ES2631360T3 - Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido - Google Patents

Microorganismo que produce un L-aminoácido y procedimiento para producir un L-aminoácido Download PDF

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Abstract

Microorganismo Pantoea ananatis modificado que presenta la capacidad de producir ácido L-glutámico y ha sido modificado de manera que el sistema ATPasa de tipo P (kdp) que transporta potasio, codificado por el operón kdp, esté aumentado en comparación con una cepa sin modificar, en el que el sistema kdp se aumenta de manera que se aumente la actividad de ATPasa de tipo P del microorganismo, incrementando la expresión de dicho operón kdp o uno o más genes que constituyen dicho operón kdp, y/o incrementando la traducción de dicho operón kdp o de dichos genes, incrementando el número de copias de dicho operón kdp o uno o más de dichos genes, o modificando una secuencia de control de la expresión de dicho operón.

Description

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DESCRIPCION
Microorganismo que produce un L-aminoacido y procedimiento para producir un L-aminoacido.
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un procedimiento para producir un L-aminoacido utilizando un microorganismo, en particular a procedimientos para producir un L-aminoacido, siendo el L-aminoacido acido L- glutamico. El acido L-glutamico es un condimento.
Tecnica anterior
Los L-aminoacidos se producen industrialmente mediante fermentacion utilizando diversos microorganismos. Por ejemplo, el acido L-glutamico se produce principalmente mediante fermentacion utilizando bacterias productoras de acido L-glutamico de las denominadas bacterias corineformes pertenecientes a los generos Brevibacterium, Corynebacterium o Microbacterium, o cepas mutantes de las mismas (vease, por ejemplo, el documento distinto de patente 1). Como procedimientos para producir acido L-glutamico mediante fermentacion utilizando otras cepas bacterianas se conocen procedimientos de utilizacion de microorganismos pertenecientes a los generos Bacillus, Streptomyces, Penicillium o similares (remftase, por ejemplo, al Documento de patente 1), procedimientos de utilizacion de microorganismos pertenecientes a los generos Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida o similares (remftase, por ejemplo, al Documento de patente 2), procedimientos de utilizacion de microorganismos pertenecientes a los generos Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (denominado actualmente Enterobacter aerogenes) o similares (remftase, por ejemplo, al Documento de patente 3), procedimientos de utilizacion de cepas mutantes de Escherichia coli (remftase, por ejemplo, al Documento de patente 1), etc. Ademas, tambien se divulgan procedimientos para producir acido L-glutamico utilizando un microorganismo perteneciente al genero Klebsiella, Erwinia, Pantoea o Enterobacter (remftase, por ejemplo, a los Documentos de patente 2 a 4).
Dichos procedimientos para producir sustancias diana tales como L-aminoacidos mediante fermentacion utilizando un microorganismo tal como se ha descrito anteriormente incluyen procedimientos de utilizacion de un microorganismo de tipo silvestre (cepa de tipo silvestre), procedimientos de utilizacion de una cepa auxotrofica derivada de una cepa de tipo silvestre, procedimientos de utilizacion de una cepa mutante de regulacion metabolica derivada de una cepa de tipo silvestre tal como una cepa resistente a alguno de diversos farmacos, procedimientos de utilizacion de una cepa que tiene propiedades tanto de cepa auxotrofica como de cepa mutante de regulacion metabolica, etc.
En los ultimos anos se han utilizado tecnicas de ADN recombinante en la produccion de sustancias diana mediante fermentacion. Por ejemplo, la productividad de L-aminoacidos de un microorganismo se mejora potenciando la expresion de un gen que codifica una enzima biosintetica de L-aminoacidos (Documentos de patente 5 y 6), o potenciando el flujo de entrada de una fuente de carbono en un sistema de biosfntesis de L- aminoacidos (Documento de patente 7).
El sistema kdp es una ATPasa de tipo P que opera captando iones potasio (Documento distinto de patente 2). El sistema kdp esta codificado por el operon kdp, y la expresion del mismo se induce cuando la concentracion de ion potasio en el medio es reducida o cuando el cultivo se realiza en condiciones hiperosmoticas (Documento distinto de patente 3). Ademas, se sabe que la expresion esta controlada por KdpD y KdpE, que constituyen uno de los sistemas de control binarios (Documento distinto de patente 4). No obstante, la relacion entre la potenciacion del sistema kdp y la produccion de L-aminoacidos no se ha investigado hasta la fecha.
Documento de patente 1: Patente japonesa abierta a inspeccion publica (KOKAI) n° 5-244970
Documento de patente 2: Patente US n° 3.563.857
Documento de patente 3: Publicacion de patente japonesa (KOKOKU) n° 32-9393.
Documento de patente 4: Patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2000-189175 Documento de patente 5: Patente US n° 5.168.056 Documento de patente 6: Patente US n° 5.776.736 Documento de patente 7: Patente US n° 5.906.925
Documento no de patente 1: Kunihiko Akashi et al., “Amino acid fermentation”, paginas 195-215, 1986, Japan Scientific Societies Press
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Documento no de patente 2: Laimonis A. Laimins, Proc, Natl. Acad Sci. USA, julio de 1978, 75(7): 3216-19 Documento no de patente 3: Laimonis A. Laimins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, enero de 1981, 78(1): 464-68 Documento no de patente 4: Mark O. Walderhaug, J. Bacteriol., abril de 1992, 174 (7): 2152-59 Exposicion de la invencion Objetivo que se va a lograr mediante la invencion
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar un microorganismo de Pantoea ananatis que es capaz de producir eficazmente un L-aminoacido, y proporcionar un procedimiento para producir de forma eficaz un L- aminoacido utilizando dicho microorganismo.
Medios para lograr el objetivo
Los inventores de la presente invencion han realizado diversas investigaciones con el fin de lograr el objetivo mencionado anteriormente; como resultado han encontrado que el acido L-glutamico podrfa producirse eficazmente utilizando un microorganismo cuyo sistema kdp estuviera potenciado, y asf se ha realizado la presente invencion.
Es decir, la presente invencion proporciona los puntos siguientes.
[1] Un microorganismo Pantoea ananatis modificado que tiene capacidad productora de acido L-glutamico y que se ha modificado de forma que se potencie el sistema ATPasa de tipo P (kdp) transportador de potasio que esta codificado por el operon kdp en comparacion con una cepa sin modificar, en el que el sistema kdp se potencia de forma que la actividad de ATPasa de tipo P del microorganismo se potencie, aumentando la expresion de dicho operon kdp o de uno o mas genes que constituyen dicho operon kdp y/o aumentando la traduccion de dicho operon kdp o de dichos genes, aumentando el numero de copias de dicho operon kdp o de uno o mas de dichos genes o modificando la secuencia de control de la expresion de dicho operon.
[2] El microorganismo segun el punto [1], en el que el operon kdp contiene por lo menos los genes kdpA, kdpB y kdpC.
[3] El microorganismo segun el punto [2], en el que el gen kdpA es un gen que codifica una protefna que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID n° 2 o n° 8 o la subunidad A del sistema kdp que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID n° 2 o n° 8 incluidas sustituciones, supresiones, inserciones o adiciones de uno a 20 restos de aminoacidos.
[4] El microorganismo segun el punto [2] o [3], en el que el gen kdpB es un gen que codifica una protefna que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID n° 3 o n° 9 o la subunidad B del sistema kdp que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID n° 3 o n° 9 incluidas sustituciones, supresiones, inserciones o adiciones de uno a 20 restos de aminoacidos.
[5] El microorganismo segun uno cualquiera de los puntos [2] a [4], en el que el gen kdpC es un gen que codifica una protefna que tiene la secuencia de aminoacidos mostrada en la SEC ID n° 4 o n° 10 o la subunidad C del sistema kdp que tiene la secuencia de aminoacidos de la SEC ID n° 4 o n° 10 incluidas sustituciones, supresiones, inserciones o adiciones de uno a 20 restos de aminoacidos.
[6] El microorganismo segun uno cualquiera de los puntos [2] a [5], en el que el operon kdp es un ADN definido en uno cualquiera de los puntos (a) a (d) siguientes:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos con los numeros de nucleotido 546 a 4871 de la SEC ID n° 1,
(b) un ADN que codifica el sistema kdp y se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleotidos de (a) o con una sonda que se ha preparado a partir de dicha secuencia de nucleotidos,
(c) un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos con los numeros de nucleotido 546 a 4853 de la SEC ID n° 7,
(d) un ADN que codifica el sistema kdp y se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleotidos de (c) o con una sonda que se ha preparado a partir de dicha secuencia de nucleotidos.
[7] Un procedimiento para producir acido L-glutamico que comprende cultivar el microorganismo segun uno
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cualquiera de los puntos [1] a [6] en un medio para producir y acumular acido L-glutamico en el medio o en las celulas y recoger acido L-glutamico a partir del medio o de las celulas
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 es un dibujo que representa la estructura de un plasmido cooperador RSF-Red-TER.
La figura 2 es un dibujo que representa la construccion de un plasmido cooperador RSF-Red-TER.
La figura 3 es un dibujo que representa la estructura de la region cromosomica de P. ananatis ubicada corriente arriba del gen LacZ.
La figura 4 es una grafica que representa el crecimiento de una cepa sustituida con el promotor del operon kdp en cultivo en condiciones acidas en un tubo de ensayo.
La figura 5 es un grafico que representa la productividad de acido L-glutamico de una cepa sustituida con el promotor del operon kdp.
La figura 6 es un dibujo que representa el alineamiento de secuencias de aminoacidos de kdpA de Pantoea ananatis (SEC ID n° 8) y Escherichia coli (SEC ID n° 2), y la secuencia de consenso de las mismas (SEC ID n° 57).
La figura 7 es un dibujo que representa el alineamiento de secuencias de aminoacidos de kdpB de Pantoea ananatis (SEC ID n° 9) y Escherichia coli (SEC ID n° 3), y la secuencia de consenso de las mismas (SEC ID n° 58).
La figura 8 es un dibujo que representa el alineamiento de secuencias de aminoacidos de kdpC de Pantoea ananatis (SEC ID n° 10) y Escherichia coli (SEC ID n° 4), y la secuencia de consenso de las mismas (SEC ID n° 59).
Mejor modo de poner en practica la invencion
A continuacion, la presente invencion se explicara en detalle.
<1> Microorganismo de la presente invencion
El microorganismo de la presente invencion es un microorganismo modificado de Pantoea ananatis que tiene capacidad productora de L-aminoacidos y que se ha modificado de forma que se potencie el sistema kdp. La capacidad productora de L-aminoacidos a la que se refiere el presente documento significa la capacidad del microorganismo de la presente invencion para producir y acumular un L-aminoacido, es decir, acido L-glutamico, en un medio o en celulas en una cantidad tal que el L-aminoacido pueda recogerse a partir del medio o de las celulas cuando el microorganismo se cultiva en el medio.
El microorganismo que tiene capacidad productora de L-aminoacidos puede ser un microorganismo que tiene de forma inherente capacidad productora de L-aminoacidos, o un microorganismo obtenido modificando dichos microorganismos tal como se describe mas adelante a fin de que tenga capacidad productora de L-aminoacidos utilizando un procedimiento de mutacion o tecnicas de ADN recombinante.
<1-1> Imparticion de la capacidad productora de L-aminoacidos
A continuacion se describiran ejemplos de procedimientos para impartir capacidad productora de L-aminoacidos y microorganismos que pueden utilizarse en la presente invencion a los que se imparte la capacidad productora de L-aminoacidos. No obstante, los microorganismos no estan limitados a estos siempre que se utilice un microorganismo que tenga capacidad productora de L-aminoacidos.
Los microorganismos utilizados por la presente invencion abarcan microorganismos clasificados dentro de la familia de las Enterobacteriaceae segun la taxonomfa utilizada por la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information)(
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347). Como cepas progenitoras de Enterobacteriaceae que se pueden modificar se utilizan preferentemente bacterias que pertenecen a los generos Escherichia, Enterobacter, Pantoea, Erwinia, Enterobacter o Klebsiella.
La cepa progenitora de bacterias de Escherichia utilizada con el fin de obtener una bacteria de Escherichia de la presente invencion no esta particularmente limitada. Pueden utilizarse las descritas en el trabajo de Neidhardt et al. (Backmann, B.J., 1996. Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12, paginas 2460-2488, Tabla 1, en F.D. Neidhardt (ed.), Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology/segunda edicion, American Society for Microbiology Press, Washington, D.C.). Entre las mismas, por
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ejemplo, se ejemplifica la Escherichia coli. Los ejemplos de Escherichia coli incluyen la cepa W3110 (ATCC n° 27325), la cepa MG1655 (ATCC n° 47076), etc., que son derivados de una cepa de tipo silvestre prototipo, la cepa K12.
Estas cepas estan disponibles, por ejemplo, en la American Type Culture Collection (ATCC) (Direccion: 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, Estados Unidos). Es decir, a cada cepa se le asigna un unico numero de registro (
http://www.atcc.org/). Las cepas pueden ordenarse utilizando este numero de registro. El numero de registro de cada cepa se enumera en el catalogo de la ATCC.
Los ejemplos de las bacterias Enterobacter incluyen Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, etc. Los ejemplos de las bacterias Pantoea incluyen Pantoea ananatis. En los ultimos anos, algunas bacterias de Enterobacter agglomerans se reclasificaron como Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis o Pantoea stewartii, sobre la base de Pantoea ananalis. Algunos ejemplos especfficos incluyen las cepas siguientes:
Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6614, Patente europea abierta a inspeccion publica n° 0952221)
Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, Patente europea abierta a inspeccion publica n° 0952221)
Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, Patente europea abierta a inspeccion publica n° 0952221)
Aunque estas cepas se identificaron y se depositaron como Enterobacter agglomerans cuando estas cepas se
aislaron, estan clasificadas actualmente como Pantoea ananatis sobre la base de un analisis de secuencia de nucleotidos del ARNr 16S, etc., tal como se ha descrito anteriormente.
A continuacion se describen procedimientos para impartir capacidad productora de L-aminoacidos a bacterias de Pantoea ananatis, o procedimientos para potenciar la capacidad productora de L-aminoacidos de dichas bacterias.
Para impartir capacidad para producir un L-aminoacido pueden utilizarse los procedimientos que se utilizan en el cultivo de bacterias corineformes o bacterias del genero Escherichia (vease “Amino Acid Fermentation”, Gakkai Shuppan Center (Ltd.), 1a edicion, publicado el 30 de mayo de 1986, paginas 77-100). Dichos procedimientos incluyen la adquisicion de un mutante auxotrofico, una cepa resistente a analogos o un mutante de regulacion metabolica, la construccion de una cepa recombinante en la que esta potenciada la expresion de la biosfntesis de L-aminoacidos, etc. En el presente documento, en el cultivo de bacterias que producen L-aminoacidos, las propiedades impartidas tales como una mutacion auxotrofica, resistencia a analogos o mutacion de regulacion metabolica pueden ser una o varias. La expresion de enzima(s) de biosfntesis de L-aminoacidos puede potenciarse sola o en combinaciones de dos o mas. Ademas, los procedimientos de imparticion de propiedades tales como una mutacion auxotrofica, resistencia a analogos o mutacion de regulacion metabolica pueden combinarse con los procedimientos de potenciacion de enzimas de biosfntesis.
Una cepa mutante auxotrofica, una cepa resistente a analogos de L-aminoacidos o una cepa mutante de regulacion metabolica con la capacidad para producir un L-aminoacido pueden obtenerse sometiendo una cepa progenitora o una cepa de tipo silvestre a mutagenesis convencional, tal como exposicion a rayos X o irradiacion UV, o tratamiento con un mutageno tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), metanosulfonato de etilo (EMS), etc., seleccionando a continuacion aquellas que muestran autotroffa, resistencia a analogos o una mutacion de regulacion metabolica y que tambien tienen capacidad para producir un L-aminoacido.
Por lo tanto, a continuacion se ejemplifican bacterias que producen L-aminoacidos o procedimientos de construccion de las mismas.
Bacterias productoras de acido L-glutamico
En primer lugar, las bacterias productoras de acido L-glutamico se explican como bacterias productoras de L- aminoacidos.
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de acido L-glutamico incluyen cepas que pertenecen al genero Escherichia, tales como E. coli VL334thrC+ (patente europea n° 1172433). La E. coli VL334 (VKPM B-4641) es una cepa auxotrofica de L-isoleucina y L-treonina que tiene mutaciones en los genes thrC e ilvA (patente US n° 4.278.765). Un alelo de tipo silvestre del gen thrC se transfirio mediante el procedimiento de transduccion general utilizando un bacteriofago P1 cultivado en celulas K12 (VKPM B-7) de la cepa de E. coli de tipo silvestre. Como resultado se obtuvo una cepa auxotrofica de L-isoleucina, VL334thrC+ (VKPM B-8961).
Los ejemplos de procedimientos para impartir capacidad productora de acido L-glutamico a una bacteria o potenciar la capacidad de una bacteria incluyen, por ejemplo, modificar una bacteria de forma que se potencie la expresion de un gen que codifica una enzima implicada en la biosfntesis de acido L-glutamico.
Los ejemplos de enzimas implicadas en la biosfntesis de acido L-glutamico incluyen glutamato deshidrogenasa (en adelante denominada tambien “GDH”) (gdh), glutamina sintetasa (glnA), glutamato sintetasa (gltAB),
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isocitrato deshidrogenasa (icdA), aconitato hidratasa (acnA, acnB), citrato sintasa (en adelante denominada tambien “CS”) (gltA), metilcitrato sintasa (en adelante denominada tambien “PRPC” (prpC), fosfoenolpiruvato carboxilasa (en adelante denominada tambien “PEPC”) (ppc), piruvato carboxilasa (pyc), piruvato deshidrogenasa (aceEF, IpdA), piruvato cinasa (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintasa (ppsA), enolasa (eno), fosfogliceromutasa (pgmA, pgml), fosfoglicerato cinasa (pgk), gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (gapA), triosa fosfato isomerasa (tpiA), fructosa bisfosfato aldolasa (fbp), fosfofructocinasa (pfkA, pfkB) y glucosa fosfato isomerasa (pgi), etc. Las abreviaturas en parentesis son los nombres de los genes que corresponden a las enzimas, y esta convencion se utiliza a lo largo de la presente memoria descriptiva. Entre estas enzimas, se prefieren una o mas de CS o PRPC, PEPC y GDH y son mas preferidas las tres enzimas (remftase al documento WO 2006/051660).
A continuacion se explicaran procedimientos de modificacion de una bacteria para aumentar la expresion del gen diana.
El primer procedimiento es un procedimiento de aumento del numero de copias de un gen diana. Por ejemplo, el numero de copias de un gen diana puede aumentarse clonando el gen diana en un plasmido apropiado y transformando una bacteria huesped con el plasmido obtenido. Por ejemplo, cuando el gen diana es el gen que codifica CS (gen gltA), el gen que codifica PRPC (gen prpC), el gen que codifica PEPC (gen ppc) o el gen que codifica GDH (gen gdhA), las secuencias de nucleotidos de estos genes de bacterias Escherichia y bacterias Corynebacterium se han elucidado ya (Biochemistry, vol. 22, paginas 5243-5249, 1983; J. Biochem., vol. 95, paginas 909-916, 1984; Gene, vol. 27, paginas 193-199, 1984; Microbiology, vol. 140, paginas 1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., vol. 218, paginas 330-339, 1989; Molecular Microbiology, vol. 6, paginas 317-326, 1992), y por lo tanto pueden obtenerse sintetizando cebadores basados en las secuencias de nucleotidos respectivas y realizando una PCR utilizando ADN cromosomico de una bacteria perteneciente a la familia de las Enterobacteriaceae como plantilla.
Los ejemplos de los plasmidos utilizados para la transformacion incluyen un plasmido que se replica de forma autonoma en la bacteria huesped perteneciente a la familia de las Enterobacteriaceae, tal como pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29 (pHSG y pSTV estan disponibles en Takara Bio Inc.), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (los vectores pMW estan disponibles en Nippon Gene Co., Ltd.), etc. Ademas, tambien puede utilizarse un ADN de fago como vector en lugar de un plasmido. Los ejemplos de plasmidos para potenciar simultaneamente actividades de CS o PRPC, PEPC y GDH descritos anteriormente incluyen RSFCPG incorporado con el gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA (remftase a la patente europea abierta a inspeccion publica n° 0952221), y RSFPPG correspondiente a RSFCPG en el que el gen gltA se ha reemplazado por el gen prpC (remftase a los ejemplos).
Los ejemplos de procedimientos de transformacion incluyen el tratamiento de celulas receptoras con cloruro de calcio con el fin de aumentar la permeabilidad del ADN, del que se ha informado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. y Higa, A., 1970, J. Mol. Biol., 53:159-162), y la preparacion de celulas competentes a partir de celulas que estan en la fase de crecimiento, seguida de la transformacion con ADN, de la que se ha informado para Bacillus subtilis (Duncan, C.H., Wilson, G. A. y Young, F. E. 1977, Gene, 1:153-167). Como alternativa, tambien puede utilizarse un procedimiento de fabricacion de celulas receptoras de ADN en protoplastos o esferoplastos que puedan aceptar facilmente ADN recombinante, seguido de la introduccion del ADN recombinante en las celulas, que se sabe que puede aplicarse a Bacillus subtilis, actinomicetos y levaduras (Chang, S. y Choen, S.N., 1979, Mol. Gen. Genet., 168:111-115; Bibb, M.J. et al., 1978, Nature, 274:398-400; Hinnen, A., Hicks, J.B. y Fink, G. R. 1978, Proc. Natl. Sci., USA, 75:1929-1933). Ademas, tambien pueden transformarse microorganismos mediante el procedimiento del pulso electrico (patente japonesa abierta a inspeccion publica 2-207791).
El numero de copias de un gen tambien puede aumentarse introduciendo multiples copias del gen en el ADN cromosomico del microorganismo, que puede transformarse mediante recombinacion homologa (Millerl, J. H. Experiments in Molecular Genetics, 1972, Cold Spring Harbor Laboratory) utilizando multiples copias de una secuencia como dianas en el ADN cromosomico. Las secuencias presentes en multiples copias en el ADN cromosomico incluyen ADN repetitivos y repeticiones invertidas presentes en el extremo de un elemento transponible. Por lo tanto, tal como se divulga en la patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2-109985, es posible incorporar el gen diana en un transposon, y permitirle transferirse para introducir multiples copias del gen en el ADN cromosomico. El gen diana tambien puede introducirse en el cromosoma bacteriano mediante fago Mu (patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2-109985) o similares.
El segundo procedimiento consiste en aumentar la expresion del gen diana reemplazando una secuencia reguladora de la expresion del gen diana, tal como un promotor, en el ADN o plasmido cromosomico por un promotor mas fuerte. Por ejemplo, se conocen como promotores fuertes el promotor lac, el promotor trp, el promotor trc, el promotor PR, el promotor lacUV5, etc. Ademas, tambien es posible sustituir varios nucleotidos en la region en la region promotora de un gen de forma que el promotor se modifique para ser mas fuerte, tal como se divulga en la publicacion internacional de patente WO 00/18935. En un artfculo de Goldstein et al. (Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128), etc., se describen ejemplos de
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promotores fuertes y procedimientos para evaluar la fuerza de promotores.
La sustitucion de una secuencia reguladora de la expresion puede realizarse, por ejemplo, del mismo modo que en la sustitucion de genes, utilizando un plasmido sensible a la temperatura. Los ejemplos de vectores que tienen un origen de replicacion sensible a la temperatura y que pueden utilizarse por la bacteria de la presente invencion perteneciente a la familia Enterobacteriaceae incluyen, por ejemplo, el plasmido pMAN997 descrito en la publicacion internacional WO 99/03988, etc.
Ademas, es conocido que las sustituciones de varios nucleotidos en un espaciador entre el sitio de union a ribosoma (RBS) y el codon de inicio, en particular una secuencia inmediatamente corriente arriba del codon de inicio, afecta enormemente a la eficacia de traduccion de ARNm. Modificando estos, puede mejorarse la cantidad de traduccion.
La modificacion de una secuencia de control de la expresion puede combinarse con el procedimiento de aumento del numero de copias de un gen descrito anteriormente.
Los ejemplos de los procedimientos para la sustitucion de genes tal como se ha descrito anteriormente incluye procedimientos que utilizan ADN lineal, tal como “integracion dirigida por Red” (Datsenko, K. A. y Wanner, B. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97:6640-6645 (2000)), e integracion dirigida por Red en combinacion con el sistema de escision de fago A (Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. 2002, J. Bacteriol., 184:5200-5203) (documento WO 2005/010175), etc., procedimientos que utilizan un plasmido que contiene un origen de replicacion sensible a la temperatura, procedimientos que utilizan un plasmido capaz de realizar una transferencia conjugativa, procedimientos que utilizan un vector suicida que no tiene un origen de replicacion que pueda utilizarse en el huesped elegido (patente US n° 6.303.383, patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 05-007491), etc.
Como se muestra en el Ejemplo de referencia 1, una cepa resistente a un producto genico de Red de A, por ejemplo la cepa SC17(0) de Pantoea ananatis, puede utilizarse de forma adecuada para la integracion dirigida por Red. La cepa SC17(0) se deposito en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika (Rusia, 117545 Moscu 1, Dorozhny proezd. 1) el 21 de septiembre de 2005 con el numero de registro VKPM B-9246.
Los ejemplos de microorganismos modificados por el procedimiento descrito anteriormente para potenciar la expresion del gen de citrato sintasa, el gen de metilcitrato sintasa, el gen de fosfoenolpiruvato carboxilasa y/o el gen de glutamato deshidrogenasa incluyen los microorganismos divulgados en las patentes japonesas abiertas a inspeccion publica n° 2001-333769, 2000-106869, 2000-189169, 2000-333769, 2006-129840, el documento WO 2006/051660, etc.
Ademas, tambien puede impartirse capacidad productora de acido L-glutamico potenciando la actividad de 6- fosfogluconato deshidratasa, la actividad de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa o estas dos actividades. Los ejemplos de los microorganismos en los que se aumenta la actividad de 6-fosfogluconato deshidratasa y la actividad de 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa incluyen el microorganismo divulgado en la patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2003-274988.
La modificacion para impartir capacidad productora de acido L-glutamico o para potenciarla tambien puede obtenerse reduciendo o eliminando la actividad de una enzima que cataliza una reaccion que se desvfa de la ruta de biosfntesis de acido L-glutamico y que produce un compuesto diferente al acido L-glutamico. Los ejemplos de dicha enzima que cataliza una reaccion que se desvfa de la ruta de biosfnstesis de acido L-glutamico y que produce un compuesto diferente al acido L-glutamico incluyen 2-oxoglutarato deshidrogenasa (a-cetoglutarato deshidrogenasa (sucA)), isocitrato liasa (aceA), fosfato acetiltransferasa (pta), acetato cinasa (ack), acetohidroxi acido sintasa (ilvG), acetolactato sintasa (ilvI), formiato acetiltransferasa (pfI), lactato deshidrogenasa (Idh), glutamato descarboxilasa (gadAB), 1-pirrolin-5-carboxilato deshidrogenasa (putA), etc. Se prefiere
particularmente reducir o eliminar la actividad de 2-oxoglurato deshidrogenasa entre estas enzimas.
Con el fin de reducir o eliminar las actividades de las enzimas mencionadas anteriormente, pueden introducirse mutaciones para reducir o eliminar actividades intracelulares de las enzimas en genes de las enzimas mencionadas anteriormente mediante tratamiento de mutagenesis habitual o una tecnica de ingenierfa genetica. Los ejemplos del tratamiento de mutagenesis incluyen, por ejemplo, procedimientos que utilizan irradiacion con rayos X o rayos ultravioleta, procedimientos que utilizan tratamiento con un mutagen tal como N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina, etc. El sitio del gen en el que se introduce la mutacion puede ser una region codificante que codifica una protefna enzimatica o una region para la expresion reguladora tal como un promotor. Los ejemplos de tecnicas de ingenierfa genetica incluyen procedimientos que utilizan recombinacion genetica, transduccion, fusion de celulas, etc.
La reduccion o la carencia de la actividad intracelular de una enzima diana y el grado de reduccion de la actividad pueden confirmarse midiendo la actividad de la enzima en un extracto celular, o una fraccion purificada del mismo, obtenido a partir de una cepa candidata y comparandola con la de la cepa de tipo silvestre. Por
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ejemplo, la actividad de 2-oxoglutarato deshidrogenasa puede medirse mediante el procedimiento de Reed et al. (L. J. Reed y B. B. Mukherjee, Methods in Enzymology, 13, paginas 55-61 (1969)).
Las bacterias pertenecientes al genero Escherichia que carecen de actividad de 2-oxoglutarato deshidrogenasa o que tienen una actividad de 2-oxoglutarato deshidrogenasa reducida incluyen las cepas siguientes (patentes US n° 5.378.616 y 5.573.945):
E. coli W3110sucA::Kmr
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
La E. coliW3110sucA::Kmr es una cepa obtenida alterando el gen de 2-oxoglutarato deshidrogenasa (gen sucA) de E. coli W3110. Esta cepa carece completamente de a-cetoglutarato deshidrogenasa.
Especfficamente, los ejemplos de bacterias en las que la actividad de 2-oxoglutarato deshidrogenasa esta suprimida o reducida incluyen las cepas siguientes:
Pantoea ananatis AJ13601 (FERM BP-7207, patente europea abierta a inspeccion publica n° 1078989) Pantoea ananatis AJ13356 (FERM BP-6615, patente US n° 6.331.419)
Pantoea ananatis SC17sucA (FERM BP-8646, WO 2005/085419)
Cepa AJ13410 de Klebsiella planticola (FERM BP-6617, patente US n° 6.197.559)
La cepa SC17sucA es una cepa obtenida seleccionando una cepa mutante de produccion de flema reducida (SC17) a partir de la cepa AJ13355, que se aislo de la naturaleza como una cepa que podrfa proliferar en un medio que contiene acido L-glutamico y una fuente de carbono a pH reducido, y alterando el gen de la 2- oxoglutarato deshidrogenasa (sucA) de la cepa mutante. La cepa AJ13601 se obtuvo introduciendo un plasmido RSFCPG que contenfa los genes gltA, ppc y gdhA derivados de Escherichia coli y un plasmido pSTVCB que contenfa el gen gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum en la cepa SC17sucA para obtener la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, y seleccionando una cepa resistente a una concentracion elevada de acido L- glutamico a pH reducido, y una cepa que muestra un elevado grado de proliferacion y una capacidad elevada de produccion de acido L-glutamico a partir de la cepa SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB (patente europea abierta a inspeccion publica n° 0952221). La cepa AJ13356 se obtuvo suprimiendo el gen de la subunidad aKGDH-E1 (sucA) de la cepa AJ13355. Ademas, la capa NP106 descrita en los ejemplos corresponde a la cepa AJ13601 de la que se ha eliminado el plasmido RSFCPG+pSTVCB.
Las cepas de Pantoea ananatis AJ13355 y AJ13356 se depositaron el 19 de febrero de 1998 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (agencia administrativa actualmente independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, depositario del organismo de patentes internacional, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon), con los numeros de deposito FERM P-16644 y FERM P-16645 respectivamente, y se transfirieron del deposito original al deposito internacional en base al Tratado de Budapest el 11 de enero de 1999, y se depositaron con los numeros de registro FERM BP-6644 y FERM BP-6615, respectivamente. A la cepa SC17sucA se le asigno el numero privado AJ417 y se deposito en el National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, depositario del organismo de patentes internacional (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japon, codigo postal: 305-8566) el 26 de febrero de 2004 y se le asigno el numero de registro FERM BP-08646. La cepa de Pantoea ananatis AJ13601 se deposito el 18 de agosto de 1999 en el National Institute of Bioscience and Human Technology of Agency of Industrial Science and Technology (agencia administrativa actualmente independiente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, depositario del organismo de patentes internacional, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon), con el numero de deposito FERM P-17156, y se transfirio del deposito original al deposito internacional en base al Tratado de Budapest el 6 de julio del 2000, y se deposito con el numero de registro FERM BP-7207.
Las cepas de Pantoea ananatis AJ13355, AJ13356 y AJ13601 y la cepa de Klebsiella planticola AJ13399 mencionadas anteriormente tienen una capacidad de acumulacion de acido L-glutamico en una cantidad que excede la cantidad que proporciona la concentracion de saturacion de acido L-glutamico en un medio lfquido cuando se cultivan en condiciones acidas.
Ademas, con el fin de mejorar la capacidad productora de acido L-glutamico de bacterias Enterobacteriaceae, tambien puede utilizarse el procedimiento de eliminacion del gen arcA (patente US n° 7.090.998), y el procedimiento de amplificacion del gen yhfK, que es un gen de secrecion de acido glutamico (documento WO 2005/085419).
El procedimiento mencionado anteriormente de potenciacion o de eliminacion de la actividad de la enzima se puede aplicar de forma similar a bacterias productoras de otros aminoacidos descritas mas adelante.
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Industrial Microorganisms (VKP) (Rusia, 117545 Moscu, 1 Dorozhny proezd. 1) el 7 de abril de 1987, con el numero de registro VKPM B-3996.
Tambien puede usarse la cepa de E. coli VKPM B-5318 (publicacion de patente europea n° 0593792) como cepa progenitora para derivar bacterias productoras de L-treonina de la presente invencion. La cepa B-5318 es prototrofica con respecto a la isoleucina, y un represor C1 de fago A sensible a la temperatura y promotor PR reemplaza la region reguladora del operon de treonina en el plasmido pVIC40. La cepa VKPM B-5318 se deposito en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) el 3 de mayo de 1990 con el numero de registro VKPM 3-5318.
Preferentemente, la bacteria de la presente invencion se modifica adicionalmente para potenciar la expresion de uno o mas de los genes siguientes:
- gen thrA mutante que codifica la aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a la inhibicion por retroalimentacion mediante treonina;
- gen thrB que codifica homoserina cinasa;
- el gen thrC que codifica treonina sintasa;
- el gen rhtP que codifica una protefna transmembranal putativa;
- el gen asd que codifica aspartato-P-semialdehfdo deshidrogenasa; y
- el gen aspC que codifica aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa).
El gen thrA que codifica aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I de Escherichia coli se ha elucidado (posiciones de nucleotidos 337 a 2799, n° de registro de GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrA se ubica entre los genes thrL y thrB en el cromosoma de E. coli K-12. El gen thrB que codifica homoserina cinasa de Escherichia coli se ha elucidado (posiciones de nucleotidos 2801 a 3733, n° de registro de GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrB se localiza entre los genes thrA y thrC en el cromosoma de E. coli K- 12. El gen thrC que codifica treonina sintasa de Escherichia coli se ha elucidado (posiciones de nucleotidos 3734 a 5020, n° de registro de GenBank NC_000913.2, gi: 49175990). El gen thrC se localiza entre el gen thrB y el marco de lectura abierto yaaX en el cromosoma de E. coli K-12. Los tres genes funcionan como un unico operon de treonina. Para potenciar la expresion del operon de treonina, la region atenuante que afecta a la transcripcion, de forma deseable, se elimina del operon (documentos WO 2005/049808, WO 2003/097839).
Un gen thrA mutante que codifica aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a inhibicion por retroalimentacion mediante treonina, asf como los genes thrB y thrC, puede obtenerse como un operon a partir del plasmido pVIC40 bien conocido, que esta presente en la cepa de E. coli productora de treonina VKPM B- 3996. El plasmido pVIC40 se describe en detalle en la patente US n° 5.705.371.
El gen rhtA existe a 18 min en el cromosoma de E. coli cercano al operon glnHPQ, que codifica componentes del sistema de transporte de glutamina. El gen rhtA es identico al ORF1 (gen ybiF, posiciones de nucleotidos 764 a 1651, numero de registro de GenBank AAA218541, gi: 440181) y se ubica entre los genes pexB y ompX. La unidad que expresa una protefna codifica por el ORF1 se ha designado el gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina). Es decir, se ha revelado que la mutacion rhtA23 es una sustitucion de A por G en la posicion 1 con respecto al codon de inicio ATG (RESUMENES del 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology en combinacion con el Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, 24-29 de agosto de 1997, resumen n° 457, patente europea abierta a inspeccion publica n° 1013765).
El gen asd de E. coli se ha elucidad ya (posiciones de nucleotidos 3572511 a 3571408, n° de registro de GenBank NC_000913.1, gi: 16131307), y puede obtenerse por PCR (reaccion en cadena de la polimerasa; remftase a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando cebadores preparados basados en la secuencia de nucleotidos del gen. Los genes asd de otros microorganismos pueden obtenerse de una forma similar.
Por lo tanto, el gen aspC de E. coli se ha elucidado ya (posiciones de nucleotidos 983742 a 984932, n° de registro de GenBank Nc_000913.1, gi: 16128895), y puede obtenerse por PCR. Los genes aspC de otros microorganismos pueden obtenerse de una forma similar.
Bacterias productoras de L-lisina
Los ejemplos de bacterias productoras de L-lisina pertenecientes al genero Eschericha incluyen mutantes que
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tienen resistencia a un analogo de L-lisina. El analogo de L-lisina inhibe el crecimiento de bacterias pertenecientes al genero Escherichia, pero esta inhibicion esta totalmente o parcialmente desensibilizada cuando coexiste L-lisina en un medio. Los ejemplos del analogo de L-lisina incluyen, pero sin limitacion, oxalisina, hidroxamato de lisina, S-(2-aminoetil)-L-cistefna (AEC), g-metil-lisina, a-clorocaprolactama, etc. Pueden obtenerse mutantes que tienen resistencia a estos analogos de lisina sometiendo bacterias pertenecientes al genero Escherichia a un tratamiento de mutagenesis artificial convencional. Los ejemplos especfficos de cepas baterianas utiles para la produccion de L-lisina incluyen Escherichia coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B- 12185; vease la patente US n° 4.346.170) y Escherichia coli VL611. En estos microorganismos, la inhibicion por retroalimentacion de aspartocinasa mediante L-lisina esta desensibilizada.
La cepa WC196 puede usarse como una bacteria productora de L-lisina de Escherichia coli. Esta cepa bacteriana se ha cultivado confiriendola resistencia AEC a la cepa W3110, que se derivo de K-12 de Escherichia coli. La cepa resultante se denomino cepa AJ13069 de Escherichia coli y se deposito en el National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology (actualmente National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, depositario del organismo de patentes internacional, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chorne, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japon) el 6 de diciembre de 1994 y recibio el numero de registro FERM P-14690. Despues, el deposito se convirtio en un deposito internacional bajo las disposiciones del Tratado de Budapest del 29 de septiembre de 1995, y recibio el numero de registro FERM BP- 5252 (patente US n° 5.827.698).
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-lisina de la presente invencion tambien incluyen cepas en las que la expresion de uno o mas genes que codifican una enzima biosintetica de L- lisina esta potenciada. Los ejemplos de dichos genes incluyen, pero sin limitacion, genes que codifican dihidrodipicolinato sintasa (dapA), aspartocinasa (lysC), dihidrodipicolinato reductasa (dapB), diaminopimelato descarboxilasa (lysA), diaminopimelato deshidrogenasa (ddh) (patente US n° 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc), aspartato semialdehfdo deshidrogenasa (asd) y aspartasa (aspA) (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1253195). Ademas, las cepas progenitoras pueden tener un nivel aumentado de expresion del gen implicado en eficiencia energetica (cyo) (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1170376), el gen que codifica nicotinamida nucleotido transhidrogenasa (pntAB) (patente US n° 5.830.716), el gen ybjE (documento WO 2005/073390) o combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-lisina de la presente invencion tambien incluyen cepas que tienen una actividad reducida o suprimida de una enzima que cataliza una reaccion para generar un compuesto diferente a la L-lisina desviandose de la ruta biosintetica de la L-lisina. Los ejemplos de enzimas que catalizan una reaccion para generar un compuesto diferente a la L-lisina desviandose de la ruta biosintetica de la L-lisina incluyen homoserina deshidrogenasa, lisina descarboxilasa (patente US n° 5.827.698) y la enzima malica (documento WO 2005/010175).
Bacterias productoras de L-cistefna
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-cistefna de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas pertenecientes al genero Escherichia, tales como E. coli JM15, que esta transformada con diferentes alelos cysE que codifican serina acetiltransferasas resistentes a retroalimentacion (patente US n° 6.218.168, solicitud de patente rusa n° 2003121601); E. coli W3110 que tiene genes sobreexpresados que codifican protefnas adecuadas para segregar sustancias toxicas para las celulas (patente US n° 5.972.663); cepas de E. coli que tienen actividad de cistefna desulfhidrasa (documento JP11155571A2); E. coli W3110 con actividad aumentada de un regulador transcripcional positivo para regulon de cistefna codificado por el gen cysB (documento WO 0127307A1) y similares.
Bacterias productoras de L-leucina
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-leucina de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas pertenecientes al genero Escherichia, tales como cepas de E. coli resistentes a leucina (por ejemplo, la cepa 57 (VKPM B-7386, patente US n° 6.124.121)) o analogos de leucina que incluyen b-2-tienilalanina, 3-hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina (publicacion de patente japonesa n° 6234397 y patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 8-70879); cepas de E. coli obtenidas mediante el procedimiento de ingenierfa genetica descrito en el documento WO 96/06926; E. coli H-9068 (patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 8-70879) y similares.
La bacteria de la presente invencion puede mejorarse potenciando la expresion de uno o mas genes implicados en la biosfntesis de L-leucina. Los ejemplos de dichos genes incluyen el operon leuABCD, del que es un ejemplo tfpico preferido un gen leuA mutante que codifica isopropilmalato sintasa desensibilizado a la inhibicion por retroalimentacion mediante L-leucina (patente US n° 6.403.342). Ademas, la bacteria de la presente invencion puede mejorarse potenciando la expresion de uno o mas genes que codifican protefnas que excretan L- aminoacidos a partir de la celula bacteriana. Los ejemplos de dichos genes incluyen los genes b2682 y b2683 (genes ygaZH) (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1239041 A2).
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Bacterias productoras de L-histidina
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-histidina de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas que pertenecen al genero Escherichia, tales como la cepa 24 de E. coli (VKPM B-5945, RU2003677); la cepa 80 de E. coli (VKPM B-7270, RU2119536); E. coli NRRL B-12116 - B12121 (patente US n° 4.388.405); E. coli H-9342 (FERM BP-6675) y H-9343 (FERM BP-6676) (patente US n° 6.344.347); E. coli H-9341 (FERN BP-6674) (patente europea n° 1085087); E. coli AI80/pFN201 (patente US n° 6.258.554) y similares.
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-histidina de la presente invencion tambien incluyen cepas en las que la expresion de uno o mas genes que codifican una enzima biosintetica de L- histidina esta potenciada. Los ejemplos de dichos genes incluyen genes que codifican ATP fosforribosiltransferasa (hisG), fosforribosil AMP ciclohidrolasa (hisI), fosforibosil-ATP pirofosfohidrolasa (hisIE), fosforibosilformimino-5-aminoimidazolo carboxamida ribotido isomerasa (hisA), amidotransferasa (hisH), histidinol fosfato aminotransferasa (hisC), histidinol fosfatasa (hisB), histidinol deshidrogenasa (hisD), etc.
Es conocido que las enzimas biosinteticas de L-histidina codificadas por hisG y bisBHAFI estan inhibidas por L- histidina, y por lo tanto tambien puede potenciarse eficazmente la capacidad productora de L-histidina introduciendo una mutacion que confiera resistencia a la inhibicion por retroalimentacion en el gen de ATP fosforribosiltransferasa (hisG) (patentes rusas n° 2003677 y n° 2119536).
Los ejemplos especfficos de cepas que tienen capacidad productora de L-histidina incluyen E. coli FERM P-5038 y 5048, a las que se ha introducido un vector que porta un ADN que codifica una enzima biosintetica de L- histidina (patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 56-005099), cepas de E. coli a las que se ha introducido rht, un gen para exportar aminoacidos (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1016710), la cepa 80 de E. coli impartida con sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina, y resistencia a estreptomicina (VKPM B-7270, patente rusa n° 2119536), etc.
Bacterias productoras de L-fenilalanina
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-fenilalanina de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas que pertenecen al gener Escherichia, tales como E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197); E. coli HW1089 (ATCC 55371) que aloja un gen pheA34 mutante (patente US n° 5.354.672); E. coli MWEC101-b (KR8903681); E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 y NRRL B- 12147 (patente US n° 4.407.952). Tambien, como cepa progenitora, puede utilizarse E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662) y E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] denominada AJ12604 (FerM BP-3579) (publicacion de patente europea n° 488424 B1). Ademas, tambien pueden utilizarse bacterias productoras de L-fenilalanina del genero Escherichia con una actividad potenciada de la protefna codificada por el gen yedA o el gen yddG (publicaciones de solicitudes de patente US n° 2003/0148473 A1 y 2003/0157 667 A1, respectivamente).
Bacterias productoras de L-triptofano
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar las bacterias productoras de L-triptofano de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas pertenecientes al genero Escherichia, tales como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) y JP6015/pMU91 (DSM10123) que carecen de triptofanil-ARNt sintetasa codificada por el gen trpS mutante (patente Us n° 5.756:345); E. coli SV164 (pGH5) que tiene un alelo serA que codifica fosfoglicerato deshidrogenasa que carece de inhibicion por retroalimentacion mediante serina y un alelo trpE que codifica antranilato sintasa que carece de inhibicion por retroalimentacion mediante triptofano (patente US n° 6.180.373); E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263) y AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) que carecen de la enzima triptofanasa (patente US n° 4.371.614); E. coli AGX17/pGX50, pACKG4-pps en la que la capacidad de produccion de fosfoenolpiruvato esta potenciada (documento WO 97/08333, patente US n° 6.319.696) y similares. Tambien pueden utilizarse bacterias productoras de L-triptofano del genero Escherichia con una actividad potenciada de la protefna codificada por el gen yedA o el gen yddG (publicaciones de solicitudes de patente europeas n° 2003/0148473 A1 y 2003/0157667 A1).
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar las bacterias productoras de L-triptofano de la presente invencion tambien incluyen cepas en las que estan potenciadas una o mas actividades de enzimas seleccionadas de antranilato sintasa (trpE), fosfoglicerato deshidrogenasa (serA) y triptofano sintasa (trpAB). La antranilato sintasa y la fosfoglicerato deshidrogenasa estan ambas sometidas a inhibicion por retroalimenacion mediante L-triptofano y L-serina y, por lo tanto, puede introducirse en estas enzimas una mutacion desensibilizadora de la inhibicion por retroalimentacion. Los ejemplos especfficos de cepas que tienen dicha mutacion incluyen E. coli SV164, que aloja antranilato sintasa desensibilizada, y una cepa transformante obtenida mediante introduccion, en la E. coli SV164, del plasmido pGH5 (documento WO 94/08031), que
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contiene un gen serA mutante que codifica fosfoglicerato deshidrogenasa desensibilizada de inhibicion por retroalimentacion.
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar las bacterias productoras de L-tripfofano de la presente invencion tambien incluyen cepas en la que se ha introducido el operon de triptofano que contiene un gen que codifica antranilato sintasa desensibilizada (patentes japonesas abiertas a inspeccion publica n° 57-71397, 62244382, patente US n° 4.371.614). Ademas, puede impartirse capacidad productora de L-triptofano potenciando la expresion de un gen que codifica triptofano sintasa, entre operones de triptofano (trpBA). La triptofano sintasa consiste en subunidades a y b que estan codificadas por los genes trpA y trpB, respectivamente. Ademas, la capacidad productora de L-triptofano puede mejorarse potenciando la expresion del operon de isocitrato liasa- malato sintasa (documento WO 2005/103275)
Bacterias productoras de L-prolina
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-prolina de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas que pertenecen al genero Escherichia, tales como E. coli 702ilvA (VKPM B- 8012) que carece del gen ilvA y es capaz de producir L-prolina (patente europea n° 1172433).
La bacteria de la presente invencion puede mejorarse potenciando la expresion de uno o mas genes implicados en la biosfntesis de L-prolina. Los ejemplos de dichos genes para bacterias productoras de L-prolina que son preferidos incluyen el gen proB que codifica glutamato cinasa del que esta desensibilizada la inhibicion por retroalimentacion mediante L-prolina (patente alemana n° 3127361) . Ademas, la bacteria de la presente invencion puede mejorarse potenciando la expresion de uno o mas genes que codifican protefnas que excretan L-aminoacidos a partir de la celula bacteriana. Los ejemplos de dichos genes incluyen los genes b2682 y b2683 (genes ygaZH) (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1239041 A2).
Los ejemplos de bacterias pertenecientes al genero Escherichia que tienen actividad productora de L-prolina incluyen las cepas de E. coli siguientes: NRRL 3-12403 y NRRL B-12404 (patente britanica n° 2075056), VKPM B-8012 (solicitud de patente rusa n° 2000124295), mutantes de plasmidos descritos en la patente alemana n° 3127361, mutantes de plasmidos descritos por Bloom F.R. et al (El 15° simposio de invierno de Miami, 1983, pagina 34) y similares.
Bacterias productoras de L-arginina
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-arginina de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas pertenecientes al genero Escherichia, tales como la cepa 237 de E. coli (VKPM B-7925) (publicacion de solicitud de patente US n° 2002/058315 A1) y sus cepas derivadas que alojan N- acetilglutamato sintasa mutante (solicitud de patente rusa n° 2001112869), la cepa 382 de E. coli (vKpM B-7926) (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1170358A1), una cepa productora de arginina en la que se ha introducido el gen argA que codifica N-acetilglutamato sintetasa (patente europea abierta a inspeccion publica n° 1170361A1) y similares.
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-arginina de la presente invencion tambien incluyen cepas en las que la expresion de uno o mas genes que codifican una enzima biosintetica de L- arginina esta potenciada. Los ejemplos de dichos genes incluyen genes que codifican N-acetilglutamil fosfato reductasa (argC), ornitina acetil transferasa (argJ), N-acetilglutamato cinasa (argB), acetilornitina transaminasa (argD), ornitina carbamoil transferasa (argF), acido argininosuccfnico sintetasa (argG), acido argininosuccfnico liasa (argH) y carbamoil fosfato sintetasa (carAB).
Bacterias productoras de L-valina
Los ejemplos de cepas progenitoras para derivar bacterias productoras de L-valina de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cepas que se han modificado para que sobreexpresen el operon ilvGMEDA (patente US n° 5.998.178). Es deseable eliminar la region del operon ilvGMEDA.
<1-2> Aumento del sistema kdp
Los microorganismos de la presente invencion pueden obtenerse modificando el microorganismo de Pantoea ananatis que tiene una capacidad productora de L-aminoacidos tal como se ha descrito anteriormente de forma que se aumente el sistema kdp. No obstante, despues de modificar un microorganismo de modo que se aumente el sistema kdp, puede impartirse capacidad productora de L-aminoacidos al microorganismo.
El sistema kdp puede potenciarse mediante una modificacion que aumente la expresion del operon kdp o uno o mas genes que constituyen el operon kdp, y dicho aumento de la expresion puede basarse en la potenciacion de la expresion de un gen endogeno mediante modificacion de una region de control de la expresion tal como una modificacion de un promotor o similar, o la potenciacion de la expresion de un gen exogeno mediante
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introduccion de un plasmido que contenga el operon o cualquiera de los genes. Estos procedimientos pueden realizarse de forma combinada. El sistema kdp tambien puede potenciarse aumentando la traduccion del operon kdp o cualquiera de los genes que codifican el operon kdp.
En la presente invencion, el "sistema kdp" significa una ATPasa de tipo P (ATPasa de tipo P transportadora de potasio) que actua sobre el sistema de transporte de potasio de alta afinidad (EC 3.6.3.12).
El estado de "estar modificado de forma que el sistema kdp este potenciado” significa un estado en el que el transporte de potasio mencionado anteriormente por la ATPasa de tipo P esta potenciado, mas especfficamente un estado en el que el microorganismo esta modificado de forma que la actividad de ATPasa de tipo P del mismo esta potenciada. Dicho estado corresponde a, por ejemplo, un estado en el que el numero de moleculas de la protefna ATPasa de tipo P por celula esta aumentado en comparacion con el de la cepa progenitora o una cepa silvestre, o un estado en el que la actividad de ATPasa de tipo P por molecula esta aumentada en comparacion con la de la cepa progenitora o una cepa silvestre. La modificacion se realiza preferentemente de forma que la actividad de ATPasa de tipo P por celula este aumentada el 150% por ciento o mas, preferentemente el 200% o mas, de forma mas preferida el 300% o mas, con respecto a la actividad de la cepa progenitora o una cepa silvestre. El microorganismo de tipo silvestre de Pantoea ananatis utilizado como referencia para la comparacion es, por ejemplo, Pantoea ananatis AJ13355 (FERM BP-6615).
El aumento de la expresion del operon kdp puede confirmarse mediante comparacion de la cantidad de ARNm del mismo con la de la cepa de tipo silvestre o no modificada. Los ejemplos del procedimiento para confirmar la expresion incluyen hibridacion Northern y RT-PCR (Molecular CLoning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Estados Unidos, 2001). El grado del aumento de la expresion no esta particularmente
limitado siempre que aumente en comparacion con la de la cepa silvestre o la cepa no modificada. No obstante,
es deseable un aumento, por ejemplo, de 1,5 veces o mas, preferentemente de 2 veces o mas, de forma mas preferida de 3 veces o mas, en comparacion con la de una cepa silvestre o una cepa no modificada.
La actividad de ATPasa de tipo P puede medirse, por ejemplo, extrayendo el sistema kdp de un microorganismo que lo tenga, purificandolo (remftase a Siebers, A. et al., Eur. J. Biochem., 178, 131 (1988)) y midiendo la actividad de ATPasa de tipo P del sistema de kdp purificado (remftase a Arnold, A. et al., Anal. Biochem., 71, 209 (1976)).
El sistema kdp consiste en tres subunidades codificadas por el operon kdp, y como para E. coli, se proporcionan los siguientes comentarios con respecto a los genes de las subunidades:
kdpA: ATPasa de sistema de transporte de potasio de alta afinidad, cadena A
kdpB: ATPasa de sistema de transporte de potasio de alta afinidad, cadena B
kdpC: ATPasa de tipo P de sistema de transporte de potasio de alta afinidad, cadena C
El "operon kdp" se refiere en la presente invencion a un complejo genico que codifica las subunidades A, B y C de la ATPasa de tipo P descrita anteriormetne, en la que la subunidad A esta codificada por el gen kdpA, la subunidad B esta codificada por el gen kdpB y la subunidad C esta codificada por el gen kdpC. En la presente invencion, el operon kdp puede contener un gen diferente a los genes kdpA, kdpB y kdpC.
La secuencia de nucleotidos del operon kdp de Escherichia coli se muestra en la SEC ID n° 1. Este operon contiene los seis genes siguientes, y las regiones codificantes (incluido el codon de detencion) de los genes en la SEC ID n° 1 son las siguientes. Las secuencias de aminoacidos condificados por kdpA, kdpB, kdpC, kdpD y kdpE se muestran en las SEC ID n° 2 a n° 6, respectivamente.
kdpF: 457 a 546 kdpA: 546 a 2219 kdpB: 2242 a 4290 kdpC: 4299 a 4871 kdpD: 4864 a 7548 kdpE: 7545 a 8222
La secuencia de nucleotidos del operon kdp de Pantoea ananatis se muestra en la SEC ID n° 7. Este operon contiene los cuatro genes siguientes, y las regiones codificantes (incluido el codon de detencion) de los genes en la SEC ID n° 7 son las siguientes. Las secuencias de aminoacidos condificados por kdpA, kdpB, kdpC y kdpD se muestran en las SEC ID n° 8 a n° 11, respectivamente.
kdpA: 543 a 2225 kdpB: 2228 a 4273 kdpC: 4284 a 4853 kdpD: 4867 a 7542
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Ademas, la secuencia de nucleotidos del gen kdpE de Pantoea ananatis y la secuencia de aminoacidos codificada por este gen se muestra en las SEC ID n° 12 y n° 13, respectivamente.
En la presente memoria descriptiva, las protefnas codificadas por kdpA, kdpB, kdpC, kdpD y kdpE pueden indicarse como KdpA, KdpB, KdpC, KdpD y KdpE, respectivamente.
Los alineamientos de las secuencias de aminoacidos de KdpA, KdpB y KdpC de Pantoea ananatis y Escherichia coli se muestran en las figuras 6 a 8. Las secuencias de consenso de las secuencias de Pantoea ananatis y Escherichia coli se muestran en las filas inferiores de los alineamientos. Ademas, las secuencias de consenso de KdpA, KdpB y KdpC se muestran en las SEC ID n° 57 a n° 59, respectivamente.
Las homologfas de KdpA, KdpB y KdpC de Pantoea ananatis y Escherichia coli son el 75,36%, el 81,35% y el 59,57%, respectivamente.
Como para bacterias de Escherichia, el gen kdpA esta registrado en el GenBank NP_415226.1 Reports potassium-transpo...To {gi: 16128674], el gen kdpB en NP_415225. Reports potassium-transpo . . . [gi: 16128673], el gen kdpC en NP_415224. Reports potassium-transpo .. . [gi: 16128672], el gen kdpD en NP_415223. Reports fused sensory his. [gi: 16128671j, y el gen kdpE en Np_415222. Reports DNA-binding respo ... [gi: 16128670].
Ademas, el operon kdp puede ser uno clonado utilizando un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae tal como bacterias de Escherichia, Pantoea, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Erwinia y Yersinia en base a homologfas a los genes ejemplificados anteriormente.
Como el operon kdp que se puede utilizar para la presente invencion, el operon kdp y las regiones flanqueantes del mismo que incluyen una region de control de la expresion ubicada corriente arriba a partir del operon pueden obtenerse por PCR (reaccion en cadena la polimerasa, remftase a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) utilizando cebadores preparados en base a una secuencia de nucleotidos ya elucidada de un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae y ADN cromosomico de un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae como plantilla. Tambien pueden obtenerse homologos del operon kdpA de otros microorganismos de una forma similar.
Un homologo de operon kdp significa un gen que codifica una ATPasa de tipo P, que incorpora iones potasio, derivado de otro microorganismo y que muestra una homologfa alta con el operon kdp de Escherichia coli o Pantoea ananatis. Con el gen kdpA, el gen kdpB y el gen kdpC derivados de otro microorganismo se quiere decir aquellos que muestran homologfas del 80% o superiores, preferentemente del 90% o superiores, de forma mas preferida del 95% o superiores, en particular del 97% o superiores, con las secuencias de aminoacidos totales de las SEC ID n° 2, n° 3, n° 4, n° 8, n° 9 y n° 10 y que codifican las subunidades constituyentes de una protefna que tiene actividad de ATPasa de tipo P.
Cada uno de los genes puede codificar variantes conservativas que tienen secuencias de aminoacidos de las SEC ID n° 2, n° 3, n° 4, n° 8, n° 9 o n° 10 que incluyen sustituciones, supresiones, inserciones o adiciones de uno o mas restos de aminoacidos en una o varias posiciones, siempre que la actividad de la ATPasa de tipo P constituida por estas subunidades no se vea degradada. Aunque el numero que designa el termino “varias” puede diferir en funcion de la posicion en la estructura tridimensional de tipos de restos de aminoacidos de las protefnas, es de 2 a 20, preferentemente de 2 a 10, de forma particularmente preferida de 2 a 5. Las sustituciones, las supresiones, las inserciones, las adiciones, las inversiones y similares de los aminoacidos descritos anteriormente incluyen las causadas por mutaciones de origen natural en funcion de diferencias individuales o diferencias en especies de los microorganismos.
Estas sustituciones son preferentemente sustituciones conservativas que son mutaciones neutras que proporcionan un cambio no funcional. Una mutacion conservativa es una mutacion en la que la sustitucion tiene lugar mutuamente entre Phe, Trp, Tyr, si el sitio de sustitucion es un aminoacido aromatico; entre Leu, Ile, Val, si el sitio de sustitucion es un aminoacido hidrofobo; entre Gln, Asn, si es un aminoacido polar; entre Lys, Arg, His, si es un aminoacido basico; entre Asp y Glu, si es un aminoacido acido; y entre Ser y Thr, si es un aminoacido que tiene un grupo hidroxilo. Los ejemplos especfficos de sustituciones conservativas incluyen: sustitucion de Ser o Thr por Ala; sustitucion de Gln, His o Lys por Arg; sustitucion de Glu, Gln, Lys, His o Asp por Asn; sustitucion de Asn, Glu o Gln por Asp; sustitucion de Ser o Ala por Cys; sustitucion de Asn, Glu, Lys, His, Asp o Arg por Gln; sustitucion de Gly, Asn, Gln, Lys o Asp por Glu; sustitucion de Pro por Gly; sustitucion de Asn, Lys, Gln, Arg o Tyr por His; sustitucion de Leu, Met, Val o Phe por Ile; sustitucion de Ile, Met, Val o Phe por Leu; sustitucion de Asn, Glu, Gln, His o Arg por Lys; sustitucion de Ile, Leu, Val o Phe por Met; sustitucion de Trp, Tyr, Met, Ile o Leu por Phe; sustitucion de Thr o Ala por Ser; sustitucion de Ser o Ala por Thr; sustitucion de Phe o Tyr por Trp; sustitucion de His, Phe o Trp por Tyr; y sustitucion de Met, Ile o Leu por Val.
Ademas, tambien puede utilizarse el operon kdp que utiliza codones que pueden utilizarse facilmente en un microorganismo huesped elegido en el que el gen esta introducido, dado que la degeneracion del gen varfa en
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funcion del microorganismo huesped. De forma similar, siempre que la produccion de L-aminoacidos pueda mejorarse mediante amplificacion del operon kdp, el operon kdp puede alargarse o acortarse en cualquiera de los extremos N-terminal y/o C-terminal de cada subunidad codificada por el operon en, por ejemplo, 50 o menos, preferentemente 20 o menos, de forma mas preferida 10 o menos, de forma particularmente preferida 5 o menos, del numero de restos de aminoacidos. Mas especfficamente, cada subunidad puede tener una secuencia de aminoacidos que esta acortada de 5 a 50 restos de aminoacido en el extremo N-terminal y/o el extremo C- terminal de la secuencia de aminoacidos de las SEC ID n° 2, n° 3, n° 4, n° 8, n° 9 o n° 10.
Ademas, el operon kdp puede ser un ADN que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleotidos mostrada en la SEC ID n° 1 o n° 7, o una secuencia complementaria a cada una de las regiones codificantes de la secuencia de nucleotidos de la SEC ID n° 1 o n° 7, o una sonda que puede preparar a partir de estas secuencias, y que codifica el sistema kdp, es decir, la protefna que tiene actividad de ATPasa de tipo P para incorporar iones potasio.
Las “condiciones rigurosas” a las que se refiere el presente documento significan condiciones en las que se forma un denominado hfbrido especffico y no se forma un hfbrido no especffico. Es diffcil definir claramente las condiciones con valores numericos, pero ejemplos de las mismas incluyen condiciones en las que los ADN que tienen alta homologfa, por ejemplo, una homologfa del 70% o superior, preferentemente del 80% o superior, de forma mas preferida del 90% o superior, de forma aun mas preferida del 95% o superior, de forma particularmente preferida del 97% o superior, se hibridan entre si y los ADN que tienen una homologfa inferior al valor no se hibridan entre si; y especfficamente incluyen condiciones correspondientes a la concentracion de sal y a la temperatura de condiciones de lavado en hibridazion Southern tfpica, por ejemplo, 1xSSC, 0,1% de SDS, preferentemente 0,1xSSC, 0,1% de SDS, a 60 °C.
La sonda puede ser una sonda que tiene una secuencia parcial del operon kdp. Dicha sonda puede prepararse por PCR utilizando oligonucleotidos preparados en base a la secuencia de nucleotidos del gen segun un procedimiento bien conocido por un experto en la materia como cebadores, y un fragmento de ADN que contienen el gen como plantilla. Cuando un fragmento de ADN de una longitud de aproximadamente 300 pb se utiliza como sonda, el lavado despues de la hibridacion en las condiciones mencionadas anteriormente puede ser, por ejemplo, un lavado de una, dos o tres veces en las condiciones de 50 °C, 2xSSC y 0,1% de SDS.
Dicho homologo genico al operon kdp puede obtenerse mediante, por ejemplo, modificacion de la region codificante en la secuencia de nucleotidos de la SEC ID n° 1 o n° 7 mediante mutagenesis especffica del sitio de modo que la protefna codificada contenga sustituciones, supresiones, inserciones o adiciones de restos de aminoacidos de un sitio especffico. Dicho gen tambien puede obtenerse mediante la mutagenesis conocida convencionalmente siguiente. Como para la mutagenesis, puede obtenerse un operon que codifica un sistema kdp muy activo introduciendo artificialmente una mutacion en el operon kdp tratando la secuencias de nucleotidos de la SEC ID n° 1 o n° 7, o una region codificante en estas secuencias de nucleotidos in vitro con hidroxilamina o similares, o tratando un microorganismo que tiene el gen, por ejemplo, un microorganismo de este tipo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, con radiacion ultravioleta o un mutagen utilizado para mutagenesis habitual tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) o metanosulfonato de etilo (EMS), mediante recombinacion genica basada en PCR propensa a error (Cadwell, R.C., PCR Meth. Appl., 2, 28 (1992)), barajado de ADN (Stemmer, W.P., Nature, 370, 389 (1994)), o StEP-PCR (Zhao, H., Nature Biotechnol., 16, 258 (1998)). Puede confirmarse si un homologo del operon kdp codifica la ATPasa de tipo P, por ejemplo, introduciendo el gen en un microorganismo que pertenece a la familia Enterobacteriaceae y que tiene capacidad productora de L-aminoacido y determinando si la capacidad productora de L-aminoacido se mejora o midiendo la actividad de ATPasa de tipo P mediante el procedimiento mencionado anteriormente.
Las descripciones anteriores relativas a variantes y homologos tambien se aplican al gen kdpD y al gen kdpE que se describen mas adelante.
Dicha modificacion de un microorganismo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae en el que se aumenta la expresion del operon kdp o uno o mas genes que constituyen el operon puede lograrse mediante el procedimiento mencionado anteriormente o modificando una bacteria de forma que se potencie la expresion de un gen diana. Es decir, aumentando el numero de copias del operon kdp o cada uno de los genes que constituyen el operon que se va a expresar, y/o reemplazando la secuencia de control de la expresion del operon por una secuencia de control de la expresion mas fuerte, o controlando cada uno de los genes que constituyen el operon por una secuencia de control de la expresion mas fuerte, puede potenciarse la expresion del operon o de cada uno de los genes. Aunque la potenciacion de la expresion de los genes que constituyen el operon kdp puede realizarse para el operon completo o para cada uno de los genes, la potenciacion se realiza preferentemente para el operon completo. Cuando se potencia la expresion para cada gen individual, el gen que se va a potenciar puede ser uno cualquiera de los genes que constituyen el operon kdp, pero se prefiere potenciar la expresion de por lo menos uno o mas tipos de genes entre los genes kdpA, kdpB y kdpC, de forma mas preferida todos los genes kdpA, kdpB y kdpC.
El sistema kdp tambien puede potenciarse modificando una secuencia de espaciador entre el sitio de union a
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ribosoma (RBS) y el codon de inicio de cada uno de los genes de forma que se aumente la traduccion de cada uno de los genes que constituye el operon kdp.
Ademas, se sabe que la expresion del operon kdp se controla mediante el sistema de control binario KdpDE codificado por el gen kdpD y el gen kdpE (J. Bacteriol., abril de 1992, 174 (7): 2152-59), y la expresion del operon kdp tambien puede aumentarse aumentando la expresion del gen kdpD y el gen kdpE.
<2> Procedimiento para producir L-aminoacido de la presente invencion
Cultivando el microorganismo de la presente invencion en un medio para producir y acumular acido L-glutamico en el medio y recogiendo el acido L-glutamico a partir del medio, puede producirse acido L-glutamico.
Como medio utilizado para el cultivo, puede utilizarse un medio habitual que contenga una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno y sales minerales, asf como oligonutrientes organicos tales como aminoacidos y protefnas, segun se requiera. Puede utilizarse tanto un medio sintetico como un medio natural. Puede utilizarse cualesquiera tipos de fuente de carbono y de fuente de nitrogeno, siempre que puedan ser utilizados por la cepa que se va a cultivar.
Pueden utilizarse azucares tales como glucosa, glicerina, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa, galactosa, hidrolizados de almidon y melazas como fuente de carbono. Ademas, tambien pueden utilizarse acidos organicos tales como acido acetico y acido cftrico, y alcoholes tales como etanol cada uno solo o en combinacion con otras fuentes de carbono. Pueden utilizarse amoniaco, sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio y acetato de amonio, sales de acido nftrico, etc., como fuente de nitrogeno. Pueden utilizarse aminoacidos, vitaminas, acidos grasos, acidos nucleicos, aquellos que contienen sustancias tales como peptona, casaminoacido, extracto de levadura y producto de descomposicion de protefna de soja, etc., como oligonutrientes organicos. Cuando se utiliza una cepa mutante auxotrofica que requiere un aminoacido o similar para su crecimiento, se prefiere suplementar el nutriente requerido.
En particular, cuando se utiliza un medio lfquido preparado con el fin de satisfacer unas condiciones para precipitar acido L-glutamico, la adicion de acido pantotenico al medio proporciona una precipitacion mas eficaz de acido L-glutamico (documento WO 2004/111258). Como sales inorganicas se utilizan sales de acido fosforico, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sal de manganeso, etc.
El cultivo se realiza preferentemente como cultivo aerobico, mientras que la temperatura de fermentacion se controla para que sea del 20 al 45 °C y el pH para que sea de 3 a 9. Cuando el pH se reduce durante el cultivo, puede anadirse carbonato de calcio, o el cultivo se neutraliza con una sustancia alcalina tal como amoniaco gaseoso. El L-aminoacido diana se acumula en el medio de cultivo despues de preferentemente 10 a 120 horas de cultivo en las condiciones que se han descrito anteriormente.
Ademas, el cultivo puede realizarse con precipitacion de acido L-glutamico en un medio utilizando, como medio, un medio lfquido ajustado para satisfacer las condiciones en la que se precipita acido L-glutamico. Los ejemplos de las condiciones en las que se precipita acido L-glutamico incluyen, por ejemplo, pH de 5,0 a 4,0, preferentemente de 4,5 a 4,0, de forma mas preferida de 4,3 a 4,0, de forma particularmente preferida de 4,0.
Cuando se precipita acido L-glutamico en el medio, la adicion preliminar de cristales de acido L-glutamico o L- lisina como semillas cristalinas puede proporcionar una cristalizacion mas eficaz (patente europea n° 1 233 069, patente europea abierta a inspeccion publica n° 1 624 069).
La recogida de L-aminoacido a partir del caldo de cultivo despues del cultivo puede realizarse mediante un procedimiento de recogida conocido. Por ejemplo, despues de retirar las celulas del medio de cultivo, puede recogerse L-aminoacido concentrando el medio para que cristalice el L-aminoacido, cromatograffa de intercambio ionico o similares. Cuando el cultivo se realiza en condiciones en las que se precipita el acido L- glutamico, el acido L-glutamico precipitado en el medio puede recogerse mediante centrifugacion o filtracion. En este caso, el acido L-glutamico disuelto en el medio puede precipitarse y despues separarse junto con el acido L- glutamico ya precipitado.
Ejemplos
A continuacion se describira la presente invencion con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos.
Ejemplo de referencia 1: Construccion de cepa de Pantoea ananatis resistente a producto genico de Red de A
Para amplificar el operon kdp en Pantoea ananatis, se construyo una cepa receptora que lleva a cabo el procedimiento denominado "integracion controlada por Red" o "integracion mediada por Red” (Proc, Nati. Acad Sci. Estados Unidos, 97, 6640-6645 (2000)).
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En primer lugar se construyo el plasmido cooperador novedoso RSF-Red-TER que expresa los genes gam, bet y exo de A (en adelante denominados “genes Red de A”) (Fig. 1). Los detalles del mismo se describen en el Ejemplo de referencia 2.
Este plasmido puede utilizarse en una amplia serie de huespedes que tengan diferentes orfgenes geneticos. Esto es debido a que 1) este plasmido tiene el replicon del plasmido de amplio espectro de huespedes RSF1010 (Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987), que puede mantenerse de forma estable por muchos tipos de bacterias gram negativas y gram positivas, e incluso celulas vegetales, 2) los genes Red de A, los genes gam, bet y exo, estan bajo el control del promotor PlacUV5, que es reconocido por las ARN polimerasas de muchos tipos de bacterias (por ejemplo, Brunschwig, E. y Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41 (1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229 (1998)) y 3) el factor de autorregulacion PlacuvslacI y el terminador de la transcripcion no dependiente de p (TrrnB) del operon rrnB de Escherichia coli reducen el nivel de expresion basal de los genes Red de A (Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)). Ademas, el plasmido RSF-Red-TER contiene el gen de levansucrasa (sacB), y utilizando este gen, el plasmido puede recogerse a partir de celulas en un medio que contiene sacarosa.
En Escherichia coli, la frecuencia de integracion de un fragmento de ADN generado por PCR junto con la region flanqueante corta proporcionada por el plasmido RSF-Red-TER es tan elevada como la frecuencia que puede obtenerse utilizando el plasmido cooperador pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)). Sin embargo, la expresion de los genes Red de A es toxica para Pantoea ananatis. Las celulas transformadas con el plasmido cooperador RSF-Red-TER crecen de forma extremadamente lenta en el medio LB que contiene IPTG (isopropil-b-D-tiogalactopiranosido, 1 mM) y un antibiotico apropiado (25 pg/ml de cloranfenicol o 40 pg/ml de kanamicina), y la eficacia de la recombinacion mediada por Red de A es extremadamente lenta (10-8), si es que se observa.
Se selecciono una cepa variante de Pantoea ananatis que es resistente a la expresion de los tres genes Red de A. Para este fin, el plasmido RSF-Red-TER se introdujo en la cepa de Pantoea ananatis SC17 (patente US n° 6.596.517) por electroporacion. Despues de un cultivo de 18 horas, se obtuvieron aproximadamente 106 transformantes, y entre estos, 10 clones formaron colonias de gran tamano y todos los demas formaron colonias extremadamente pequenas. Despues de un cultivo de 18 horas, las colonias grandes tenfan un tamano de aproximadamente 2 mm y las colonias pequenas tenfan un tamano de aproximadamente 0,2 mm. Mientras que las colonias pequenas no crecieron mas incluso cuando se prolongo el cultivo hasta 24 horas adicionales, las colonias grandes continuaron creciendo. Una de las cepas mutantes de Pantoea ananatis y resistente a la expresion de los tres genes Red de A (gam, bet y exo) se utilizo para los analisis posteriores.
El ADN del plasmido RSF-Red-TER se aislo a partir de un clon de los clones de colonias grandes y de varios clones de colonias pequenas y se transformo de nuevo en Escherichia coli MG1655 para examinar la capacidad del plasmido de sintetizar un producto genico de Red activo. Mediante un experimento de control para la integracion dependiente de Red en los transformantes obtenidos, se demostro que solo el plasmido aislado del clon de colonia grande indujo la expresion de los genes de Red de A requerida por la integracion dependiente de Red. Con el fin de investigar si la integracion mediada por Red tiene lugar en el clon de colonia grande seleccionado, se realizo una electroporacion utilizando un fragmento de ADN lineal producido por PCR. El fragmento se diseno de forma que tuviera un marcador KmR y una region flanqueante de 40 pb homologa al gen hisD. Este fragmento se integro en el gen hisD de Pantoea ananatis en el sitio de reconocimiento Smal. Se utilizaron dos clones de colonia pequena como control. La secuencia de nucleotidos del gen hisD de Pantoea ananatis se muestra en la SEC iD n° 14. Para la PCR se utilizaron los oligonucleotidos de las SEC ID n° 15 y n° 16 como cebadores y el plasmido pMW118-(Aatt-Kmr-Aatt) se utilizo como plantilla. Los dos clones de colonia pequena que no eran resistentes a los genes Red de A se utilizaron como control. La construccion del plasmido pMW118-(AattL-Kmr-AattR) se explicara en detalle en el Ejemplo de referencia 3.
El plasmido RSF-Red-TER puede inducir la expresion de los genes Red mediante el gen lacI portado por el plasmido. Se investigaron dos clases de condiciones de induccion. En el primer grupo se anadio IPTG (1 mM) una hora antes de la electroporacion y en el segundo grupo se anadio IPTG al comienzo del cultivo para la preparacion de celulas en las que es posible una electroporacion. La velocidad de crecimiento de las celulas que alojan RSF-Red-TER derivado del clon de colonia grande no fue significativamente inferior a la de una cepa que no tenia el plasmido SC17. La adicion de IPTG solo reduce ligeramente la velocidad de crecimiento de estos cultivos. Por otra parte, la progenie de los clones de colonia pequena crecio de forma extremadamente lenta incluso sin la adicion de IPTG, y despues de la induccion, el crecimiento se detuvo sustancialmente. Despues de la electroporacion de las celulas de la progenie del clon de colonia grande, muchos clones KmR crecieron (18 clones despues de un tiempo de induccion corto, y aproximadamente 100 clones despues de un tiempo de induccion prolongado). Los 100 clones que se investigaron tenfan un fenotipo His- y se confirmo por PCR que aproximadamente 20 clones tenfan la estructura esperada de cromosoma en las celulas. Por otra parte, incluso cuando se realizo una electroporacion con la progenie de los clones de colonia pequena, no se obtuvo una cepa integrada.
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El clon de colonia grande obtenido se cultivo en una placa que contenfa el 7% de sacarosa para eliminar el plasmido, y se transformo de nuevo con RSF-Red-TER. La cepa sin el plasmido se denomino SC17 (0). Esta cepa se deposito en el Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM, GNII Genetica (1 Dorozhny proezd., 1 Moscu 117545, Rusia) el 21 de septiembe de 2005, y se le asigno el numero de registro VKPM B-9246.
Todos los clones que se cultivaron despues de la retransformacion mencionada anteriormente mostraron tamanos de colonia grandes al igual que el clon de la cepa progenitora SC17 (0). El experimento de integracion mediado por Red se realizo en la cepa SC17(0) retransformada con el plasmido RSF-Red-TER. Tres de los transformantes independientes se investigaron utilizando el mismo fragmento de ADN que se uso para el experimento previo. Se utilizo un tiempo de induccion corto (1 hora antes de la electroporacion). Los clones KmR que superaban diez clones crecieron en cada experimento. Todos los clones examinados tenfan el fenotipo His-. De este modo, se selecciono una cepa mutante denominada SC17(0) resistente a la expresion de los genes Red de A. Esta cepa puede utilizarse como una cepa receptora adecuada para la integracion dependiente de Red en el cromosoma de Pantoea ananatis.
Ejemplo de Referenda 2: Construccion del plasmido cooperador RSF-Red-TER
El esquema de construccion del plasmido cooperador RSF-Red-TER se muestra en la Fig. 2.
Como primera etapa de la construccion se diseno un vector RSFsacBPlacMCS. Para este fin se amplificaron por PCR fragmentos de ADN que contenfan el gen cat del plasmido pACYC184 y la region genica estructural del gen sacB de Bacillus subtilis utilizando los oligonucleotidos de las SEC ID n° 17 y n° 18, y n° 19 y n° 20, respectivamente. Estos oligonucleotidos contenfan sitios de enzima de restriccion BglII, SacI, XbaI y BamHI, requeridos y convenientes para la clonacion posterior, en las regiones terminales 5', respectivamente. El fragmento sacB de 1,5 kb obtenido se clono en el vector pMW119-PlaclacI obtenido previamente en el sitio XbaI- BamHI. Este vector se construyo del mismo modo que el descrito para el vector pMW118-PlaclacI (Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya (Rus), 5, 3-21 (2004)). No obstante, este vector contenfa un resto polienlazador derivado de pMW219 en vez de del plasmido pMw218.
Despues, el fragmento cat de 1,0 kb mencionado anteriormente se trato con BglII y SacI, y se clono en el plasmido RSF-PlaclacIsacB obtenido en la etapa anterior en el sitio BamHI-SacI. El plasmido obtenido pMW- PlaclacIsacBcat contenfa el fragmento PlacUV5-lacI-sacB-cat. Con el fin de subclonar este fragmento en el vector RSF1010, se digirio pMW-PlaclacIsacB-cat con BglII, se hizo romo con el fragmento de Klenow de ADN polimerasa I y sucesivamente se digirio con SacI. Se eluyo un fragmento BglII-SacI de 3,8 kb del plasmido pMWPlaclacIsacBcat a partir de gel de agarosa al 1% y se ligo con el vector RSF1010 que se habfa tratado con PstI y SacI. Se transformo Escherichia coli TG1 con la mezcla de ligadura y se plaqueo en medio LB que contenfa cloranfenicol (50 mg/l). Los plasmidos aislados a partir de los clones cultivados se analizaron con enzimas de restriccion para obtener el plasmido RSFsacB. Con el fin de construir un vector RSFsacBPlacMCS se amplifico un fragmento de ADN que contenfa el promotor Placuv5 por PCR utilizando oligonucleotidos de las SEC ID n° 21 y n° 22 como cebadores y el plasmido pMW119PlaclacI como plantilla. El fragmento de 146 pb obtenido se digirio con SacI y NotI y se ligo con el fragmento grande SacI-NotI del plasmido RSFsacB. Despues, por PCR, utilizando los nucleotidos de las SEC ID n° 23 y n° 24 como cebadores y el plasmido pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645 (2000)) como plantilla, se amplifico un fragmento de ADN de 2,3 kb que contenfa los genes RedaPy de A y el terminador de la transcripcion tL3. El fragmento obtenido se clono en el vector RSFsacBPlacMCS en el sitio PvuI-NotI. De este modo se diseno el plasmido RSFRed.
Con el fin de eliminar la lectura a traves de la transcripcion de los genes Red, se inserto un terminador de la transcripcion dependiente de p del operon rrnB de Escherichia coli en la posicion entre el gen cat y el promotor Placuv5. Con este fin se amplifico un fragmento de ADN que contenfa el promotor Placuv5 y el terminador TrrnB por PCR utilizando los oligonucleotidos de las SEC ID n° 25 y n° 22 como cebadores y el cromosoma de Escherichia coli BW3350 como plantilla. Estos fragmentos obtenidos se trataron con KpnI y se ligaron. Despues, el fragmento de 0,5 kb que contenfa tanto Placuv5 como TrrnB se amplifico por PCR utilizando los oligonucleotidos de las SEC ID n° 22 y n° 26 como cebadores. El fragmento de ADN obtenido se digirio con EcoRI, se hizo romo mediante un tratamiento con fragmento Klenow de ADN polimerasa I, se digirio con BamHI y se ligo con el fragmento largo Ecl136II-BamHI del vector RSFsacBPlacMCS. El plasmido obtenido se designo RSF-Red-TER.
Ejemplo de Referencia 3: Construccion del plasmido pMW118-(AattL-Kmr-AattR)
El plasmido pMW118-(AattL-Kmr-AattR) se construyo a partir del plasmido pMW118-attL-Tc-attR (documento WO 2005/010175) reemplazando el gen marcador de resistencia a la tetraciclina por un gen de resistencia a la kanamicina del plasmido pUC4K. Con este fin, el fragmento grande EcoRI-HindIII del plasmido pMW118-attL-Tc- attR se ligo a dos fragmentos del plasmido pUC4K: el fragmento HindIII-PstI (676 pb) y el fragmento EcoRI- HindIII (585 pb). El pMW118-attL-Tc-attR basico se obtuvo mediante ligadura de los cuatro fragmentos siguientes.
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1) El fragmento Bgl\\-EcoR\ (114 pb) que incluye attL (SEC ID n° 29) que se obtuvo mediante amplificacion por PCR de la region correspondiente a attL del cromosoma de Escherichia coli W3350 (que contiene el profago A) utilizando los cebadores P1 y P2 (SEC ID n° 27 y n° 28) (estos cebadores contenfan los sitios de reconocimiento subsidiario para Bgl\ \ y EcoRI).
2) El fragmento Pst\-Hind\\\ (182 pb) que incluye attR (SEC \D n° 32) que se obtuvo mediante amplificacion por PCR de la region correspondiente a attR del cromosoma de Escherichia coli W3350 (que contiene el profago A) utilizando los cebadores P3 y P4 (SEC \D n° 30 y n° 31) (estos cebadores contenfan los sitios de reconocimiento subsidiario para Pst\ y Hind\\\).
3) El fragmento grande Bgl\\-Hind\\\ (3916 pb) de pMW118-ter_rrnB. El plasmido pMW118-ter_rrnB se obtuvo mediante ligadura de los tres fragmentos de ADN siguientes:
- El fragmento de ADN grande (2359 pb) que incluye el fragmento Aat\\-EcoR\ de pMW118 que se obtuvo mediante digestion de pMW118 con EcoR\, tratamiento con fragmento Klenow de ADN polimerasa \ y despues digestion con Aat\\;
- El fragmento pequeno Aat\\-Bgl\\ (1194 pb) de pUC19 que incluye el gen bla para la resistencia a ampilicina (ApR), que se obtuvo mediante amplificacion por PCR de la region correspondiente del plasmido pUC19 utilizando los cebadores P5 y P6 (SEC \D n° 33 y n° 34) (estos cebadores contenfan los sitios de reconocimiento subsidiario para Pst\, Aat\\ y Bgl\\);
- El fragmento Bgl\\-Pstlpol pequeno (363 pb) del terminador de la transcripcion ter_rrnB, que se obtuvo mediante amplificacion por PCR de la region correspondiente del cromosoma de Escherichia coli G1655 utilizando los cebadores P7 y P8 (SEC \D n° 35 y n° 36) (estos cebadores contenfan los sitios de reconocimiento subsidiario para Pst\, Bgl\\ y Pst\).
4) El fragmento EcoR\-Pst\ pequeno (1388 pb) (SEC \D n° 37) de pML-Tc-ter_thrL que incluye el gen de resistencia a la tetraciclina y el terminador de la transcripcion ter_thrL; el plasmido pML-Tc-ter_thrL se obtuvo mediante las dos etapas siguientes:
- el plasmido pML-ter_thrL se obtuvo mediante digestion del plasmido pML-MCS (Mashko, S.V. et al., Biotekhnologiya (en ruso), 2001, n° 5, 3-20) con Xba\ y BamH\, seguida de la ligadura del fragmento grande (3342 pb) con el fragmento Xba\-BamH\ (68 pb) que porta el terminador ter_thrL obtenido mediante amplificacion por PCR de la region correspondiente del cromosoma de Escherichia coli MG1655 utilizando los cebadores P9 y P10 (SEC \D n° 38 y n° 39) (estos cebadores contenfan los sitios de reconocimiento subsidiario para Pst\, Xba\ y BamH\);
- el plasmido pML-Tc-ter_thrL se obtuvo mediante digestion del plasmido pML-ter_thrL con Kpn\ y Xba\ seguida de tratamiento con fragmento Klenow de ADN polimerasa \ y se ligo con el fragmento EcoR\- Van91\ pequeno (1317 pb) de pBR322 que incluye el gen de resistencia a la tetraciclina (pBR322 se digirio con EcoR\ y Van91 \ y despues se trato con el fragmento Klenow de ADN polimerasa \).
Ejemplo 1: Adquisicion de la cepa sustituida con el promotor del operon kdp
(1) Construccion de plasmido productor de acido glutamico RSFPPG
Se construyo un plasmido RSFPPG en el que se amplificaron genes del sistema de biosfntesis de acido L- glutamico, el gen prpC (publicacion de patente internacional WO 2006/051660), el gen ppc y el gen gdhA (documento EP0999282A).
El cebador 1 (SEC \D n° 40) y el cebador 2 (SEC \D n° 41) se disenaron para la amplificacion de una porcion de RSFCPG (documento EP1 233 068 A) distinta del ORF del gen gltA. Utilizando estos cebadores y RSFCPG como plantilla, se realizo una PCR para obtener un fragmento de aproximadamente 14,9 kb. Como para prpC, la PCR se realizo utilizando el cebador 3 (SEC \D n° 42) y el cebador 4 (SEC \D n° 43) y el ADN cromosomico de la cepa W3110 de E. coli como plantilla para obtener un fragmento de aproximadamente 1,2 kb. Ambos productos de la PCR se trataron con Bgl\\ y Kpn\, se ligaron y despues se utilizaron para transformar la cepa JM109 de E. coli. Se recogieron todas las colonias surgidas y se extrajeron plasmidos de las colonias en forma de mezcla. La cepa ME8330 de E. coli, que es una cepa que carece de citrato sintasa (CS), se transformo con la mezcla de plasmidos, y la suspension celular se aplico al medio mfnimo M9 (que contenfa 5 g de glucosa, sulfato de magnesio 2 mM, 3 g de fosfato de monopotasio, 0,5 g de cloruro de sodio, 1 g de cloruro de amonio y 6 g de fosfato de disodio en 1 l de agua pura) que contenfa 50 mg/l de uracilo y 5 mg/l de tiamina HCl. A partir de las cepas surgidas se extrajo un plasmido y se denomino RSFPPG. Este plasmido RSFPPG se introdujo en la cepa NP106 de Pantoea ananatis, que es una cepa productora de acido L-glutamico, para construir una cepa productora de acido L-glutamico, NP106/RSFPPG (esta cepa se denomina “cepa NA1”).
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La cepa NP106 se obtuvo del modo siguiente. La cepa AJ13601de Pantoea ananatis descrita anteriormente se cultivo durante la noche a 34 °C en el medio lfquido LBGM9 con agitacion, y despues el medio se diluyo de modo que aparecieran de 100 a 200 colonias por placa y se aplico a una placa de LBGM9 que contema 12,5 mg/l de tetraciclina. Las colonias que aparecieron se replicaron en una placa de LBGM9 que contema 12,5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y se selecciono una cepa que era sensible al cloranfenicol para obtener una cepa de la se elimino pSTVCB, que se denomino G106S. La cepa G106S se cultivo posteriormente durante la noche a 34 °C en el medio lfquido LBGM9 con agitacion, y el medio se diluyo de modo que aparecieran de 100 a 200 colonias por placa, y se aplico a una placa con LBGM9 sin farmacos. Las colonias que aparecieron se replicaron en una placa con LBGM9 que contema 12,5 mg/l de tetraciclina y una placa con LGBM9 sin farmacos, y se selecciono una cepa que era sensible a la tetraciclina para obtener una cepa de la se elimino RSFCPG, que se denomino NP106. La NP106 obtenida tal como se ha descrito anteriormente es una cepa que no contiene ninguno de los dos plasmidos RSFCPG y pSTVCB, que los alberga la cepa AJ13601.
(2) Adquisicion de una cepa en la que el promotor del operon kdp estaba reemplazado por el promotor tac
i) Construccion de la cepa de P. ananatis SC17(0) en la que la secuencia que comprende AattL-Kmr-AattR y el promotor Ptac ligado corriente abajo (AattL-Km-AattR-Ptac) se integro corriente arriba del gen lacZ.
El promotor Ptac se integro en el cromosoma de la cepa de P. ananatis SC17(0) en una posicion corriente arriba del gen lacZ. La estructura de la region cromosomica de P. ananatis corriente arriba del gen LacZ se muestra en la Fig. 3. Las secuencias de nucleotidos de los genes yghU, scrK y lacZ de Pantoea ananatis se muestran en las SEC ID n° 44, n° 45 y n° 46. La secuencia de la region -35 del promotor Ptac es ttgaca.
El fragmento del promotor Ptac se amplifico por PCR utilizando el cebador 5' 1 (SEC ID n° 47) y el cebador 3' 2 (SEC ID n° 48) que corresponden al promotor Ptac, y el plasmido pDR540 (Pharmacia, Suecia) como plantilla. Ambos cebadores conteman una secuencia de reconocimiento de Bglll en el extremo 5'. El cebador 2 contema 46 nucleotidos de la porcion terminal 3' de Ptac, secuencia SD, y una porcion inicial de la region codificante del gen lacZ.
Un fragmento de ADN que contema un gen de resistencia a Km eliminable flanqueando los sitios attL y attR de A se amplifico tambien por PCR utilizando pMW118-(AattL-Kmr-AattR) como plantilla, y el cebador 3 (SeC ID n° 49) y el cebador 4 (SEC ID n° 50). El fragmento obtenido tema un sitio de reconocimiento de BglII para la ligadura con el fragmento del promotor tac en un extremo y un sitio correspondiente a una secuencia homologa al cromosoma de Pantoea ananatis y que se localiza corriente arriba del gen scrK para la integracion en el genoma bacteriano en el otro extremo (Fig. 3). Dos de los fragmentos del producto de PCR se trataron con BglII y se ligaron in vitro con ADN ligasa de T4.
Se utilizo la mezcla de reaccion de ligadura para la integracion dependiente de A en el cromosoma de Pantoea ananatis. El plasmido cooperador RSF-Red-TER se utilizo como velmculo de genes Red de fago A. Con el fin de obtener celulas electrocompetentes de Pantoea ananatis, se transformo la cepa SC17(0) con el plasmido RSF- Red-Ter y se cultivo durante la noche a 34 °C en medio LB que contema 50 pg/ml de cloranfenicol. Despues, el caldo de cultivo se diluyo 100 veces con medio LB reciente que contema 50 pg/ml de cloranfenicol, y el cultivo de las celulas se dejo a 34 °C con aireacion hasta que la DO600 fuera de 0,3. Despues, se anadio IPTG 1 mM, y se continuo con el cultivo hasta que la DO600 fuera de 0,7. Se lavo una muestra 10 mM 3 veces con un volumen igual de agua desionizada y las celulas se suspendieron en 40 pl de glicerol fno al 10%. Inmediatamente antes de la electroporacion se anadieron de 100 a 200 ng del fragmento de ADN amplificado in vitro disueltos en 5 pl de agua desionizada a la suspension celular. La electroporacion se realizo utilizando un aparato de electroporacion de bacterias (BioRad, Estados Unidos, Numero de catalogo 165-2089, Version 2-89). Los parametros del pulso utilizados fueron una intensidad de campo de 20 kV/cm, y un tiempo de pulso de 5 milisegundos.
Despues de la electroporacion se anadio inmediatamente 1 ml de medio LB suplementado con glucosa (0,5%) a la suspension celular. Despues, las celulas se dejaron crecer a 34 °C durante 2 horas con aireacion, se plaquearon en medio solido mLB que contema 40 pg/ml de cloranfenicol y se incubaron durante la noche a 34 °C. El integrante KmR seleccionado se dispuso en bandas en una placa con medio LB a la que se anadio IPTG (1 mM) y sacarosa (5 g/l), y se cultivo a 34 °C para dejar que se formaran colonias individuales. Con el fin de eliminar el plasmido cooperador RSF-Red-TER del integrante, se aislaron las variantes KmR y CmS.
Las estructuras cromosomicas de las colonias KmR y CmS seleccionadas se confirmaron mediante secuenciacion de nucleotidos.
ii) Sustitucion del promotor tac por el promotor del operon kdp
Se sintetizaron dos cebadores de ADN sinteticos mostrados en las SEC ID n° 51 y n° 52 de una forma convencional. El cebador mostrado en la SEC ID n° 51 tema una estructura tal que una secuencia homologa a la region corriente arriba del operon kdp de Pantoea ananatis estaba seguida de una secuencia homologa al
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extremo 5' de AattL-Kmr-AattR-Ptac. El cebador de la SEC ID n° 52 tenia una estructura tal que una secuencia complementaria al extremo 5' que contenia el primer codon de inicio del operon kdp de Pantoea ananatis estaba seguida de una secuencia complementaria al extremo 3' de AattL-Kmr-AattR-Ptac. Mediante la realizacion de una PCR utilizando estos cebadores y el ADN cromosomico de la cepa seleccionada en i) como plantilla, se amplifico un fragmento de aproximadamente 1,6 kpb de secuencia AattL-Km-AattR-Ptac que tenia la secuencia homologa a la region corriente arriba del operon kdp en el extremo 5' y la secuencia homologa al extremo 5' que contiene el primer codon de inicio del operon kdp en el extremo 3'.
El fragmento de PCR mencionado anteriormente se purifico y se introdujo en SC17(0)/RSF-Red-TER por electroporacion de una forma convencional.
La cepa SC17(0)/RSF-Red-TER a la que se introdujo el fragmento PCR se selecciono en el medio L (medio que contiene 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1 l de agua purificada, pH 7,0) que contenia 40 mg/l de kanamicina para obtener aproximadamente 20 colonias como transformantes. La insercion del fragmento mencionado anteriormente en la region corriente arriba del operon kdp se confirmo por PCR utilizando dos cebadores de ADN sinteticos mostrados en las SEC ID n° 53 y n° 54, y una cepa para la que pudo confirmarse la insercion del fragmento se denomino SC17(0) ::Ptac-kdp. Se extrajo ADN genomico de esta cepa y se utilizo para transformar la cepa NA1/pSTV-yhfK por electroporacion. La cepa NA1/pSTV-yhfK se obtuvo a partir de la cepa AJ13601 (remftase a la patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2001-333769) eliminando dos plasmidos, RSFCPG y pSTVCB, e introduciendo dos plasmidos, el plasmido para la produccion de acido L-glutamico, RSFPPG y pSTV-yhfK (remftase a la patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2005-278643).
Ambos plasmidos RSFCPG y pSTVCB se divulgan en la patente japonesa abierta a inspeccion publica n° 2001333769. El RSFCPG es un plasmido que contiene los genes gltA, ppc y gdhA derivados de Escherichia coli. El pSTVCB es un plasmido obtenido mediante insercion del gen gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum en pSTV29 (Takara Shuzo). El pSTV-yhfk es un plasmido obtenido insertando el gen yhfk derivado de Pantoea ananatis en pSTV29 (Takara Shuzo).
La cepa NA1/pSTV-yhfK en la que se introdujo ADN genomico de SC17(0)::Ptac-kdp se selecciono en una placa del medio L (medio que contiene 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1 l de agua purificada, pH 7,0) que estaba suplementado con ingredientes de medio mfnimo (medio que contiene 0,5 g de glucosa, sulfato de magnesio 2 mM, 3 g de fosfato de monopotasio, 0,5 g de cloruro de sodio, 1 g de cloruro de amonio y 6 g de fosfato de disodio en 1 l de agua purificada), 40 mg/l de kanamicina, 12,5 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol. Como resultado, se obtuvieron aproximadamente 20 colonias como transformantes. En todas estas cepas el fragmento de AattL-Kmr-AattR-Ptac se inserto corriente arriba del operon kdp, y una vez realizada esta operacion se selecciono un clon entre las mismas y se denomino NA1:: Ptac-kdp/pSTV-yhfK.
(3) Evaluacion del cultivo de la cepa sustituida con el promotor del operon kdp en tubo de ensayo
Despues, con el fin de examinar el efecto de potenciacion del operon kdp sobre el crecimiento, se realizo un cultivo en tubos de ensayo. La cepa NA1:Ptac-kdp/pSTV-yhfK y la cepa NA1/pSTV-yhfK se utilizaron como control, y el crecimiento de las mismas se examino en condiciones acidas.
[Composicion del medio para el cultivo en tubo de ensayo]
D-glucosa
0,5%
Na2HPO4
6,0 g/l
KH2PO4
3,0 g/l
NaCl
0,5 g/l
NH4Cl
1,0 g/l
MgSO4-7H2O
2,0 mM
Acido e-diaminopimelico
200 mg/l
Clorhidrato de L-lisina
200 mg/l
DL-Metionina
200 mg/l
Acido L-glutamico
30 g/l
Clorhidrato de tetraciclina
12,5 mg/l
Cloranfenicol
25 mg/l
El medio se ajusto a pH 4,5 o pH 4,9 con amoniaco acuoso y despues se filtro.
Las cepas NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK y NA1/pSTV-yhfK se precultivaron cada una en el medio L (medio que contiene 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1 l de agua purificada, pH 7,0) que estaba suplementado con ingredientes de medio mfnimo (medio que contiene 0,5 g de glucosa, sulfato de magnesio 2 mM, 3 g de fosfato de monopotasio, 0,5 g de cloruro de sodio, 1 g de cloruro de
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aluminio y 6 g de fosfato de disodio en 1 l de agua purificada), 12,5 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y las celulas correspondientes a 1/8 de la placa se rasparon, se lavaron dos veces con solucion salina fisiologica y finalmente se suspendieron en 1 ml de solucion salina fisiologica. La suspension se inoculo en un volumen de 20 pl en 5 ml del medio para cultivo en tubo de ensayo contenido en un tubo de ensayo y se cultivo a 34 °C con agitacion. Durante el cultivo se midio la DO (660 nm) cada 30 minutos utilizando un medidor de DO (TN1506 BIO PHOTORECORDER, ADVANTEC). Los resultados se muestran en la figura 4.
En comparacion con la cepa NA1/pSTV-yhfK como control, la cepa potenciada con kdp, cepa NA1::Ptac- kdp/pSTV-yhfK, mostro una mejora en el crecimiento en condiciones acidas de pH 4,5 o pH 4,9. Asf, el efecto de potenciacion del operon kdp para mejorar el crecimiento y la velocidad de produccion de acido L-glutamico se demostro por medio de estos resultados.
(4) Evaluacion del cultivo de la cepa sustituida con el promotor del operon kdp en un recipiente S-jar
Despues, con el fin de examinar el efecto de potenciacion del operon kdp sobre la produccion de acido L- glutamico, el cultivo de produccion de acido L-glutamico se realizo utilizando la cepa NA1:Ptac-kdp/pSTV-yhfK y la cepa NA1/pSTV-yhfK.
El cultivo se realizo en dos etapas de cultivo de siembra para permitir la formacion de celulas y el cultivo principal para producir acido L-glutamico.
El cultivo de siembra se realizo con la composicion de medio siguiente.
[Composicion de medio de cultivo de siembra]
Sacarosa
50 g/l
MgSO4-7H2O
0,4 g/l
GD113 (antiespumante)
0,1 ml/l
(NH4)2SO4
4,0 g/l
KH2PO4
2,0 g/l
Extracto de levadura
4,0 g/l
FeSO4-7H2O
0,01 g/l
MnSO4-5H2O
0,01 g/l
Acido cftrico
0,02 g/l
Clorhidrato de L-lisina
0,4 g/l
DL-Metionina
0,4 g/l
Acido e-diaminopimelico
0,4 g/l
Pantotenato de calcio
18 mg/l
Clorhidrato de tetraciclina
12,5 mg/l
Cloranfenicol
25 mg/l
El medio se esterilizo con vapor a 120 °C durante 20 minutos.
Las cepas NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK y NA1/pSTV-yhfK se precultivaron cada una en el medio L (medio que contiene 10 g de Bacto-triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de NaCl y 15 g de agar en 1 l de agua purificada, pH 7,0) que estaba suplementado con ingredientes de medio mfnimo (medio que contiene 0,5 g de glucosa, sulfato de magnesio 2 mM, 3 g de fosfato de monopotasio, 0,5 g de cloruro de sodio, 1 g de cloruro de aluminio y 6 g de fosfato de disodio en 1 l de agua purificada), 12,5 mg/l de clorhidrato de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol, y las celulas correspondientes a una placa se inocularon en 300 ml del medio de la composicion mencionada anteriormente contenido en un minirrecipiente de 1 l de volumen, y la agitacion se controlo a 34 °C y pH 6,0 durante aproximadamente 12 horas de forma que se obtuviera una aireacion de 1/1 vvm y una concentracion de oxfgeno del 3% o superior. Durante el cultivo el pH se controlo para que fuera el 6,0 con adicion de gas amoniaco. El cultivo de siembra se termino en el momento del agotamiento del sacarido en el medio observado como fndice.
La composicion del medio del cultivo principal se muestra a continuacion.
[Composicion del medio de cultivo] (Las concentraciones son las de despues de inocular el 20% de medio de
cultivo de siembra)
Sacarosa
100 g/l
MgSO4-7H2O
0,4 g/l
GD113
0,1 ml/l
(NH4)2SO4
5,0 g/l
KH2PO4
6,0 g/l
Extracto de levadura
6,0 g/l
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FeSO4'7H2O MnSO4'5H2O Acido cftrico Betafna*
Clorhidrato de L-lisina DL-Metionina Acido e-diaminopimelico Pantotenato de calcio Clorhidrato de tetaciclina Cloranfenicol * N,N, N-trimetilglicina
Las celulas obtenidas mediante el cultivo de siembra en un volumen de 60 ml se inocularon en 240 ml de medio que tenia la composicion mencionada anteriormente contenido en un minirrecipiente con un volumen de 1 l y se cultivaron a pH 4,7. El cultivo se termino 16 horas despues del comienzo del cultivo principal. La densidad celular y la concentracion de acido L-glutamino en el medio de cultivo se midieron a lo largo del tiempo. La densidad celular se examino midiendo la turbidez del medio de cultivo diluido 101 veces con agua a 620 nm utilizando un espectrofotometro (U-2000A, Hitachi). La concentracion de acido L-glutamico se midio para el sobrenadante del cultivo diluido de forma apropiada con agua utilizando un aparato Biotech Analyzer (AS-210, Sakura SI)
Los resultados se muestran en la tabla 1 y en la figura 5. Se observa claramente que el crecimiento, asi como la acumulacion de acido L-glutamico y la velocidad de produccion de acido L-glutamino de la cepa potenciada con el operon kdp, NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK eran mejores en compacion con la cepa comparativa, cepa NA1/pSTV- yhfK.
0,02 g/l 0,02 g/l 0,02 g/l 2,0 g/l 0,8 g/l 0,6 g/l 0,6 g/l 18 mg/l 25 mg/l 25 mg/l
Tabla 1
NA1/pSTVyhfK NA1: : Ptac-kdp/pSTV-yhfK
Acido L-glutamico producido (g/recipiente)
15,8 19,0
Tasa de produccion de acido L-glutamico (g/l/h)
3,30 3,96
Ejemplo 2: Amplificacion del operon kdp en Escherichia coli acumuladora de L-treonina (Ejemplo solo de referenda)
(1) Construccion de plasmido por amplificacion del operon kdp
Con el fin de introducir el operon kdp en una bacteria Escherichia, se contruye un plasmido para la amplificacion del operon kdp utilizando un plasmido pMW218 conocido (Takara Shuzo).
El pMW218 se digiere en primer lugar con las enzimas de restriccion Hindlll y BamHI, y la reaccion se termina mediante la adicion de solucion de fenol/cloroformo y mezclandolas. La mezcla de reaccion se centrifuga, despues se recoge la capa superior y se recogen aDn mediante precipitacion en etanol. El operon kdp se amplifica por separado por PCR utilizando cromosoma extraido de Escherichia coli MG1655 como plantilla y los cebadores de ADN mostrados en las SEC ID n° 55 y n° 56 (desnaturalizacion a 94 °C durante 10 segundos, hibridacion a 60 °C durante 30 segundos y extension a 72 °C durante 120 segundos). Para la PCR, se utiliza ADN polimerasa Pyrobest (Takara Shuzo). El fragmento del operon kdp obtenido se digiere con las enzimas de restriccion Hindlll y BamHI, y la reaccion se termina mediante la adicion de solucion de fenol/cloroformo y mezclandolas.
La digestion de pMW218 y el fragmento de la region del gen kdpABC preparado tal como se ha descrito anteriormente se ligan utilizando un kit de ligadura de ADN Ver. 2 (Takara Shuzo). Se transforma Escherichia coli (celulas competentes de E. coli JM109, Takara Shuzo) con la solucion de ligadura, se aplica a medio agar LB que contiene 50 mg/l de kanamicina, y se incuba durante la noche a 37 °C. Las colonias que aparecen en el medio agar se inoculan en el medio liquido LB que contiene 50 mg/l de kanamicina, y se cultivan a 37 °C durante 8 horas con agitacion. El ADN del plasmido se extrae de cada medio de cultivo mediante el procedimiento de alcali-SDS y la estructura del mismo se confirma mediante digestion con enzimas de restriccion para obtener pMW218kdp.
(2) Introduccion de pMW218kdp en Escherichia coli B-3996 acumuladora de treonina y produccion de aminoacidos
El pMW218kdp obtenido tal como se ha descrito anteriormente se introduce en la cepa VKPM B-3996 mediante el procedimiento de electroporacion (Canadian Journal of Microbiology, 43, 197 (1997)).
El transformante obtenido (esta cepa se denomina “B-3996/pMW218kdp”) y la cepa en la que se introduce pMW218 como control (esta cepa se denomina “B-3996/pMW218”) se cultivan del modo siguiente, y se
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examinan las concentraciones de treonina en los sobrenadantes de los cultivos.
Cada transformante se inocula en 3 ml del medio lfquido LB que contiene 50 mg/l de kanamicina y 20 mg/l de estreptomicina, y se cultiva durante la noche a 37 °C en un tubo de ensayo, despues se inoculan 200 pl del medio de cultivo en un medio de produccion de treonina (20 ml) que contiene 50 mg/l de kanamicina y 20 mg/l de estreptomicina, y el cultivo se realiza a 37 °C durante 24 horas con agitacion. Despues de completar el cultivo, las celulas se retiran por centrifugacion y se mide la concentracion de L-treonina en el sobrenadante del cultivo utilizando un analizador de aminoacidos (L-8500, Hitachi). Puede observarse que la cantidad de acumulacion de L-treonina en el medio mejora en la cepa amplificada con el operon kdp, B-3996/pMW218kdp, en comparacion con la cepa B-3996/pMW2l8 como control.
[Medio de produccion de treonina]
D-glucosa 40 g/l
(NH4)2SO4 16 g/l
KH2PO4 1,0 g/l
MgSO4-7H2O 1,0 g/l
FeSO4-7H2O 0,01 g/l
MnSO4-7H2O 0,01 gIl
L-Isoleucina 50 mg/l
DL-Metionina 500 mg/l
Carbonato de calcio 0,6 g/l
Estreptomicina 20 mg/l
Kanamicina 50 mg/l
El medio se ajusta a pH 7,5 con hidroxido de potasio.
El medio se esteriliza con vapor a 115 °C durante 10 minutos.
Explicacion del listado de secuencias
SEC ID n° 1: Secuencia de nucleotidos del operon kdp de Escherichia coli (tambien se muestran las secuencias de aminoacidos de kdpA, kdpB y kdpC)
kdpF: 457 a 546
kdpA: 546 a 2219
kdpB: 2242 a 4290
kdpC: 4299 a 4871
kdpD: 4864 a 7548
kdpE: 7545 a 8222
SEC ID n° 2: Secuencia de aminoacidos de KdpA SEC ID n° 3: Secuencia de aminoacidos de KdpB SEC ID n° 4: Secuencia de aminoacidos de KdpC SEC ID n° 5: Secuencia de aminoacidos de KdpD SEC ID n° 6: Secuencia de aminoacidos de KdpE
SEC ID n° 5: Secuencia de nucleotidos del operon KdpD (tambien se muestra la secuencia de aminoacidos de SDHC)
SEC ID n° 7: Secuencia de nucleotidos del operon kdp de Pantoea ananatis (tambien se muestran las secuencias de aminoacidos de kdpA, kdpB, kdpC y kdpD)
kdpA: 543 a 2225
kdpB: 2228 a 4273
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kdpC: 4284 a 4853 kdpD: 4867 a 7542
SEC ID n° 8: Secuencia de aminoacidos de KdpA SEC ID n° 9: Secuencia de aminoacidos de KdpB SEC ID n° 10: Secuencia de aminoacidos de KdpC SEC ID n° 11: Secuencia de aminoacidos de KdpD
SEC ID n° 12: Secuencia de nucleotidos del gen kdpE de Pantoea ananatis
SEC ID n° 13: Secuencia de aminoacidos de KdpE
SEC ID n° 14: Secuencia de nucleotidos del gen hisD de Pantoea ananatis
SEC ID n° 15: Cebador para la amplificacion del fragmento para la integracion del gen Kmr en el gen hisD
SEC ID n° 16: Cebador para la amplificacion del fragmento para la integracion del gen Kmr en el gen hisD
SEC ID n° 17: Cebador para la amplificacion del gen cat
SEC ID n° 18: Cebador para la amplificacion del gen cat
SEC ID n° 19: Cebador para la amplificacion del gen sacB
SEC ID n° 20: Cebador para la amplificacion del gen sacB
SEC ID n° 21: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el promotor PlacUV5
SEC ID n° 22: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el promotor PlacUV5
SEC ID n° 23: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene los genes RedaPy de A y tL3
SEC ID n° 24: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene los genes RedaPy de A y tL3
SEC ID n° 25: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el promotor PlacUV5 y TrrnB
SEC ID n° 26: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el promotor PlacUV5 y TrrnB
SEC ID n° 27: Cebador para la amplificacion de attL
SEC ID n° 28: Cebador para la amplificacion de attL
SEC ID n° 29: Secuencia de nucleotidos de attL SEC ID n° 30: Cebador para la amplificacion de attR
SEC ID n° 31: Cebador para la amplificacion de attR
SEC ID n° 32: Secuencia de nucleotidos de attR
SEC ID n° 33: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el gen bla
SEC ID n° 34: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el gen bla
SEC ID n° 35: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene ter_rrnB
SEC ID n° 36: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene ter_rrnB
SEC ID n° 37: Secuencia de nucleotidos del fragmento de ADN que contiene el terminador ter_thrL
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SEC ID n° 38: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el terminador ter_thrL
SEC ID n° 39: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el terminador ter_thrL
SEC ID n° 40: Cebador para la amplificacion de la porcion del gen gltA distinta del ORF
SEC ID n° 41: Cebador para la amplificacion de la porcion del gen gltA distinta del ORF
SEC ID n° 42: Cebador para la amplificacion del gen prpC
SEC ID n° 43: Cebador para la amplificacion del gen prpC
SEC ID n° 44: Secuencia de nucleotidos del gen yghU de Pantoea ananatis
SEC ID n° 45: Secuencia de nucleotidos del gen scrK de Pantoea ananatis
SEC ID n° 46: Secuencia de nucleotidos del gen lacZ de Pantoea ananatis
SEC ID n° 47: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el promotor Ptac
SEC ID n° 48: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el promotor Ptac
SEC ID n° 49: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el gen de resistencia a Km
SEC ID n° 50: Cebador para la amplificacion del fragmento de ADN que contiene el gen de resistencia a Km
SEC ID n° 51: Cebador para la amplificacion de la secuencia corriente arriba del operon kdp ligada al promotor tac
SEC ID n° 52: Cebador para la amplificacion de la secuencia corriente arriba del operon kdp ligada al promotor tac
SEC ID n° 53: Cebador para confirmar la estructura corriente arriba del operon kdp SEC ID n° 54: Cebador para confirmar la estructura corriente arriba del operon kdp SEC ID n° 55; Cebador para la amplificacion del operon kdp SEC ID n° 56: Cebador para la amplificacion del operon kdp
SEC ID n° 57: Secuencia de consenso de las secuencias de aminoacidos KdpA de Pantoea ananatis y Escherichia coli
SEC ID n° 58: Secuencia de consenso de las secuencias de aminoacidos KdpB de Pantoea ananatis y Escherichia coli
SEC ID n° 59: Secuencia de consenso de las secuencias de aminoacidos KdpC de Pantoea ananatis y Escherichia coli
Aplicabilidad Industrial
Utilizando el microorganismo de la presente invencion puede producirse eficazmente acido L-glutamico mediante fermentacion. En una forma de realizacion preferida, el microorganismo de la presente invencion muestra tanto una cantidad de produccion de acido L-aminoacido como una velocidad de produccion superiores.
Listado de secuencias
<110> Ajinomoto Co., Inc.
<120> Bacteria que produce L-aminoacido y procedimiento para producir L-aminoacido
<130> C874-C7269
<150> JP2007-011392 <151 > 2007-01-22
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<160> 59
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 8501
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<220>
<221 > CDS <222> (546)..(2219)
<220>
<221 > CDS <222> (2242)..(4290)
<220>
<221 > CDS <222> (4299)..(4871)
<400> 1
cgaccagacg
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590
IVfet Al a Al
a Q n Q y Phe Leu Leu I I e Al a Thr Phe Leu Leu Val
1
5 10 15
11 a at g
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Val Leu Al a Arg Pr o Leu Q y Ser Q y Leu Al a Arg Leu I I e
20 25 30
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I I e Pr o Leu Pr o Q y Thr Thr Q y Val Q u Arg Val Leu Phe
35 40 45
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Leu Q y Val Ser Asp Arg Q u IVfet Asn Tr p Lys Q n Tyr Leu
50 55 60
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I I e Leu Q y Leu Asn IVfet Leu Q y Leu Al a Val Leu Phe Phe
65
70 75
at g t t g
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Leu Q y Q n Hi s Tyr Leu Pr o Leu Asn Pr o Q n Q n Leu Pr o
80
85 90 95
ggg ctg
t eg t gg gat ct g geg ct g aat acc gee gt c age 111 gt c acc 878
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Ser Tr p Asp Leu Al a Leu Asn Thr Al a Val Ser Phe Val Thr
100 105 110
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Asn Thr
Asn Tr p Q n Ser Tyr Ser Q y Q u Thr Thr Leu Ser Tyr Phe

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Microorganismo Pantoea ananatis modificado que presenta la capacidad de producir acido L-glutamico y ha sido modificado de manera que el sistema ATPasa de tipo P (kdp) que transporta potasio, codificado por el operon kdp, este aumentado en comparacion con una cepa sin modificar, en el que el sistema kdp se aumenta de manera que se aumente la actividad de ATPasa de tipo P del microorganismo, incrementando la expresion de dicho operon kdp o uno o mas genes que constituyen dicho operon kdp, y/o incrementando la traduccion de dicho operon kdp o de dichos genes, incrementando el numero de copias de dicho operon kdp o uno o mas de dichos genes, o modificando una secuencia de control de la expresion de dicho operon.
  2. 2. Microorganismo segun la reivindicacion 1, en el que el operon kdp contiene por lo menos los genes kdpA, kdpB y kdpC.
  3. 3. Microorganismo segun la reivindicacion 2, en el que el gen kdpA es un gen que codifica una protefna que presenta la secuencia de aminoacidos representada en SEC ID n° 2 u 8 o la subunidad A del sistema kdp que presenta la secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 2 u 8 incluyendo sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones de uno a 20 restos de aminoacidos.
  4. 4. Microorganismo segun la reivindicacion 2 o 3, en el que el gen kdpB es un gen que codifica una protefna que presenta la secuencia de aminoacidos representada en SEC ID n° 3 o 9 o la subunidad B del sistema kdp que presenta una secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 3 o 9 incluyendo sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones de uno a 20 restos de aminoacidos.
  5. 5. Microorganismo segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que el gen kdpC es un gen que codifica una protefna que presenta la secuencia de aminoacidos representada en SEC ID n° 4 o 10 o la subunidad C del sistema kdp que presenta una secuencia de aminoacidos de SEC ID n° 4 o 10 incluyendo sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones de uno a 20 restos de aminoacidos.
  6. 6. Microorganismo segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que el operon kdp es un ADN definido en cualquiera de los (a) a (d) siguientes:
    (a) un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de los numeros de nucleotido 546 a 4871 de SEC ID n° 1,
    (b) un ADN que codifica el sistema kdp e hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleotidos de (a) o con una sonda, que se ha preparado a partir de dicha secuencia de nucleotidos,
    (c) un ADN que comprende la secuencia de nucleotidos de los numeros de nucleotido 543 a 4853 de SEC ID n° 7,
    (d) un ADN que codifica el sistema kdp e hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleotidos de (c) o con una sonda, que se ha preparado a partir de dicha secuencia de nucleotidos.
  7. 7. Procedimiento para producir acido L-glutamico que comprende cultivar el microorganismo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en un medio para producir y acumular acido L-glutamico en el medio o las celulas y recoger el acido L-glutamico del medio o de las celulas.
    imagen1
    imagen2
    pMWPIadacIsacBca
    Bgtll/BamH!
    RSF1010
    mobC
    mobB
    PlacUVS
    PlacUVS
    RSFsacBPIacMCS
    PlaclA/5
    PlacUVS r&.
    Xba I
    PlacUVS
    XbaJPg pMW) 1811191-Placlacl
    lad
    Xba I
    Sac/
    Pstl
    TrrnB
    Pst/
    sacB
    Sad
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    strA
    Bam HI
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    Not I
    sacB
    Xba1
    TFJRrrnB Bam HI
    cat
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    Red - tL3
    sacB
    Xba!
    PlaclA/5
    Not/
    PlacUV5
    Sad Bam HI
    Pvul
    NotI
    sacB
    Sad(Eclf36)
    &mse^ Red- tL3
    sacB >
    PlaclA/5
    Aloti
    lad
    PlacU/5
    PtacN/Ptac
    imagen3
    yghU lacZ
    Recombinacion dependiente de Red
    V
    yghU lacZ
    imagen4
    attL kan PtacN/Ptac
    DO660
    imagen5
    o NA1 /pSTV-yhfK • NA1 ::Ptac-kdp/pSTV-yhfK
    imagen6
    o NA1 /pSTV-yhfK • NA1::Ptac-kdp/pSTV-yhfK
    D0620nm(x1/101)
    imagen7
    imagen8
    i
    50
    KdpA_P. ananatis KdpA_E.coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E.coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    KdpA_P. ananatis KdpA_E. coli Consenso
    (1) MAANAFLLIAVYLLLLMVMAQPLGRGLAALVADKPLFAR—AEALLWRFS (1) MAAOGFLLIATFLLVLMVLARPLGSGLARLINDIPLPGTTGVERVLFRAL MAAXXFLLIAXXLLXLMVXAXPLGXGLAXLXXDXPLXXXXXXEXXLXRXX
    51 100
    (49) GVQEGGMRWQHYLLAILVFNLLGFVVLLAILMFQGALPLNPQHLPGLSWD (51) GVSDREMNWKQYLCAILGLNMLGLAVLFFMLLGQHYLPLNPQQLPGLSWD GVXXXXMXWXXYLXAILXXNXLGXXVLXXXLXXQXXLPLNPQXLPGLSWD
    101 150
    (99) LALNTAISFVTNTNWQSYAGESTLSYFSQMVGLTVQNFVSAATGIAVAFA (101) LALNTAVSFVTNTNWQS YSGETTLS YFSQM AGLTVQNFLS AASGIAVI FA LALNTAXSFVTNTNWQSYXGEXTLSYFSQMXGLTVQNFXSAAXGIAVXFA
    151 200 (149) LIRGFANRSVATLGNAWRDLTRITLYVLLPISLLMALFFVSQGSIQNFLP (151 LIRAFTRQSMSTLGNAWVDLLRITLWVLVPVALLIALFFIQQGALQNFLP LIRXFXXXSXXTLGNAWXDLXRITLXVLXPXXLLXALFFXXQGXXQNFLP
    201 250 (199) YHNVTSLEGAQQTLAMGPVASQEAIKMLGTNGGGFFNVNSAHPFENPTAL (201) YQAVNTVEGAQQLLPMGPVASQEAIKMLGTNGGGFFNANSSHPFENPTAL YXXVXXXEGAQQXLXMGPVASQEAIKMLGTNGGGFFNXNSXHPFENPTAL
    251 300
    (249) SNFVQMLSIFLIPAALCFAFGESVKDRRQGSMLLWSMTLMFVVAAALVMW (251) TNFVQMLAIFLIPTALCFAFGEVMGDRRQGRMLLWAMSVIFVICVGVVMW XNFVQMLXIFLIPXALCFAFGEXXXDRRQGXMLLWXMXXXFVXXXXXVMW
    301 350
    (299) AELRGNPHFLTLGADSAINMEGKETRFGILNSSLFAVITTAASCGAVNAM (301) AEVQGNPHLLALGTDSSINMEGKESRFGVLVSSLFAWTTAASCGAVIAM AEXXGNPHXLXLGXDSXINMEGKEXRFGXLXSSLFAVXTTAASCGAVXAM
    351
    (349) HDSFTALGGMVPMLLMQLGEVVFGGVGAGLYGMLLFVLLAVFIAGLMIGR (351) HDSFTALGGMVPMWLMQIGEVVFGGVGSGLYGMMLFVLLAVFIAGLMIGR HDSFTALGGMVPMXLMQXGEVVFGGVGXGLYGMXLFVLLAVFIAGLMIGR

    401 450
    (399) TPEFLGKKIDVWEMKMTALAILVTPALVLIGTAIAMMTDAGRAGMANPGT (401) TPEYLGKKIDVREMKLTALAILVTPTLVLMGAALAMMTDAGRSAMLNPGP TPEXLGKKIDVXEMKXTALAILVTPXLVLXGXAXAMMTDAGRXXMXNPGX

    451 5^0
    (449) HGFSEVLYAVSSAANNNGSAFAGLNANTPFWNLLLAVCMFVGRFGIIIPV (451) HGFSEVLYAVSSAANNNGSAFAGLSANSPFWNCLLAFCMFVGRFGVIIPV HGFSEVLYAVSSAANNNGSAFAGLXANXPFWNXLLAXCMFVGRFGXIIPV

    501 550
    (499) MAIAGAMAVKKVQPVGNGTLPTHGPLFIALLVGTVLLVGALTFIPALALG (501) MAIAGSLVSKKSQAASSGTLPTHGPLFVGLLIGTVLLVGALTFIPALALG MAIAGXXXXKKXQXXXXGTLPTHGPLFXXLLXGTVLLVGALTFIPALALG

    551 562
    (549) PYAEHLQLIQGQ (551) PVAEYLS PVAEXLX
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E.coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB P. ananatis KdpBlE. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    KdpB_P. ananatis KdpB_E. coli Consenso
    i 50
    (1) MSR-QQQVFDAALLRTSAIDAVKKLDPRVQFRNPVMFVVYLGSILTSILA
    (1) msrkqlalfeptlvvqalkeavkklnpqaqwrnpvmfivwigsllttcis
    MSRXQXXXFXXXLXXXXXXXAVKKLXPXXQXRNPVMFXVXXGSXLTXXXX
    flii
    51
    100
    50) IMMFTGHQSGSASFTGAIALWLWFTVLFANMAEALAEGRSKAQANSLKGV IAMASGAMPGNALFS AAI SGffLWI TV LFANFAEALAEGRSKAQANSLKGV IXMXXGXXXGXAXFXXAIXXWLWXTVLFANXAEALAEGRSKAQANSLKGV
    101
    150
    (100) KKTSFAKKLSAAHYGAAWQQVAADALRKGDAVLVEAGDVIPCDGEVVEGG 01 KKTAFARKLREPK YGAAADK VPADQLRKGDIVLVEAGD11PCDGEVI EGG KKTXFAXKLXXXXYGAAXXXVXADXLRKGDXVLVEAGDXIPCDGEVXEGG
    Hi?)
    151
    200
    150) AS VDES AITGESAPVIRESGGDFASVTGGTRI LSD VO ITCS ANPGETFL ^ ASVDESAITGESAPVIRESGGDFASVTGGTRILSDWLVIECSVNPGETFL AS VDES AI TGESAPV I RESGGDFASVTGGTR ILSDWLVIXCSXNPGETFL
    250
    201
    (200) DRMIAMVEGAQRRKTPNEIALTILLVSLTIVFLLATVTLWPFSAWGGTPV (2015 DRMIAMVEGAQRRKTPNEIALTILLIALTIVFLLATATLWPFSAWGGNAV u ; dSiaKegaqrrktpneialtillxxltivfllatxtlwpfsawggxxv
    300
    251
    (250) titvlvallvclipttiggllsaigvagmsrmlganviatsgraveaagd
    (251) SVTVLVALLVCLIPTTIGGLLSA1GVAGMSRMLGANVIATSGRAVEAAGD XXTVLVALLVCLIPTTIGGLLSAIG VAGMSRMLGANVIATSGR AVEAAGD
    350
    301
    (300) VDVLMLDKTGTITLGNRQATQFLPAPGVTEEQLADAAQLASLADETPEGR
    (301) VDVLLLDKTGTITLGNRQASEFIPAQGVDEKTLADAAQLASLADETPEGR VDVLXLDKTGTITLGNRQAXXFXPAXGVXEXXLADAAQLASLADETPEGR
    351
    400
    ill?)
    ' ' SIVXLAKOXFNLREKDXXSXXAXFXPFXAQXRMSGXNXXXRXIRKGXVDA
    450
    401
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    500
    451
    GGIKERFAXLRKMGIKTVMITGDNXLTAAAIAAEAGVDDFLXEATPEAKL
    501
    550
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    650)
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    KdpC_P.ananatis KdpC_E. coli Consenso
    KdpC_P. ananatis KdpC_E. coli Consenso
    KdpC_P. ananatis KdpC_E. coli Consenso
    KdpC_P. ananatis KdpC_E. coli Consenso
    (1) MSQLRPAIFLLLLLTVVCGVVYPLLTTGLSQLLFPWQANGSVLNVDGEER (1) MSGLRPALSTFIFLLLITGGVYPLLTTVLGQWWFPWQANGSLIREGDTVR MSXLRPAXXXXXXLXXXXGXVYPLLTTXLXQXXFPWQANGSXXXXXXXXR
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    101 150 (101) RVAALRTANPQANGAVPVELVTTSASGLDPEISPEAALWQAPRIAAARQL (101) RVAALRAANPDASASVPVELVTASASGLDNNITPQAAAWQIPRVAKARNL RVAALRXANPXAXXXVPVELVTXSASGLDXXIXPXAAXWQXPRXAXARXL
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