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Technisches
Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von
Purinnucleosiden, wie Inosin und Guanosin, die als Ausgangsmaterialien
für die
Synthese von 5'-Inosinsäure beziehungsweise
5'-Guanylsäure wichtig
sind, und ein für
die Herstellung eingesetzter neuer Mikroorganismus.
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Hintergrund
der Erfindung
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Für die Herstellung
von Inosin und Guanosin durch Fermentation gibt es bekannte Verfahren
unter Einsatz von Adeninauxotrophen Stämmen oder solchen Stämmen, denen
Resistenz gegen verschiedene Arzneimittel, wie Purinanaloga, verliehen
worden sind und die zu der Gattung Bacillus gehören (Japanische Patentveröffentlichungen
Nrn. 38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980) und 55-45199
(1980), offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 56-162998 (1981),
Japanische Patentveröffentlichungen
Nrn. 57-14160 (1982) und 57-41915 (1982), und offengelegte Japanische
Patentanmeldung Nr. 59-42895
(1984)), oder zu der Gattung Brevibacterium (Japanische Patentveröffentlichungen
Nrn. 51-5075 (1976) und 58-17592 (1972), und Agric. Biol. Chem.,
42, 399 (1978)) und dergleichen gehören.
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Die
herkömmliche
Bereitstellung solcher mutierten Stämme umfasst die Mutagenesebehandlung
solcher Mikroorganismen, beispielsweise mit UV-Strahlen und Nitrosoguanidin
(N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin),
und das Selektieren eines gewünschten
Stammes unter Verwendung eines geeigneten Selektionsmediums. Andererseits
ist auch das Züchten
solcher mutierten Stämme
unter Verwendung von gentechnologischen Verfahren für Stämme der
Gattung Bacillus (offengelegte Japanische Patent anmeldung Nrn. 58-158197 (1983),
58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989),
1-174385 (1989), 3-58787 (1991),
3-164185 (1991), 5-84067 (1993) und 5-192164 (1993)) und der Gattung
Brevibacterium durchgeführt worden
(offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. 63-248394 (1988)).
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Offenbarung
der Erfindung
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Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, einen für die Produktion
von Purinnucleosid durch Fermentation geeigneten Mikroorganismus
zu erzeugen.
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Um
dieses Ziel zu erreichen, hatten die Erfinder der vorliegenden Erfindung
die Idee, die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosiden auf Bakterienstämme der
Gattung Escherichia zu übertragen,
wobei sich diese Gattung von den bislang für die Herstellung von Purinnucleosiden
durch Fermentation eingesetzten Mikroorganismen unterscheiden, und
sie haben dieses Ziel erreicht. Auf diese Weise wurde die vorliegende
Erfindung gemacht.
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Somit
stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus der Gattung
Escherichia mit der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid, wie in den Ansprüchen definiert,
bereit.
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Im
Speziellen stellt die vorliegende Erfindung einen Mikroorganismus
bereit, der die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Deregulation der
Kontrolle eines Enzyms, das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt
ist, erworben hat.
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Das
in der Purinnucleosidbiosynthese eingesetzte Enzym kann beispielsweise
Phosphoribosylpyrophosphat(PRPP)-Amidotransferase und Phosphoribosylpyrophospaht(PRPP)-Synthetase
sein.
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Als
Mittel zum Aufheben der Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese
beteiligten Enzyms kann beispielsweise die Defizienz eines Purinrepressors
genannt werden.
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In
einer Ausführungsform
hat der Mikroorganismus die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Blockierung einer
Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu
einem anderen Metaboliten führt,
erworben.
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Beispiele
für Reaktionen,
die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigen und zu einem anderen Metaboliten
führen,
umfassen solche, die von einem Enzym katalysiert werden, das unter
Succinyladenosinmonophosphat(AMP)-Synthase, Purinnucleosidphosphorylase,
Adenosindeaminase, Inosinguanosinkinase, Guanosinmonophosphat(GMP)-Reduktase,
5-Phosphogluconatdehydrase, Phosphoglucoseisomerase, Adenindeaminase
und Xanthosinphosphorylase ausgewählt ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
wird der Mikroorganismus bezüglich
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Verringerung der
Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus
verbessert.
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Die
Einverleibung des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus
kann durch Blockierung einer Reaktion, die an der Einverleibung
des Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus beteiligt ist,
verringert werden. Ein Beispiel der an der Einverleibung des Purinnucleosids
in Zellen des Mikroorganismus beteiligten Reaktion ist die von Nucleosidpermease
katalysierte Reaktion.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem
ein Verfahren zur Produktion eines Purinnucleosids durch Fermentation
bereit, welches die Kultivierung des vorstehend genannten Mikroorganismus
in einem Kulturmedium unter Produktion und Anhäufung des Purinnucleosids in
dem Medium und das Gewinnen des Purinnucleosids umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung wird im Folgenden eingehend beschrieben.
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(1) Mikroorganismus der
Gattung Escherichia mit der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
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Als
Beispiel des Mikroorganismus der Gattung Escherichia, der in der
vorliegenden Erfindung eingesetzt wird, kann Escherichia coli (E.
coli) und dergleichen genannt werden. Wenn E. coli-Stämme durch
gentechnologische Verfahren gezüchtet
werden, kann der Stamm E. coli K12 eingesetzt werden.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Purinnucleosid" umfasst beispielsweise
Inosin, Guanosin und Adenosin.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid" bedeutet die Fähigkeit, ein Purinnucleosid
in einem Medium zu produzieren und anzuhäufen. Der Ausdruck "mit der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid" bedeutet, dass der Mikroorganismus
der Gattung Escherichia ein Purinnucleosid in einem Medium in einer
größeren Menge
als ein Wildtypstamm von E. coli, beispielsweise der Stamm W3110, produziert
und anhäuft,
und er bedeutet vorzugsweise, dass der Mikroorganismus Inosin in
einem Medium in einer Menge von nicht weniger als 50 mg/l, stärker bevorzugt
nicht weniger als 100 mg/l, noch stärker bevorzugt nicht weniger
als 200 mg/l, am stärksten
bevorzugt nicht weniger als 500 mg/l unter den in dem nachstehenden
Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen produziert und anhäuft.
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Um
einen Mikroorganismus der Gattung Escherichia mit der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid zu züchten, kann die Züchtung durch
Aufheben der Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten
Enzyms eingesetzt werden.
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Außerdem kann
ein Züchten
durch Blockieren einer Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt
und zu einem anderen Metaboliten führt, und die Züchtung durch
Verringern der Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen des
Mikroorganismus durchgeführt
werden.
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(2) Mikroorganismus, worin
eine Aktivität
eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms in Zellen des
Mikroorganismus erhöht
ist
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Alle
Enzyme, die an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt sind, und
alle Reaktionen, die durch diese Enzyme in Mikroorganismen der Gattung
Escherichia katalysiert werden, sind bereits aufgeklärt worden (Escherichia
coli and Salmonella, CELLULAR AND MOLECULAR BIOLOGY, Second Edition,
Vol. 1 und Vol. 2, ASM PRESS, WASHINGTON D.C.). Die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid kann durch Erhöhen einer Aktivität eines
Enzyms, das unter den Enzymen eine Geschwindigkeits-bestimmende Reaktion
katalysiert, übertragen
werden. Ein Beispiel des Enzyms, das eine Geschwindigkeits-bestimmende
Stufe katalysiert, ist die PRPP-Amidotransferase oder die PRPP-Synthetase.
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Beispiele
der Vorgehensweisen zur Erhöhung
der Aktivität
eines Enzyms, das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt ist,
in den erfindungsgemäßen Zellen
werden nachstehend beschrieben, wobei die Erfindung jedoch nicht
darauf beschränkt
ist.
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Als
Mittel zum Erhöhen
der Aktivität
eines an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms in erfindungsgemäßen Zel len
ist es möglich,
die Kontrolle des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms
aufzuheben.
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Die
Kontrolle des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms
bedeutet einen Mechanismus, der die Aktivität des Enzyms negativ kontrolliert,
und umfasst die Rückkopplungshemmung
durch ein Intermediat in dem Biosyntheseweg oder ein Endprodukt,
die Attenuation, die Transkriptionssuppression und dergleichen.
Ein durch einen Mikroorganismus hergestelltes Purinnucleosid inhibiert
die Aktivität
des an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligten Enzyms oder reprimiert
die Expression eines dieses Enzym codierenden Gens durch die Kontrolle.
Um zuzulassen, dass der Mikroorganismus das Purinnucleosid produziert,
ist es deshalb bevorzugt, die Kontrolle aufzuheben.
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Das
an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligte Enzym, das einer Kontrolle
unterliegt, umfasst PRPP-Amidotransferase, die einer Rückkopplungshemmung
durch AMP oder GMP unterliegt, und PRPP-Synthetase, die einer Rückkopplungshemmung
durch Adenosindiphosphat (ADP) unterliegt. Daneben unterliegen Inosinmonophosphatdehydrogenase
(guaB) und GMP-Synthetase (guaA) einer Rückkopplungshemmung durch GMP.
Daneben wird das Purinoperon guaBA auch reprimiert.
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(Beispielsweise
kann purF, welches ein für
PRPP-Amidotransferase codierendes Gen ist, aus der chromosomalen
DNA des Stammes E. coli K12 W3110 (ATCC27325) unter Verwendung der
PCR-Technologie kloniert werden. Die dafür eingesetzte chromosomale
DNA kann von einem beliebigen Stamm von E. coli stammen. Das Gen
purF ist ein für
PRPP-Amidotransferase codierendes Gen, das einer Rückkopplungshemmung
durch Adenosinmonophosphat (AMP) oder Guanosinmonophosphat (GMP)
unterliegt, und umfasst Mutanten, die durch genetischen Poly morphismus
oder dergleichen erzeugt werden. Genetischer Polymorphismus bedeutet
ein Phänomen,
das eine Aminosäuresequenz
eines Proteins aufgrund natürlich
auftretender Mutationen in dem Gen teilweise verändert ist.)
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Als
ein Verfahren zum Aufheben der Kontrolle kann ein Verfahren zum
Einführen
einer Mutation in ein dieses Enzym codierende Gen oder in eine regulatorische
Region dafür
erwähnt
werden. Die Mutation umfasst die Mutation zum Aufheben der Rückkopplungshemmung,
die üblicherweise
eine Mutation in einem Strukturgen ist. Die Mutation umfasst auch
die Aufhebung der Attenuation, die üblicherweise eine Mutation
in einem Attenuator ist. Die Mutation umfasst auch die Aufhebung
der Repression, die üblicherweise
eine Mutation in einem Gen, das für ein regulatorisches Protein,
das Repressor genannt wird, codiert, oder eine Mutation in einer
Operatorregion ist.
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Die
Mutation zur Aufhebung der Repression umfasst die Mutation zur Inaktivierung
eines Purinrepressors. Der Purinrepressor bindet an eine Operatorregion
eines Purinoperons unter den Bedingungen, dass ein Purinnucleosid
in großer
Menge vorhanden ist, was zu einer Reprimierung der Transkription
des Operons führt.
Die Inaktivierung des Repressors führt zu einer Aufhebung der
Repression.
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Um
eine Mutation in ein Gen einzuführen,
können
ortsgerichtete Mutagenese (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in
Enzymology, 154, 350 (1987)), die rekombinante PCR-Technologie (PCR
Technology, Stockton Press (1989)), die chemische Synthese eines
spezifischen Abschnitts einer DNA, die Hydroxylaminbehandlung eines
gewünschten
Gens, die Behandlung von mikrobiellen Stämmen, die ein Zielgen enthalten, durch
UV-Bestrahlung oder
ein chemisches Mittel, wie Nitrosoguanidin oder salpetrige Säure, und
dergleichen eingesetzt werden.
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Wenn
die Funktion eines Gens vollständig
inaktiviert werden soll, kann die Addition oder Deletion einer DNA
an einer geeigneten Restriktionsschnittstelle durchgeführt werden.
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Ein
Mikroorganismus, in dem die Kontrolle eines an der Purinnucleosidbiosynthese
beteiligten Enzyms aufgehoben ist, kann durch Bestimmen der Expressionsmenge
des Enzyms durch einen enzymatischen Aktivitätstest oder unter Verwendung
von Antikörpern
selektiert werden. Als ein Beispiel eines Verfahrens zum Bereitstellen
eines mutierten Stammes, in dem die Kontrolle eines Enzyms aufgehoben
ist, kann ein Verfahren genannt werden, bei dem ein Stamm, der in
einem Minimalmedium, das ein Purinanalogon, wie 8-Azaadenin und
8-Azaguanidin enthält,
wachsen kann, selektiert wird und die Änderung der Expressionsmenge
oder die Aktivität
des Enzyms bestimmt wird.
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(3) Mikroorganismus, der
die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid aufgrund der Blockierung einer
Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigt und zu
einem anderen Metaboliten führt,
erworben hat
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Der
Purinnucleosidbiosyntheseweg von Mikroorganismen der Gattung Escherichia
ist bereits aufgeklärt
worden, und alle Enzyme, die an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt
sind, und Reaktionen, die durch diese Enzyme katalysiert werden,
sind bereits aufgeklärt
worden (Escherichia coli and Salmonella, CELLULAR AND MOLECULAR
BIOLOGY, Second Edition, Vol. 1 und Vol. 2, ASM PRESS WASHINGTON
D.C.). Daneben sind einige der Reaktionen, die zu anderen Metaboliten
führen,
aufgeklärt
worden.
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Ein
Mikroorganismus, worin eine Reaktion, die zu einem anderen Metaboliten
führt,
blockiert ist, kann durch diese Blockierung den Metaboliten benötigen. Um
einen solchen Mikroor ganismus, der diesen Metaboliten benötigt, zu
kultivieren, ist es erforderlich, den Metaboliten oder ein Intermediat
(Vorläufer)
davon zu einem Kulturmedium als Nährstoff zuzugeben. Deshalb
ist es wünschenswert,
dass eine Reaktion, die keine zusätzliche Zugabe von Metaboliten
erfordert, wenn sie blockiert wird, als Reaktion ausgewählt wird,
die blockiert werden soll.
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Die
Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid kann durch Blockieren einer Beliebigen
der Reaktionen, die zu anderen Metaboliten führt, nicht immer verbessert
werden. Wenn eine Reaktion, die ein Purinnucleosidintermediat oder
ein Purinnucleosid in einem anderen Metaboliten umwandelt, während der
Produktion des Purinnucleosids durch den Mikroorganismus fortschreitet,
kann die Blockierung einer solchen Reaktion die Purinnucleosidproduktivität verbessern.
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Eine
Reaktion, deren Blockierung die Fähigkeit zur Produktion von
Purinnucleosid tatsächlich
verbessert, kann unter den Reaktionen, die von der Purinnucleosidbiosynthese
abzweigen und zur Herstellung eines anderen Metaboliten führen, auf
der Grundlage des für
die Purinnucleosidbiosynthese bereits aufgeklärten Schemas vorhergesagt werden.
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Als
ein Verfahren zur Blockierung der Reaktion, die von der Purinnucleosidbiosynthese
abzweigt und zu einem anderen Metaboliten führt, kann ein Verfahren zum
Entfernen oder Inaktivieren eines die Reaktion katalysierenden Enzyms
oder dergleichen erwähnt
werden. Das Enzym kann beispielsweise durch Entfernen eines für dieses
Enzym codierenden Gens entfernt werden. Das Enzym kann beispielsweise
durch Einführen einer
Mutation in ein für
dieses Enzym codierendes Gen, durch Zugeben eines Mittels, welches
das Enzym spezifisch inaktiviert, oder dergleichen inaktiviert werden.
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Beispiele
der Reaktionen, die von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigen
und zu einem anderen Metaboliten führen, deren Blockierung die
Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid tatsächlich verbessern kann, umfassen
eine Reaktion, die von einem Enzym katalysiert wird, das unter Succinyl-AMP-Synthase, Purinnucleosidphosphorylase,
Adenosindeaminase, Inosinguanosinkinase, GMP-Reduktase, 6-Phosphogluconatdehydrase,
Phosphoglucoseisomerase, Adenindeaminase und Xanthosinphosphorylase
ausgewählt
ist.
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Wenn
beispielsweise die Verzweigung von IMP zu Succinyl-AMP und die Umwandlung
von Inosin zu Hypoxanthin blockiert werden, wird IMP nicht in AMP
umgewandelt, und Inosin wird nicht in Hypoxanthin umgewandelt. Dementsprechend
wird erwartet, dass Inosin angehäuft
wird. Um die Effektivität
einer solchen Blockierung abzuschätzen, kann eine Mutante, die
für den
gewünschten
Zweck erhalten wurde, kultiviert werden, und ihre Inosin-Produktivität kann bestimmt
werden.
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Wie
in den nachstehenden Beispielen beschrieben wird, wurde es, wenn
E. coli durch Zerstören
des Succinyl-AMP-Synthasegens
(purA-Gen) Adenin auxotroph gemacht wurde, erforderlich, eine AMP-Substanz, wie
Adenin und Adenosin, zu einem Kulturmedium zuzugeben, damit die
Adenin-auxotrophen Zellen von E. coli wachsen konnten. Es wurde
jedoch in E. coli gefunden, dass eine solche zugegebene Substanz
unmittelbar in Inosin oder Hypoxanthin umgewandelt wurde, und das
Wachstum hörte
aufgrund des Verlusts der AMP-Substanz an einem gewissen Punkt auf.
Deshalb wird angesichts des metabolischen Weges von E. coli erwartet,
dass es erforderlich ist, die Adenosindeaminase, die an der Umwandlung
von Adenosin zu Inosin beteiligt ist, oder die Adenindeaminase,
die an der Umwandlung von Adenin zu Hypoxanthin beteiligt ist, zu
inakti vieren, um ein nachhaltiges Wachstum zu ermöglichen.
Deshalb wurde die Effektivität
der Inaktivierung von Adenosindeaminase oder Adenindeaminase bestätigt, und
die Anhäufung
von Inosin wurde überwacht.
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GMP-Reduktase
ist an der Umwandlung von GMP zu IMP beteiligt. Es wird erwartet,
dass die Guanosinproduktivität
durch Inaktivieren der GMP-Reduktase verbessert wird. Wie in den
nachstehenden Beispielen gezeigt wird, wurde ein bestimmtes Maß der Verbesserung
der Guanosinanhäufung
beobachtet.
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Eine
Kohlenstoffquelle, wie Glucose, wird für die Produktion eines Purinnucleosids
eingesetzt. Es ist bekannt, dass in dem Zuckermetabolismussystem,
der zu der Purinnucleosidbiosynthese führt, in Abhängigkeit von der eingesetzten
Kohlenstoffquelle oder den Kulturbedingungen Unterschiede bestehen.
Deshalb wird für
das vorteilhafte Leiten des Metabolismussystems zu der Purinnucleosidbiosynthese
in Betracht gezogen, Abzweigungen, mit Ausnahme des Pentosephosphatweges,
zu blockieren, um dem Pentosephosphatweg den Vorzug zu geben. Um
dies durchzuführen,
wurde die Inaktivierung von 6-Phosphogluconatdehydrase oder Phosphoglucoseisomerase
untersucht, und die Wirksamkeit dieser Inaktivierung wurde bestätigt.
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(4) Mikroorganismus, der
die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid erworben hat, indem die Einverleibung
eines Purinnucleosids in Zellen des Mikroorganismus abgeschwächt wurde
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Da
die Einverleibung eines Purinnucleosids, das aus den Zellen ausgeschieden
wurde, in die Zellen hinein im Hinblick auf die für die Anhäufung des
Purinnucleosids erforderlichen Energie unzweckmäßig ist, ist ein Abschwächen der
Einverleibung eines Purinnucleosids wirksam.
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Als
Mittel zum Abschwächen
der Einverleibung eines Purinnucleosids in Zellen kann die Blockierung einer
Reaktion genannt werden, die an der Membrandurchlässigkeit
für Purinnucleoside
beteiligt ist. Die Blockierung der Reaktion kann auf dieselbe Weise
wie vorstehend in (3) beschrieben durchgeführt werden.
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Beispielsweise
wurde durch Inaktivierung von Nucleosidpermease, die eine der Permeasen
ist, die an der Einverleibung von Purinnucleosiden in Zellen beteiligt
sind, eine Verbesserung der Anhäufung
von Inosin beobachtet.
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(5) Verfahren zur Produktion
eines Purinnucleosids
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Das
Verfahren zur Produktion eines Purinnucleosids durch Fermentation
unter Verwendung des Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von
Purinnucleosid wird im Folgenden beschrieben.
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Ein
einzusetzendes Kulturmedium für
die Purinnucleosidproduktion kann ein übliches Medium sein, das eine
Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Ionen und
andere organische Komponenten bei Bedarf enthält. Als Kohlenstoffquelle können Saccharide,
wie Glucose, Lactose, Galactose, Fructose, Arabinose, Maltose, Xylose,
Trehalose, Ribose und Hydrolysate von Stärke; Alkohole, wie Glycerin,
Mannitol und Sorbitol; organische Säuren, wie Gluconsäure, Fumarsäure, Citronensäure und
Bernsteinsäure,
und dergleichen eingesetzt werden. Als Stickstoffquelle können anorganische
Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat;
organischer Stickstoff, wie Sojabohnenhydrolysate; Ammoniakgas;
wässriges
Ammoniak und dergleichen eingesetzt werden. Es ist wünschenswert,
dass Vitamine, wie Vitamin B1, erforderliche Substanzen, beispielsweise
Nucleinsäuren,
wie Adenin und RNA, oder Hefeextrakt und dergleichen in geeigneten
Mengen als organische Spurennährstoffe
enthalten sind. Daneben können
bei Bedarf kleine Mengen Calciumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisenionen,
Manganionen und dergleichen zugegeben werden.
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Die
Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen während 16
bis 72 Stunden durchgeführt,
und die Kulturtemperatur während
der Kultivierung wird innerhalb 30 bis 45°C und einem pH-Wert von 5 bis
8 gehalten. Der pH-Wert kann durch Einsatz einer anorganischen oder
organischen, sauren oder alkalischen Substanz sowie Ammoniakgas
eingestellt werden.
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Ein
Purinnucleosid kann aus der Fermentationsflüssigkeit durch ein beliebiges
herkömmliches
Verfahren oder eine beliebige Kombination davon, beispielsweise
durch Techniken unter Einsatz eines Ionenaustauscherharzes und Ausfällung, gewonnen
werden.
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(6) Spezifische Beispiele
von Purinnucleosid-produzierenden Bakterien
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Zuerst
werden purF (ein Gen, das für
PRPP-Amidotransferase. codiert), purR (ein Gen, das für einen Purinrepressor
codiert), deoD (ein Gen, das für
Purinnucleosidephosphorylase codiert), purA (ein Gen, das für Succinyl-AMP-Synthase
codiert), add (ein Gen, das für
Adenosindeaminase codiert), gsk (ein Gen, das für Inosinguanosinkinase codiert),
guaC (ein Gen, das für
GMP-Reduktase codiert), edd (ein Gen, das für 6-Phosphogluconatdehydrase codiert), pgi
(ein Gen, das für
Phosphoglucoseisomerase codiert), yicP (ein Gen, das für Adenindeaminase
codiert), prs (ein Gen, das für
PRPP-Synthetase codiert), xapA (ein Gen, das für Xanthosinphosphorylase codiert)
und nupG (ein Gen, das für
Nucleosidpermease codiert) aus einer chromosomalen DNA von Escherichia
coli (E. coli) K12 Stamm W3110 (ATCC27325) unter Verwendung der
PCR-Technologie
kloniert, und sie können
in Abhängigkeit
vom Verwendungszweck mutiert werden. Die für dieses Verfahren eingesetzte
chromosomale DNA kann von einem beliebigen Stamm von E. coli erhalten
werden.
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Die
in purF eingeführte
Mutation ist eine Mutation, bei der purF zerstört wird, oder eine Mutation
zum Aufheben der Rückkopplungshemmung
der PRPP-Amidotransferase. Die in purR eingeführte Mutation ist eine Mutation,
bei der purR zerstört
wird. Die in deoD eingeführte
Mutation ist eine Mutation, bei der deoD zerstört wird. Die in purA eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der purA zerstört wird. Die in add eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der add zerstört wird. Die in gsk eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der gsk zerstört wird.
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Die
in guaC eingeführte
Mutation ist eine Mutation, bei der guaC zerstört wird. Die in edd eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der edd zerstört wird. Die in pgi eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der pgi zerstört wird. Die in yicP eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der yicP zerstört wird. Die in prs eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der die Rückkopplungshemmung
von PRPP-Synthetase aufgehoben wird. Die in xapA eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der xapA zerstört wird. Die in nupG eingeführte Mutation
ist eine Mutation, bei der nupG zerstört wird.
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Um
eine Mutation in ein Gen einzuführen
können
ortsgerichtete Mutagenese (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in
Enzymology, 154, 350 (1987)), die rekombinante PCR-Technologie (PCR
Technology, Stockton Press (1989)), die chemische Synthese spezifischer
DNA-Abschnitte, die Hydroxylaminbehandlung eines interessierenden
Genes, die Behandlung von mikrobiellen Stämmen mit einem interessierenden
Gen durch UV-Bestrahlung oder mit einem chemischen Mittel, wie Nitrosoguanidin
oder salpetrige Säure,
und dergleichen eingesetzt werden. Wenn die Funktion eines Gens
vollständig
inaktiviert werden soll, kann eine Addition oder Deletion von DNA
an einer geeigneten Restriktionsschnittstelle durchgeführt werden.
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Dann
werden purF und prs, auf die eine Mutation zum Aufheben der Rückkopplungshemmung
von PRPP-Amidotransferase beziehungsweise PRPP-Synthetase übertragen
wird, als rekombinante DNA in einen geeigneten Mikroorganismus eingeführt, um
die Gene zu exprimieren, wodurch ein Mikroorganismus erhalten wird,
der das PRPP-Amidotransferasegen (purF) und das PRPP-Synthetasegen (prs),
deren Rückkopplungshemmung
im Wesentlichen aufgehoben ist, enthält. Die vorstehend erhaltene
rekombinante DNA bedeutet einen Vektor, wie ein Plasmid oder einen
Phagen, in den ein nützliches
Gen, wie PRPP-Amidotransferasegen (purF) und das PRPP-Synthetasegen
(prs), deren Rückkopplungshemmung
im Wesentlichen aufgehoben worden ist, als Passagier integriert
ist. Der Vektor kann einen Promotor enthalten, der in dem Mikroorganismus operabel
ist, wie lac, trp, tac, trc und PL, sodass eine effiziente Expression
des nützlichen
Gens erzielt werden kann.
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Die
hier eingesetzte rekombinante DNA umfasst beliebige solcher DNAs,
die durch Integrieren eines nützlichen
Gens in ein Chromosom unter Einsatz eines Transposons (Berg, D.E.
and Berg, C.M., Bio/Technol., 1, 417(1983)), eines Mu-Phagen (offengelegte
Japanische Patentanmeldung Nr. 2-109985 (1990)) und eines Plasmids
für die
homologe Rekombination oder dergleichen erhalten werden.
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Als
Plasmid für
die homologe Rekombination kann ein Plasmid mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
eingesetzt werden. Das Plasmid mit dem temperaturempfindlichen Replikationsursprung kann
bei einer permissiven Temperatur, beispielsweise etwa 30°C replizieren,
es kann jedoch bei einer nicht-permissiven Temperatur, beispielsweise
37°C bis
42°C nicht
replizieren. Bei dem homologen Rekombinationsverfahren unter Verwendung
des Plasmids mit dem temperatursensitiven Replikationsursprung kann das
Plasmid bei einer permissiven Temperatur repliziert werden oder
bei Bedarf bei einer nicht-permissiven Temperatur abgestoßen werden.
In den nachstehend beschriebenen Beispielen wurde pMAN997, welches pMAN031
(J. Bacteriol., 162, 1196 (1985)) entspricht, dessen VspI-HindIII-Fragment
durch das von pUC19 (Takara Shuzo) ersetzt worden ist (1),
als Plasmid für
die homologe Rekombination eingesetzt.
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Eine
spezifische genetische Funktion auf dem Chromosom wurde durch die
homologe Rekombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Habor Lab. (1972)) inaktiviert, um die Fähigkeit zur Produktion von
Purinnucleosid zu verbessern. Das zu inaktivierende Gen ist ein
Gen, bei dem die Inaktivierung zu einer Erhöhung der Expressionsmenge eines
Gens für
ein Enzym, das an der Purinnucleosidbiosynthese beteiligt ist, führt. Im
Speziellen wurde das Purinrepressorgen (purR) auf dem Chromosom
zerstört,
um den Expressionsregulationsmechanismus der Purinnucleotidbiosynthesegene,
einschließlich
des PRPP-Amidotransferasegens (purF), auszuschalten.
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Außerdem wurde
ein Gen, das für
ein Enzym codiert, welches eine von der Purinnucleosidbiosynthese abzweigende
und zu einem anderen Metaboliten führende Reaktion katalysiert,
zerstört.
Im Speziellen wurde das Purinnucleosidphosphorylasegen (deoD) zerstört, um die
Zersetzung von Inosin und Guanosin zu Hypoxanthin beziehungsweise
Guanin zu unterdrücken.
Außerdem
wurde das Succinyl-AMP-Synthasegen (purA) zerstört, um Adeninauxotrophie zu
verleihen. Überdies
wurde das Adenosindeaminasegen (add) zerstört, um die Umwandlung von Adenosin
zu Inosin zu unterdrücken.
Schließlich
wurde das Inosinguanosinkinasegen (gsk) zerstört, um die Umwandlung von Inosin
und Guanosin zu IMP beziehungsweise GMP zu unterdrücken. Das
GMP-Reduktasegen
(guaC) wurde zerstört,
um die Umwandlung von GMP zu IMP zu unterdrücken. Das 6-Phosphogluconatdehydrasegen
(edd) wurde zerstört,
um den Metabolismus von Zuckern durch den Entner-Doudoroff-Weg zu
unterdrücken.
Das Phosphoglucoseisomerasegen (pgi) wurde zerstört, um den Metabolismus von
Zuckern über
den Glycolyseweg zu unterdrücken,
wodurch der Fluss in den Pentosephosphatweg gefördert wurde. Das Adenindeaminasegen
(yicP) wurde zerstört,
um die Umwandlung von Adenin zu Hypoxanthin zu unterdrücken. Das
Xantosinphosphorylasegen (xapA) wurde zerstört, um die Zersetzung von Xanthosin
zu Xanthin zu unterdrücken
und den Abbau von Inosin und Guanosin zu Hypoxanthin beziehungsweise
Guanin zu unterdrücken.
Die Inaktivierung eines Zielgens kann natürlich auch durch Behandlung
eines die Gene enthaltenden mikrobiellen Stammes mit UV-Strahlen
oder mit einem chemischen Mittel, wie Nitrosoguanidin und salpetriger
Säure,
durchgeführt
werden.
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Als
der Mikroorganismus mit der rekombinanten DNA wurde ein Mikroorganismus
der Gattung Escherichia eingesetzt, worin ein Gen exprimiert wurde,
das für
ein Zielenzym, wie PRPP-Amidotransferase,
codiert.
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Um
das PRPP-Amidotransferasegen (purF) effizient einzusetzen, wird
es vorzugsweise zusammen mit anderen nützlichen Genen eingesetzt,
beispielsweise mit Genen, die an der IMP- Biosynthese von PRPP beteiligt sind
(purD, purT, purL, purM, purK, purE, purC, purB, purH), das IMP-Dehydrogenasegen
(guaB), das GMP-Synthetasegen (guaA), das PRPP-Synthetasegen (prs)
und dergleichen. Wie bei dem PRPP-Amidotransferasegen (purF) können solche
nützlichen
Gene auf einem Wirtschromosom oder einem Plasmid oder Phagen vorhanden
sein.
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Ein
Mikroorganismus, dem purA (das Succinyl-AMP-Synthasegen) fehlt und/oder
deoD (Purinnucleosidphosphorylasegen) fehlt und/oder purR (Purinrepressorgen)
fehlt und/oder purF (PRPP-Amidotransferasegen)
unempfindlich gemacht worden ist und/oder add (Adenosindeaminasegen)
fehlt und/oder gsk (Inosinguanosinkinasegen) fehlt und/oder guaC
(GMP-Reduktasegen) fehlt und/oder edd (6-Phosphogluconatdehydrasegen)
fehlt und/oder pgi (Phosphoglucoseisomerasegen) fehlt und/oder yicP
(Adenindeaminasegen) fehlt und/oder xapA (Xanthosinphosphorylasegen)
fehlt und/oder nupG (Nucleosidpermeasegen) fehlt, oder ein Mikroorganismus,
der mit einer rekombinanten DNA, die ein desensibilisiertes PRPP-Amidotransferasegen (purF)
und/oder ein desensibilisiertes prs (PRPP-Synthetasegen), das wie
vorstehend beschrieben erhalten wurde, trägt, wird kultiviert, sodass
das Ziel-Purinnucleosid, wie Inosin und Guanosin, in dem Kulturmedium angehäuft wird
und das angehäufte
Nucleosid gewonnen wird.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
die Konstruktion des Plasmids pMAN997.
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2 zeigt
die Strukturen von Genen für
die homologe Rekombination. Die Zahlen in der Figur stellen die
Längen
(bp) der erhaltenen Fragmente und die Positionen von den 5'-Enden an dar.
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3 zeigt
die Strukturen von Genen für
die homologe Rekombination. Die Zahlen in der Figur stellen die
Längen
(bp) der erhaltenen Fragmente und die Positionen von den 5'-Enden an dar.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Beispiel 1
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1) Züchten eines Stammes, dem das
PRPP-Amidotransferasegen (purF) fehlt
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Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung von chromosomaler DNA von E. coli K12 Stamm
W3110 (ATCC27325) als Matrize und 29-mer und 31-mer Primer für beide
Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG (SEQ
ID Nr: 1) und CTCAAGCTTTCATCCTTCGTTATGCATTTCG (SEQ ID Nr: 2), präpariert
auf der Grundlage der Information einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr.
M26893) durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1530 bp der purF-Strukturgenregion,
einschließlich
SD-ATG und Translationsterminationscodon, wurde in einen pCRTMII-Vektor
(Invitrogen) kloniert. Das amplifizierte Fragment des PCR-Produkts
kann als solches in diesen Vektor kloniert werden. Der Vektor hat
EcoRI-Schnittstellen in der Nähe
der beiden Seiten der Klonierungsstelle. In den PCR-Primern wird
eine PstI-Schnittstelle beziehungsweise eine HindIII-Schnittstelle
bereitgestellt.
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Das
klonierte 1530 bp purF-Fragment enthielt eine BglII-Schnittstelle bei
etwa 880 bp von dem 5'-Ende entfernt,
und der Vektor pCRTMII hatte selbst auch eine BglII-Schnittstelle.
Deshalb wurde das Plasmid mit BglII teilweise verdaut, mit T4-DNA-Polymerase
abgestumpft und dann mit T4-DNA- Ligase
ligiert. Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert,
und Transformanten, die auf LB (1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,1%
NaCl, 0,1% Glucose, pH 7) Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin,
gewachsen waren, wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 18 Klonen präpariert, und
eine Plasmid-DNA,
die ein Fragment von etwa 1550 bp durch EcoRI-Verdauung bereitstellte,
wobei das Fragment mit BglII nicht verdaut worden war (pCRTMIIpurF'#14), wurde aus den
Plasmid-DNAs selektiert. Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene purF
hatte eine Leserahmenverschiebung an der BglII-Schnittstelle, sodass vorhergesagt
wurde, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
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Dann
wurde pCRTMIIpurF'#14
mit EcoRI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,6 kb, welches purF enthielt,
herzustellen. Dieses Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstelle von
pMAN997 eingeführt,
welches ein Vektor für
die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) ist (wie 1 zeigt, pMAN031 (J. Bacteriol.,
162, 1196(1985)), worin das VspI-HindIII-Fragment mit demjenigen von
pUC19 (Takara Shuzo) ersetzt ist), wobei das Plasmid pMAN997purF'#14 erhalten wurde.
E. coli W3110 (Wildtyp) wurde bei 30°C mit pMAN997purF'#14 transformiert,
und einige der erhaltenen Klone wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten,
wodurch bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
gewachsen waren, wurde einmal wiederholt, und Klone, worin das gesamte
Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom integriert
war, wurden selektiert. Es wurde bestätigt, dass diese Klone kein
Plasmid in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen
mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, bei 30°C über Nacht
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kulturbrühe wurde
in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine etwa 10–5-
bis 10–6-Verdünnung),
auf LB-Agarplatten
plattiert und über
Nacht bei 42°C
kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden
von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und
auf LB-Agarplatten
und LB-Agarplatten, die 25 μg/ml
Ampicillin enthielten, jeweils gezüchtet, und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone,
die nur auf LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Unter den Ampicillin-empfindlichen
Klonen wurden Klone, die in Minimalmedium (Na2HPO4 6,8 g, KH2PO4 3 g, NaCl 0,5 g, NH4Cl
1 g, MgSO4·7H2O
0,5 g, CaCl2·2H2O 15
mg, Thiamin·HCl
2 mg, Glucose 0,2 g pro 1 l) nicht wuchsen, jedoch auf Minimalmedium,
das mit 50 mg/l Hypoxanthin supplementiert war, wuchsen, selektiert.
Außerdem
wurde das Fragment von etwa 1,5 kb, welches purF enthielt, durch
PCR aus der chromosomalen DNA der vorstehend erhaltenen Zielklone
amplifiziert, und bestätigt,
dass sie mit BglII nicht verdaut werden können. Die Klone, die die vorstehend
beschriebenen Bedingungen erfüllen,
wurden als Stämme
vermutet, denen purF fehlt, und wurden als Stämme F-2-51 und F-1-72 bezeichnet.
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2) Züchten von Stämmen, denen
das Succinyl-AMP-Synthasegen (purA) fehlt
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Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als
Matri ze und den 31-mer Primern für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGAGCTCATGGGTAACAACGTCGTCGTAC
(SEQ ID Nr: 3) und CTCGTCGACTTACGCGTCGAACGGGTCGCGC (SEQ ID Nr: 4),
präpariert
auf der Grundlage der Information einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr.
J04199), durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1300 bp der purA-Strukturgenregion,
die ATG und das Translationsterminationscodon einschließt, wurde
zwischen der SacI- und SalI-Schnittstelles des Vektors pUC18 (Takara
Shuzo) kloniert. In den Primern wird eine SacI-Schnittstelle beziehungsweise eine SalI-Schnittstelle
bereitgestellt. Das klonierte purA-Fragment von etwa 1300 bp enthielt
eine HpaI-Schnittstelle und eine SnaBI-Schnittstelle bei etwa 520
bp beziehungsweise 710 bp vom 5'-Ende
entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit HpaI und SnaBI verdaut
und mit T4-DNA-Ligase ligiert, wobei das Plasmid erhalten wurde,
von dem ein Fragment mit etwa 190 entfernt wurde. Kompetente Zellen
von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und Transformanten,
die auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, wuchsen, wurden
erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten von 18 Klonen
präpariert,
und eine Plasmid-DNA, die mit FspI nicht verdaut war, jedoch ein
Fragment von etwa 1100 bp durch SacI- und SalI-Verdauung bereitstellte (pUC18purA'#1), wurde aus den
Plasmid-DNAs selektiert. Das Gen purA, das in diesem Plasmid enthalten war,
wies eine Deletion zwischen der HpaI- und Sna-BI-Schnittstelle auf, und es wurde deshalb
vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
-
Dann
wurde pUC18purA'#1
mit SacI und SalI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,1 kb, welches
purA umfasst, herzustellen. Dieses Fragment wurde zwischen den SacI-
und SalI-Schnittstellen von pMAN997 eingeführt, welches ein Vektor für die homologe
Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, wobei das Plasmid pMAN997purA'#1 erhalten wurde. Der
Stamm F-2-51 (purF–) wurde bei 30°C mit dem
Plasmid pMAN997purA'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei die Kolonien bei 42°C gezüchtet wurden. Die Vorgehensweise
zur Bereitstellung einzelner Kolonien, die bei 42°C wachsen,
wurde einmal wiederholt, und Kolonien, worin das gesamte Plasmid
in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert war, wurden
selektiert. Es wurde bestätigt,
dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann
wurden mehrere Klone unter diesen Klonen auf LB-Agarplatten ausgestrichen,
bei 30°C über Nacht
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kulturbrühe
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten
plattiert und über
Nacht bei 42°C
kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden
von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und
jeweils auf LB-Agarplatten und LB-Agarplatten, die 25 μg/ml Ampicillin
enthielten, gezüchtet,
und Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf den LB-Agarplatten
wuchsen, wurden selektiert. Unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen
wurden Klone, die auf Minimalmedium, das mit 50 mg/l Hypoxanthin
supplementiert war, nicht wuchsen, jedoch auf Minimalmedium, das
mit 50 mg/l Adenin supplementiert war, wuchsen, selektiert. Außerdem wurde
das purA-Fragment von etwa 1,1 kb durch PCR aus der chromosomalen
DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestä tigt, dass
es kleiner ist als dasjenige vom Wildtyp (etwa 1,3 kb) und mit FspI nicht
verdaut werden kann. Der Klon, der die vorstehend beschriebenen
Bedingungen erfüllte
wurde als ein Klon betrachtet, dem purA fehlt, und wurde als Stamm
FA-31 bezeichnet.
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3) Züchten eines Stammes, den das
Purinnucleosidphosphorylasegen (deoD) fehlt
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Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als
Matrize und der 30-mer- und 31-mer-Primer für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen
CTCGTCGACGCGGGTCTGGAACTGTTCGAC (SEQ ID Nr: 5) und CTCGCATGCCCGTGCTTTACCAAAGCGAATC
(SEQ ID Nr: 6), präpariert
auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer
Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter dem Schlüsselwort "deoD" erhalten
wurde, durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1350 bp, welches die deoD-Strukturgenregion,
einschließlich
SD-ATG und Translationsterminationscodon, einschließt, wurde
in den Vektor pCRTMII (Invitrogen) kloniert. Der Vektor hat EcoRI-Schnittstellen
in der Nähe
beider Seiten der Klonierungsstelle. In den PCR-Primern wurde eine SalI-Schnittstelle
beziehungsweise eine SphI-Schnittstelle bereitgestellt. Das klonierte
deoD-Fragment von
etwa 1350 bp enthielt eine HpaI-Schnittstelle von etwa 680 bp von
dem 5'-Ende entfernt,
und deshalb wurde das Plasmid mit HpaI verdaut, und ein Gemisch
des verdauten Plasmids und eines 10-mer-ClaI-Linkers wurde einer
T4-DNA-Ligasereaktion
unterworfen. Als Ergebnis wurde eine ClaI-Schnittstelle an der HpaI-Schnittstelle
eingeführt.
Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert,
und es wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsene
Transformanten erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 16 Klonen präpariert, und
eine Plasmid-DNA, die mit HpaI nicht verdaut worden war, jedoch
mit ClaI verdaut worden war (pCRTMIIdeoD'#16), wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das
in diesem Plasmid enthaltene deoD hatte eine Leserahmenverschiebung
an der HpaI-Schnittstelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das
codierte Enzym seine Funktion nicht hat (2).
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Dann
wurde pCRTMIIdeoD'#16
mit EcoRI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,35 kb, welches deoD enthält, herzustellen.
Dieses Fragment wurde in die EcoRI-Schnittstelle von pMAN997, einem
Vektor für
die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben), eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997deoD'#16 erhalten wurde.
Der Stamm F-1-72 (purF–) und der Stamm FA-31
(purF–,
purA–)
wurden bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997deoD'#16
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Der Vorgang der Bereitstellung
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und Klone, worin das gesamte Plasmid
in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert war, wurden
selektiert. Es wurde bestätigt,
dass diese Klone in ihrem Zytoplasma kein Plasmid enthielten. Dann
wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen,
bei 30°C über Nacht
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kulturbrühe
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten
plattiert und bei 42°C über Nacht kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und auf LB-Agarplatten
beziehungsweise LB-Agarplatten, die 25 μg/ml Ampicillin enthielten,
gezüchtet,
und es wurden Ampicillin-empfindliche
Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Die Ampicillin-empfindlichen
Klone wurden auf dem LG-Medium, das mit 1 g/l Inosin supplementiert
war, gezüchtet, und
Klone, die Inosin nicht zu Hypoxanthin zersetzten, wurden durch
Dünnschichtchromatografieanalyse
des Kulturmediums selektiert. Außerdem wurde das Fragment von
etwa 1,35 kb, welches deoD einschließt, durch PCR aus der chromosomalen
DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass
es mit ClaI verdaut wird, jedoch mit HpaI nicht verdaut wird. Die
Klone, welche die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllen, wurden
als Stämme
betrachtet, denen deoD fehlt, und Klone, die aus dem Stamm F-1-72
(purF–)
und dem Stamm FA-31 (purF–, purA–)
stammten, wurden als Stamm FD-6 beziehungsweise FAD-25 bezeichnet.
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4) Züchten eines Stammes, dem das
Purinrepressorgen (purR) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als
Matrize und den 29-mer- und 28-mer-Primern für beide Enden mit den Nucleotidsequenzen
CTCGTCGACGAAAGTAGAAGCGTCATCAG (SEQ ID Nr: 7) und CTCGCATGCTTAACGACGATAGTCGCGG
(SEQ ID Nr: 8), präpariert
auf der Grundlage der Information, die durch Recherche einer Gendatenbank
(E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "purR" als
Suchbegriff erhalten wurde, durchgeführt, und ein amplifiziertes
Fragment von etwa 1,8 kb, welches eine purR-Strukturgenregion, einschließlich ATG
und das Translationsterminationscodon und etwa 800 bp 5'-stromaufwärts von
ATG, umfasste, wurde zwischen die SalI-Schnittstelle und die SphI-Schnittstelle
des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Schnittstelle
und eine SphI-Schnittstelle wurden jeweils in den PCR-Primern eingebaut,
und diese Stellen wurden für
das Klonieren verwendet. Das klonierte purR-Fragment von etwa 1,8
kb enthielt eine PmaCI-Schnittstelle bei etwa 810 bp von dem 5'-Ende entfernt (in
der Nähe
des N-Terminus in der purR-Strukturgenregion), und deshalb wurde
das Plasmid als PmaCI bezeichnet. Ein Gemisch des verdauten Plasmids
und eines 8-mer-BglII-Linkers wurde einer T4-DNA-Ligasereaktion
unterworfen. Als Ergebnis wurde eine BglII-Schnittstelle an der
PmaCI-Stelle eingeführt.
Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert,
und auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gewachsene
Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 10 Klonen präpariert,
und eine Plasmid-DNA, die mit PmaCI nicht verdaut wurde, jedoch
mit BglII verdaut wurde (pUC19purR'#2), wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das
in dieser Plasmid-DNA enthaltene purR hatte eine Leserahmenverschiebung
an der PmaCI-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte
Enzym seine Funktion nicht hat (2).
-
Dann
wurde pUC19purR'#2
mit SacI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,8 kb, welches purR
einschloss, erhalten wurde. Dieses Fragment wurde zwischen der SacI-Schnittstelle
und der SphI-Schnittstelle von pMAN997 eingeführt, der ein Vektor für die homologe
Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) ist (wie vorste hend beschrieben), wobei das Plasmid pMAN997purR'#2 erhalten wurde.
Der Stamm FD-6 (purF–, deoD–)
und der Stamm FAD-25 (purF–, purA–,
deoD–)
wurden bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997purR'#2
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone, worin das
gesamte Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination integriert
war, ausgewählt.
Es wurde bestätigt,
dass diese Klone in ihrem Zytoplasma das Plasmid nicht aufwiesen.
Dann wurden mehrere Klone unter diesen Klonen auf LB-Agarplatten
aufgestrichen, bei 30°C über Nacht
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kulturbrühe
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten
plattiert und über
Nacht bei 42°C
kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden
von den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt und
auf LB-Agarplatten
beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und
es wurden Ampicillin-empfindliche
Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. 10 Klone
wurden unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen willkürlich ausgewählt, und
das Fragment von etwa 1,8 kb, welches purR enthielt, wurde aus der
chromosomalen DNA dieser Klone durch PCR amplifiziert, und Klone,
die mit BglII verdaut wurden, jedoch mit PmaCI nicht verdaut wurden,
wurden ausgewählt.
Diese Klone wurden als Stämme
be trachtet, denen purR fehlt, und Klone, abgeleitet von dem Stamm
FD-6 (purF–,
deoD–)
und dem Stamm FAD-25 (purF–, purA–,
deoD–)
wurden als Stamm FDR-18 beziehungsweise FADR-8 bezeichnet. Es wurde
bestätigt,
dass die PRPP-Amidotransferaseaktivität in den Stämmen, in denen purR zerstört war,
im Vergleich zu den Stämmen, worin
purR nicht zerstört
war, erhöht
war, wobei der purF+-Stamm, dem deoD und
purR fehlt, oder der purF+-Stamm, dem purA,
deoD und purR fehlt, eingesetzt wurde. Die PRPP-Amidotransferaseaktivität wurde nach
dem Verfahren von L. J. Messenger et al. (J. Biol. Chem., 254, 3382(1979))
gemessen.
-
5) Konstruktion eines
unempfindlich gemachten PRPP-Amidotransferasegens
(purF)
-
Ein
purF-Fragment wurde aus dem Plasmid, welches das purF von etwa 1530
bp, kloniert in dem Vektor pCRTMII (Invitrogen) in Abschnitt 1,
enthielt, durch Verdauen mit PstI und HindIII ausgeschnitten und
zwischen die PstI- und HindIII-Schnittstellen der Multiklonierungsstelle
auf einem Plasmid zur Einführung
einer Mutation, pKF18 (Takara Shuzo) eingeführt, um den Zielklon zu erhalten
(pKFpurF). G. Zhou et al. (J. Biol. Chem., 269, 6784 (1994)) haben
entdeckt, dass PRPP-Amidotransferase (PurF), dessen Lys (K) an der
Position 326 durch Gln (Q) ersetzt ist und dessen Pro (P) an der
Position 410 durch Trp (W) ersetzt ist, jeweils bezüglich der
Rückkopplungshemmung
durch GMP und AMP unempfindlich sind. Deshalb wurden die folgenden synthetischen
DNA-Primer für
die Gensubstitution unter Ausführung
der Mutationen von Lys (K) an der Position 326 und Pro (P) an der
Position 410 von PRPP-Amidotransferase
(PurF) nach Gln (Q) beziehungsweise Trp (W) präpariert, und pKFpurF wurde
einer ortsgerichteten Mutagenese nach dem Protokoll von Site-directed Mutagenesis
System Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo) unterworfen, um in
pKFpurF eine ortsgerichtete Mutation einzuführen.
-
Primer für die K326Q-Mutation:
-
- 5'-GGGCTTCGTT
CAG AACCGCTATGTTGG-3' (SEQ
ID Nr: 9)
-
Primer für die P410W-Mutation:
-
- 5'-TATGGTATTGATATG
TGG AGCGCCACGGAAC-3' (SEQ
ID Nr: 10)
-
Nach
der Mutagenisierung wurden 6 Klone von jeder der erhaltenen Transformanten
willkürlich
ausgewählt,
und es wurden Plasmide aus ihnen präpariert. Durch die Nucleotidsequenzierung
der Plasmide um die Positionen, bei denen die Mutationen eingeführt wurden,
wurde bestätigt,
dass die gewünschten
Mutanten erhalten wurden. Die erhaltenen Plasmide wurden als pKFpurFKQ
beziehungsweise pKFpurFPW bezeichnet. Die Mutation P410W (410Pro→Trp) wurde
zudem in pKFpurFKQ auf dieselbe Weise eingeführt, wobei pKFpurFKQPW erhalten
wurde, ein mutiertes Plasmid mit zwei simultanen Mutationen. Jedes
der Plasmide pKFpurFKQ, pKFpurFPW und pKFpurFKQPW hatte ein eingeführtes mutiertes
purF stromabwärts
von lacp/o (Promotor des Lactoseoperons) aus pKF18, und purF wurde
unter Kontrolle dieses Promotors exprimiert.
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Rekombinante
Bakterien, die durch Transformieren von E.-coli-KM109-Zellen mit den vorstehend beschriebenen
Plasmiden erhalten wurden, wurden in LB-Flüssigmedium während 8
Stunden kultiviert und dann gesammelt, und Rohenzymextrakte wurden
aus ihnen hergestellt. Die PRPP-Amidotransferaseaktivität der Extrakte
und die Ausmaße
der Inhibition durch AMP und GMP wurden nach dem Verfahren von L.
J. Messenger (J. Biol. Chem., 254, 3382 (1979)) gemessen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 1 gezeigt.
-
Tabelle
1 PRPP-Amidotransferaseaktivität und Inhibition
durch AMP und GMP
-
6) Abschätzung der
Fähigkeit
eines Stammes mit eingeführtem
mutiertem purF-Plasmid zur Produktion von Purinnucleosid
-
Transformanten
wurden durch Einführen
von pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW in den Stamm FDR-18 (purF–,
deoD–,
purR–)
und den Stamm FADR-8 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
hergestellt in Abschnitt 4), hergestellt, und die Fähigkeiten
dieser Stämme
zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt.
-
Das
Basalmedium und das Kulturverfahren zur Produktion von Purinnucleosid
und das Analyseverfahren zur Beurteilung der Fähigkeit zur Produktion von
Purinnucleosid werden nachstehend beschrieben.
1.
Basalmedium: | MS-Medium |
| Endkonzentration |
Glucose | 40
g/l (getrennt sterilisiert) |
(NH4)2SO4 | 16
g/l |
KH2PO4 | 1
g/l |
MgSO4·7H2O | 1
g/l |
FeSO4·7H2O | 0,01
g/l |
MnSO4·4H2O | 0,01
g/l |
Hefeextrakt | 2
g/l |
CaCO3 | 30
g/l (getrennt sterilisiert) |
-
Kulturverfahren
-
- Auffrischungskultur: gelagertes Bakterium, eingeimpft in
LB-Agarmedium (bei
Bedarf supplementiert mit einem Arzneimittel), über Nacht bei 37°C kultiviert
- Animpfkultur: das mit der Auffrischungskultur kultivierte Bakterium
in LB-Flüssigmedium
eingeimpft (bei Bedarf supplementiert mit einem Arzneimittel), über Nacht
bei 37°C
kultiviert
- Hauptkultur: 2% eingeimpft von der Animpfkultur in MS-Medium
(supplementiert mit Adenin und bei Bedarf mit einem Arzneimittel)
- 37°C,
20 ml/500-ml Volumen Sakaguchi-Kulturkolben
-
Analyseverfahren
-
Eine
Probe des Kulturmediums (500 μl)
wird im Laufe der Zeit wiederholt entnommen und 5 Minuten bei 15.000
UpM zentrifugiert, und der Überstand
wird viermal mit H2O verdünnt und
mittels HPLC analysiert. Wenn nichts anderes angegeben ist, wird
die Abschätzung
auf der Grundlage der angehäuften
Menge eines Purinnucleosids pro Einheitsvolumen des Mediums nach
Kultivierung während
3 Tagen gemacht.
-
Analysebedingungen:
-
- Säule:
Asahipak GS-220 (7,6 mm Innendurchmesser × 500 mm Länge)
- Puffer: Der pH-Wert wird mit 0,2M NaH2PO4 (pH 3,98) und mit Phosphorsäure eingestellt
- Temperatur: 55°C
- Fließgeschwindigkeit:
1,5 ml/min
- Nachweis: UV 254 nm
- Retentionszeit (min)
-
Inosin |
16,40 |
Hypoxanthin |
19,27 |
Guanosin |
20,94 |
Guanin |
23,55 |
Adenin |
24,92 |
Adenosin |
26,75 |
-
Für die Stämme von
purA– (Adenin-auxotroph)
wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 2 gezeigt. Eine überlegene
Inosinproduktion wurde im Gegensatz zu dem Stamm W3110 (Wildtypstamm),
bei dem eine Produktion in Spurenmengen beobachtet wurde, bei Stämmen mit
eingeführtem
mutierten purF-Plasmid beobachtet.
-
Tabelle
2 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 2
-
1) Züchten eine Stammes, dem das
Adenosindeaminasegen (add) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als
Matrize und 29-mer-Primern für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACGGCTGGATGCCTTACGCATC
(SEQ ID Nr: 11) und CTCGCATGCAGTCAGCACGGTATATCGTG (SEQ ID Nr: 12),
präpariert
auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer
Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "add" als Suchbegriff
erhalten wurde, durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1,8 kb, welches eine add-Strukturgenregion
einschließt,
die ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, etwa 420
bp 5'-stromaufwärts von
ATG und etwa 370 bp stromabwärts
des Translationsterminationscodons, wurde zwischen die SalI-Stelle
und die SphI-Stelle
des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Stelle und eine SphI-Stelle
werden jeweils in den PCR-Primern bereitgestellt, und diese Stellen
werden für
das Klonieren eingesetzt. Das klonierte add-Fragment von etwa 1,8
kb enthielt eine StuI-Stelle bei etwa 880 bp von dem 5'-Ende entfernt, und
deshalb wurde das Plasmid mit StuI verdaut, und ein Gemisch des
verdauten Plasmids und eines 8-mer-BglII-Linkers wurde einer T4-DNA-Ligasereaktion
unterworfen. Als Ergebnis wurde die BglII-Stelle an der StuI-Stelle
eingebaut. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser
Ligationslösung
transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten
wuchsen, die 25 μg/ml
Ampicillin enthielten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 10 Klonen präpariert,
und eine Plasmid-DNA, die mit StuI nicht verdaut wurde, jedoch mit
BglII verdaut wurde (pUC19add'#1),
wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene add
wies eine Leserahmenverschiebung an der StuI-Stelle auf, und deshalb
wurde vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht
aufweist (2).
-
Dann
wurde pUC19add'#1
mit SacI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,8 kb hergestellt wurde,
welches add enthielt. Dieses Fragment wurde zwischen der SacI-Stelle
und der SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe
Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997add'#1 erhalten wurde.
Der Stamm FDR-18 (purF–, deoD–,
purR–)
und der Stamm FADR-8 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–)
wurden bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997add'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
die 25 μg/ml
Ampicillin enthielten, ausgestrichen und über Nacht bei 30°C kultiviert.
Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, plattiert, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone, in die das
gesamte Plasmid in das Chromosom durch homologe Rekombination eingeführt war,
ausgewählt. Es
wurde bestätigt,
dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten.
Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten
ausgestrichen, über
Nacht bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kulturbrühe
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden willkürlich unter
den auftretenden Kolonien ausgewählt,
und jede wurde auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, gezüchtet, und
es wurden Ampicillin-empfindliche Klone, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen,
selektiert. Die Ampicillin-empfindlichen Klone wurden in dem LG-Medium,
das mit 1,5 g/l Adenosin supplementiert war, gezüchtet, und Klone, die Adenosin
nicht in Inosin umwandelten, wurden durch Dünnschichtchromatografieanalyse
des Kulturmediums selektiert. Außerdem wurde das add-Fragment
von etwa 1,8 kb durch PCR aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone
amplifiziert, und es wurde bestätigt,
dass sie mit BlgII, jedoch nicht mit StuI verdaut wurden. Diese
Klone wurden als Stämme
betrachtet, denen add fehlt, und Klone aus dem Stamm FDR-18 (purF–,
deoD–,
purR–)
und dem Stamm FADR-8 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–)
wurden als Stämme
FDRadd-18-1 beziehungsweise FADRadd-8-3 bezeichnet.
-
2) Beurteilung der Fähigkeit
eines Stammes mit eingeführtem,
unempfindlich gemachten purF zur Produktion von Purinnucleosid
-
Durch
Einführen
von pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW in den Stamm FDRadd-18-1 (purF–,
deoD–, purR–,
add–)
und den Stamm FADRadd-8-3
(purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–),
die in Abschnitt 1) gezüchtet wurden,
wurden Transformanten hergestellt, und die Fähigkeit dieser Stämme zur
Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Für den Stamm FADRadd-8-3 wurde
auch eine Transformante mit dem Wildtyp-purF-Plasmid (pKFpurF) hergestellt
und mit der mit pKFpurFKQ und der mit pKFpurFKQPW transformierten
Transformante verglichen. Das Basalmedium und das Kultivierungsverfahren
für die
Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe
wie in Beispiel 1.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 3 gezeigt. Eine überlegene
Inosinproduktion wurde im Vergleich mit dem Stamm W3110 (Wildtypstamm)
beobachtet. Die Wirkungen von purFKQ von unempfindlichen Typ und
purFKQPW wurden durch Vergleichen mit dem Wildtyp purF bestimmt.
-
Tabelle
3 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 3
-
1) Konstruktion eines
unempfindlichen purF-Plasmids für
die homologe Rekombination
-
Um
die Substitution eines unempfindlichen purF in einem Chromosom unter
Einsatz eines purF–-Stammes, der in Abschnitt
1) in Beispiel 1 hergestellt wurde, durchzuführen, wurde ein weiteres purF-Fragment,
das um etwa 0,5 kb auf der 3'-Seite
länger
als das vorher erhaltene purF-Fragment (etwa 1,6 kb) war, hergestellt. Die
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
29-mer-Primern für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCCTGCAGAACGAGGAAAAAGACGTATG
(SEQ ID Nr: 1) und CTCAAGCTTGTCTGATTTATCACATCATC (SEQ ID Nr: 13),
präpariert
auf der Grundlage der Information aus der Gendatenbank (E. coli
Gene Bank), durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,1 kb, welches die purF-Strukturgenregion
einschloss, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon enthielt,
wurde in den Vektor pCRTMII (Invitrogen) kloniert. Das in diesem
Klon erhaltene Plasmid wurde pCRTMIIpurFL genannt. Das Plasmid pCRTMIIpurFL
hat EcoRI-Schnittstellen in der Nähe der beiden Enden der Klonierungsstelle.
Eine PstI-Stelle beziehungsweise eine HindIII-Stelle wird in den
PCR-Primern bereitgestellt.
-
Dann
wurde das Plasmid pCRTMIIpurFL mit SnaBI und HindIII verdaut, wobei
ein Fragment von etwa 0,65 kb stromabwärts des C-Terminus der purF-codierenden
Region erhalten wurde. Dieses Fragment wurde zwischen die SnaBI-Stelle
und die HindIII-Stelle
des in Abschnitt 5) des Beispiels 1 erhaltenen Plasmids pKFpurFKQ
und pKFpurFKQPW eingeführt,
wobei pKFpurFLKQ und pKFpurFLKQPW erhalten wurden.
-
Dann
wurden pKFpurFLKQ und pKFpurFLKQPW mit EcoRI und HindIII verdaut,
wobei Fragmente von etwa 2,1 kb, enthaltend purFLKQ und purFLKQPW,
erhalten wurden. Diese Fragmente wurden zwischen die EcoRI- und
HindIII-Stellen von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe
Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997purFLKQ
beziehungsweise das Plasmid pMAN997purFLKQPW erhalten wurde.
-
2) Züchten eines Stammes mit in
das Chromosom eingeführtem
unempfindlichen purF
-
Der
Stamm FDRadd-18-1 (purF–, deoD–,
purR–,
add–)
und der Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
wurden jeweils mit den Plasmiden pMAN997purFLKQ und pMAN997purFLKQPW
bei 30°C transformiert,
und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone, in denen
das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom
eingeführt
war, selektiert. Es wurde bestätigt,
dass diese Klone das Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten.
Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten
ausgestrichen, über
Nacht bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kulturbrühe
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten
ausgestrichen und bei 42°C über Nacht
kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden
willkürlich
von den auftretenden Kolonien ausgewählt und jeweils auf LB-Agarplatten
beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen,
wobei Ampicillin-empfindliche
Klone, die nur auf LB-Agarplatten wachsen konn ten, selektiert wurden.
Unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen wurden Klone, die auf
dem Minimalmedium wuchsen, für
den Stamm FDRadd-18-1 (purF–, deoD–,
purR–,
add–) selektiert,
und Klone, die in Minimalmedium, das mit 100 mg/l L-Histidin und
50 mg/l Adenin supplementiert war, wurden für den Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
selektiert.
-
Die
Fragmente von etwa 1,5 kb, einschließlich purF, wurden aus chromosomaler
DNA dieser Zielklone amplifiziert, und Nucleotidsequenzen um die
Stellen, wo Mutationen durch homologe Rekombinationssubstitution
eingeführt
waren, wurden bestimmt. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass sie die Mutation
von K326Q (326Lys→Gln)
und die Mutationen K326Q (326Lys→Gin)
+ P410W (410Pro→Trp)
enthielten.
-
Solche,
die von dem Stamm FDRadd-18-1 (purF–,
deoD–,
purR–,
add–)
abgeleitet waren, wurden als Stamm FDRadd-18-1::KQ (purFKQ, deoD–,
purR–,
add–)
und als Stamm FDRadd-18-1::KQPW (purFKQPW, deoD–,
purR–,
add–)
bezeichnet, und solche, die von dem Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–, add–)
abgeleitet waren, wurden als Stamm FADRadd-8-3::KQ (purFKQ, purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
und als Stamm FADRadd-8-3::KQPW (purFKQPW, purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
bezeichnet.
-
3) Beurteilung der Fähigkeit
eines Stammes mit unempfindlichem purF, das in das Chromosom einverleibt
ist, zur Produktion von Purinnucleosid
-
Die
Fähigkeiten
zur Produktion von Purinnucleosid des Stammes FDRadd-18-1::KQ (purFKQ,
deoD–, purR–,
add–),
des Stammes FDRadd-18-1::KQPW (purFKQPW, deoD–,
purR–,
add–),
des Stammes FADRadd-8-3::KQ (purFKQ, purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
und des Stammes FADRadd-8-3::KQPW (purFKQPW, purA–,
deoD–,
purR–,
add–),
hergestellt in Abschnitt 2), zur Produktion von Purin nucleosid wurden
beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion
und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Für die Stämme von
purA– (Adenin-auxotroph)
wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 4 gezeigt. Überlegene
Inosinproduktion wurde im Vergleich zu dem Stamm W3110 (Wildtypstamm)
beobachtet.
-
Tabelle
4 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 4
-
1) Züchtung eines Stammes, in dem
das Inosinguanosinkinasegen (gsk) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 23-mer- und 21-mer-Primer für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGAGCTCATGAAATTTCCCGG (SEQ
ID Nr: 14) und CTCGGATCCGGTACCATGCTG (SEQ ID Nr: 15), präpariert
auf der Grundlage der Information einer Gendatenbank (GenBank Zugangsnr.
D00798), durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 1,5 kb, welches die gsk-Strukturgenregion
einschloss, die ATG und das Translationsterminationscodon umfasste, wurde
zwischen die SacI-Stelle und die BamHI-Stelle des Vektors pUC18
(Takara Shuzo) kloniert. Eine SacI-Stelle beziehungsweise eine BamHI-Stelle
wurde in den PCR-Primern bereitgestellt.
-
Das
klonierte gsk-Fragment von 1,5 kb enthielt eine BglII-Stelle bei etwa 830
bp von dem 5'-Ende
entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit BglII verdaut und einer
T4-DNA-Ligasereaktion
unterworfen, um einen Kanamycin-resistenten (Kmr)
Genblock (BamHI-Verdauung, Pharmacia Biotech) einzufügen. Kompetente Zellen
von E. coli JH109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und die
auf LB-Agarplatten, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, gewachsenen
Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 4 Klonen präpariert,
und eine Plasmid-DNA, die mit BglII nicht verdaut wurde, wobei aus diesem
Plasmid ein Fragment von etwa 2,8 kb durch EcoRI- und SalI-Verdauung
ausgeschnitten wurde (pUCgsk'#2),
wurde aus den Plasmid-DNAs ausgewählt. Das in diesem Plasmid
enthaltene gsk wies an der BglII-Stelle ein eingeführtes heterogenes
Gen auf, und deshalb wurde vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine
Funktion nicht aufweist (2).
-
Dann
wurde pUCgsk'#2
mit SacI, SphI und DraI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 2,8
kb hergestellt wurde, welches gsk und die Kmr-Gene
enthält.
Die DraI-Verdauung wird durchgeführt,
um die Präparation eines
SacI-SphI-Fragments zu erleichtern. Das Fragment wurde zwischen
die SacI- und SphI-Stellen
von pMAN997 eingeführt,
welches ein Vektor für
die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, wobei das Plasmid pMAN997gsk'#2 erhalten wurde.
Der Stamm FDR-18 (purF–, deoD–,
purR–)
und der Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–, add–)
wurden bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997gsk'#2
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Der Vorgang zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert,
in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das
Chromosom einverleibt war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das
Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter
diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten
ausgestrichen und über
Nacht bei 42°C
kultiviert, wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden
aus den auftretenden Kolonien willkürlich ausgewählt, und auf
LB-Agarplatten beziehungsweise
LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 20 μg/ml Kanamycin,
gezüchtet,
und es wurden Klone selektiert, die auf den LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, nicht wuchsen, jedoch auf LB-Agarplatten, enthaltend
20 μg/ml Kanamycin,
wuchsen. Außerdem
wurde das gsk-Gen enthaltende Fragment durch PCR von der chromosomalen
DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass
das etwa 2,8 kb-Fragment, welches das Kmr-Gen
enthält,
und nicht das ursprüngliche
Fragment von etwa 1,5 kb amplifiziert wurde. Es wurde ebenfalls bestätigt, dass
die Inosinguanosinkinaseaktivität
darin nicht nachgewiesen wurde. Die Inosinguanosinkinaseaktivität wurde
nach dem Verfahren von Usuda et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1341,
200-206 (1997)) gemessen. Diese Klone wurden als Stämme betrachtet,
denen gsk fehlt, und Klone, die von dem Stamm FDR-18 (purF–,
deoD–,
purR–)
und dem Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
abgeleitet waren, wurden als Stamm FDRG-18-13 beziehungsweise Stamm
FADRaddG-8-3 bezeichnet.
-
2) Beurteilung der Fähigkeit
der Stämme
mit dem Plasmid mit unempfindlichem purF zur Produktion von Purinnucleosid
-
Weil
die Plasmide pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW das Kmr-Gen
als Arzneimittelselektionsmarker enthalten und die Wirtsstämme FDRG-18-13
(purF–,
deoD–,
purR–,
gsk–)
und FADRaddG-8-3 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–),
präpariert
in Abschnitt 1), Kanamycin-resistent gemacht werden, ist es schwierig,
durch Einführen
von pKFpurFKQ und pKFpurFKQPW in die Stämme FDRG-18-13 und FADRaddG-8-3
Transformanten für
die Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid zu erhalten. Deshalb wurde der Austausch
der Arzneimittelselektionsmarkergene des Plasmids pKFpurFKQ und
pKFpurFKQPW unter Verwendung des Vektors pUC18 mit dem Ampicillinresistenzgen
(Takara Shuzo) durchgeführt.
Weil die Positionsbeziehung zwischen dem lac-Promotor und der Multiklonierungsstelle
in pKF18 und pUC18 dieselbe ist, wurden purFKQ- und purFKQPW-Fragmente aus pKFpurFKQ
und pKFpurFKQPW unter Verwendung von PstI und HindIII ausgeschnitten,
und die Fragmente wurden zwischen die PstI- und HindIII-Stellen
von pUC18 eingeführt, wobei
pUCpurFKQ und pUCpurFKQPW erhalten wurden. Die Wirte, nämlich die
Stämme FDRG-18-13
und FADRaddG-8-3 wurden mit pUCpurFKQ und pUCpurFKQPW transformiert,
und die Fähigkeiten
der Rekombinanten zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt.
Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion
und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Für die Stämme von
purA– (Adeninauxotroph)
wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 5 gegeben. Diese
Ergebnisse zeigen, dass die Mikroorganismen Guanosin sowie Inosin
anhäufen,
wenn das Fehlen von gsk übertragen
wurde.
-
Tabelle
5 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
3) Züchtung von Stämmen mit
unempfindlichem purF, das in das Chromosom einverleibt ist, und
Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Die
Stämme
FDRG-18-3 (purF–, deoD–,
purR–,
gsk–)
und FADRaddG-8-3
(purF–,
purA–,
deoD–,
purR–, add–,
gsk–)
wurden bei 30°C
mit den Plasmiden pMAN997purFLKQ beziehungsweise pMAN997purFLKQPW transformiert.
Einige der erhaltenen Kolo nien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und bei 30°C über Nacht kultiviert. Dann
wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert,
in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das
Chromosom einverleibt war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das
Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthalten. Dann wurden unter diesen
Klonen einige Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und jeweils auf LB-Agarplatten
beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, wobei
Ampicillin-empfindliche Klone selektiert wurden, die nur auf LB-Agarplatten
wachsen konnten. Unter den Ampicillin-empfindlichen Klone wurden
Klone, die auf Minimalmedium wachsen, für den Stamm FDRG-18-13 (purF–,
deoD–,
purR–,
gsk–)
selektiert, und Klone, die in dem Minimalmedium, das mit 100 mg/l
L-Histidin und 50 mg/l Adenin supplementiert war, wachsen, wurden
für den Stamm
FADRaddG-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–)
selektiert.
-
Chromosomale
DNAs dieser Zielklone wurden präpariert,
und Fragmente von etwa 1,5 kb, die purF einschlossen, wurden durch
PCR amplifiziert und um die Stellen sequenziert, wo die Mutationen
durch Substitution durch homologe Rekombination eingeführt waren.
Als Ergebnis wurde bestätigt,
dass sie eine Mutation von K326Q (326Lys→Gln) beziehungsweise K326Q
(326Lys→Gln)
+ P410W (410Pro→Trp)
aufwiesen.
-
Die
Stämme,
die von dem Stamm FDRG-18-13 (purF–,
deoD–,
purR–,
gsk–)
abgeleitet waren, wurden als Stamm FDRG-18-13::KQ (purFKQ, deoD–,
purR–,
gsk–)
und Stamm FDRG-18-13::KQPW (purFKQPW, deoD–,
purR–,
gsk–)
bezeichnet, und solche, die von dem Stamm FADRaddG-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–, add–,
gsk–)
abgeleitet waren, wurden als Stamm FADRaddG-8-3::KQ (purFKQ, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–) und
Stamm FADRaddG-8-3::KQPW (purFKQPW, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–)
bezeichnet.
-
Der
Stamm FADRaddG-8-3::KQ (purFKQ, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–)
wurden mit der privaten Nummer AJ13334 versehen. Dieser Stamm wurde
beim National Institute of Bioscience und Human-Technology of Ministry of International
Trade and Industry (1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-0046
Japan) am 24. Juni 1997 als internationale Hinterlegung nach dem
Budapester Abkommen mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-5993 hinterlegt.
-
Die
Fähigkeiten
dieser 4 Arten von Stämmen
mit unempfindlichem purF, das in das Chromosom einverleibt war,
zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt. Das Grundmedium
und das Kulturverfahren für
die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren
dasselbe wie in Beispiel 1. Für
die Stämme
von purA– (Adenin-auxotroph)
wurden 5 mg/l Adenin zu dem MS-Medium gegeben.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 6 gezeigt. Es
zeigte sich, dass die Mikroorganismen Guanosin sowie Inosin anhäuften, wenn
das Fehlen von gsk übertragen
wurde.
-
Tabelle
6 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 5
-
1) Konstruktion des Wildtyp-purR-Plasmids
für die
homologe Rekombination und Züchten
von Stämmen
mit in das Chromosom eingeführtem
revertierten purR+
-
In
Abschnitt 4) des Beispiels 1 wurde das Plasmid (pUCpurR), welches
das purR-Fragment von etwa 1,8 kb zwischen der SalI-Stelle und der SphI-Stelle
des Vektors pUC19 (Takara Shuzo) trägt, erhalten. Das Plasmid pUCpurR
wurde mit SacI und SphI verdaut, um ein Fragment von etwa 1,8 kb
herzustellen, welches Wildtyp-purR enthält. Dieses Fragment wurde zwischen
die SacI-Stelle und die SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor
für die
homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori)
(wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997purR
erhalten wurde. Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
wurde bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997purR transformiert, und einige der erhaltenen
Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin,
ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Dieses Verfahren zum Bereitstellen
von bei 42°C
gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden
Klone selektiert, worin das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination
in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid
nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen
mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert,
dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden von den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt,
und jeweils auf LB-Agarplatten
beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und
es wurden Ampicillin-empfindliche
Klone selektiert, die nur auf LB-Agarplatten wachsen konnten. Von
den Ampicillin-empfindlichen Klonen wurden 10 Klone willkürlich ausgewählt, und
die purR-Fragmente von etwa 1,8 kb wurden aus der chromosomalen
DNA dieser Klone durch PCR amplifiziert. Klone, worin das amplifizierte
Fragment mit PmaCI, jedoch nicht mit BglII verdaut werden konnte,
wurden ausgewählt.
Diese Klone wurden als purR+-Revertantenstämme betrachtet
und als FADadd-8-3-2 (purF–, purA–,
deoD–,
add–)
bezeichnet.
-
2) Beurteilung der Fähigkeit
des Stammes mit eingeführtem
unempfindlichen purF zur Produktion von Purinnucleosid
-
Eine
Transformante wurde durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADadd-8-3-2 (purF–,
purA–,
deoD–,
add–)
hergestellt, und die Fähigkeit
des Stammes zur Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Für den Stamm
FADRadd-8-3 wurde auch eine Transformante mit pKFpurKQ präpariert,
und die Wirkung der purR-Defizienz wurde durch Vergleich beurteilt.
Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren für die Purinnucleosidproduktion
und das Analyseverfahren waren dasselbe wie in Beispiel 1. Das MS-Medium
wurde mit 5 mg/l Adenin supplementiert.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 7 gezeigt. Eine überlegene
Inosinproduktion wurde in FADRadd (purR–-Typ)
im Vergleich mit FADadd (purR-Wildtyp) beobachtet, und es wurde
die Wirkung der purR-Defizienz bestätigt.
-
Tabelle
7 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 6
-
1) Erneute Züchtung eines
Stammes, dem das Inosinguanosinkinasegen (gsk) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 32-mer- und 29-mer-Primer für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGGTACCCTGTTGCGTTAAGCCATCCCAGA
(SEQ ID Nr: 16) und CTCGCATGCCAACGTACGGCATTAACCTA (SEQ ID Nr: 17),
präpariert
auf der Grundlage der Information aus einer Gendatenbank (GenBank
Zugangsnr. D00798), durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 3,0 kb, welches die gsk-Strukturgenregion
(etwa 800 bp) enthielt, die ATG und das Translationsterminationscodon
umfasste, wurde zwischen der KpnI-Stelle und der SphI-Stelle des Vektors
pUC19 (Takara Shuzo) kloniert. Eine KpnI-Stelle beziehungsweise
SphI-Stelle wurde in den PCR-Primern bereitgestellt.
-
Das
klonierte gsk-Fragment von 3,0 kb enthielt zwei Aro51HI-Stellen bei etwa
900 bp und 1030 bp und eine BglII-Stelle bei etwa 1640 bp von dem
5'-Ende entfernt,
und deshalb wurde das Plasmid mit Aro51HI und BglII verdaut und
mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Dann wurde das Aro51HI-BglII-Fragment
entfernt, und die DNA des Vektors wurde mit T4-DNA-Ligase eines
Selbstligation unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli JM109
wurden mit dieser Ligationslösung
transformiert, und auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin,
gewachsene Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus
den Transformanten von 10 Klonen hergestellt, und eine Plasmid-DNA,
die mit Aro51HI oder BglII nicht verdaut wurde und aus der ein Fragment
von etwa 2,3 kb durch KpnI- und SphI-Verdauung ausgeschnitten wurde (pUC19gsk'#10), wurde unter
den Plasmid-DNAs ausgewählt.
Das in diesem Plasmid enthaltene gsk hat eine Deletion im Strukturgen zwischen
der Aro51HI-Stelle
und der BglII-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das kodierte
Enzym seine Funktion nicht aufweist (Figur 3).
-
Dann
wurde pUC19gsk'#10
mit KpnI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 2,3 kb erhalten wurde,
welches das gsk-Gen umfasste. Das Fragment wurde zwischen der KpnI-
und der SphI-Stelle
von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination
mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie
vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997gsk'#10 erhalten wurde.
Der Stamm FADRadd-8-3 (purF) purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
wurde bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997gsk'#10
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
von bei 42°C
gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden
Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination
in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das
Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter
diesen Klonen einige Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden bei 42°C unter Schütteln kultiviert. Die Kultur
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, gezüchtet,
wobei Ampicillin-empfindliche
Klone selektiert wurden, die nur auf den LB-Agarplatten wachsen konnten. Außerdem wurden
unter den Ampicillin-empfindlichen Klonen willkürlich 10 Klone ausgewählt, die
Fragmente, die das gsk-Gen enthielten, wurden durch PCR unter Verwendung
der vorstehend beschriebenen Primer von der chromosomalen DNA dieser Zielklone
amplifiziert, und die Klone, worin das Fragment von etwa 2,3 kb,
nicht aber das ursprüngliche
Fragment von etwa 3,0 kb amplifiziert wurde, wurden selektiert.
Es wurde auch bestätigt,
dass die Inosinguanosinkinaseaktivität in ihnen nicht nachgewiesen
wurde. Die Inosinguanosinkinaseaktivität wurde nach dem Verfahren
von Usuda et al. (Biochim. Biophys. Acta., 1341, 200-206 (1997))
gemessen. Die Klone wurden als neue Stämme betrachtet, denen gsk fehlt,
und die Klone, die von dem Stamm FADRadd-8-3 (purF–,
purA–,
deoD–, purR–,
add–)
abgeleitet waren, wurden abs FADRaddgsk (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–)
gezeichnet.
-
2) Züchten von Stämmen, denen
das GMP-Reduktasegen (guaC) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 29-mer-Primer für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCAAGCTTACGGCTCTGGTCCACGCCAG
(SEQ ID Nr: 18) und CTCCTGCAGCAGCGTTGGGAGATTACAGG (SEQ ID Nr: 19),
hergestellt auf der Grundlage der Information aus einer Gendatenbank
(E. coli Gene Bank), durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,2 kb, welches die guaC-Strukturgenregion
enthielt, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, wurde
zwischen die HindIII-Stelle und die PstI-Stelle des Vektors pUC18
(Takara Shuzo) kloniert. Eine HindIII-Stelle beziehungsweise eine
PstI-Stelle wurde in den PCR-Primern bereitgestellt.
-
Das
klonierte guaC-Fragment von etwa 2,2 kb enthielt eine BglII-Stelle
bei etwa 1,1 kb von dem 5'-Ende
entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit BglII verdaut, mit T4-DNA-Polymerase abgestumpft
und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Kompetente Zellen von E. coli JM109
wurden mit dieser Ligationslösung
transformiert, und Transformanten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, wuchsen, wurden erhalten. Plasmid-DNAs wurden aus den
Transformanten von 18 Klonen präpariert,
und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 2,2 kb durch
Verdauung mit HindIII und PstI ausgeschnitten war, wobei das Fragment
mit BglII nicht verdaut wurde (pUC18guaC'#1), wurde unter den Plasmid-DNAs selektiert.
Das in diesem Plasmid enthaltene guaC hatte eine Leserahmenverschiebung
an der BglII-Stelle, und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte
Enzym seine Funktion nicht aufweist (3).
-
Dann
wurde pUC18guaC'#1
mit HindIII und PstI verdaut, um ein Fragment von etwa 2,2 kb, welches guaC
enthält,
zu präparieren.
Das Fragment wurde zwischen die HindIII- und PstI-Stellen von pMAN997,
welches ein Vektor für
die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori)
(wie vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997guaC'#1 erhalten wurde.
Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
und der Stamm FADRaddgsk (purF–, purA–,
deoD–, purR–,
add–,
gsk–)
wurden bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997guaC'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zur Bereitstellung
von bei 42°C
gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden
Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination
in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das
Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter
diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf, auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, gezüchtet,
und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur
auf den LB-Agarplatten wachsen konnten. Die Fragmente von etwa 2,2
kb, die guaC enthalten, wurden durch PCR aus der chromosomalen DNA
dieser Zielklone amplifiziert, und es wurde bestätigt, dass das Fragment mit
BglII nicht verdaut wurde. Die Klone, die diese Bedingungen erfüllen, wurden
als Stämme
betrachtet, denen guaC fehlt, und die Klone, die von den Stämmen FADRadd-8-3
und FADRaddgsk abgeleitet sind, wurden als FADRaddguaC (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
guaC–)
beziehungsweise FADRaddgskguaC (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–, add–,
gsk–,
guaC–)
bezeichnet. Es wurde auch bestätigt,
dass die GMP-Reduktaseaktivität
in ihnen nicht nachgewiesen wurde. Die GMP-Reduktaseaktivität wurde
nach dem Verfahren von B. B. Garber et al. (J. Bacteriol., 43, 105(1980))
gemessen.
-
3) Beurteilung der Fähigkeit
der Stämme,
in denen ein Plasmid mit dem unempfindlichen purF eingeführt ist, zur
Produktion von Purinnucleosid
-
Transformanten
wurden durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddguaC (purF–,
purA–, deoD–,
purR–,
add–,
guaC–)
und FADRaddgskguaC (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
gsk–,
guaC–),
hergestellt in Abschnitt 2), produziert, und die Fähigkeiten
der Stämme
zur Produktion von Purinnucleosid wurden beurteilt. Das Grundmedium
und das Kulturverfahren für
die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe
wie in Beispiel 1. Das MS-Medium wurde mit 5 mg/l Adenin supplementiert.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 8 gezeigt. Ein
bestimmtes Maß der
Verbesserung der Guanosinproduktion wurde durch das Fehlen von guaC
beobachtet.
-
Tabelle
8 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 7
-
1) Züchten eines Stammes, dem das
6-Phosphogluconatdehydrasegen (edd) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 29-mer-Primer für
beide Enden mit den Sequenzen CTCGAATTCGGATATCTGGAAGAAGAGGG (SEQ
ID Nr: 20) und CTCAAGCTTGGAATAGTCCCTTCGGTAGC (SEQ ID Nr: 21), präpariert
auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer
Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "edd" als Suchbegriff
erhalten wurde, durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 3,0 kb, welches die edd-Strukturgenregion,
welche ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, etwa 810
bp der 5'-stromaufwärts-Region von
ATG und eine etwa 360 bp Stromabwärtsregion des Translationsterminationscodons
enthielt, wurde in den Vektor pCRTMII (Invitrogen) als solches kloniert.
Das amplifizierte Fragment des PCR-Produkts kann als solches in
diesem Vektor kloniert werden. Der Vektor hat EcoRI-Stellen als
Restriktionsstellen in der Nähe
der beiden Enden der Klonierungsstelle. Eine BamHI-Stelle und eine
HindIII-Stelle werden jeweils in den PCR-Primern bereitgestellt.
Das klonierte edd-Fragment von 3,0 kb enthielt zwei StuI-Stellen
bei etwa 660 bp und 1900 bp von dem 5'-Ende entfernt, und deshalb wurde das
Plasmid mit StuI verdaut. Dann wurde das StuI-Fragment von etwa
1,25 kb entfernt, und die DNA des Vektors wurde mit T4-DNA-Ligase
einer Selbstligation unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli
HB101 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert, und auf
LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, gewachsene Transformanten wurden erhalten. Plasmid-DNAs
wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA,
aus der ein Fragment von etwa 1,25 kb durch StuI nicht ausgeschnitten
wurde (pCRTMIIedd'#1),
wurde unter diesen Plasmid-DNAs selektiert. Das in diesem Plasmid
enthaltene edd hatte eine Deletion einer Protein-codierenden Region,
einschließlich
einer Promotorregion, und deshalb wird vorhergesagt, dass dieses
Enzym nicht gebildet wird (3).
-
Dann
wurde pCRTMIIedd'#1
mit EcoRI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,75 kb erhalten
wurde, das einen Teil von edd und eine flankierende Region davon
umfasste. Das Fragment wurde in die EcoRI-Stelle von pMAN997, welches
ein Vektor für
die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, wobei das Plasmid pMAN997edd'#1 erhalten wurde. Der
Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
wurde bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997edd'#1 transformiert,
und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zur Bereitstellung
von bei 42°C
gewachsenen einzelnen Kolonien wurde einmal wiederholt, und es wurden
Klone selektiert, worin das ganze Plasmid durch homologe Rekombination
in das Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das Plasmid
in ihrem Zytoplasma nicht enthielten. Dann wurden unter diesen Klonen
mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht bei 30°C kultiviert,
dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhal ten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, gezüchtet,
und es wurden Ampicillin-empfindliche
Klone, die nur auf LB-Agarplatten wuchsen, selektiert. Die edd-Regionen
wurden durch PCR unter Verwendung der vorstehenden PCR-Primer aus
der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden
die Klone selektiert, in denen die Größe des amplifizierten Fragments
die etwa 1,75 kb des Deletionstyps, nicht aber die etwa 3,0 kb des
Wildtyps ist. Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen edd fehlt,
und sie wurden als FADRaddedd (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–)
bezeichnet.
-
2) Beurteilung der Fähigkeit
der Stämme,
in denen ein Plasmid mit unempfindlichem purF eingeführt ist,
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Eine
Transformante wurde durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddedd (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–),
gezüchtet
in Abschnitt 1), hergestellt, und die Fähigkeit des Stammes zur Produktion
von Purinnucleosid wurde beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren
für die
Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe
wie in Beispiel 1. Das MS-Medium wurde mit 5 mg/l Adenin supplementiert.
Die von edd codierte 6-Phosphogulconatdehydrase ist ein Enzym, das
durch Gluconsäure
induziert wird und sich an der ersten Stufe des Entner-Doudoroff-Weges
befindet, in dem Gluconat zu Pyruvat metabolisiert wird. Weil das
Gluconat vermutlich nur in den Pentosephosphatweg fließt, weil dieses
Enzym fehlt, wurde Gluconsäure
(48 g/l zugegeben) als andere Kohlenstoffquelle als Glucose eingesetzt,
um die Beurteilung durchzuführen.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 9 gezeigt. Eine
deutliche Verbesserung der Inosinproduktion wurde bei Fehlen von
edd beobachtet, wenn Gluconsäure
als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurde. Diese Wirkung wurde auch
beobachtet, wenn Glucose als Kohlenstoffquelle eingesetzt wurde.
-
Tabelle
9 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 8
-
1) Züchten eines Stammes, dem das
Phosphoglucoseisomerasegen (pgi) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 29-mer-Primer für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACTCCATTTTCAGCCTTGGCAC
(SEQ ID Nr: 22) und CTCGCATGCGTCGCATCAGGCATCGGTTG (SEQ ID Nr: 23),
präpariert
auf der Grundlage der Information, die durch Recherche in einer
Gendatenbank (E. coli Gene Bank) unter Verwendung von "pgi" als Suchbegriff
erhalten wird, durchgeführt,
und ein amplifiziertes Fragment von etwa 2,2 kb, welches die pgi-Strukturgenregion
umfasste, die ATG und das Translationsterminationscodon enthielt,
wurde zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle des Vektors pUC18 (Takara Shuzo)
kloniert. Eine SalI-Stelle
beziehungsweise eine SphI-Stelle wurden in den PCR-Primern bereitgestellt.
Das klonierte pgi-Fragment von 2,2 kb enthielt eine BssHII-Stelle
und eine MluI-Stelle bei etwa 1170 bp beziehungsweise 1660 bp von
dem 5'-Ende entfernt,
und deshalb wurde das Plasmid mit BssHII und MluI verdaut und mit
T4-DNA-Polymerase abgestumpft. Dann wurde das Fragment von etwa
500 bp zwischen der BssHII-Stelle und der MluI-Stelle entfernt,
und die DNA des Vektors wurde mit T4-DNA-Ligase einer Selbstligation
unterworfen. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser
Ligationslösung
transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, wuchsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 10 Klonen präpariert,
und eine Plasmid-DNA, aus der ein Fragment von etwa 1,7 kb durch
SalI und SphI ausgeschnitten wurde (pUC18pgi'#1), wurde unter den Plasmid-DNAs selektiert.
Das in diesem Plasmid enthaltene pgi hat eine Deletion zwischen
der BssHII-Stelle und der MluI-Stelle,
und deshalb wird vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion
nicht aufweist (3).
-
Dann
wurde pUC18pgi'#1
mit SalI und SphI verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,7 kb, welches
pgi enthielt, hergestellt wurde. Das Fragment wurde zwischen die
SalI-Stelle und die SphI-Stelle von pMAN997, welches ein Vektor
für die
homologe Rekombination mit einem temperatursensitiven Replikationsursprung (tsori)
(wie vorstehend beschrieben) ist, einge führt, wobei das Plasmid pMAN997pgi'#1 erhalten wurde.
Der Stamm FADRadd-8-3 (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–)
und der Stamm FADRaddedd (purF–, purA–,
deoD–, purR–,
add–,
edd–)
wurden bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997pgi'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden jeweils
auf LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, ausgestrichen
und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
von einzelnen Kolonien, die bei 42°C wachsen, wurde einmal wiederholt,
und es wurden Klone selektiert, in denen das gesamte Plasmid durch
homologe Rekombination in das Chromosom integriert war. Es wurde
bestätigt,
dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten.
Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten
ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden bei 42°C unter Schütteln kultiviert. Die Kultur
wurde in geeigneter Weise verdünnt,
sodass einzelne Kolonien erhalten werden sollten (eine Verdünnung von
etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und jede wurde auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, gezüchtet,
und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur
auf LB-Agarplatten wachsen konnten. Die pgi-Regionen wurden durch PCR unter Verwendung
der vorstehend beschriebenen PCR-Primer aus der chromosomalen DNA
dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden die Klone selektiert,
in denen die Größe des amplifizierten
Fragments etwa 1,7 kb des Deletionstyps, nicht jedoch etwa 2,2 kb des
Wildtyps war. Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen pgi fehlt,
und Klone, die von FADRadd-8-3 und FADRaddedd abgeleitet sind, wurden
als FADRaddpgi (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
pgi–)
und FADRaddeddpgi (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
pgi–)
bezeichnet.
-
2) Beurteilung der Fähigkeit
von Stämmen,
die ein eingeführtes
Plasmid mit unempfindlichem purF enthalten, zur Produktion von Purinnucleosid
-
Transformanten
wurden durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddpgi (purF–,
purA–, deoD–,
purR–,
add–,
pgi–)
und in den Stamm FADRaddeddpgi (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
pgi–),
gezüchtet
in Abschnitt 1), hergestellt, und die Fähigkeit dieser Stämme zur
Produktion von Purinnucleosid wurde beurteilt. Das Grundmedium und
das Kultivierungsverfahren für
die Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe
wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe,
dass die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium (Grundmedium),
welches ein Medium für
die Beurteilung der Produktion war, auf 0,8% erhöht wurde.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 10 gezeigt. Durch
das Fehlen von pgi verringerte das Wachstum in dem MS-Medium, das
mit 5 mg/l Adenin supplementiert war, welches in den vorstehend
beschriebenen Beispielen eingesetzt wurde, deutlich. Deshalb wurde das
Medium, worin die Menge des Hefeextrakts auf 0,8% erhöht wurde,
eingesetzt. In diesem Medium zeigte der pgi+-Ausgangsstamm
eine erhöhte
Wachstumsrate, was zu einer geringeren Inosinproduktion und Nebenproduktion
von Hypoxanthin führte.
Im Gegensatz dazu wurde bei der Inosinproduktion in dem Stamm, dem pgi
fehlt, eine deutliche Verbesserung beobachtet.
-
Tabelle
10 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 9
-
1) Züchten eines Stammes, dem das
Adenindeaminasegen (yicP) fehlt
-
In
einer Gendatenbank (E. coli Gene Bank) ist yicP als ORF (offener
Leserahmen, Strukturgen) registriert, der eine hohe Homologie mit
Adenindeaminase aus Bacillus subtilis hat. Eine PCR (94°C, 30 sec;
55°C, 1
min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde durch Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 29-mer-Primer
für beide
Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCCTGCAGCGACGTTTTCTTTTATGACA (SEQ
ID Nr: 24) und CTCAAGCTTCGTAACTGGTGACTTTTGCC (SEQ ID Nr: 25), präpariert
auf der Grundlage der Information, die durch Recherchieren unter Verwendung
von "yicP" als Suchbegriff
erhalten wurde, durchgeführt,
wobei ein Fragment von etwa 1,9 kb amplifiziert wurde, welches die
yicP-Strukturgenregion, die ATG und das Translationsterminationscodon
umfasst, etwa 50 pb der 5'-stromaufwärtigen Region
von ATG und etwa 40 bp der stromabwärtigen Region des Translationsterminationscodons
umfasste. Eine PstI-Stelle und eine HindIII-Stelle wurden jeweils
in den PCR-Primern bereitgestellt. Das PCR-Produkt wurde mit PstI
und HindIII verdaut und zwischen die PstI-Stelle und die HindIII-Stelle
des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Das klonierte yicP-Fragment von 1,9
kb enthielt eine HapI-Stelle und eine EcoRV-Stelle bei etwa 540 bp beziehungsweise
590 bp von dem 5'-Ende
entfernt, und deshalb wurde das Plasmid mit HapI und EcoRV verdaut.
Dann wurde das HapI-EcoRV-Fragment von 47 bp entfernt, und die DNA
des Vektors wurde durch T4-DNA-Ligase einer Selbstligation unterworfen.
Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert,
und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, wachsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 10 Klonen präpariert,
und es wurde aus den Plasmid-DNAs eine Plasmid-DNA selektiert, die
mit HapI oder EcoRV nicht verdaut wurde (pUC18yicP'#1). Das in diesem
Plasmid enthaltene yicP hatte aufgrund der Deletion von 47 bp der
HapI-EcoRV-Schnittstelle eine Leserahmenverschiebung, und deshalb wird
vorhergesagt, dass das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist
(3).
-
Dann
wurde pUC18yicP'#1
mit PstI und HindIII verdaut, wobei ein Fragment von etwa 1,9 kb,
welches das yicP-Gen enthält,
präpariert.
Das Fragment wurde zwischen die PstI-Stelle und die HindIII-Stelle
von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination
mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie
vorstehend beschrieben) ist, eingeführt, wobei das Plasmid pMAN997yicP'#1 erhalten wurde.
Der Stamm FADRaddedd (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–)
wurde bei 30°C
mit dem Plasmid pMAN997yicP'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien er halten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert,
in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das
Chromosom integriert war. Es wurde bestätigt, dass diese Klone das
Plasmid nicht in ihrem Zytoplasma enthielten. Dann wurden unter
diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 42°C kultiviert,
wobei Kolonien erhalten wurden. Unter den auftretenden Kolonien
wurden willkürlich
100 Kolonien ausgewählt
und jeweils auf LB-Agarplatten und LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin,
gezüchtet,
und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur
auf LB-Agarplatten wuchsen. Die yicP-Regionen wurden durch PCR unter
Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer aus der chromosomalen DNA dieser
Zielklone amplifiziert, und es wurden die Klone selektiert, in denen
die Größe des amplifizierten
Fragments mit HapI oder EcoRV nicht verdaut wurde. Es wurde auch
bestätigt,
dass die Adenindeaminaseaktivität
in diesen Klonen nicht nachgewiesen wurde. Die Adenindeaminaseaktivität wurde
nach dem Verfahren von Per Nygaard et al. gemessen (J. Bacteriol.,
178, 846-853 (1996)). Die Klone wurden als Stämme betrachtet, denen yicP
fehlt, und sie wurden als FADRaddeddyicP (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–)
bezeichnet.
-
2) Züchten von Stämmen, denen
das Phosphoglucoseisomerasegen (pgi) fehlt, aus Stämmen, denen
das Adenindeaminasegen (yicP) fehlt
-
Das
Fehlen von pgi wurde auch auf den Stamm FADRaddeddyicP (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–, edd–,
yicP–) übertragen.
Unter Verwendung von pMAN997pgi'#1,
konstruiert in Beispiel 8, wurde ein Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–)
auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 erhalten.
-
3) Beurteilung der Fähigkeit
eines Stammes, in den ein Plasmid mit unempfindlichem purF eingeführt war,
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Transformanten
wurden durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicP (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–)
und den Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–, edd–,
yicP–,
pgi–)
gezüchtet
in den Abschnitten 1) und 2), hergestellt, und es wurden die Auswirkungen
von zugegebenem Adenin auf das Wachstum und die Fähigkeiten
zur Produktion von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und
das Kultivierungsverfahren für
die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren
dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass das eingesetzte
Medium das MS-Medium war, das mit Adenin in einer Menge zwischen
0 bis 50 mg/l versetzt wurde.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Auswirkung von Adenin auf das Wachstum
und die Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 11 gezeigt. Durch
das Fehlen von yicP wurde die Wachstumsgeschwindigkeit im Hinblick
auf Adenin verbessert, und es wurde eine Wirkung des Fehlens von
yicP beobachtet, wenn Adenin in Mengen von 50 mg/l und 20 mg/l zugegeben
wurde.
-
Tabelle
11 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 10
-
1) Präparation des PRPP-Synthetasegens
(prs)
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und
der 38-mer- und 29-mer-Primer für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGTCGACTGCCTAAGGATCTTCTCATGCCTGATATG
(SEQ ID Nr: 26) und CTCGCATGCGCCGGGTTCGATTAGTGTTC (SEQ ID Nr: 27),
präpariert auf
der Grundlage der Information aus der Gendatenbank (E. coli Gene
Bank), durchgeführt,
und es wurde ein amplifiziertes Fragment von etwa 1 kb, welches
die prs-Strukturgenregion, die SD-ATG und das Translationsterminationscodon abdeckte,
enthielt, in den Vektor pUC18 (Takara Shuzo) kloniert. Eine SalI-Stelle
beziehungsweise eine SphI-Stelle wurden in die PCR-Primer eingebaut.
Das PCR-Produkt wurde mit SalI und SphI verdaut und zwischen die
SalI-Stelle und die SphI-Stelle des Vektors pUC18 (pUCprs) kloniert.
-
2) Konstruktion von unempfindlichem
prs
-
Ein
prs-Fragment wurde aus dem Plasmid, welches das in Abschnitt 1)
klonierte prs von etwa 1 kb enthielt, durch SalI und SphI ausgeschnitten
und zwischen die SalI- und SphI-Stellen
der Multiklonierungsstelle eines Plasmids für die Einführung einer Mutation, pKF19k
(Takara Shuzo), eingeführt,
wobei der Zielklon erhalten wurde (pKFprs). S. G. Bower et al. (J.
Biol. Chem., 264, 10287 (1989)) haben vorgeschlagen, dass PRPP-Synthetase
(Prs) einer Rückkopplungshemmung
durch AMP und ADP unterliegt. Es wird auch geschrieben, dass das
Enzym, dessen ASP (D) an der Position 128 zu Ala (A) mutiert ist,
teilweise unempfindlich gemacht ist. Deshalb wurde der folgende
synthetische DNA-Primer für
eine Gensubstitution zur Ausführung der
Mutation von Asp (D) an der Position 128 von PRPP-Synthetase (Prs)
nach Ala (A) präpariert,
und pKFprs wurde nach dem Protokoll der Site-directed Mutagenesis
System Mutan-Super Express Km (Takara Shuzo) einer ortsgerichteten
Mutagenese unterworfen, wobei eine ortsgerichtete Mutation in pKFprs
eingeführt
wurde.
-
Primer für die D128A-Mutation:
-
- 5'-GCGTGCAGAGCCACTATCAGC-3' (SEQ ID Nr: 28)
-
Nach
der Mutagenese wurden 12 Klone willkürlich von den erhaltenen Transformanten
aufgenommen, und aus ihnen wurden Plasmide hergestellt. Durch die
Nucleotidsequenzierung der Plasmide um die Bereiche herum, an denen
die Mutationen ein geführt
wurden, wurde bestätigt,
dass 9 Klone der Zielmutanten erhalten wurden. Das prs-Fragment
wurde mit SalI und SphI aus pKFprsDA mit dem mutierten prs ausgeschnitten
und zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle von pUC18 und pSTV18
(Takara Shuzo) eingeführt.
Für die
Verwendung des Wildtyp-prs als Kontrolle wurde das prs-Fragment
mit SalI und SphI aus pUCprs, konstruiert wie vorstehend beschrieben,
ausgeschnitten und zwischen die SalI-Stelle und die SphI-Stelle
von pSTV18 (Takara Shuzo) eingeführt.
Jedes der Plasmide pUCprsDA und pSTVprsDA und der Plasmide pUCprs
und pSTVprs hat ein eingeführtes
mutiertes prs oder ein Wildtyp-prs stromabwärts des lacp/o (Promotor des
Lactoseoperons), abgeleitet von pUC18 beziehungsweise pSTV18, und
das prs wird unter der Kontrolle dieses Promotors exprimiert.
-
Rekombinante
Bakterien, die durch Transformation von E.-coli-JM109-Zellen mit den vorstehend beschriebenen
4 Plasmiden erhalten wurden, wurden in LB-Flüssigmedium während 8
Stunden kultiviert und gesammelt, und aus ihnen wurden Rohenzymextrakte
präpariert.
Die PRPP-Synthetaseaktivität
der Extrakte und das Ausmaß der
Inhibition durch ADP wurden nach dem Verfahren von K. F. Jensen
et al. (Analytical Biochemistry, 98, 254-263 (1979)), welches teilweise
modifiziert wurde, durchgeführt.
Im Speziellen wurde [α-32P]ATP als Substrat eingesetzt, und [32P]AMP, welches durch diese Reaktion produziert
wurde, wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 gezeigt.
-
Tabelle
12 PRPP-Synthetase(Prs)-Aktivität
-
3) Beurteilung der Fähigkeit
eines Stammes, der ein eingeführtes
Plasmid mit unempfindlichem prs enthielt, zur Produktion von Purinnucleosid
-
Stämme, die
jeweils zwei Plasmide gleichzeitig enthielten, wurden durch Einführen von
pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–)
gezüchtet
in Abschnitt 3) des Beispiels 9, hergestellt, wobei eine Transformante
erhalten wurde, und außerdem
wurden die Stämme
jeweils durch Einführen
von pSTVprs und pSTVprsDA, die prs- und prsDA-Gene enthielten, in
die Transformanten hergestellt, und es wurde die Fähigkeit
dieser Stämme
zur Produktion von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und
das Kultivierungsverfahren für
die Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren
dasselbe wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe, dass die Menge des Hefeextrakts
in dem MS-Medium auf
0,4% erhöht
wurde.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 13 gezeigt. Durch
Einfüh ren
des mutierten prsDA als Plasmid wurde eine Verbesserung der Inosinproduktion
beobachtet.
-
Tabelle
13 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 11
-
1) Züchten eines Stammes, dem das
Xanthosinphosphorylasegen (xapA) fehlt
-
Ein
durch Mutation inaktiviertes Gen wurde in einer Stufe durch Cross-over-PCR
unter Verwendung von 4 Primern hergestellt, die auf der Grundlage
der Information präpariert
wurden, die durch Recherchieren in einer Gendatenbank (E. coli Gene
Bank) unter Verwendung von "xapA" als Suchbegriff
erhalten wurde. Die eingesetzten Primer sind Folgende:
N-aus:
5'-CGCGGATCCGCGACATAGCCGTTGTCGCC-3' (SEQ ID Nr: 29)
N-in:
5'-CCCATCCACTAAACTTAAACATCGTGGCGTGAAATCAGG-3' (SEQ ID Nr: 30)
C-in:
5'-TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCATCAACCTTATTTGTGG-3' (SEQ ID Nr: 31)
C-aus:
5'-CGCAAGCTTCAAACTCCGGGTTACGGGCG-3' (SEQ ID Nr: 32).
-
Zuerst
wurde eine PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) unter
Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 und des Primers N-aus
(29-mer) und des Primers N-in (39-mer) sowie der Primer C-in (39-mer)
und C-aus (29-mer) für
beide Enden durchgeführt,
wobei zwei PCR-Produkte (beide sind Fragmente von etwa 850 bp) jeweils
erhalten wurden. Dann wurde die PCR unter Verwendung eines Gemisches
der 2 PCR-Produkte als Matrize und der Primer N-aus und C-aus für beide
Enden erneut durchgeführt,
um ein Genfragment zu amplifizieren, worin die Genregion, die die
xapA-Strukturgenregion enthielt, von einem Fragment von etwa 2,4
kb (Größe des Wildtyps)
zu einem Fragment von etwa 1,7 kb gekürzt wurde. Eine BamHI-Stelle und eine HindIII-Stelle
wurden in den PCR-Primern N-aus
beziehungsweise C-aus bereitgestellt. Dieses PCR-Produkt wurde mit
BamHI und HindIII verdaut, und das erhaltene Fragment wurde mit
T4-DNA-Ligase mit einem Plasmid ligiert, das durch Verdauen von
pMAN997, welches ein Vektor für
die homologe Rekombination mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung
(tsori) (wie vorstehend beschrieben) ist, mit BamHI und HindIII
erhalten wurde. Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser
Ligationslösung
transformiert, und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, wuchsen. Plasmid-DNAs
wurden aus den Transformanten von 10 Klonen präpariert, und eine Plasmid-DNA,
aus der ein Fragment von etwa 1,7 kb durch BamHI- und HindIII-Verdauung
ausgeschnitten wurde (pMAN997xapA'#1), wurde aus den Plasmid-DNAs selektiert.
Das in diesem Plasmid enthaltene xapA hatte eine Deletion von etwa
700 bp in dem Strukturgen und deshalb wird vorhergesagt, dass das
codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (Figur 3).
-
Der
Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–)
wurde bei 30°C mit
dem Plasmid pMAN997xapA'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachsene Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zur Bereitstellung
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert,
in denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das
Chromosom eingeführt
war. Es wurde bestätigt,
dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten.
Dann wurden mehrere Klone dieser Klone auf LB-Agarplatten ausgestrichen, über Nacht
bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (eine Verdünnung von etwa 10–5 bis
10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 42°C über Nacht kultiviert, wobei
Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden willkürlich unter
den auftretenden Kolonien ausgewählt
und jeweils auf LB-Agarplatten
beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend 25 μg/ml Ampicillin, gezüchtet, und
es wurden Ampicillin-empfindliche
Klone selektiert, die nur auf den LB-Agarplatten wuchsen. Die xapA-Region
wurde durch PCR unter Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer
N-aus und C-aus aus der chromosomalen DNA dieser Zielklone amplifiziert,
und die Klone, in denen die Größe des amplifizierten
Fragments etwa 1,7 kb war, wurden selektiert. Die Klone wurden als
Stämme
betrachtet, denen xapA fehlt, und sie wurden als FADRaddeddyicPpgixapA
(purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–,
xap–)
bezeichnet. In dem Stamm, dem xapA fehlt, wurde die Xanthinproduktion
in einem Medium durch Kultivierung mit supplementiertem Xanthosin nicht
beobachtet, und es wurde bestätigt,
dass Xanthosinphosphorylase nicht induziert wurde. Die Xanthosinphosphorylaseaktivität wurde
nach dem Verfahren von K. Hammer Jespersen et al. (Molec. Gen. Genet.,
179, 341-348 (1980))
gemessen.
-
2) Beurteilung der Fähigkeit
des Stammes, der ein Plasmid mit unempfindlichem purF enthielt,
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Eine
Transformante wurde durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicPpgixapA (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–,
xapA–),
gezüchtet
in Abschnitt 1), hergestellt, und es wurde die Fähigkeit des Stammes zur Produktion
von Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren
für die
Produktion von Purinnucleosid und das Analyseverfahren waren dasselbe
wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe,
dass das MS-Medium, worin die Menge des Hefeextrakts auf 0,8% erhöht wurde, eingesetzt
wurde.
-
Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 14 gezeigt. Wenn
die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium erhöht wurde, wurde die Nebenproduktion
von Hypoxanthin, die nach Verbrauch des Zuckers in der zweiten Hälfte der
Kultivierung deutlich auftrat, durch das Fehlen von xapA verringert,
und es wurde eine Verbesserung der Inosinproduktion beobachtet.
-
Tabelle
14 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
-
Beispiel 12
-
1) Züchten eines Stammes, dem das
Nucleosidpermeasegen (nupG) fehlt
-
Eine
PCR (94°C,
30 sec; 55°C,
1 min; 72°C,
2 min; 30 Zyklen; Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer)
wurde unter Verwendung der chromosomalen DNA des Stammes W3110 als
Matrize und von 35-mer-Primern für
beide Enden mit den Nucleotidsequenzen CTCGAATTCATGGTGCCGAACCACCTTGATAAACG
(SEQ ID Nr: 33) und CTCGTCGACATGCCGAAACCGGCGAATATAGCGAC (SEQ ID
Nr: 34), präpariert
auf der Grundlage der Information aus einer Gendatenbank (E. coli
Gene Bank), durchgeführt,
wobei ein Fragment von etwa 2,7 kb der nupG-Strukturgenregion, die
SD-ATG und das Translationsterminationscodon umfasst, erhalten wurde.
Eine EcoRI-Stelle beziehungsweise eine SalI-Stelle sind in den PCR-Primern
bereitgestellt. Das amplifizierte Fragment wurde mit EcoRI, SalI
und AflII verdaut. Da das PCR-amplifizierte
Fragment 2 AflII-Stellen enthielt, wurden 3 Fragmente von etwa 750
bp, 820 bp und 1130 bp gebildet. Die 2 Fragmente von etwa 720 bp
und 1130 bp, die nicht das AflII-Fragment
von etwa 820 bp waren, wurden gewonnen und durch T4- DNA-Ligase mit DNA,
die durch Verdauen des Vektors pUC18 (Takara Shuzo) mit EcoRI und SalI
erhalten wurde, ligiert. Kompetente Zellen von E. coli HB101 wurden
mit dieser Ligationslösung
transformiert, und Plasmid-DNAs wurden aus 16 der auftretenden Kolonien
präpariert,
und es wurde eine Plasmid-DNA, worin ein Fragment, das mit EcoRI
und SalI verdaut war, von etwa 1,9 kb enthalten war (pUC18nupG'#1), aus den Plasmid-DNAs selektiert.
Das Plasmid pUC18nupG'#1
wurde mit EcoRI und SalI verdaut, und das erhaltene Fragment von
etwa 1,9 kb wurde durch T4-DNA-Ligase mit einem Plasmid, das durch
Verdauen von pMAN997, welches ein Vektor für die homologe Rekombination
mit einem temperaturempfindlichen Replikationsursprung (tsori) (wie
vorstehend beschrieben) ist, mit EcoRI und SalI erhalten wurde.
Kompetente Zellen von E. coli JM109 wurden mit dieser Ligationslösung transformiert,
und es wurden Transformanten erhalten, die auf LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, wuchsen. Plasmid-DNAs wurden aus den Transformanten
von 10 Klonen präpariert,
und eine Plasmid-DNA,
aus der ein Fragment von etwa 1,9 kb durch Verdauen mit EcoRI und
SalI ausgeschnitten wurde (pMAN997nupG'#1), wurde aus den Plasmid-DNAs selektiert.
Das in dieser Plasmid-DNA enthaltene nupG hatte eine Deletion von
etwa 820 bp in dem Strukturgen, und deshalb wird vorhergesagt, dass
das codierte Enzym seine Funktion nicht aufweist (3).
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Der
Stamm FADRaddeddyicPpgi (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–)
wurde bei 30°C mit
dem Plasmid pMAN997nupG'#1
transformiert, und einige der erhaltenen Kolonien wurden auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen und über
Nacht bei 30°C
kultiviert. Dann wurden die kultivierten Bakterienzellen auf LB-Agarplatten,
enthaltend 25 μg/ml
Ampicillin, ausgestrichen, sodass einzelne Kolonien erhalten werden
sollten, wobei bei 42°C
gewachse ne Kolonien erhalten wurden. Das Verfahren zum Bereitstellen
einzelner Kolonien, die bei 42°C
wachsen, wurde einmal wiederholt, und es wurden Klone selektiert, in
denen das gesamte Plasmid durch homologe Rekombination in das Chromosom
integriert war. Es wurde bestätigt,
dass diese Klone das Plasmid in ihrem Zytoplasma nicht enthielten.
Dann wurden unter diesen Klonen mehrere Klone auf LB-Agarplatten
ausgestrichen, über
Nacht bei 30°C
kultiviert, dann in LB-Flüssigmedium
(3 ml/Teströhrchen)
eingeimpft und 3 bis 4 Stunden unter Schütteln bei 42°C kultiviert.
Die Kultur wurde in geeigneter Weise verdünnt, sodass einzelne Kolonien
erhalten werden sollten (Verdünnung
von etwa 10–5 bis 10–6),
auf LB-Agarplatten ausgestrichen und bei 42°C über Nacht kultiviert, wobei
Kolonien erhalten wurden. 100 Kolonien wurden unter den auftretenden
Kolonien willkürlich
ausgewählt
und jeweils auf LB-Agarplatten beziehungsweise LB-Agarplatten, enthaltend
25 μg/ml
Ampicillin, gezüchtet,
und es wurden Ampicillin-empfindliche Klone selektiert, die nur
auf LB-Agarplatten wuchsen. Die nupG-Region wurde durch PCR unter
Verwendung der vorstehend beschriebenen PCR-Primer aus der chromosomalen
DNA dieser Zielklone amplifiziert, und es wurden Klone selektiert,
in denen die Größe des amplifizierten
Fragments etwa 1,9 kb war. Diese Klone wurden als Stämme betrachtet,
denen nupG fehlt, und sie wurden als FADRaddeddyicPpginupG (purF–, purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–,
nupG–)
bezeichnet.
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2) Beurteilung der Fähigkeit
eines Stammes, der unempfindliches purF enthält, zur Produktion von Purinnucleosid
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Eine
Transformante wurde durch Einführen
von pKFpurFKQ in den Stamm FADRaddeddyicPpginupG (purF–,
purA–,
deoD–,
purR–,
add–,
edd–,
yicP–,
pgi–,
nupG–),
gezüchtet
in Abschnitt 1), hergestellt, und es wurde die Fähigkeit des Stammes zur Produktion von
Purinnucleosid beurteilt. Das Grundmedium und das Kultivierungsverfahren
für die
Purinnucleosidproduktion und das Analyseverfahren waren dasselbe
wie in Beispiel 1, mit der Maßgabe,
dass das MS-Medium eingesetzt wurde, worin die Menge des Hefeextrakts
auf 1,2% erhöht wurde.
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Die
Ergebnisse der Beurteilung der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid sind in Tabelle 15 gezeigt. Wenn
die Menge des Hefeextrakts in dem MS-Medium erhöht wurde, wurde die Nebenproduktion
von Hypoxanthin, die nach dem Verbrauch des Zuckers in der zweiten
Stufe der Kultivierung deutlich auftritt, verringert, und es wurde
eine verbesserte Inosinproduktion aufgrund des Fehlens von nupG
beobachtet.
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Tabelle
15 Beurteilung
der Fähigkeit
zur Produktion von Purinnucleosid
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Industrielle Anwendbarkeit
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Erfindungsgemäß wird ein
Purinnucleosid-produzierendes Bakterium erzeugt, indem ein Enzym,
das einer Kontrolle in der Purinnucleosidbiosynthese unterliegt,
dereprimiert und unempfindlich gemacht wird und außerdem ein
Abbausystem und ein Umwandlungssystem blockiert werden. Das erzeugte
Bakterium, welches Purinnucleosid produziert, kann in geeigneter
Weise für
die Produktion von Purinnucleosid durch Fermentation eingesetzt
werden.
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