schnittstelle an der HpaI-Schnittstelle eingeführt. Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und es wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsene Transformanten erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 16 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, die mit HpaI nicht verdaut worden war, jedoch mit ClaI verdaut worden war (pCRTMIIdeoD'#16), wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in diesem Plasmid enthaltene deoD hatte eine Leserahmenverschiebung an der HpaI-Schnittstelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
  • Dann wurde pCRTMIIdeoD'#16 mit EcoRI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,35 kb, welches deoD enthält, herzustellen. Dieses Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstelle von pMAN997, einem Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben), eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997deoD'#16 erhalten wurde. Der Stamm F-1-72 (purF–) und der Stamm FA-31 (purF–, purA–) wurden bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997deoD'#16 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Der Vorgang der Bereitstellung einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und Klone, worin das gesamte Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert war, wurden selektiert. Es wurde bestätigt, dass diese Klone in ihrem Zytoplasma kein Plasmid enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten plattiert und bei 42°C über Nacht kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, die 25 μg/ml Ampicillin enthielten, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Die Ampicillin-empfindlichen Klone wurden auf dem LG-Medium, das mit 1 g/l Inosin supplementiert war, gezüchtet, und Klone, die Inosin nicht zu Hypoxanthin zersetzten, wurden durch Dünnschichtchromatografieanalyse des Kulturmediums selektiert. Außerdem wurde das Fragment von etwa 1,35 kb, welches deoD einschließt, durch PCR aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass es mit ClaI verdaut wird, jedoch mit HpaI nicht verdaut wird. Die Klone, welche die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllen, wurden als Stämme betrachtet, denen deoD fehlt, und Klone, die aus dem Stamm F-1-72 (purF–) und dem Stamm FA-31 (purF–, purA–) stammten, wurden als Stamm FD-6 beziehungsweise FAD-25 bezeichnet.
  • 4) Züchten eines Stammes, dem das Purinrepressorgen (purR) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als Matrize und den 29-mer- und 28-mer-Primern für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG (SEQ ID Nr: 7) und CTCGCATGCTTAACGACGATAGTCGCGG (SEQ ID Nr: 8), präpariert auf der Grundlage der Information, die durch Recherche einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "purR" als Suchbegriff erhalten wurde, durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1,8 kb, welches eine purR-Strukturgenregion, einschließlich ATG und das Translationsterminationscodon und etwa 800 bp 5'-stromaufwärts von ATG, umfasste, wurde zwischen die SalI-Schnittstelle und die SphI-Schnittstelle des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Schnittstelle und eine SphI-Schnittstelle wurden jeweils in den PCR-Primern eingebaut, und diese Stellen wurden für das Klonieren verwendet. Das klonierte purR-Fragment von etwa 1,8 kb enthielt eine PmaCI-Schnittstelle bei etwa 810 bp von dem 5'-Ende entfernt (in der Nähe des N-Terminus in der purR-Strukturgenregion), und deshalb wurde das Plasmid als PmaCI bezeichnet. Ein Gemisch des verdauten Plasmids und eines 8-mer-BglII-Linkers wurde einer T4-DNA-Ligasereaktion unterworfen. Als Ergebnis wurde eine BglII-Schnittstelle an der PmaCI-Stelle eingeführt. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsene Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, die mit PmaCI nicht verdaut wurde, jedoch mit BglII verdaut wurde (pUC19purR'#2), wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene purR hatte eine Leserahmenverschiebung an der PmaCI-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
  • Dann wurde pUC19purR'#2 mit SacI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,8 kb, welches purR einschloss, erhalten wurde. Dieses Fragment wurde zwischen der SacI-Schnittstelle und der SphI-Schnittstelle von pMAN997 eingeführt, der ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) ist (wie vorste hend beschrieben), wobei das Plasmid pMAN997purR'#2 erhalten wurde. Der Stamm FD-6 (purF–, deoD–) und der Stamm FAD-25 (purF–, purA–, deoD–) wurden bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997purR'#2 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone, worin das gesamte Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert war, ausgewählt. Es wurde bestätigt, dass diese Klone in ihrem Zytoplasma das Plasmid nicht aufwiesen. Dann wurden mehrere Klone unter diesen Klonen auf LB-Agarplatten aufgestrichen, bei 30°C über Nacht kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten plattiert und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. 10 Klone wurden unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen willkürlich ausgewählt, und das Fragment von etwa 1,8 kb, welches purR enthielt, wurde aus der chromosomalen DNA dieser Klone durch PCR amplifiziert, und Klone, die mit BglII verdaut wurden, jedoch mit PmaCI nicht verdaut wurden, wurden ausgewählt. Diese Klone wurden als Stämme be trachtet, denen purR fehlt, und Klone, abgeleitet von dem Stamm FD-6 (purF–, deoD–) und dem Stamm FAD-25 (purF–, purA–, deoD–) wurden als Stamm FDR-18 beziehungsweise FADR-8 bezeichnet. Es wurde bestätigt, dass die PRPP-Amidotransferaseaktivität in den Stämmen, in denen purR zerstört war, im Vergleich zu den Stämmen, worin purR nicht zerstört war, erhöht war, wobei der purF+-Stamm, dem deoD und purR fehlt, oder der purF+-Stamm, dem purA, deoD und purR fehlt, eingesetzt wurde. Die PRPP-Amidotransferaseaktivität wurde nach dem Verfahren von L. J. Messenger et al. (J. Biol. Chem., 254, 3382(1979)) gemessen.
  • 5) Konstruktion eines unempfindlich gemachten PRPP-Amidotransferasegens (purF)
  • Ein purF-Fragment wurde aus dem Plasmid, welches das purF von etwa 1530 bp, kloniert in dem Vektor pCRTMII (Invitrogen) in Abschnitt 1, enthielt, durch Verdauen mit PstI und HindIII ausgeschnitten und zwischen die PstI- und HindIII-Schnittstellen der Multiklonierungsstelle auf einem Plasmid zur Einführung einer Mutation, pKF18 (Takara Shuzo) eingeführt, um den Zielklon zu erhalten (pKFpurF). G. Zhou et al. (J. Biol. Chem., 269, 6784 (1994)) haben entdeckt, dass PRPP-Amidotransferase (PurF), dessen Lys (K) an der Position 326 durch Gln (Q) ersetzt ist und dessen Pro (P) an der Position 410 durch Trp (W) ersetzt ist, jeweils bezüglich der Rückkopplungshemmung durch GMP und AMP unempfindlich sind. Deshalb wurden die folgenden synthetischen DNA-Primer für die Gensubstitution unter Ausführung der Mutationen von Lys (K) an der Position 326 und Pro (P) an der Position 410 von PRPP-Amidotransferase (PurF) nach Gln (Q) beziehungsweise Trp (W) präpariert, und pKFpurF wurde einer ortsgerichteten Mutagenese nach dem Protokoll von Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo) unterworfen, um in pKFpurF eine ortsgerichtete Mutation einzuführen.
  • Primer für die K326Q-Mutation:
    • 5'-GGGCTTCGTT CAG AACCGCTATGTTGG-3' (SEQ ID Nr: 9)
  • Primer für die P410W-Mutation:
    • 5'-TATGGTATTGATATG TGG AGCGCCACGGAAC-3' (SEQ ID Nr: 10)
  • Nach der Mutagenisierung wurden 6 Klone von jeder der erhaltenen Transformanten willkürlich ausgewählt, und es wurden Plasmide aus ihnen präpariert. Durch die Nucleotidsequenzierung der Plasmide um die Positionen, bei denen die Mutationen eingeführt wurden, wurde bestätigt, dass die gewünschten Mutanten erhalten wurden. Die erhaltenen Plasmide wurden als pKFpurFKQ beziehungsweise pKFpurFPW bezeichnet. Die Mutation P410W (410Pro→Trp) wurde zudem in pKFpurFKQ auf dieselbe Weise eingeführt, wobei pKFpurFKQPW erhalten wurde, ein mutiertes Plasmid mit zwei simultanen Mutationen. Jedes der Plasmide pKFpurFKQ, pKFpurFPW und pKFpurFKQPW hatte ein eingeführtes mutiertes purF stromabwärts von lacp/o (Promotor des Lactoseoperons) aus pKF18, und purF wurde unter Kontrolle dieses Promotors exprimiert.
  • Rekombinante Bakterien, die durch Transformieren von E.-coli-KM109-Zellen mit den vorstehend beschriebenen Plasmiden erhalten wurden, wurden in LB-Flüssigmedium während 8 Stunden kultiviert und dann gesammelt, und Rohenzymextrakte wurden aus ihnen hergestellt. Die PRPP-Amidotransferaseaktivität der Extrakte und die Ausmaße der Inhibition durch AMP und GMP wurden nach dem Verfahren von L. J. Messenger (J. Biol. Chem., 254, 3382 (1979)) gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Tabelle 1 PRPP-Amidotransferaseaktivität und Inhibition durch AMP und GMP
    Figure 00310001
  • 6) Abschätzung der Fähigkeit eines Stammes mit eingeführtem mutiertem purF-Plasmid zur Produktion von Purinnucleosid
  • Transformanten wurden durch Einführen von pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW in den Stamm FDR-18 (purF–, deoD–, purR–) und den Stamm FADR-8 (purF–, purA–, deoD–, purR–, hergestellt in Abschnitt 4), hergestellt, und die Fähigkeiten dieser Stämme zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt.
  • Das Basalmedium und das Kulturverfahren zur Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren zur Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid werden nachstehend beschrieben.
    1. Basalmedium: MS-Medium
    Endkonzentration
    Glucose 40 g/l (getrennt sterilisiert)
    (NH4)2SO4 16 g/l
    KH2PO4 1 g/l
    MgSO4·7H2O 1 g/l
    FeSO4·7H2O 0,01 g/l
    MnSO4·4H2O 0,01 g/l
    Hefeextrakt 2 g/l
    CaCO3 30 g/l (getrennt sterilisiert)
  • Kulturverfahren
    • Auffrischungskultur: gelagertes Bakterium, eingeimpft in LB-Agarmedium (bei Bedarf supplementiert mit einem Arzneimittel), über Nacht bei 37°C kultiviert
    • Animpfkultur: das mit der Auffrischungskultur kultivierte Bakterium in LB-Flüssigmedium eingeimpft (bei Bedarf supplementiert mit einem Arzneimittel), über Nacht bei 37°C kultiviert
    • Hauptkultur: 2% eingeimpft von der Animpfkultur in MS-Medium (supplementiert mit Adenin und bei Bedarf mit einem Arzneimittel)
    • 37°C, 20 ml/500-ml Volumen Sakaguchi-Kulturkolben
  • Analyseverfahren
  • Eine Probe des Kulturmediums (500 μl) wird im Laufe der Zeit wiederholt entnommen und 5 Minuten bei 15.000 UpM zentrifugiert, und der Überstand wird viermal mit H2O verdünnt und mittels HPLC analysiert. Wenn nichts anderes angegeben ist, wird die Abschätzung auf der Grundlage der angehäuften Menge eines Purinnucleosids pro Einheitsvolumen des Mediums nach Kultivierung während 3 Tagen gemacht.
  • Analysebedingungen:
    • Säule: Asahipak GS-220 (7,6 mm Innendurchmesser × 500 mm Länge)
    • Puffer: Der pH-Wert wird mit 0,2M NaH2PO4 (pH 3,98) und mit Phosphorsäure eingestellt
    • Temperatur: 55°C
    • Fließgeschwindigkeit: 1,5 ml/min
    • Nachweis: UV 254 nm
    • Retentionszeit (min)
  • Inosin 16,40
    Hypoxanthin 19,27
    Guanosin 20,94
    Guanin 23,55
    Adenin 24,92
    Adenosin 26,75
  • Für die Stämme von purA– (Adenin-auxotroph) wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 2 gezeigt. Eine überlegene Inosinproduktion wurde im Gegensatz zu dem Stamm W3110 (Wildtypstamm), bei dem eine Produktion in Spurenmengen beobachtet wurde, bei Stämmen mit eingeführtem mutierten purF-Plasmid beobachtet.
  • Tabelle 2 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00330001
  • Beispiel 2
  • 1) Züchten eine Stammes, dem das Adenosindeaminasegen (add) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als Matrize und 29-mer-Primern für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACGGCTGGATGCCTTACGCATC (SEQ ID Nr: 11) und CTCGCATGCAGTCAGCACGGTATATCGTG (SEQ ID Nr: 12), präpariert auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "add" als Suchbegriff erhalten wurde, durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1,8 kb, welches eine add-Strukturgenregion einschließt, die ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, etwa 420 bp 5'-stromaufwärts von ATG und etwa 370 bp stromabwärts des Translationsterminationscodons, wurde zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Stelle und eine SphI-Stelle werden jeweils in den PCR-Primern bereitgestellt, und diese Stellen werden für das Klonieren eingesetzt. Das klonierte add-Fragment von etwa 1,8 kb enthielt eine StuI-Stelle bei etwa 880 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit StuI verdaut, und ein Gemisch des verdauten Plasmids und eines 8-mer-BglII-Linkers wurde einer T4-DNA-Ligasereaktion unterworfen. Als Ergebnis wurde die BglII-Stelle an der StuI-Stelle eingebaut. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten wuchsen, die 25 μg/ml Ampicillin enthielten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, die mit StuI nicht verdaut wurde, jedoch mit BglII verdaut wurde (pUC19add'#1), wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene add wies eine Leserahmenverschiebung an der StuI-Stelle auf, und deshalb wurde vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (2).
  • Dann wurde pUC19add'#1 mit SacI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,8 kb hergestellt wurde, welches add enthielt. Dieses Fragment wurde zwischen der SacI-Stelle und der SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997add'#1 erhalten wurde. Der Stamm FDR-18 (purF–, deoD–, purR–) und der Stamm FADR-8 (purF–, purA–, deoD–, purR–) wurden bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997add'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, die 25 μg/ml Ampicillin enthielten, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone, in die das gesamte Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination eingeführt war, ausgewählt. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden willkürlich unter den auftretenden Kolonien ausgewählt, und jede wurde auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Die Ampicillin-empfindlichen Klone wurden in dem LG-Medium, das mit 1,5 g/l Adenosin supplementiert war, gezüchtet, und Klone, die Adenosin nicht in Inosin umwandelten, wurden durch Dünnschichtchromatografieanalyse des Kulturmediums selektiert. Außerdem wurde das add-Fragment von etwa 1,8 kb durch PCR aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass sie mit BlgII, jedoch nicht mit StuI verdaut wurden. Diese Klone wurden als Stämme betrachtet, denen add fehlt, und Klone aus dem Stamm FDR-18 (purF–, deoD–, purR–) und dem Stamm FADR-8 (purF–, purA–, deoD–, purR–) wurden als Stämme FDRadd-18-1 beziehungsweise FADRadd-8-3 bezeichnet.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit eines Stammes mit eingeführtem, unempfindlich gemachten purF zur Produktion von Purinnucleosid
  • Durch Einführen von pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW in den Stamm FDRadd-18-1 (purF–, deoD–, purR–, add–) und den Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–), die in Abschnitt 1) gezüchtet wurden, wurden Transformanten hergestellt, und die Fähigkeit dieser Stämme zur Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Für den Stamm FADRadd-8-3 wurde auch eine Transformante mit dem Wildtyp-purF-Plasmid (pKFpurF) hergestellt und mit der mit pKFpurFKQ und der mit pKFpurFKQPW transformierten Transformante verglichen. Das Basalmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 3 gezeigt. Eine überlegene Inosinproduktion wurde im Vergleich mit dem Stamm W3110 (Wildtypstamm) beobachtet. Die Wirkungen von purFKQ von unempfindlichen Typ und purFKQPW wurden durch Vergleichen mit dem Wildtyp purF bestimmt.
  • Tabelle 3 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00370001
  • Beispiel 3
  • 1) Konstruktion eines unempfindlichen purF-Plasmids für die homologe Rekombination
  • Um die Substitution eines unempfindlichen purF in einem Chromosom unter Einsatz eines purF–-Stammes, der in Abschnitt 1) in Beispiel 1 hergestellt wurde, durchzuführen, wurde ein weiteres purF-Fragment, das um etwa 0,5 kb auf der 3'-Seite länger als das vorher erhaltene purF-Fragment (etwa 1,6 kb) war, hergestellt. Die PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und 29-mer-Primern für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG (SEQ ID Nr: 1) und CTCAAGCTTGTCTGATTTATCACATCATC (SEQ ID Nr: 13), präpariert auf der Grundlage der Information aus der Gendatenbank (E. coli Gene Bank), durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,1 kb, welches die purF-Strukturgenregion einschloss, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon enthielt, wurde in den Vektor pCRTMII (Invitrogen) kloniert. Das in diesem Klon erhaltene Plasmid wurde pCRTMIIpurFL genannt. Das Plasmid pCRTMIIpurFL hat EcoRI-Schnittstellen in der Nähe der beiden Enden der Klonierungsstelle. Eine PstI-Stelle beziehungsweise eine HindIII-Stelle wird in den PCR-Primern bereitgestellt.
  • Dann wurde das Plasmid pCRTMIIpurFL mit SnaBI und HindIII verdaut, wobei ein Fragment von etwa 0,65 kb stromabwärts des C-Terminus der purF-codierenden Region erhalten wurde. Dieses Fragment wurde zwischen die SnaBI-Stelle und die HindIII-Stelle des in Abschnitt 5) des Beispiels 1 erhaltenen Plasmids pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW eingeführt, wobei pKFpurFLKQ und pKFpurFLKQPW erhalten wurden.
  • Dann wurden pKFpurFLKQ und pKFpurFLKQPW mit EcoRI und HindIII verdaut, wobei Fragmente von etwa 2,1 kb, enthaltend purFLKQ und purFLKQPW, erhalten wurden. Diese Fragmente wurden zwischen die EcoRI- und HindIII-Stellen von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997purFLKQ beziehungsweise das Plasmid pMAN997purFLKQPW erhalten wurde.
  • 2) Züchten eines Stammes mit in das Chromosom eingeführtem unempfindlichen purF
  • Der Stamm FDRadd-18-1 (purF–, deoD–, purR–, add–) und der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) wurden jeweils mit den Plasmiden pMAN997purFLKQ und pMAN997purFLKQPW bei 30°C transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom eingeführt war, selektiert. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kulturbrühe wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 42°C über Nacht kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden willkürlich von den auftretenden Kolonien ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, wobei Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf LB-Agarplatten wachsen konn ten, selektiert wurden. Unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen wurden Klone, die auf dem Minimalmedium wuchsen, für den Stamm FDRadd-18-1 (purF–, deoD–, purR–, add–) selektiert, und Klone, die in Minimalmedium, das mit 100 mg/l L-Histidin und 50 mg/l Adenin supplementiert war, wurden für den Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) selektiert.
  • Die Fragmente von etwa 1,5 kb, einschließlich purF, wurden aus chromosomaler DNA dieser Zielklone amplifiziert, und Nucleotidsequenzen um die Stellen, wo Mutationen durch homologe Rekombinationssubstitution eingeführt waren, wurden bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass sie die Mutation von K326Q (326Lys→Gln) und die Mutationen K326Q (326Lys→Gin) + P410W (410Pro→Trp) enthielten.
  • Solche, die von dem Stamm FDRadd-18-1 (purF–, deoD–, purR–, add–) abgeleitet waren, wurden als Stamm FDRadd-18-1::KQ (purFKQ, deoD–, purR–, add–) und als Stamm FDRadd-18-1::KQPW (purFKQPW, deoD–, purR–, add–) bezeichnet, und solche, die von dem Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) abgeleitet waren, wurden als Stamm FADRadd-8-3::KQ (purFKQ, purA–, deoD–, purR–, add–) und als Stamm FADRadd-8-3::KQPW (purFKQPW, purA–, deoD–, purR–, add–) bezeichnet.
  • 3) Beurteilung der Fähigkeit eines Stammes mit unempfindlichem purF, das in das Chromosom einverleibt ist, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Die Fähigkeiten zur Produktion von Purinnucleosid des Stammes FDRadd-18-1::KQ (purFKQ, deoD–, purR–, add–), des Stammes FDRadd-18-1::KQPW (purFKQPW, deoD–, purR–, add–), des Stammes FADRadd-8-3::KQ (purFKQ, purA–, deoD–, purR–, add–) und des Stammes FADRadd-8-3::KQPW (purFKQPW, purA–, deoD–, purR–, add–), hergestellt in Abschnitt 2), zur Produktion von Purin nucleosid wurden beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Für die Stämme von purA– (Adenin-auxotroph) wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 4 gezeigt. Überlegene Inosinproduktion wurde im Vergleich zu dem Stamm W3110 (Wildtypstamm) beobachtet.
  • Tabelle 4 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00410001
  • Beispiel 4
  • 1) Züchtung eines Stammes, in dem das Inosinguanosinkinasegen (gsk) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 23-mer- und 21-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGAGCTCATGAAATTTCCCGG (SEQ ID Nr: 14) und CTCGGATCCGGTACCATGCTG (SEQ ID Nr: 15), präpariert auf der Grundlage der Information einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr. D00798), durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1,5 kb, welches die gsk-Strukturgenregion einschloss, die ATG und das Translationsterminationscodon umfasste, wurde zwischen die SacI-Stelle und die BamHI-Stelle des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SacI-Stelle beziehungsweise eine BamHI-Stelle wurde in den PCR-Primern bereitgestellt.
  • Das klonierte gsk-Fragment von 1,5 kb enthielt eine BglII-Stelle bei etwa 830 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit BglII verdaut und einer T4-DNA-Ligasereaktion unterworfen, um einen Kanamycin-resistenten (Kmr) Genblock (BamHI-Verdauung, Pharmacia Biotech) einzufügen. Kompetente Zellen von E. coli JH109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und die auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gewachsenen Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 4 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, die mit BglII nicht verdaut wurde, wobei aus diesem Plasmid ein Fragment von etwa 2,8 kb durch EcoRI- und SalI-Verdauung ausgeschnitten wurde (pUCgsk'#2), wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in diesem Plasmid enthaltene gsk wies an der BglII-Stelle ein eingeführtes heterogenes Gen auf, und deshalb wurde vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (2).
  • Dann wurde pUCgsk'#2 mit SacI, SphI und DraI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 2,8 kb hergestellt wurde, welches gsk und die Kmr-Gene enthält. Die DraI-Verdauung wird durchgeführt, um die Präparation eines SacI-SphI-Fragments zu erleichtern. Das Fragment wurde zwischen die SacI- und SphI-Stellen von pMAN997 eingeführt, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, wobei das Plasmid pMAN997gsk'#2 erhalten wurde. Der Stamm FDR-18 (purF–, deoD–, purR–) und der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) wurden bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997gsk'#2 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Der Vorgang zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom einverleibt war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden aus den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt, und auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, gezüchtet, und es wurden Klone selektiert, die auf den LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, nicht wuchsen, jedoch auf LB-Agarplatten, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin, wuchsen. Außerdem wurde das gsk-Gen enthaltende Fragment durch PCR von der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass das etwa 2,8 kb-Fragment, welches das Kmr-Gen enthält, und nicht das ursprüngliche Fragment von etwa 1,5 kb amplifiziert wurde. Es wurde ebenfalls bestätigt, dass die Inosinguanosinkinaseaktivität darin nicht nachgewiesen wurde. Die Inosinguanosinkinaseaktivität wurde nach dem Verfahren von Usuda et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206 (1997)) gemessen. Diese Klone wurden als Stämme betrachtet, denen gsk fehlt, und Klone, die von dem Stamm FDR-18 (purF–, deoD–, purR–) und dem Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) abgeleitet waren, wurden als Stamm FDRG-18-13 beziehungsweise Stamm FADRaddG-8-3 bezeichnet.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit der Stämme mit dem Plasmid mit unempfindlichem purF zur Produktion von Purinnucleosid
  • Weil die Plasmide pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW das Kmr-Gen als Arzneimittelselektionsmarker enthalten und die Wirtsstämme FDRG-18-13 (purF–, deoD–, purR–, gsk–) und FADRaddG-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–), präpariert in Abschnitt 1), Kanamycin-resistent gemacht werden, ist es schwierig, durch Einführen von pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW in die Stämme FDRG-18-13 und FADRaddG-8-3 Transformanten für die Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid zu erhalten. Deshalb wurde der Austausch der Arzneimittelselektionsmarkergene des Plasmids pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW unter Verwendung des Vektors pUC18 mit dem Ampicillinresistenzgen (Takara Shuzo) durchgeführt. Weil die Positionsbeziehung zwischen dem lac-Promotor und der Multiklonierungsstelle in pKF18 und pUC18 dieselbe ist, wurden purFKQ- und purFKQPW-Fragmente aus pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW unter Verwendung von PstI und HindIII ausgeschnitten, und die Fragmente wurden zwischen die PstI- und HindIII-Stellen von pUC18 eingeführt, wobei pUCpurFKQ und pUCpurFKQPW erhalten wurden. Die Wirte, nämlich die Stämme FDRG-18-13 und FADRaddG-8-3 wurden mit pUCpurFKQ und pUCpurFKQPW transformiert, und die Fähigkeiten der Rekombinanten zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Für die Stämme von purA– (Adeninauxotroph) wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 5 gegeben. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Mikroorganismen Guanosin sowie Inosin anhäufen, wenn das Fehlen von gsk übertragen wurde.
  • Tabelle 5 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00450001
  • 3) Züchtung von Stämmen mit unempfindlichem purF, das in das Chromosom einverleibt ist, und Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
  • Die Stämme FDRG-18-3 (purF–, deoD–, purR–, gsk–) und FADRaddG-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) wurden bei 30°C mit den Plasmiden pMAN997purFLKQ beziehungsweise pMAN997purFLKQPW transformiert. Einige der erhaltenen Kolo nien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und bei 30°C über Nacht kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom einverleibt war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthalten. Dann wurden unter diesen Klonen einige Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, wobei Ampicillin-empfindliche Klone selektiert wurden, die nur auf LB-Agarplatten wachsen konnten. Unter den Ampicillin-empfindlichen Klone wurden Klone, die auf Minimalmedium wachsen, für den Stamm FDRG-18-13 (purF–, deoD–, purR–, gsk–) selektiert, und Klone, die in dem Minimalmedium, das mit 100 mg/l L-Histidin und 50 mg/l Adenin supplementiert war, wachsen, wurden für den Stamm FADRaddG-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) selektiert.
  • Chromosomale DNAs dieser Zielklone wurden präpariert, und Fragmente von etwa 1,5 kb, die purF einschlossen, wurden durch PCR amplifiziert und um die Stellen sequenziert, wo die Mutationen durch Substitution durch homologe Rekombination eingeführt waren. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass sie eine Mutation von K326Q (326Lys→Gln) beziehungsweise K326Q (326Lys→Gln) + P410W (410Pro→Trp) aufwiesen.
  • Die Stämme, die von dem Stamm FDRG-18-13 (purF–, deoD–, purR–, gsk–) abgeleitet waren, wurden als Stamm FDRG-18-13::KQ (purFKQ, deoD–, purR–, gsk–) und Stamm FDRG-18-13::KQPW (purFKQPW, deoD–, purR–, gsk–) bezeichnet, und solche, die von dem Stamm FADRaddG-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) abgeleitet waren, wurden als Stamm FADRaddG-8-3::KQ (purFKQ, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) und Stamm FADRaddG-8-3::KQPW (purFKQPW, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) bezeichnet.
  • Der Stamm FADRaddG-8-3::KQ (purFKQ, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) wurden mit der privaten Nummer AJ13334 versehen. Dieser Stamm wurde beim National Institute of Bioscience und Human-Technology of Ministry of International Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0046 Japan) am 24. Juni 1997 als internationale Hinterlegung nach dem Budapester Abkommen mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5993 hinterlegt.
  • Die Fähigkeiten dieser 4 Arten von Stämmen mit unempfindlichem purF, das in das Chromosom einverleibt war, zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt. Das Grundmedium und das Kulturverfahren für die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Für die Stämme von purA– (Adenin-auxotroph) wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 6 gezeigt. Es zeigte sich, dass die Mikroorganismen Guanosin sowie Inosin anhäuften, wenn das Fehlen von gsk übertragen wurde.
  • Tabelle 6 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00480001
  • Beispiel 5
  • 1) Konstruktion des Wildtyp-purR-Plasmids für die homologe Rekombination und Züchten von Stämmen mit in das Chromosom eingeführtem revertierten purR+
  • In Abschnitt 4) des Beispiels 1 wurde das Plasmid (pUCpurR), welches das purR-Fragment von etwa 1,8 kb zwischen der SalI-Stelle und der SphI-Stelle des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) trägt, erhalten. Das Plasmid pUCpurR wurde mit SacI und SphI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,8 kb herzustellen, welches Wildtyp-purR enthält. Dieses Fragment wurde zwischen die SacI-Stelle und die SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997purR erhalten wurde. Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997purR transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Dieses Verfahren zum Bereitstellen von bei 42°C gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, worin das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt, und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur auf LB-Agarplatten wachsen konnten. Von den Ampicillin-empfindlichen Klonen wurden 10 Klone willkürlich ausgewählt, und die purR-Fragmente von etwa 1,8 kb wurden aus der chromosomalen DNA dieser Klone durch PCR amplifiziert. Klone, worin das amplifizierte Fragment mit PmaCI, jedoch nicht mit BglII verdaut werden konnte, wurden ausgewählt. Diese Klone wurden als purR+-Revertantenstämme betrachtet und als FADadd-8-3-2 (purF–, purA–, deoD–, add–) bezeichnet.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit des Stammes mit eingeführtem unempfindlichen purF zur Produktion von Purinnucleosid
  • Eine Transformante wurde durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADadd-8-3-2 (purF–, purA–, deoD–, add–) hergestellt, und die Fähigkeit des Stammes zur Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Für den Stamm FADRadd-8-3 wurde auch eine Transformante mit pKFpurKQ präpariert, und die Wirkung der purR-Defizienz wurde durch Vergleich beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Das MS-Medium wurde mit 5 mg/l Adenin supplementiert.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 7 gezeigt. Eine überlegene Inosinproduktion wurde in FADRadd (purR–-Typ) im Vergleich mit FADadd (purR-Wildtyp) beobachtet, und es wurde die Wirkung der purR-Defizienz bestätigt.
  • Tabelle 7 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00500001
  • Beispiel 6
  • 1) Erneute Züchtung eines Stammes, dem das Inosinguanosinkinasegen (gsk) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 32-mer- und 29-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGGTACCCTGTTGCGTTAAGCCATCCCAGA (SEQ ID Nr: 16) und CTCGCATGCCAACGTACGGCATTAACCTA (SEQ ID Nr: 17), präpariert auf der Grundlage der Information aus einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr. D00798), durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 3,0 kb, welches die gsk-Strukturgenregion (etwa 800 bp) enthielt, die ATG und das Translationsterminationscodon umfasste, wurde zwischen der KpnI-Stelle und der SphI-Stelle des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) kloniert. Eine KpnI-Stelle beziehungsweise SphI-Stelle wurde in den PCR-Primern bereitgestellt.
  • Das klonierte gsk-Fragment von 3,0 kb enthielt zwei Aro51HI-Stellen bei etwa 900 bp und 1030 bp und eine BglII-Stelle bei etwa 1640 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit Aro51HI und BglII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Dann wurde das Aro51HI-BglII-Fragment entfernt, und die DNA des Vektors wurde mit T4-DNA-Ligase eines Selbstligation unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsene Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen hergestellt, und eine Plasmid-DNA, die mit Aro51HI oder BglII nicht verdaut wurde und aus der ein Fragment von etwa 2,3 kb durch KpnI- und SphI-Verdauung ausgeschnitten wurde (pUC19gsk'#10), wurde unter den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in diesem Plasmid enthaltene gsk hat eine Deletion im Strukturgen zwischen der Aro51HI-Stelle und der BglII-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das kodierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (Figur 3).
  • Dann wurde pUC19gsk'#10 mit KpnI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 2,3 kb erhalten wurde, welches das gsk-Gen umfasste. Das Fragment wurde zwischen der KpnI- und der SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997gsk'#10 erhalten wurde. Der Stamm FADRadd-8-3 (purF) purA–, deoD–, purR–, add–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997gsk'#10 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen von bei 42°C gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen einige Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden bei 42°C unter Schütteln kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, wobei Ampicillin-empfindliche Klone selektiert wurden, die nur auf den LB-Agarplatten wachsen konnten. Außerdem wurden unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen willkürlich 10 Klone ausgewählt, die Fragmente, die das gsk-Gen enthielten, wurden durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Primer von der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und die Klone, worin das Fragment von etwa 2,3 kb, nicht aber das ursprüngliche Fragment von etwa 3,0 kb amplifiziert wurde, wurden selektiert. Es wurde auch bestätigt, dass die Inosinguanosinkinaseaktivität in ihnen nicht nachgewiesen wurde. Die Inosinguanosinkinaseaktivität wurde nach dem Verfahren von Usuda et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206 (1997)) gemessen. Die Klone wurden als neue Stämme betrachtet, denen gsk fehlt, und die Klone, die von dem Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) abgeleitet waren, wurden abs FADRaddgsk (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) gezeichnet.
  • 2) Züchten von Stämmen, denen das GMP-Reduktasegen (guaC) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 29-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCAAGCTTACGGCTCTGGTCCACGCCAG (SEQ ID Nr: 18) und CTCCTGCAGCAGCGTTGGGAGATTACAGG (SEQ ID Nr: 19), hergestellt auf der Grundlage der Information aus einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank), durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,2 kb, welches die guaC-Strukturgenregion enthielt, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, wurde zwischen die HindIII-Stelle und die PstI-Stelle des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Eine HindIII-Stelle beziehungsweise eine PstI-Stelle wurde in den PCR-Primern bereitgestellt.
  • Das klonierte guaC-Fragment von etwa 2,2 kb enthielt eine BglII-Stelle bei etwa 1,1 kb von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit BglII verdaut, mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und Transformanten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wuchsen, wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 18 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 2,2 kb durch Verdauung mit HindIII und PstI ausgeschnitten war, wobei das Fragment mit BglII nicht verdaut wurde (pUC18guaC'#1), wurde unter den Plasmid-DNAs selektiert. Das in diesem Plasmid enthaltene guaC hatte eine Leserahmenverschiebung an der BglII-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (3).
  • Dann wurde pUC18guaC'#1 mit HindIII und PstI verdaut, um ein Fragment von etwa 2,2 kb, welches guaC enthält, zu präparieren. Das Fragment wurde zwischen die HindIII- und PstI-Stellen von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997guaC'#1 erhalten wurde. Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) und der Stamm FADRaddgsk (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–) wurden bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997guaC'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zur Bereitstellung von bei 42°C gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf, auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur auf den LB-Agarplatten wachsen konnten. Die Fragmente von etwa 2,2 kb, die guaC enthalten, wurden durch PCR aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass das Fragment mit BglII nicht verdaut wurde. Die Klone, die diese Bedingungen erfüllen, wurden als Stämme betrachtet, denen guaC fehlt, und die Klone, die von den Stämmen FADRadd-8-3 und FADRaddgsk abgeleitet sind, wurden als FADRaddguaC (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, guaC–) beziehungsweise FADRaddgskguaC (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–, guaC–) bezeichnet. Es wurde auch bestätigt, dass die GMP-Reduktaseaktivität in ihnen nicht nachgewiesen wurde. Die GMP-Reduktaseaktivität wurde nach dem Verfahren von B. B. Garber et al. (J. Bacteriol., 43, 105(1980)) gemessen.
  • 3) Beurteilung der Fähigkeit der Stämme, in denen ein Plasmid mit dem unempfindlichen purF eingeführt ist, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Transformanten wurden durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddguaC (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, guaC–) und FADRaddgskguaC (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, gsk–, guaC–), hergestellt in Abschnitt 2), produziert, und die Fähigkeiten der Stämme zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt. Das Grundmedium und das Kulturverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Das MS-Medium wurde mit 5 mg/l Adenin supplementiert.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 8 gezeigt. Ein bestimmtes Maß der Verbesserung der Guanosinproduktion wurde durch das Fehlen von guaC beobachtet.
  • Tabelle 8 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00560001
  • Beispiel 7
  • 1) Züchten eines Stammes, dem das 6-Phosphogluconatdehydrasegen (edd) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 29-mer-Primer für beide Enden mit den Sequenzen CTCGAATTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG (SEQ ID Nr: 20) und CTCAAGCTTGGAATAGTCCCTTCGGTAGC (SEQ ID Nr: 21), präpariert auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "edd" als Suchbegriff erhalten wurde, durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 3,0 kb, welches die edd-Strukturgenregion, welche ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, etwa 810 bp der 5'-stromaufwärts-Region von ATG und eine etwa 360 bp Stromabwärtsregion des Translationsterminationscodons enthielt, wurde in den Vektor pCRTMII (Invitrogen) als solches kloniert. Das amplifizierte Fragment des PCR-Produkts kann als solches in diesem Vektor kloniert werden. Der Vektor hat EcoRI-Stellen als Restriktionsstellen in der Nähe der beiden Enden der Klonierungsstelle. Eine BamHI-Stelle und eine HindIII-Stelle werden jeweils in den PCR-Primern bereitgestellt. Das klonierte edd-Fragment von 3,0 kb enthielt zwei StuI-Stellen bei etwa 660 bp und 1900 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit StuI verdaut. Dann wurde das StuI-Fragment von etwa 1,25 kb entfernt, und die DNA des Vektors wurde mit T4-DNA-Ligase einer Selbstligation unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsene Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 1,25 kb durch StuI nicht ausgeschnitten wurde (pCRTMIIedd'#1), wurde unter diesen Plasmid-DNAs selektiert. Das in diesem Plasmid enthaltene edd hatte eine Deletion einer Protein-codierenden Region, einschließlich einer Promotorregion, und deshalb wird vorhergesagt, dass dieses Enzym nicht gebildet wird (3).
  • Dann wurde pCRTMIIedd'#1 mit EcoRI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,75 kb erhalten wurde, das einen Teil von edd und eine flankierende Region davon umfasste. Das Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, wobei das Plasmid pMAN997edd'#1 erhalten wurde. Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997edd'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zur Bereitstellung von bei 42°C gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, worin das ganze Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhal ten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Die edd-Regionen wurden durch PCR unter Verwendung der vorstehenden PCR-Primer aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden die Klone selektiert, in denen die Größe des amplifizierten Fragments die etwa 1,75 kb des Deletionstyps, nicht aber die etwa 3,0 kb des Wildtyps ist. Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen edd fehlt, und sie wurden als FADRaddedd (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–) bezeichnet.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit der Stämme, in denen ein Plasmid mit unempfindlichem purF eingeführt ist, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Eine Transformante wurde durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddedd (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–), gezüchtet in Abschnitt 1), hergestellt, und die Fähigkeit des Stammes zur Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Das MS-Medium wurde mit 5 mg/l Adenin supplementiert. Die von edd codierte 6-Phosphogulconatdehydrase ist ein Enzym, das durch Gluconsäure induziert wird und sich an der ersten Stufe des Entner-Doudoroff-Weges befindet, in dem Gluconat zu Pyruvat metabolisiert wird. Weil das Gluconat vermutlich nur in den Pentosephosphatweg fließt, weil dieses Enzym fehlt, wurde Gluconsäure (48 g/l zugegeben) als andere Kohlenstoffquelle als Glucose eingesetzt, um die Beurteilung durchzuführen.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 9 gezeigt. Eine deutliche Verbesserung der Inosinproduktion wurde bei Fehlen von edd beobachtet, wenn Gluconsäure als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurde. Diese Wirkung wurde auch beobachtet, wenn Glucose als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurde.
  • Tabelle 9 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00600001
  • Beispiel 8
  • 1) Züchten eines Stammes, dem das Phosphoglucoseisomerasegen (pgi) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 29-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC (SEQ ID Nr: 22) und CTCGCATGCGTCGCATCAGGCATCGGTTG (SEQ ID Nr: 23), präpariert auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "pgi" als Suchbegriff erhalten wird, durchgeführt, und ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,2 kb, welches die pgi-Strukturgenregion umfasste, die ATG und das Translationsterminationscodon enthielt, wurde zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Stelle beziehungsweise eine SphI-Stelle wurden in den PCR-Primern bereitgestellt. Das klonierte pgi-Fragment von 2,2 kb enthielt eine BssHII-Stelle und eine MluI-Stelle bei etwa 1170 bp beziehungsweise 1660 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit BssHII und MluI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Dann wurde das Fragment von etwa 500 bp zwischen der BssHII-Stelle und der MluI-Stelle entfernt, und die DNA des Vektors wurde mit T4-DNA-Ligase einer Selbstligation unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wuchsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 1,7 kb durch SalI und SphI ausgeschnitten wurde (pUC18pgi'#1), wurde unter den Plasmid-DNAs selektiert. Das in diesem Plasmid enthaltene pgi hat eine Deletion zwischen der BssHII-Stelle und der MluI-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (3).
  • Dann wurde pUC18pgi'#1 mit SalI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,7 kb, welches pgi enthielt, hergestellt wurde. Das Fragment wurde zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperatursensitiven Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, einge führt, wobei das Plasmid pMAN997pgi'#1 erhalten wurde. Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–) und der Stamm FADRaddedd (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–) wurden bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997pgi'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden jeweils auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen von einzelnen Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden bei 42°C unter Schütteln kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und jede wurde auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur auf LB-Agarplatten wachsen konnten. Die pgi-Regionen wurden durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden die Klone selektiert, in denen die Größe des amplifizierten Fragments etwa 1,7 kb des Deletionstyps, nicht jedoch etwa 2,2 kb des Wildtyps war. Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen pgi fehlt, und Klone, die von FADRadd-8-3 und FADRaddedd abgeleitet sind, wurden als FADRaddpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, pgi–) und FADRaddeddpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, pgi–) bezeichnet.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit von Stämmen, die ein eingeführtes Plasmid mit unempfindlichem purF enthalten, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Transformanten wurden durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, pgi–) und in den Stamm FADRaddeddpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, pgi–), gezüchtet in Abschnitt 1), hergestellt, und die Fähigkeit dieser Stämme zur Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium (Grundmedium), welches ein Medium für die Beurteilung der Produktion war, auf 0,8% erhöht wurde.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 10 gezeigt. Durch das Fehlen von pgi verringerte das Wachstum in dem MS-Medium, das mit 5 mg/l Adenin supplementiert war, welches in den vorstehend beschriebenen Beispielen eingesetzt wurde, deutlich. Deshalb wurde das Medium, worin die Menge des Hefeextrakts auf 0,8% erhöht wurde, eingesetzt. In diesem Medium zeigte der pgi+-Ausgangsstamm eine erhöhte Wachstumsrate, was zu einer geringeren Inosinproduktion und Nebenproduktion von Hypoxanthin führte. Im Gegensatz dazu wurde bei der Inosinproduktion in dem Stamm, dem pgi fehlt, eine deutliche Verbesserung beobachtet.
  • Tabelle 10 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00640001
  • Beispiel 9
  • 1) Züchten eines Stammes, dem das Adenindeaminasegen (yicP) fehlt
  • In einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) ist yicP als ORF (offener Leserahmen, Strukturgen) registriert, der eine hohe Homologie mit Adenindeaminase aus Bacillus subtilis hat. Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde durch Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 29-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCCTGCAGCGACGTTTTCTTTTATGACA (SEQ ID Nr: 24) und CTCAAGCTTCGTAACTGGTGACTTTTGCC (SEQ ID Nr: 25), präpariert auf der Grundlage der Information, die durch Recherchieren unter Verwendung von "yicP" als Suchbegriff erhalten wurde, durchgeführt, wobei ein Fragment von etwa 1,9 kb amplifiziert wurde, welches die yicP-Strukturgenregion, die ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, etwa 50 pb der 5'-stromaufwärtigen Region von ATG und etwa 40 bp der stromabwärtigen Region des Translationsterminationscodons umfasste. Eine PstI-Stelle und eine HindIII-Stelle wurden jeweils in den PCR-Primern bereitgestellt. Das PCR-Produkt wurde mit PstI und HindIII verdaut und zwischen die PstI-Stelle und die HindIII-Stelle des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Das klonierte yicP-Fragment von 1,9 kb enthielt eine HapI-Stelle und eine EcoRV-Stelle bei etwa 540 bp beziehungsweise 590 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit HapI und EcoRV verdaut. Dann wurde das HapI-EcoRV-Fragment von 47 bp entfernt, und die DNA des Vektors wurde durch T4-DNA-Ligase einer Selbstligation unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wachsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und es wurde aus den Plasmid-DNAs eine Plasmid-DNA selektiert, die mit HapI oder EcoRV nicht verdaut wurde (pUC18yicP'#1). Das in diesem Plasmid enthaltene yicP hatte aufgrund der Deletion von 47 bp der HapI-EcoRV-Schnittstelle eine Leserahmenverschiebung, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (3).
  • Dann wurde pUC18yicP'#1 mit PstI und HindIII verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,9 kb, welches das yicP-Gen enthält, präpariert. Das Fragment wurde zwischen die PstI-Stelle und die HindIII-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997yicP'#1 erhalten wurde. Der Stamm FADRaddedd (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997yicP'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien er halten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. Unter den auftretenden Kolonien wurden willkürlich 100 Kolonien ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten und LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur auf LB-Agarplatten wuchsen. Die yicP-Regionen wurden durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden die Klone selektiert, in denen die Größe des amplifizierten Fragments mit HapI oder EcoRV nicht verdaut wurde. Es wurde auch bestätigt, dass die Adenindeaminaseaktivität in diesen Klonen nicht nachgewiesen wurde. Die Adenindeaminaseaktivität wurde nach dem Verfahren von Per Nygaard et al. gemessen (J. Bacteriol., 178, 846-853 (1996)). Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen yicP fehlt, und sie wurden als FADRaddeddyicP (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–) bezeichnet.
  • 2) Züchten von Stämmen, denen das Phosphoglucoseisomerasegen (pgi) fehlt, aus Stämmen, denen das Adenindeaminasegen (yicP) fehlt
  • Das Fehlen von pgi wurde auch auf den Stamm FADRaddeddyicP (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–) übertragen. Unter Verwendung von pMAN997pgi'#1, konstruiert in Beispiel 8, wurde ein Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–) auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 erhalten.
  • 3) Beurteilung der Fähigkeit eines Stammes, in den ein Plasmid mit unempfindlichem purF eingeführt war, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Transformanten wurden durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicP (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–) und den Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–) gezüchtet in den Abschnitten 1) und 2), hergestellt, und es wurden die Auswirkungen von zugegebenem Adenin auf das Wachstum und die Fähigkeiten zur Produktion von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass das eingesetzte Medium das MS-Medium war, das mit Adenin in einer Menge zwischen 0 bis 50 mg/l versetzt wurde.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Auswirkung von Adenin auf das Wachstum und die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 11 gezeigt. Durch das Fehlen von yicP wurde die Wachstumsgeschwindigkeit im Hinblick auf Adenin verbessert, und es wurde eine Wirkung des Fehlens von yicP beobachtet, wenn Adenin in Mengen von 50 mg/l und 20 mg/l zugegeben wurde.
  • Tabelle 11 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00680001
  • Beispiel 10
  • 1) Präparation des PRPP-Synthetasegens (prs)
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und der 38-mer- und 29-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACTGCCTAAGGATCTTCTCATGCCTGATATG (SEQ ID Nr: 26) und CTCGCATGCGCCGGGTTCGATTAGTGTTC (SEQ ID Nr: 27), präpariert auf der Grundlage der Information aus der Gendatenbank (E. coli Gene Bank), durchgeführt, und es wurde ein amplifiziertes Fragment von etwa 1 kb, welches die prs-Strukturgenregion, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon abdeckte, enthielt, in den Vektor pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Stelle beziehungsweise eine SphI-Stelle wurden in die PCR-Primer eingebaut. Das PCR-Produkt wurde mit SalI und SphI verdaut und zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle des Vektors pUC18 (pUCprs) kloniert.
  • 2) Konstruktion von unempfindlichem prs
  • Ein prs-Fragment wurde aus dem Plasmid, welches das in Abschnitt 1) klonierte prs von etwa 1 kb enthielt, durch SalI und SphI ausgeschnitten und zwischen die SalI- und SphI-Stellen der Multiklonierungsstelle eines Plasmids für die Einführung einer Mutation, pKF19k (Takara Shuzo), eingeführt, wobei der Zielklon erhalten wurde (pKFprs). S. G. Bower et al. (J. Biol. Chem., 264, 10287 (1989)) haben vorgeschlagen, dass PRPP-Synthetase (Prs) einer Rückkopplungshemmung durch AMP und ADP unterliegt. Es wird auch geschrieben, dass das Enzym, dessen ASP (D) an der Position 128 zu Ala (A) mutiert ist, teilweise unempfindlich gemacht ist. Deshalb wurde der folgende synthetische DNA-Primer für eine Gensubstitution zur Ausführung der Mutation von Asp (D) an der Position 128 von PRPP-Synthetase (Prs) nach Ala (A) präpariert, und pKFprs wurde nach dem Protokoll der Site-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo) einer ortsgerichteten Mutagenese unterworfen, wobei eine ortsgerichtete Mutation in pKFprs eingeführt wurde.
  • Primer für die D128A-Mutation:
    • 5'-GCGTGCAGAGCCACTATCAGC-3' (SEQ ID Nr: 28)
  • Nach der Mutagenese wurden 12 Klone willkürlich von den erhaltenen Transformanten aufgenommen, und aus ihnen wurden Plasmide hergestellt. Durch die Nucleotidsequenzierung der Plasmide um die Bereiche herum, an denen die Mutationen ein geführt wurden, wurde bestätigt, dass 9 Klone der Zielmutanten erhalten wurden. Das prs-Fragment wurde mit SalI und SphI aus pKFprsDA mit dem mutierten prs ausgeschnitten und zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle von pUC18 und pSTV18 (Takara Shuzo) eingeführt. Für die Verwendung des Wildtyp-prs als Kontrolle wurde das prs-Fragment mit SalI und SphI aus pUCprs, konstruiert wie vorstehend beschrieben, ausgeschnitten und zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle von pSTV18 (Takara Shuzo) eingeführt. Jedes der Plasmide pUCprsDA und pSTVprsDA und der Plasmide pUCprs und pSTVprs hat ein eingeführtes mutiertes prs oder ein Wildtyp-prs stromabwärts des lacp/o (Promotor des Lactoseoperons), abgeleitet von pUC18 beziehungsweise pSTV18, und das prs wird unter der Kontrolle dieses Promotors exprimiert.
  • Rekombinante Bakterien, die durch Transformation von E.-coli-JM109-Zellen mit den vorstehend beschriebenen 4 Plasmiden erhalten wurden, wurden in LB-Flüssigmedium während 8 Stunden kultiviert und gesammelt, und aus ihnen wurden Rohenzymextrakte präpariert. Die PRPP-Synthetaseaktivität der Extrakte und das Ausmaß der Inhibition durch ADP wurden nach dem Verfahren von K. F. Jensen et al. (Analytical Biochemistry, 98, 254-263 (1979)), welches teilweise modifiziert wurde, durchgeführt. Im Speziellen wurde [α-32P]ATP als Substrat eingesetzt, und [32P]AMP, welches durch diese Reaktion produziert wurde, wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
  • Tabelle 12 PRPP-Synthetase(Prs)-Aktivität
    Figure 00710001
  • 3) Beurteilung der Fähigkeit eines Stammes, der ein eingeführtes Plasmid mit unempfindlichem prs enthielt, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Stämme, die jeweils zwei Plasmide gleichzeitig enthielten, wurden durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–) gezüchtet in Abschnitt 3) des Beispiels 9, hergestellt, wobei eine Transformante erhalten wurde, und außerdem wurden die Stämme jeweils durch Einführen von pSTVprs und pSTVprsDA, die prs- und prsDA-Gene enthielten, in die Transformanten hergestellt, und es wurde die Fähigkeit dieser Stämme zur Produktion von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium auf 0,4% erhöht wurde.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 13 gezeigt. Durch Einfüh ren des mutierten prsDA als Plasmid wurde eine Verbesserung der Inosinproduktion beobachtet.
  • Tabelle 13 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00720001
  • Beispiel 11
  • 1) Züchten eines Stammes, dem das Xanthosinphosphorylasegen (xapA) fehlt
  • Ein durch Mutation inaktiviertes Gen wurde in einer Stufe durch Cross-over-PCR unter Verwendung von 4 Primern hergestellt, die auf der Grundlage der Information präpariert wurden, die durch Recherchieren in einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "xapA" als Suchbegriff erhalten wurde. Die eingesetzten Primer sind Folgende:
    N-aus: 5'-CGCGGATCCGCGACATAGCCGTTGTCGCC-3' (SEQ ID Nr: 29)
    N-in: 5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-3' (SEQ ID Nr: 30)
    C-in: 5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-3' (SEQ ID Nr: 31)
    C-aus: 5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3' (SEQ ID Nr: 32).
  • Zuerst wurde eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und des Primers N-aus (29-mer) und des Primers N-in (39-mer) sowie der Primer C-in (39-mer) und C-aus (29-mer) für beide Enden durchgeführt, wobei zwei PCR-Produkte (beide sind Fragmente von etwa 850 bp) jeweils erhalten wurden. Dann wurde die PCR unter Verwendung eines Gemisches der 2 PCR-Produkte als Matrize und der Primer N-aus und C-aus für beide Enden erneut durchgeführt, um ein Genfragment zu amplifizieren, worin die Genregion, die die xapA-Strukturgenregion enthielt, von einem Fragment von etwa 2,4 kb (Größe des Wildtyps) zu einem Fragment von etwa 1,7 kb gekürzt wurde. Eine BamHI-Stelle und eine HindIII-Stelle wurden in den PCR-Primern N-aus beziehungsweise C-aus bereitgestellt. Dieses PCR-Produkt wurde mit BamHI und HindIII verdaut, und das erhaltene Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase mit einem Plasmid ligiert, das durch Verdauen von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, mit BamHI und HindIII erhalten wurde. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wuchsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 1,7 kb durch BamHI- und HindIII-Verdauung ausgeschnitten wurde (pMAN997xapA'#1), wurde aus den Plasmid-DNAs selektiert. Das in diesem Plasmid enthaltene xapA hatte eine Deletion von etwa 700 bp in dem Strukturgen und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (Figur 3).
  • Der Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997xapA'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zur Bereitstellung einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom eingeführt war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden mehrere Klone dieser Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 42°C über Nacht kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden willkürlich unter den auftretenden Kolonien ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen. Die xapA-Region wurde durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer N-aus und C-aus aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und die Klone, in denen die Größe des amplifizierten Fragments etwa 1,7 kb war, wurden selektiert. Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen xapA fehlt, und sie wurden als FADRaddeddyicPpgixapA (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–, xap–) bezeichnet. In dem Stamm, dem xapA fehlt, wurde die Xanthinproduktion in einem Medium durch Kultivierung mit supplementiertem Xanthosin nicht beobachtet, und es wurde bestätigt, dass Xanthosinphosphorylase nicht induziert wurde. Die Xanthosinphosphorylaseaktivität wurde nach dem Verfahren von K. Hammer Jespersen et al. (Molec. Gen. Genet., 179, 341-348 (1980)) gemessen.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit des Stammes, der ein Plasmid mit unempfindlichem purF enthielt, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Eine Transformante wurde durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicPpgixapA (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–, xapA–), gezüchtet in Abschnitt 1), hergestellt, und es wurde die Fähigkeit des Stammes zur Produktion von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass das MS-Medium, worin die Menge des Hefeextrakts auf 0,8% erhöht wurde, eingesetzt wurde.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 14 gezeigt. Wenn die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium erhöht wurde, wurde die Nebenproduktion von Hypoxanthin, die nach Verbrauch des Zuckers in der zweiten Hälfte der Kultivierung deutlich auftrat, durch das Fehlen von xapA verringert, und es wurde eine Verbesserung der Inosinproduktion beobachtet.
  • Tabelle 14 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00760001
  • Beispiel 12
  • 1) Züchten eines Stammes, dem das Nucleosidpermeasegen (nupG) fehlt
  • Eine PCR (94°C, 30 sec; 55°C, 1 min; 72°C, 2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als Matrize und von 35-mer-Primern für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGAATTCATGGTGCCGAACCACCTTGATAAACG (SEQ ID Nr: 33) und CTCGTCGACATGCCGAAACCGGCGAATATAGCGAC (SEQ ID Nr: 34), präpariert auf der Grundlage der Information aus einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank), durchgeführt, wobei ein Fragment von etwa 2,7 kb der nupG-Strukturgenregion, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, erhalten wurde. Eine EcoRI-Stelle beziehungsweise eine SalI-Stelle sind in den PCR-Primern bereitgestellt. Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI, SalI und AflII verdaut. Da das PCR-amplifizierte Fragment 2 AflII-Stellen enthielt, wurden 3 Fragmente von etwa 750 bp, 820 bp und 1130 bp gebildet. Die 2 Fragmente von etwa 720 bp und 1130 bp, die nicht das AflII-Fragment von etwa 820 bp waren, wurden gewonnen und durch T4- DNA-Ligase mit DNA, die durch Verdauen des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) mit EcoRI und SalI erhalten wurde, ligiert. Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und Plasmid-DNAs wurden aus 16 der auftretenden Kolonien präpariert, und es wurde eine Plasmid-DNA, worin ein Fragment, das mit EcoRI und SalI verdaut war, von etwa 1,9 kb enthalten war (pUC18nupG'#1), aus den Plasmid-DNAs selektiert. Das Plasmid pUC18nupG'#1 wurde mit EcoRI und SalI verdaut, und das erhaltene Fragment von etwa 1,9 kb wurde durch T4-DNA-Ligase mit einem Plasmid, das durch Verdauen von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, mit EcoRI und SalI erhalten wurde. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wuchsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 1,9 kb durch Verdauen mit EcoRI und SalI ausgeschnitten wurde (pMAN997nupG'#1), wurde aus den Plasmid-DNAs selektiert. Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene nupG hatte eine Deletion von etwa 820 bp in dem Strukturgen, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (3).
  • Der Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–) wurde bei 30°C mit dem Plasmid pMAN997nupG'#1 transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten, wobei bei 42°C gewachse ne Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium (3 ml/Teströhrchen) eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert. Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (Verdünnung von etwa 10–5 bis 10–6), auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 42°C über Nacht kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur auf LB-Agarplatten wuchsen. Die nupG-Region wurde durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden Klone selektiert, in denen die Größe des amplifizierten Fragments etwa 1,9 kb war. Diese Klone wurden als Stämme betrachtet, denen nupG fehlt, und sie wurden als FADRaddeddyicPpginupG (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–, nupG–) bezeichnet.
  • 2) Beurteilung der Fähigkeit eines Stammes, der unempfindliches purF enthält, zur Produktion von Purinnucleosid
  • Eine Transformante wurde durch Einführen von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicPpginupG (purF–, purA–, deoD–, purR–, add–, edd–, yicP–, pgi–, nupG–), gezüchtet in Abschnitt 1), hergestellt, und es wurde die Fähigkeit des Stammes zur Produktion von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass das MS-Medium eingesetzt wurde, worin die Menge des Hefeextrakts auf 1,2% erhöht wurde.
  • Die Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 15 gezeigt. Wenn die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium erhöht wurde, wurde die Nebenproduktion von Hypoxanthin, die nach dem Verbrauch des Zuckers in der zweiten Stufe der Kultivierung deutlich auftritt, verringert, und es wurde eine verbesserte Inosinproduktion aufgrund des Fehlens von nupG beobachtet.
  • Tabelle 15 Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid
    Figure 00790001
  • Industrielle Anwendbarkeit
  • Erfindungsgemäß wird ein Purinnucleosid-produzierendes Bakterium erzeugt, indem ein Enzym, das einer Kontrolle in der Purinnucleosidbiosynthese unterliegt, dereprimiert und unempfindlich gemacht wird und außerdem ein Abbausystem und ein Umwandlungssystem blockiert werden. Das erzeugte Bakterium, welches Purinnucleosid produziert, kann in geeigneter Weise für die Produktion von Purinnucleosid durch Fermentation eingesetzt werden.
  • Sequenzliste
    Figure 00810001
  • Figure 00820001
  • Figure 00830001
  • Figure 00840001
  • Figure 00850001
  • Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • Figure 00880001
  • Figure 00890001

Claims (10)

  1. Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid, der die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Deregulation der Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms erworben hat.
  2. Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin die Kontrolle des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms durch Aufhebung der Rückkopplungshemmung aufgehoben ist.
  3. Mikroorganismus nach Anspruch 1 oder 2, worin das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligte Enzym Phosphoribosylpyrophosphatamidotransferase ist.
  4. Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligte Enzym Phosphoribosylpyrophosphatsynthetase ist.
  5. Mikroorganismus nach Anspruch 1, worin die Kontrolle des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms durch Inaktivierung eines Purinrepressors dereprimiert wird.
  6. Mikroorganismus nach Anspruch 1, der die Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Blockierung einer Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu einem anderen Mataboliten führt, erworben hat.
  7. Mikroorganismus nach Anspruch 6, worin die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigende und zu einem anderen Metaboliten führende Reaktion eine Reaktion ist, die durch ein Enzym katalysiert wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Succinyladenosinmonophosphatsynthase, Purinnucleosidphosphorylase, Adenosindeaminase, Inosinguanosinkinase, Guanosinmonophosphatreductase, 6-Phosphogluconatde hydrase, Phosphoglucoseisomerase, Adenindeaminase und Xanthosinphosphorylase besteht.
  8. Mikroorganismus nach Anspruch 1, der dadurch eine erhöhte Fähigkeit zur Produktion von Purinnucleosid hat, daß die Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus geschwächt ist.
  9. Mikroorganismus nach Anspruch 8, worin die Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus durch Blockieren einer Reaktion, die an der Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus beteiligt ist, geschwächt ist und die Reaktion, die an der Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus beteiligt ist, eine durch Nucleosidpermease katalysierte Reaktion ist.
  10. Verfahren zum Herstellen eines Purinnucleosids durch Fermentation, welches das Kultivieren des Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einem Kulturmedium unter Produktion und Anhäufung des Purinnucleosids in dem Medium und das Gewinnen des Purinnucleosids umfaßt.
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