CN115851693B - 葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用 - Google Patents
葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于微生物基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用。申请人将葡萄糖异构酶第235位氨基酸由亮氨酸变为丙氨酸，通过构建重组表达载体，发现突变体TogI‑L235A的比活力达到了158.7U/mg，相比对照至少提高了16.4%。进一步通过筛选不同信号肽实现葡萄糖异构酶的胞外高效表达，酶活高达42.5U/mL，为工业生产葡萄糖异构酶奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程和蛋白质工程改造技术领域，具体涉及葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌及应用。
背景技术
葡萄糖异构酶(GI)是高果糖浆工业的关键用酶，能可逆催化D-葡萄糖和D-果糖之间的异构转化，由于高果糖浆比蔗糖更有益于健康，并有着良好的发酵性能和适宜的口感，广泛应用于食品和饮料工业。强化表达葡萄糖异构酶基因以及提高酶与底物的亲和力是提高GI产量和酶活性的有效途径。目前常用于GI表达的工程宿主菌是大肠杆菌，且为胞内表达。为了更好满足食品工业的安全要求，从国际公认的食品工业安全宿主菌(GRAS)着眼，本专利使用地衣芽胞杆菌作为宿主菌。
地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)被认为是安全菌株，且能分泌大量的胞外蛋白，是一个很好的分泌表达系统。地衣芽胞杆菌BL10来源于野生菌地衣芽胞杆菌WX-02，该菌株缺失野生菌的胞外蛋白酶，作为表达宿主有利于外源蛋白的的分泌表达。葡萄糖异构酶已经在大肠杆菌和枯草芽胞杆菌中获得不同程度的表达，但还未有在地衣芽胞杆菌中分泌表达的报道。
发明内容
提高酶与底物亲和力是提高酶活性的有效措施，本申请的目的在于提供了葡萄糖异构酶突变体TogI-L235A，其比活力达到158.7U/mg，相比野生型提高了16.4％。
本发明的另一个目的在于提供了高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌，该工程菌实现葡萄糖异构酶的胞外高效表达，酶活高达42.5U/mL。
本发明的最后一个目的在于提供了上述菌株在生产葡萄糖异构酶突变体中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人通过PCR扩增获得来源于Thermus oshimai的葡萄糖异构酶基因togI，再将葡萄糖异构酶进行改造，相对于原始氨基酸序列，将其第235位氨基酸由亮氨酸变为丙氨酸、丝氨酸或异亮氨酸中的一种，获得突变体TogI-L235A、TogI-L235S、TogI-L235I。通过构建重组表达载体，发现突变体TogI-L235A的比活力达到了158.7U/mg，相比对照(即野生型)至少提高了16.4％，所述的葡萄糖异构酶突变体，为SEQ ID NO.1所示，编码其的基因为SEQID NO.2所示。
高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌(Bacillus licheniformis)，其是将SEQ ID NO.3所述的蛋白表达载体转入地衣芽胞杆菌中获得，所述的地衣芽胞杆菌为表达外源蛋白的地衣芽孢杆菌。
以上所述的应用，优选的，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10
高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌在制备葡萄糖异构酶中的应用，所述的应用过程是发酵，使用的发酵培养基为：
8-12g/L酵母粉、10-14g/L骨蛋白胨、9-12g/L玉米浆、17-22g/L蔗糖、1-5g/LKH2PO4、2-8g/L Na2HPO4、0.1-0.5g/L MgSO4，pH 6.8-7.5。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过对Thermus oshimai葡萄糖异构酶基因进行定点突变，获得一个比酶活提高16.4％的突变体。随后，通过筛选10种枯草芽胞杆菌属来源的信号肽，进一步提高葡萄糖异构酶酶活性，方法简单易行，改进后地衣芽胞杆菌发酵液中的Thermus oshimai葡萄糖异构酶活性最高达42.5U/mL。为介导地衣芽胞杆菌表达系统中葡萄糖异构酶基因的异源表达奠定基础，推动葡萄糖异构酶的高效表达及工业化生产。
附图说明
图1为葡萄糖异构酶基因重组表达载体图谱。
图2葡萄糖异构酶突变体的比活力示意图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
实施例1：
葡萄糖异构酶突变体构建
申请人通过PCR扩增获得来源于Thermus oshimai的葡萄糖异构酶基因togI，再将葡萄糖异构酶进行改造，相对于原始氨基酸序列，将其第235位氨基酸由亮氨酸变为丙氨酸、丝氨酸或异亮氨酸中的一种，获得突变体TogI-L235A、TogI-L235S、TogI-L235I。通过构建重组表达载体，发现突变体TogI-L235A的比活力达到了158.7U/mg，相比对照(即野生型)至少提高了16.4％。
具体操作如下：
Thermus oshimai的葡萄糖异构酶基因togI(Genebank：13924178)，以及来源于枯草芽胞杆菌168中的P43启动子，来源于地衣芽胞杆菌WX-02的淀粉酶终止子TamyL产物纯化后克隆到pHY300表达载体上，获得葡萄糖异构酶表达载体pHY-TogI。
在此载体基础上，使用设计的突变引物，扩增出突变体的骨架。设计的突变引物序列如下：
TogI-L235A-F:GCCGTTGCTCAAGTCGCTGATGCAGGAAAGTTATTCCACATTG
TogI-L235A-R:CCTGCATCAGCGACTTGAGCAACGGCATGGACGAAGTTCAAAC
TogI-L235S-F:GCCGTTGCTCAAGTCAGTGATGCAGGAAAGTTATTCCACATTG
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TogI-L235I-R:CCTGCATCAATGACTTGAGCAACGGCATGGACGAAGTTCAAAC
琼脂糖凝胶电泳分离出目的骨架DNA，使用OMEGA的Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化，随后将少量突变体骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-amp-F与pHY-amp-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由北京擎科生物技术有限公司武汉分公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即突变载体构建成功，获得的突变载体分别为：pHY-TogI-L235A、pHY-TogI-L235S、pHY-TogI-L235I。
实施例2：
含有葡萄糖异构酶突变体载体的地衣芽胞杆菌BL10的液体发酵：
将实施例1中获得的突变载体pHY-TogI-L235A、pHY-TogI-L235S、pHY-TogI-L235I分别电转入地衣芽胞杆菌BL10(CN114807100A)中构建重组菌株，挑取菌落接种于5mL的有四环素(20μg/mL)的LB培养基中，37℃，230r/min振荡培养过夜。
再以5％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以5％的接种量(1mL)接种到预先准备好的葡萄糖异构酶液体发酵培养基中，37℃，230r/min，发酵时间48h。
所述的葡萄糖异构酶液体发酵培养基为：10g/L酵母粉；10g/L骨蛋白胨、10g/L玉米浆、20g/L蔗糖；3g/L KH2PO4；6g/L Na2HPO4；0.3g/LMgSO4。
发酵结束后，葡萄糖异构酶活力测定方法参照GB/T23533—2009，即在酶活测定标准条件下，每分钟产生1μml D-果糖所需葡萄糖异构酶酶量被定义为一个酶活单位，用U表示。通过对突变体进行比酶活测定，结果如图2所示，其中TogI-L235A的比酶活达到158.7U/mg，与对照组相比提高了16.4％。因此选用葡萄糖异构酶突变体L235A进行进一步研究，葡萄糖异构酶突变体L235A为SEQ ID NO.1所示。
实施例3：
适宜于葡萄糖异构酶突变体高效表达的信号肽筛选
利用NCBI数据库并通过在线分析软件SignalP 5.0Server和TatP 1.0Server预测获得枯草芽胞杆菌来源的10种信号肽，分别与启动子P43组合合成，扩增获得葡萄糖异构酶突变体基因，纯化回收，构建相应葡萄糖异构酶表达载体及地衣芽胞杆菌工程菌株。
根据NCBI上枯草芽胞杆菌168的启动子P43的基因序列设计引物，PCR扩增得到启动子P43片段。
P43-F:TGATAGGTGGTATGTTTTCG
P43-R:TATATATTCCTCCTTTCT。
信号肽扩增所用引物：信号肽扩增所有F端的引物均以5’-AGAAAGGAGGAATATATA-3’开始，所有R端的引物均以5’-GTTCCGGTTTAGGTTCGTA-3’开始，酶切位点SpeI和XhoI分别位于F端和R端的引物两端，信号肽扩增模板为枯草芽孢杆菌168。
以葡萄糖异构酶突变载体为模板，扩增葡萄糖异构酶突变体基因togI-L235A，扩增目的基因设计一对引物。
togI-F:TACGAACCTAAACCGGAAC
togI-R:TCATCCCCGAACCCCTAAAAGGTG
根据NCBI上地衣芽胞杆菌WX-02中的淀粉酶基因amyL的终止子TamyL的序列设计引物：
amyl-F:CACCTTTTAGGGGTTCGGGGATGACTGTCAGACCAAGTTTAC
amyl-R:CGCAATAATGCCGTCGCAC
菌落PCR所用引物的序列如下：
pHY-amp-F GTTTATTATCCATACCCTTAC
pHY-amp-R CAGATTTCGTGATGCTTGTC
10种枯草芽胞杆菌属来源的信号肽的核苷酸序列
上述构建方法如下：
将葡萄糖异构酶基因togI-L235A，P43+SP与togI-L235A片段经相同酶切后连接，连接产物纯化后克隆到pHY300表达载体上。随后将少量骨架DNA加入到大肠杆菌DH5α感受态中，利用菌株自身修复系统，完成突变载体的环化。将菌体涂布在含有Tet抗性的培养平板上进行筛选，置于37℃培养箱中培养；对转化子进行菌落PCR验证，所用引物为pHY-amp-F与pHY-amp-R，如目的大小正确，则可进行下一步测序，载体核苷酸序列测定由北京擎科生物技术有限公司武汉分公司完成；分析测序结果，如序列与设计相符，即载体构建成功。一共获得了10个表达载体，其中pHY-P43-SPMntA-togI-TamyL-L235A为SEQ ID NO.3所示。
再将成功构建的载体分别电转入地衣芽胞杆菌BL10中，获得10株重组表达菌株BL10/pHY-P43-SP(PstS、MntA、NucB、DppE、Epr、FeuA、OcrA、Ggt、YhcJ、OpuAC)-togI-TamyL-L235A。
实施例3：
不同信号肽的葡萄糖异构酶液体发酵
挑取菌落接种于5mL的有四环素(20μg/mL)的LB培养基中，37℃，230r/min振荡培养过夜。再以5％的接种量转接到50mL新鲜的LB培养基中，直到OD600为1.0时，以5％的接种量(1mL)接种到预先准备好的葡萄糖异构酶液体发酵培养基中，37℃，230r/min，发酵时间48h。。
所述的葡萄糖异构酶液体发酵培养基：10g/L酵母粉；10g/L骨蛋白胨、10g/L玉米浆、20g/L蔗糖；3g/L KH2PO4；6g/L Na2HPO4；0.3g/L MgSO4，pH7.2。
发酵结束后，葡萄糖异构酶活力测定方法参照GB/T23533—2009，即在酶活测定标准条件下，每分钟产生1μml D-果糖所需葡萄糖异构酶酶量被定义为一个酶活单位，用U表示。通过对10种不同信号肽的工程菌株进行发酵验证，其中BL10/pHY-P43-SPMntA-togI-TamyL-L235A的酶活性最高，达到42.5U/mL，由此，本发明获得一株新型的葡萄糖异构酶突变体及其高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌。
地衣芽胞杆菌工程菌株葡萄糖异构酶酶活
| 菌株 | 葡萄糖异构酶活力(U/mL) |
| BL10/pHY-P43-SPYvfO-togI-TamyL-L235A | 25.4 |
| BL10/pHY-P43-SPEpr-togI-TamyL-L235A | 18.7 |
| BL10/pHY-P43-SPBLi03719-togI-TamyL-L235A | 30.5 |
| BL10/pHY-P43-SPYxiA-togI-TamyL-L235A | 32.8 |
| BL10/pHY-P43-SPBpr-togI-TamyL-L235A | 27.9 |
| BL10/pHY-P43-SPAppA-togI-TamyL-L235A | 22.4 |
| BL10/pHY-P43-SPMntA-togI-TamyL-L235A | 42.5 |
| BL10/pHY-P43-SPPhy-togI-TamyL-L235A | 15.6 |
| BL10/pHY-P43-SPYcdH-togI-TamyL-L235A | 9.8 |
| BL10/pHY-P43-SPYusW-togI-TamyL-L235A | 11.7 |
Claims (9)
1. 一种葡萄糖异构酶突变体，所述的突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。
2.编码权利要求1所述葡萄糖异构酶突变体的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其为SEQ ID NO.2所示。
4.表达权利要求1所述突变体的蛋白表达载体。
5. 根据权利要求4所述的蛋白表达载体，其为SEQ ID NO.3所示。
6. 高产葡萄糖异构酶的地衣芽胞杆菌工程菌（Bacillus licheniformis），其是将权利要求5所述的蛋白表达载体转入地衣芽胞杆菌中获得，所述的地衣芽胞杆菌为表达外源蛋白的地衣芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的工程菌，所述的地衣芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌BL10。
8.权利要求6所述的地衣芽胞杆菌在制备葡萄糖异构酶中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，应用过程中使用的发酵培养基为：
8-12 g/L 酵母粉、 10-14 g/L骨蛋白胨 、9-12g/L 玉米浆、17-22 g/L 蔗糖、1-5 g/LKH2PO4、2-8 g/L Na2HPO4 、0.1-0.5 g/L MgSO4 ，pH 6.8-7.5。
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