CN108350412B - 用于生产醛的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于生产目标物质，即芳香醛诸如香草醛的方法。通过使用具有目标物质生产能力的棒状杆菌细菌从碳源或目标物质的前体生产目标物质，所述细菌已经以使醇脱氢酶活性降低的方式修饰。

Description

用于生产醛的方法
发明领域
本发明涉及通过使用细菌生产目标物质，即醛诸如香草醛的方法。
发明背景
香草醛是香草气味的主要成分，通过混入食品、饮料、香水等中作为芳香物使用。香草醛主要通过从天然产物中提取或通过化学合成来生产。
还试图用生物工程技术生产香草醛。作为用生物工程技术生产香草醛的方法，已报道了用丁香酚、异丁子香酚、阿魏酸、葡萄糖、香草酸、椰子壳等作为原料使用各种微生物的方法(非专利文献1)。
然而，香草醛是一种醛，因此对微生物显示出高毒性(非专利文献2)。因此，香草醛的毒性是使用微生物产生香草醛的重要问题。据报道，通过将香草醛转化为香草醇可以减轻香草醛的毒性(非专利文献3和4)。此外，已经报道了使用微生物生产香草醛，同时减轻香草醛的毒性的方法，例如下面举例说明的方法。
使用丁香酚或异丁子香酚作为原料高度积累香草醛的微生物，已报道了大肠杆菌等(非专利文献1)。这些原料的水溶性差，因此，从这些原料生产的香草醛作为双层发酵进行，并且为了提高生产率而进一步添加了二甲基亚砜等溶剂。在双层发酵中，生成的香草醛在有机层中积累，从而使香草醛在水层中的浓度保持较低，从而可以减轻香草醛的毒性，导致香草醛的高积累。然而，双层发酵提高了纯化成本，并且由于发酵罐需要由对有机溶剂有抗性的材料制成，进一步提高了成本。另外，在需氧条件下双层发酵涉及由于静电等引起爆炸的风险。
也报道了通过使用树脂来高度累积香草醛同时减轻香草醛毒性的方法(非专利文献1)。但是，使用树脂会增加成本。
同时，据报道醇脱氢酶包括参与香草醛向香草醇转化的酶，并且减弱这种酶的活性改善了大肠杆菌和酵母的香草醛生产(非专利文件5和6)。但是，香草醛在这种情况下的积累量对于大肠杆菌和酵母都是约0.5g/L(非专利文献5和6)。另外，在不使用树脂等吸收香草醛的情况下，大肠杆菌的香草醛在水层系统中的积累量最多为约2.5g/L(非专利文献7)。此外，酿酒酵母在水层中香草醛的累积量最大为约0.5g/L(非专利文献5和8)。因此，在香草醛的工业生产中强烈指出了由于醛毒性引起的问题。
相反，报道了放线菌等，诸如拟无枝菌酸菌种(Amycolatopsis sp.)ATCC39116，作为在水层系统中高度积累香草醛的微生物(非专利文献1和9)。然而，这些放线菌需要相当长的培养期，这会增加成本。另外，还没有建立针对这些放线菌的基因重组技术，因此，通过菌株修饰难以提高香草醛的产量。此外，由于香草醛用于食品，优选的是香草醛由GRAS(通常认为安全(Generally Recognized As Safe))微生物生产，其安全性经证实。但是，尚未知道在水层系统中高度积累香草醛的GRAS微生物。
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[非专利文献]
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Kaur B.and Chakraborty D.,Appl.Biochem.Biotechnol.,2013Feb；169(4):1353-72
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Ma XK.andDaugulis AJ.,Bioprocess Biosyst.Eng.,2014,Vol.37,p891-899。
发明概述
[发明要实现的目的]
本发明的目的是开发一种用于改善目标物质，即香草醛等醛的生产的新技术，从而提供一种有效生产目标物质的方法。特别地，本发明的目的可以是提供在不使用用于减轻目标物质的毒性的手段，诸如双层发酵和树脂的情况下有效生产诸如香草醛等目标物质的方法。
[实现目的的手段]
为了实现上述目的，本发明的发明人进行了各种研究。结果，本发明人开发了筛选适合于生产目标物质，即诸如香草醛等醛的微生物菌株的方法，并且发现棒状杆菌细菌具有优于其他细菌的香草醛抗性。本发明人进一步发现，通过修饰细菌使醇脱氢酶的活性降低，可以显著提高棒状杆菌细菌用于产生诸如香草醛等目标物质的能力，从而完成了本发明。
因此，本发明可以如下体现。
[1]具有生产目标物质的能力的棒状杆菌细菌(coryneform bacterium)，所述细菌已经以使醇脱氢酶的活性与非修饰菌株相比降低的方式进行了修饰，并且
其中所述目标物质是醛。
[2]上文提及的细菌，其中所述醇脱氢酶由选自由以下组成的组的一种或多种类型的蛋白质组成：由NCgl0324基因和NCgl2709基因编码的蛋白质。
[3]上文提及的细菌，其中至少降低所述由NCgl0324基因编码的蛋白质的活性。
[4]上文提及的细菌，其中至少降低所述由NCgl2709基因编码的蛋白质的活性。
[5]上文提及的细菌，其中所述由NCgl0324基因编码的蛋白质是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列，但包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并且具有醇脱氢酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:66的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并且具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
[6]上文提及的细菌，其中所述由NCgl2709基因编码的蛋白质是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列，但包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并且具有醇脱氢酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并且具有醇脱氢酶活性的蛋白质。
[7]上文提及的细菌，其中通过降低编码所述醇脱氢酶的基因的表达，或者通过破坏所述基因降低所述醇脱氢酶的活性。
[8]上文提及的细菌，所述细菌已经以使参与所述目标物质生物合成的酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步修饰。
[9]上文提及的细菌，其中所述参与目标物质生物合成的酶由选自以下的一种或多种类型的酶组成：催化从所述目标物质的前体转化成所述目标物质的酶。
[10]上文提及的细菌，其中所述参与目标物质生物合成的酶由选自由以下组成的组的一种或多种类型的酶组成：3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氢莽草酸脱水酶、O-甲基转移酶、芳香族羧酸还原酶、和苯丙氨酸脱氨酶。
[11]上文提及的细菌，其中所述芳香族羧酸还原酶是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:48、76、或98的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:48、76、或98的氨基酸序列，但包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并且具有芳香族羧酸还原酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:48、76、或98的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并且具有芳香族羧酸还原酶活性的蛋白质。
[12]上文提及的细菌，所述细菌已经以使磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步修饰。
[13]上文提及的细菌，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列，但包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并且具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并且具有磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶活性的蛋白质。
[14]上文提及的细菌，所述细菌已经以使除所述目标物质以外的物质的摄取系统的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步修饰。
[15]上文提及的细菌，其中所述摄取系统由选自由以下组成的组的一种或多种类型的摄取系统组成：香草酸摄取系统和原儿茶酸摄取系统。
[16]上文提及的细菌，其中所述香草酸摄取系统是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，但包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并且具有香草酸摄取活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并且具有香草酸摄取活性的蛋白质。
[17]上文提及的细菌，所述细菌已经以使参与除所述目标物质以外的物质的副生产的酶活性与非修饰菌株相比降低的方式进行了进一步修饰。
[18]上文提及的细菌，其中所述参与除目标物质以外的物质的副生产的酶由选自由以下组成的组的一种或多种类型的酶组成：香草酸脱甲基酶、原儿茶酸3,4-双加氧酶、和莽草酸脱氢酶。
[19]上文提及的细菌，其中所述香草酸脱甲基酶是下述(a)、(b)、或(c)中限定的蛋白质：
(a)包含SEQ ID NO:58或60的氨基酸序列的蛋白质；
(b)包含SEQ ID NO:58或60的氨基酸序列，但包含1至10个氨基酸残基的取代、缺失、插入和/或添加，并且具有香草酸脱甲基酶活性的蛋白质；
(c)包含与SEQ ID NO:58或60的氨基酸序列显示90％或更高的同一性的氨基酸序列，并且具有香草酸脱甲基酶活性的蛋白质。
[20]上文提及的细菌，其中所述棒状杆菌细菌属于棒杆菌属(genusCorynebacterium)。
[21]上文提及的细菌，其中所述棒状杆菌细菌是谷氨酸棒状杆菌(谷氨酸棒状杆菌)。
[22]用于生产目标物质的方法，所述方法包括下述步骤(A)：
(A)通过上文提及的细菌生产所述目标物质，
其中所述目标物质是醛。
[23]上文提及的方法，其中通过下述步骤(B)来进行所述步骤(A)：
(B)在含有碳源的培养基中培养所述细菌以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。
[24]上文提及的方法，其中通过下述步骤(C)来进行所述步骤(A)：
(C)通过使用所述细菌将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。
[25]上文提及的方法，其中通过下述(C1)来进行所述步骤(C)：
(C1)在含有所述前体的培养基中培养所述细菌以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。
[26]上文提及的方法，其中通过下述(C2)来进行所述步骤(C)：
(C2)允许所述细菌的细胞作用于反应混合物中的所述前体以在所述反应混合物中生产并积累所述目标物质。
[27]上文提及的方法，其中所述细胞由所述细菌的培养肉汤、从所述培养肉汤收集的细胞、其加工产物、或其组合组成。
[28]上文提及的方法，其中所述前体由选自由以下组成的组的一种或多种类型的物质组成：原儿茶酸、香草酸、苯甲酸、L-苯丙氨酸、和肉桂酸。
[29]上文提及的方法，所述方法还包括从所述培养基或反应混合物收集所述目标物质。
[30]上文提及的方法，其中所述目标物质是芳族醛。
[31]上文提及的方法，其中所述目标物质由选自由以下组成的组的一种或多种类型的芳族醛组成：香草醛、苯甲醛、和肉桂醛。
[32]用于筛选醛抗性菌株的方法，所述方法包括：
在含有醛的培养基中培养微生物；并且
选择醛抗性菌株。
[33]上文提及的方法，其中所述培养基含有2g/L或更高浓度的醛。
[34]上文提及的方法，其中所述微生物是以醇脱氢酶的活性与非修饰菌株相比降低的方式进行了修饰的菌株。
[35]上文提及的方法，其中所述醛是香草醛。
附图简述
[图1]
图1显示了大肠杆菌(E.coli)的香草醛生产的结果。
[图2]
图2显示了评估香草醛抗性(细菌)的结果。
[图3]
图3显示了评估香草醛抗性(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S228C菌株)的结果
[图4]
图4显示了评估显示降低的香草醇副生产的棒状杆菌细菌菌株的香草醛抗性的结果。
[图5]
图5显示了由醇脱氢酶基因同源物缺陷的棒状杆菌细菌菌株从香草醛生产香草醇的评估结果。在图5中，FKS0165,FKFC1,FKFC3,FKFC5,FKFC7,FKFC9,FKFC11,和FKFC14菌株表示为无,ΔNCgl313,ΔNCgl2709,ΔNCgl324,ΔNCgl2709ΔNCgl324,ΔNCgl2709ΔNCgl313,ΔNCgl324ΔNCgl313,andΔNCgl2709ΔNCgl324ΔNCgl313。
发明详述
在下文中，详细解释了本发明。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌是具有生产目标物质的能力的棒状杆菌细菌，该细菌已被修饰以降低醇脱氢酶的活性。生产目标物质的能力也称为“目标物质生产能力”。
<1-1>具有目标物质生产能力的细菌
在本发明中，术语“具有目标物质生产能力的细菌”是指能够生产目标物质的细菌。
术语“具有目标物质生产能力的细菌”是指如果该细菌用于发酵方法，则其能够通过发酵产生目标物质的细菌。也就是说，术语“具有目标物质生产能力的细菌”可以指能够从碳源获得目标物质的细菌。具体而言，术语“具有目标物质生产能力的细菌”可以指当在含有碳源的培养基等培养基中培养时能够在细菌培养基中以一定程度产生并积累目标物质，从而可以从中收集目标物质的细菌。
此外，术语“具有目标物质生产能力的细菌”是指如果将该细菌用于生物转化方法，则其通过生物转化能够产生目标物质的细菌。也就是说，术语“具有目标物质生产能力的细菌”可以指能够从目标物质的前体获得目标物质的细菌。具体而言，术语“具有目标物质生产能力的细菌”可以指当在含有目标物质的前体的培养基中培养时，能够在培养基中以一定程度产生并积累目标物质，从而可以从中收集目标物质的细菌。而且，具体而言，术语“具有目标物质生产能力的细菌”可以指能够在被允许作用于反应混合物中的目标物质的前体时在反应混合物中以一定程度产生和积累目标物质，从而可以从中收集目标物质的细菌。
具有目标物质生产能力的细菌可以是能够在培养基或反应混合物中以比非修饰菌株可获得的量更大的量积累目标物质的细菌。术语“非修饰菌株”是指未经修饰使得醇脱氢酶的活性降低的对照菌株。非修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株，例如谷氨酸棒状杆菌菌株ATCC 13869和ATCC13032。具有目标物质生产能力的细菌可以是能够在培养基或反应混合物中以例如0.008g/L或更多，0.05g/L或更多，0.3g/L或更多，0.5g/L或更多，1.0g/L或更多，3.0g/L或更多，6.0g/L或更多或9.0g/L或更多的量积累目标物质的细菌。
在本发明中，术语“目标物质”是指醛。该醛的实例包括芳香醛。芳香醛的实例包括香草醛、苯甲醛和肉桂醛。本发明的细菌可以具有仅产生一种目标物质的能力，或者可以具有产生两种或更多种目标物质的能力。此外，本发明的细菌可以具有从目标物质的一种前体或目标物质的两种或更多种前体产生目标物质的能力。
棒状杆菌细菌的实例包括属于棒状杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、细杆菌属(Microbacterium)等的细菌。
这种棒状细菌的具体实例包括以下物种。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
解烷棒状杆菌(Corynebacterium alkanolyticum)
帚石南棒状杆菌(Corynebacterium callunae)
钝齿棒状杆菌(Corynebacteriumcrenatum)
谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)
百合棒杆菌(Corynebacterium lilium)
栖糖蜜棒杆菌(Corynebacterium melassecola)
热产氨棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)(有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens))
力士棒杆菌(Corynebacterium herculis)
二歧短杆菌(Brevibacterium divaricatum)(谷氨酸棒状杆菌)
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)(谷氨酸棒状杆菌)
未成熟短杆菌(Brevibacterium immariophilum)
乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒状杆菌)
玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)
解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)
硫殖短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)
产氨短杆菌(Corynebacterium ammoniagenes)(Corynebacterium stationis)
白色短杆菌(Brevibacterium album)
蜡状短杆菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨细杆菌(Microbacterium ammoniaphilum)
棒状杆菌细菌的具体实例包括以下菌株。
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
醋谷氨酸棒状杆菌ATCC 15806
解烷棒杆菌ATCC 21511
帚石南棒状杆菌ATCC 15991
钝齿棒状杆菌AS1.542
谷氨酸棒状杆菌ATCC 13020,ATCC 13032,ATCC 13060,ATCC 13869,FERM BP-734
百合棒杆菌ATCC 15990
栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965
有效棒杆菌(热产氨棒状杆菌)AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒杆菌ATCC 13868
二歧短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 14020
黄色短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 13826,ATCC 14067,AJ12418(FERM BP-2205)
未成熟短杆菌ATCC 14068
乳糖发酵短杆菌(谷氨酸棒状杆菌)ATCC 13869(2256菌株)
玫瑰色短杆菌ATCC 13825
解糖短杆菌ATCC 14066
硫殖短杆菌ATCC 19240
产氨短杆菌(Corynebacterium stationis)ATCC 6871,ATCC 6872
白色短杆菌ATCC 15111
蜡状短杆菌ATCC 15112
嗜氨细杆菌ATCC 15354
棒状杆菌细菌包括先前被分类为短杆菌属但目前掺入棒状杆菌属中的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,41,255(1991))。此外，Corynebacterium stationis包括先前已被分类为产氨棒状杆菌，但目前基于16S rRNA的核苷酸序列分析等重新分类为Corynebacterium stationis的细菌(Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,60,874-879(2010))。
这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址：12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland 20852,P.O.Box 1549,Manassas,VA20108,United States ofAmerica)获得。也就是说，注册号被赋予各自的菌株，并且菌株可以通过使用这些注册号订购(参见http://www.atcc.org/)。美国典型培养物保藏中心的目录中列出了菌株的注册号。这些菌株也可以从例如菌株保藏的保藏所获得。
本发明的细菌可以是固有具有目标物质生产能力的细菌，或者可以是经修饰以具有目标物质生产能力的细菌。具有目标物质生产能力的细菌可以通过赋予如上所述的此类细菌以目标物质生产能力或增强如上所述的此类细菌的目标物质生产能力来获得。
以下，说明赋予或提高目标物质生成能力的方法的具体实例。为了赋予或提高目标物质生产能力，下面举例说明的此类修饰可以独立使用，或者可以适当组合使用。
目标物质可以通过参与目标物质生物合成的酶的作用产生。此类酶也称为“目标物质生物合成酶”。因此，本发明的细菌可以具有目标物质生物合成酶。换句话说，本发明的细菌可以具有编码目标物质生物合成酶的基因。此类基因也称为“目标物质生物合成基因”。本发明的细菌可以固有具有目标物质生物合成基因，或者可以是已经导入了目标物质生物合成基因的细菌。稍后将解释用于引入基因的方法。
另外，通过提高目标物质生物合成酶的活性，可以提高细菌的目标物质生产能力。也就是说，赋予或提高目标物质生成能力的方法的实例包括提高目标物质生物合成酶的活性的方法。也就是说，本发明的细菌可以已被修饰，从而增加了目标物质生物合成酶的活性。一种目标物质生物合成酶的活性可以增加，或者两种或更多种目标物质生物合成酶的活性可以增加。稍后将描述用于增加蛋白质(酶等)的活性的方法。通过例如增加编码蛋白质的基因的表达，可以提高蛋白质(酶等)的活性。
目标物质可以从例如碳源和/或目标物质的前体产生。因此，目标物质生物合成酶的实例包括例如催化从碳源和/或前体向目标物质转化的酶。例如，3-脱氢莽草酸可以通过部分莽草酸途径产生，其可以包括由3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)，3-脱氢奎尼酸合酶和3-脱氢奎尼酸脱水酶催化的步骤；可以通过3-脱氢莽草酸脱水酶(DHSD)的作用将3-脱氢莽草酸转化为原儿茶酸；可以通过O-甲基转移酶(OMT)或芳香醛氧化还原酶(芳香族羧酸还原酶，ACAR)的作用将原儿茶酸分别转化为香草酸或原儿茶醛；以及可以通过ACAR或OMT的作用将香草酸或原儿茶醛转化为香草醛。而且，苯甲醛和肉桂醛可以分别由例如苯甲酸和肉桂酸通过ACAR的作用产生。也就是说，目标物质生物合成酶的具体实例包括例如DAHP合酶，3-脱氢奎尼酸合酶，3-脱氢奎尼酸脱水酶，DHSD，OMT和ACAR。
术语“3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸合酶(DAHP合酶)”是指具有催化将D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸转化成3-脱氧-D-阿拉伯-庚糖酮酸7-磷酸(DAHP)和磷酸的反应的活性的蛋白质(EC 2.5.1.54)。编码DAHP合酶的基因也称为“DAHP合酶基因”。DAHP合酶的实例包括分别由aroF，aroG和aroH基因编码的AroF，AroG和AroH蛋白。其中，AroG可以发挥主要的DAHP合酶功能。诸如AroF，AroG和AroH蛋白的DAHP合酶的实例包括各种生物如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌和棒状杆菌细菌的那些。DAHP合酶的具体实例包括大肠杆菌的AroF，AroG和AroH蛋白。大肠杆菌K-12MG1655的aroG基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:85所示，并且由该基因编码的AroG蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示。
DAHP合酶活性可以通过例如将酶与底物(即D-赤藓糖-4-磷酸和磷酸烯醇丙酮酸)温育并测量DAHP的酶和底物依赖性生成来测量。
术语“3-脱氢奎尼酸合酶”是指具有催化脱磷酸化DAHP以产生3-脱氢奎宁酸的反应的活性的蛋白质(EC 4.2.3.4)。编码3-脱氢奎尼酸合酶的基因也称为“3-脱氢奎尼酸合酶基因”。3-脱氢奎尼酸合酶的实例包括由aroB基因编码的AroB蛋白。3-脱氢奎尼酸合酶如AroB蛋白的实例包括各种生物如肠杆菌科细菌和棒状杆菌细菌的那些。3-脱氢奎尼酸合酶的具体实例包括大肠杆菌的AroB蛋白。大肠杆菌K-12MG1655的aroB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:87所示，并且由该基因编码的AroB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:88所示。
3-脱氢奎尼酸合酶活性可以通过例如将酶与底物(即DAHP)温育并测量3-脱氢奎宁酸的酶和底物依赖性产生来测量。
术语“3-脱氢奎尼酸脱水酶”是指具有催化脱水3-脱氢奎宁酸生成3-脱氢莽草酸的反应的活性的蛋白质(EC 4.2.1.10)。编码3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因也称为“3-脱氢奎尼酸脱水酶基因”。3-脱氢奎尼酸脱水酶的实例包括由aroD基因编码的AroD蛋白。3-脱氢奎尼酸脱水酶例如AroD蛋白的实例包括各种生物如肠杆菌科细菌和棒杆菌的那些。3-脱氢奎尼酸脱水酶的具体实例包括大肠杆菌的AroD蛋白。大肠杆菌K-12MG1655的aroD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:89所示，并且由该基因编码的AroD蛋白的氨基酸序列如SEQID NO:90所示。
3-脱氢奎尼酸脱水酶活性可以通过例如将酶与底物(即3-脱氢奎宁酸)温育并测量3-脱氢莽草酸的酶和底物依赖性产生来测量。
术语“3-脱氢草酸脱水酶(DHSD)”是指具有催化脱水3-脱氢莽草酸生成原儿茶酸的反应的活性的蛋白质(EC 4.2.1.118)。编码DHSD的基因也称为“DHSD基因”。DHSD的实例包括由asbF基因编码的AsbF蛋白。DHSD例如AsbF蛋白的实例包括各种生物如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)和Neurospora crassa的那些。苏云金芽孢杆菌BMB171的asbF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:91所示，并且由该基因编码的AsbF蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示。
DHSD活性可以通过例如将酶与底物(即3-脱氢莽草酸)温育并测量原儿茶酸的酶和底物依赖性产生来测量。
编码莽草酸途径的酶如DAHP合酶，3-脱氢奎尼酸合酶和3-脱氢奎尼酸脱水酶的基因的表达受到酪氨酸阻遏物TyrR阻遏，所述TyrR其由tyrR基因编码。因此，莽草酸途径酶的活性也可以通过降低酪氨酸阻遏物TyrR的活性而增加。大肠杆菌K-12MG1655的tyrR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:93所示，并且由该基因编码的TyrR蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:94所示。
术语“O-甲基转移酶(OMT)”是指具有在甲基供体存在下催化原儿茶酸和/或原儿茶醛的甲基化反应以产生香草酸和/或香草醛的活性的蛋白质(即间位羟基的甲基化，EC2.1.1.68等)。此活性也称为“OMT活性”。编码OMT的基因也称为“OMT基因”。OMT通常可以使用原儿茶酸和原儿茶醛作为底物，但不一定限于此。也就是说，可以采用具有所需底物特异性的OMT，这取决于在本发明的方法中生产目标物质的生物合成途径的类型。例如，当通过从原儿茶酸到香草酸的转化步骤生产香草醛时，可以使用至少使用原儿茶酸的OMT。另外，例如，当香草醛通过从原儿茶醛转化为香草醛的转化步骤产生时，可以使用至少使用原儿茶醛的OMT。甲基供体的实例包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)。OMT的实例包括各种生物的OMT，例如人(Homo sapiens)(Hs)的OMT(GenBank登录号NP_000745和NP_009294)，拟南芥(Arabidopsis thaliana)的OMT(GenBank登录号NP_200227和NP_009294)，Fragariaxananassa的OMT(GenBank登录号AAF28353)以及WO2013/022881A1中示例的哺乳动物、植物和微生物的其他各种OMT。人的OMT基因已知四种转录物变体和两种OMT同种型。这四种转录物变体(转录物变体1-4，GenBank登录号NM_000754.3，NM_001135161.1，NM_001135162.1和NM_007310.2)的核苷酸序列显示为SEQ ID NO:41至44，较长OMT同种型(MB-COMT，GenBank登录号NP_000745.1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示，并且较短OMT同种型(S-COMT，GenBank登录号NP_009294.1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。SEQ ID NO:46对应于其N-末端50个氨基酸残基被截短的SEQ ID NO:45。OMT的实例进一步包括拟杆菌纲(Bacteroidetes)细菌(即属于拟杆菌纲的细菌)的OMT。拟杆菌纲细菌的实例包括属于Niastella、Terrimonas、Chitinophaga等的细菌(International Journal of Systematicand Evolutionary Microbiology(2007),57,1828-1833)。Niastella细菌的实例包括Niastella koreensis。Niastella koreensis的OMT基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:95所示，并且由该基因编码的OMT的氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示。
OMT还可以催化原儿茶酸和/或原儿茶醛的甲基化反应以产生异香草酸和/或异香草醛(即对位羟基的甲基化)作为副反应。作为OMT，优选选择性催化间位羟基的甲基化的。表述“选择性催化间位羟基的甲基化”可以意味着OMT选择性地从原儿茶酸生成香草酸的OMT和/或选择性地从原儿茶醛生成香草醛的OMT。表述“从原儿茶酸选择性产生香草酸”可以表示当允许OMT作用于原儿茶酸时按摩尔比计，OMT产生香草酸的量为异香草酸的量的例如3倍或更多，5倍或更多，10倍或更多，15倍或更多，20倍或更多，25倍或更多，或30倍或更多。此外，表述“从原儿茶醛选择性产生香草酸”可以表示当允许OMT作用于原儿茶醛时按摩尔比计，OMT产生香草醛的量为异香草酸的量的例如3倍或更多，5倍或更多，10倍或更多，15倍或更多，20倍或更多，25倍或更多，或者30倍或更多。选择性催化间位羟基甲基化的OMT的实例包括后述的具有“特定突变”的OMT。
具有“特定突变”的OMT也称为“突变体OMT”。编码突变体OMT的基因也称为“突变体OMT基因”。
不具有“特定突变”的OMT也称为“野生型OMT”。编码野生型OMT的基因也称为“野生型OMT基因”。本文提及的术语“野生型”是为了方便将“野生型”OMT与“突变体”OMT区分开而使用，并且“野生型”OMT不限于作为天然物质获得的那些，并且包括任何没有“特定突变”的OMT。野生型OMT的实例包括例如上面例示的OMT。另外，上述例示的所有OMT保守变体应当包括在野生型OMT中，条件是此类保守变体不具有“特定突变”。
“特定突变”的实例包括WO2013/022881A1中描述的突变体OMT中包含的突变。也就是说，“特定突变”的实例包括野生型OMT的198位亮氨酸残基(L198)被比亮氨酸残基的疏水性指数显示更低疏水性指数(亲水性指数)的氨基酸残基取代的突变，以及野生型OMT的199位谷氨酸残基(E199)被在pH7.4具有中性或正侧链电荷的氨基酸残基取代的突变。突变体OMT可以具有这些突变中的一个或两者。
“比亮氨酸残基的疏水性指数显示更低疏水性指数(亲水指数)的氨基酸残基”的实例包括Ala,Arg,Asn,Asp,Cys,Glu,Gln,Gly,His,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp和Tyr。作为“比亮氨酸残基的疏水性指数显示更低疏水性指数(亲水指数)的氨基酸残基”，特别优选选自Ala,Arg,Asn,Asp,Glu,Gln,Gly,His,Lys,Met,Pro,Ser,Thr,Trp和Tyr的氨基酸残基，并且Tyr是更优选的。
“在pH7.4具有中性或正侧链电荷的氨基酸残基”包括Ala,Arg,Asn,Cys,Gln,Gly,His,Ile,Leu,Lys,Met,Phe,Pro,Ser,Thr,Trp,Tyr和Val。作为“在pH7.4具有中性或正侧链电荷的氨基酸残基”，Ala或Gln是特别优选的。
在本发明中，任意的野生型OMT中的“L198”和“E199”是指“与以SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的第198位的亮氨酸残基对应的氨基酸残基”，“与以SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的第199位谷氨酸残基对应的氨基酸残基”。这些氨基酸残基的位置表示相对位置，并且其绝对位置可以由于氨基酸残基的缺失，插入，添加等而改变。例如，如果在SEQ IDNO:46所示的氨基酸序列中的位置X的N端侧的位置缺失或插入一个氨基酸残基，则原来在位置X处的氨基酸残基重新定位在位置X-1或X+1，但仍被认为是“与SEQ ID NO:46所示的氨基酸序列的X位的氨基酸残基对应的氨基酸残基”。此外，虽然“L198”和“E199”通常分别是亮氨酸残基和谷氨酸残基，但它们可以不是亮氨酸残基和谷氨酸残基。也就是说，当“L198”和“E199”分别不是亮氨酸残基和谷氨酸残基时，“特定突变”包括那些氨基酸残基各自被突变后存在的任何上述氨基酸残基替换的突变。
在任意OMT的氨基酸序列中，哪个氨基酸残基为对应于“L198”或“E199”的氨基酸残基可以通过将任意OMT的氨基酸序列和SEQ ID NO:46的氨基酸序列比对确定。比对可以通过例如使用已知的基因分析软件来进行。此类软件的具体实例包括由HitachiSolutions生产的DNASIS，Genetyx生产的GENETYX等(Elizabeth C.Tyler et al.,Computers and Biomedical Research,24(1)72-96,1991；Barton GJ et al.,Journal ofMolecular Biology,198(2),327-37,1987)。
例如，可以通过修饰野生型OMT基因使得由其编码的OMT具有“特异性突变”来获得突变体OMT基因。待修饰的野生型OMT基因可以通过例如从具有野生型OMT基因的生物体的克隆或化学合成获得。此外，也可以不使用野生型OMT基因而获得突变体OMT基因。例如，可以通过化学合成直接获得突变体OMT基因。获得的突变OMT基因可以在使用前进一步修饰。
基因可以通过使用已知的方法进行修改。例如，可以通过位点特异性诱变方法将目标突变引入DNA的靶位点。位点特异性诱变方法的实例包括使用PCR的方法(Higuchi,R.,61,in PCR Technology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press(1989)；Carter P.,Meth.InEnzymol.,154,382(1987))；以及使用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.inEnzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。
可以通过例如在SAM存在下将酶与底物(即原儿茶酸或原儿茶醛)温育并测量相应产物(即香草酸或香草醛)的酶和底物依赖性产生来测量OMT活性(WO2013/022881A1)。此外，通过在相同条件下测量相应副产物(即异香草酸或异香草醛)的产生，并将副产物的产生与产物的产生进行比较，可以确定OMT是否选择性地生成产物。
术语“芳香醛氧化还原酶(芳香族羧酸还原酶；ACAR)”是指具有在电子供体和ATP的存在下催化还原芳香羧酸的反应以产生相应的芳香醛的活性的蛋白质(EC 1.2.99.6等)。此活性也称为“ACAR活性”。编码ACAR的基因也称为“ACAR基因”。根据本发明的方法中产生目标物质的生物合成途径的类型，可以使用具有所需底物特异性的ACAR。例如，当通过从香草酸到香草醛的转化步骤生产香草醛时，可以使用至少使用香草酸的ACAR。另外，例如，当通过从原儿茶酸到原儿茶醛的转化步骤产生香草醛时，可以使用至少使用原儿茶酸的ACAR。也就是说，具体而言，术语“ACAR”还可以指具有在电子供体和ATP存在下催化还原香草酸和/或原儿茶酸以产生香草醛和/或原儿茶醛的反应的活性的蛋白质。ACAR可以使用香草酸和原儿茶酸两者作为底物，但不一定限于此。另外，当生产苯甲醛时，可以使用至少使用苯甲酸的ACAR。也就是说，具体而言，术语“ACAR”还可以指具有在存在电子供体和ATP的情况下催化还原苯甲酸以产生苯甲醛的反应的活性的蛋白质。另外，当生产肉桂醛时，可以使用至少使用肉桂酸的ACAR。也就是说，具体而言，术语“ACAR”还可以指具有在电子供体和ATP存在下催化肉桂酸还原反应以产生肉桂醛的活性的蛋白质。电子供体的实例包括NADH和NADPH。
ACAR的实例包括各种微生物如诺卡尔菌属种(Nocardia sp.)菌株NRRL5646、放线菌属种、热乙酸梭菌(Clostridium thermoaceticum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、甜瓜棒孢(Corynespora melonis)、革盖菌属种(Coriolus sp.)和链孢霉属种(Neurosporasp.)(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。诺卡尔菌属种菌株NRRL 5646已被分类为Nocardia iowensis。ACAR的实例还包括其他诺卡氏菌细菌的ACAR，例如巴西诺卡菌和受损诺卡氏菌(Nocardia vulneris)。巴西诺卡菌ATCC 700358的ACAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:75所示，并且由该基因编码的ACAR的氨基酸序列如SEQID NO:76所示。另外，巴西诺卡菌ATCC 700358的变体ACAR基因实例的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示，并且由该基因编码的ACAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示。ACAR的实例还包括戈登氏菌(Gordonia)细菌(即属于戈登氏菌属的细菌)的ACAR。戈登氏菌细菌的实例包括Gordoniaeffusa。Gordonia effusa的ACAR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:97所示，并且由该基因编码的ACAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示。另外，Gordonia effusa的密码子优化的ACAR基因的实例的核苷酸序列如SEQ ID NO:100所示。
可以通过例如在ATP和NADPH存在下将酶与底物(即香草酸或原儿茶酸)温育并测量NADPH的酶和底物依赖性氧化来测量ACAR活性(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485中所述的方法的修改)。
可以通过磷酸泛酰巯基乙胺化(phosphopantetheinylation)将ACAR变为活性酶(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。因此，ACAR活性也可以通过增加催化蛋白质的磷酸泛酰巯基乙胺化的酶(也称为“磷酸泛酰巯基乙胺基化酶”)的活性来增加。也就是说，赋予或提高目标物质生产能力的方法的实例包括增加磷酸泛酰巯基乙胺基化酶的活性的方法。也就是说，本发明的细菌可以已经被修饰，使得磷酸泛酰巯基乙胺基化酶的活性增加。磷酸泛酰巯基乙胺基化酶的实例包括磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)。
术语“磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)”是指具有在磷酸泛酰巯基乙胺基供体存在下催化磷酸泛酰巯基乙胺化ACAR的反应的活性的蛋白质。此活性也称为“PPT活性”。编码PPT的基因也称为“PPT基因”。磷酸泛酰巯基乙胺基供体的实例包括辅酶A(CoA)。PPT的实例包括EntD蛋白，其由entD基因编码。PPT例如EntD蛋白质的实例包括各种生物体的那些。PPT的具体实例包括大肠杆菌的EntD蛋白。大肠杆菌K-12MG1655的entD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:49所示，并且由该基因编码的EntD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示。PPT的具体实例还包括巴西诺卡菌的PPT，皮疽诺卡菌(Nocardia farcinica)IFM10152的PPT(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)和谷氨酸棒状杆菌的PPT(App.Env.Microbiol.2009,Vol.75,No.9,pp.2765-2774)。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的PPT基因的核苷酸序列如SEQID NO:51所示，并且由该基因编码的PPT的氨基酸序列如SEQID NO:52所示。
PPT活性可以基于例如在CoA存在下与ACAR温育时观察到的ACAR活性的增强来测量(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。
而且，如上所述，苯甲醛和肉桂醛可以分别从例如苯甲酸和肉桂酸产生。也就是说，目标物质生物合成酶的实例还包括例如苯甲酸生物合成酶和肉桂酸生物合成酶。具体而言，肉桂酸可以通过苯丙氨酸脱氨酶(PAL；EC4.3.1.24)的作用从例如L-苯丙氨酸生成。也就是说，肉桂酸生物合成酶的实例包括例如L-苯丙氨酸生物合成酶和PAL。L-苯丙氨酸生物合成酶的实例包括芳香氨基酸的常见生物合成酶，如3-脱氧-D-阿拉伯庚糖酮酸-7-磷酸合酶(aroF，aroG，aroH)，3-脱氢奎尼酸合酶(aroB)，3-脱氢奎尼酸脱水酶(aroD)，莽草酸脱氢酶(aroE)，莽草酸激酶(aroK，aroL)，5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(aroA)和分支酸合酶(AROC)；以及分支酸变位酶(pheA)，预苯酸脱水酶(pheA)和酪氨酸氨基转移酶(tyrB)。分支酸变位酶和预苯酸脱水酶可由pheA基因编码为双功能酶。
用于赋予或提高目标物质生产能力的方法的实例还包括提高目标物质以外物质，例如在生产目标物质期间作为中间产物生成的物质和用作目标物质前体的物质的吸收系统的活性的方法。也就是说，本发明的细菌可以已被修饰，使得此类摄取系统的活性增加。术语“物质的吸收系统”是指具有将来自细胞外部的物质掺入细胞的功能的蛋白质。此活性也称为“物质的摄取活性”。编码此类摄取系统的基因也称为“摄取系统基因”。此类摄取系统的实例包括香草酸摄取系统和原儿茶酸摄取系统。香草酸摄取系统的实例包括由vanK基因编码的VanK蛋白(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007,153:857-865)。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的vanK基因(NCgl2302)的核苷酸序列如SEQ ID NO:53所示，并且由该基因编码的VanK蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:54所示。原儿茶酸摄取系统基因包括由pcaK基因编码的PcaK蛋白(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007,153:857-865)。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的pcaK基因(NCgl1031)的核苷酸序列如SEQ ID NO:55所示，并且由该基因编码的PcaK蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:56所示。
可以根据例如已知方法(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007.153:857-865)测量物质的摄取活性。
用于赋予或提高目标物质生产能力的方法的实例还包括降低参与目标物质以外的物质的副产物的酶的活性的方法。除了目标物质以外的此类物质也称为“副产物”。此类酶也称为“副产物生成酶”。副产物生成酶的实例包括例如参与目标物质利用的酶和催化远离目标物质的生物合成途径分支的反应以产生除目标物质之外的物质的酶。稍后将描述降低蛋白质(酶等)的活性的方法。通过例如破坏编码蛋白质的基因可以降低蛋白质(酶等)的活性。例如，据报道，在棒状杆菌细菌中，香草醛按香草醛->香草酸->原儿茶酸的顺序代谢并利用(Current Microbiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。也就是说，副产物生成酶的具体实例包括催化香草醛转化为原儿茶酸的酶和催化原儿茶酸进一步代谢的酶。此类酶的实例包括香草酸脱甲基酶，原儿茶酸3,4-双加氧酶，以及将原儿茶酸3,4-双加氧酶的反应产物进一步分解为琥珀酰-CoA和乙酰-CoA的各种酶(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。此外，作为香草醛生物合成途径中间体的3-脱氢莽草酸也可以通过莽草酸脱氢酶的作用转化为莽草酸。也就是说，用于香草醛生产的副产物生成酶的具体实例还包括莽草酸脱氢酶。
术语“香草酸脱甲基酶”是指具有催化香草酸脱甲基化生成原儿茶酸的反应的活性的蛋白质。此活性也称为“香草酸脱甲基酶活性”。编码香草酸脱甲基酶的基因也称为“香草酸脱甲基酶基因”。香草酸脱甲基酶的实例包括由vanAB基因编码的VanAB蛋白(CurrentMicrobiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。vanA基因和vanB基因分别编码香草酸脱甲基酶的亚基A和亚基B。为了降低香草酸脱甲基酶活性，这两种vanAB基因可以被破坏等，或者两者中仅一种可以被破坏等。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的vanAB基因的核苷酸序列分别如SEQID NO:57和59所示，并且由这些基因编码的VanAB蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:58和60所示。vanAB基因通常与vanK基因一起构成vanABK操纵子。因此，为了降低香草酸脱甲基酶活性，vanABK操纵子可以被完全破坏等(例如删除)。在这种情况下，可以将vanK基因再引入宿主。例如，当使用存在于细胞外的香草酸，并且vanABK操纵子完全被破坏等(例如删除)时，优选再引入vanK基因。
香草酸脱甲基酶活性可以通过例如将酶与底物(即香草酸)温育并测量原儿茶酸的酶和底物依赖性产生来测量(J Bacteriol,2001,Vol.183,p3276-3281)。
术语“原儿茶酸3,4-双加氧酶”是指具有催化氧化原儿茶酸反应生成β-羧基-顺,顺-粘康酸的反应活性的蛋白质。此活性也称为“原儿茶酸3,4-双加氧酶活性”。编码原儿茶酸3,4-双加氧酶的基因也称为“原儿茶酸3,4-双加氧酶基因”。原儿茶酸3,4-双加氧酶的实例包括由pcaGH基因编码的PcaGH蛋白(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,Vol.95,p77-89)。pcaG基因和pcaH基因分别编码原儿茶酸3,4-双加氧酶的α亚基和β亚基。为了降低原儿茶酸3,4-双加氧酶活性，这两种pcaGH基因可以被破坏等，或者两者中仅一种可以被破坏等。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的pcaGH基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:61和63所示，并且由这些基因编码的PcaGH蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:62和64所示。
原儿茶酸3,4-双加氧酶活性可以通过例如将酶与底物(即原儿茶酸)温育并测量酶和底物依赖性氧消耗量来测量(Meth.Enz.,1970,Vol.17A,p526-529)。
术语“莽草酸脱氢酶”是指具有在电子供体存在下催化还原3-脱氢莽草酸以产生莽草酸的反应的活性的蛋白质(EC 1.1.1.25)。该活性也称为“莽草酸脱氢酶活性”。编码莽草酸脱氢酶的基因也称为“莽草酸脱氢酶基因”。电子供体的实例包括NADH和NADPH。莽草酸脱氢酶的实例包括AroE蛋白，其由aroE基因编码。大肠杆菌K-12MG1655的aroE基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:101所示，并且由该基因编码的AroE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:102所示。
莽草酸脱氢酶活性可通过例如在NADPH或NADH存在下将酶与底物(即3-脱氢莽草酸)温育并测量NADPH或NADH的酶和底物依赖性氧化来测量。
根据本发明的方法中产生目标物质的生物合成途径的类型和本发明的细菌固有拥有的蛋白质的类型和活性，可以适当地选择活性待修饰的蛋白质。例如，当通过生物转化方法从原儿茶酸生产香草醛时，可以优选增加选自OMT，ACAR，PPT和原儿茶酸摄取系统的一种或多种蛋白质的一种或多种活性。此外，当通过生物转化方法从原儿茶醛生产香草醛时，可以优选增加OMT的活性。另外，当通过生物转化方法从香草酸生产香草醛时，可以优选增加一种或多种选自ACAR，PPT和香草酸摄取系统的蛋白质的一种或多种活性。
用于育种具有目标物质生产能力的细菌的基因和蛋白质可以分别具有例如上述例示或其他已知的核苷酸序列和氨基酸序列。此外，用于育种具有目标物质生产能力的细菌的基因和蛋白质可以是上述例示的基因和蛋白质的保守变体，例如具有上述例示的或其他已知核苷酸序列和氨基酸序列的基因和蛋白质。具体而言，例如，用于育种具有目标物质生产能力的细菌的基因可以各自为编码具有上述例示的氨基酸序列的蛋白质或已知蛋白质的氨基酸序列的基因，但包括在一个或几个位置处一个或几个某些氨基酸残基的取代，缺失，插入或添加，只要其原始功能即酶活性，转运蛋白活性等得以保持。至于基因和蛋白质的保守变体，关于后面描述的ADH基因和ADH的保守变体的描述在必要修改后可以适用。
<1-2>醇脱氢酶活性的降低
本发明的细菌已被修饰，以使醇脱氢酶(ADH)的活性降低。具体而言，本发明的细菌已被修饰，使得与非修饰菌株相比，ADH的活性降低。通过对棒状杆菌细菌进行修饰以降低ADH的活性，可以提高细菌的目标物质生产能力，即可以提高利用该细菌生产目标物质。
本发明的细菌可以通过对具有目标物质生产能力的棒状杆菌细菌进行修饰以使其ADH活性降低来获得。本发明的细菌还可以通过修饰棒状杆菌细菌使其ADH活性降低，然后赋予细菌以目标物质生产能力或提高细菌目标物质生产能力而获得。另外，本发明的细菌可以是作为降低ADH活性的修饰的结，或作为用于降低ADH活性的修饰和其他用于赋予或提高目标物质生产能力的修饰的组合的结果而获得了目标物质生产能力的细菌。用于构建本发明细菌的修饰可以以任意顺序进行。
术语“醇脱氢酶(ADH)”是指具有在电子供体存在下催化还原醛以产生醇的反应的活性的蛋白质(EC 1.1.1.1，EC 1.1.1.2，EC 1.1.1.71等)。此活性也称为“ADH活性”。编码ADH的基因也称为“ADH基因”。用作ADH底物的醛的实例包括在本发明的方法中作为目标物质示例的醛，例如芳香醛如香草醛，苯甲醛和肉桂醛。也就是说，在“ADH活性”的定义中提到的醛和醇的组合的实例包括芳香醛和相应的芳香醇的组合，例如香草醛和香草醇的组合，苯甲醛和苯甲醇的组合，以及肉桂醛和肉桂醇的组合。使用芳香醛，香草醛，苯甲醛或肉桂醛的ADH也分别称为“芳香醇脱氢酶”，“香草醇脱氢酶”，“苯甲醇脱氢酶”或“肉桂醇脱氢酶”。此外，将芳香醛，香草醛，苯甲醛或肉桂醛用作底物的ADH活性也称为“芳香醇脱氢酶活性”，“香草醇脱氢酶活性”，“苯甲醇脱氢酶活性”或“肉桂醇脱氢酶活性”。ADH可以使用一种醇，或者可以使用两种或更多种醇。电子供体的实例包括NADH和NADPH。
ADH活性可通过例如在NADPH或NADH存在下将酶与底物(即诸如香草醛的醛)一起温育并测量NADPH或NADH的酶和底物依赖性氧化来测量。在至少一个适当的条件下检测ADH活性就足够了，例如，在适当的电子供体例如NADPH或NADH存在下进行。
ADH的实例包括分别由NCgl0324基因，NCgl0313基因，NCgl2709基因，NCgl0219基因和NCgl2382基因编码的NCgl0324蛋白质，NCgl0313蛋白质，NCgl2709蛋白质，NCgl0219蛋白质和NCgl2382蛋白质。NCgl0324基因，NCgl0313基因，NCgl2709基因，NCgl0219基因和NCgl2382基因可在棒状杆菌细菌例如谷氨酸棒状杆菌中发现。谷氨酸棒状杆菌ATCC13869的NCgl0324基因，NCgl0313基因和NCgl2709基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:65,67和69所示，并且由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:66,68和70所示。谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的NCgl0219基因和NCgl2382基因的核苷酸序列分别如SEQ IDNO:71和73所示，并且由这些基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:72和74所示。也就是说，ADH基因可以是例如具有如SEQ ID NO:65,67,69,71或73所示的核苷酸序列的基因。另外，ADH可以是例如具有氨基酸序列如SEQ ID NO:66,68,70,72或74所示的蛋白质。表述“基因或蛋白质具有核苷酸或氨基酸序列”包括基因或蛋白质包含核苷酸或氨基酸序列的情况，以及其中基因或蛋白质由核苷酸或氨基酸序列组成的情况。
在本发明中，可以降低一种ADH的活性，或者可以降低两种或更多种ADH的活性。例如，可以降低选自NCgl0324蛋白质，NCgl2709蛋白质和NCgl0313蛋白质的一种或多种ADH例如，所有ADH的活性。而且，可以至少降低NCgl0324蛋白和NCgl2709蛋白中任一个或两者的活性。也就是说，例如，可以降低至少NCgl1024蛋白质的活性，并且可以进一步降低NCgl2709蛋白质的活性。或者，可以降低至少NCgl2709蛋白的活性，并且可以进一步降低NCglO324蛋白的活性。ADH与目标物质的组合没有特别限制，只要棒状杆菌细菌中ADH活性的降低提高了目标物质的产量即可。例如，可以降低ADH的活性，其在本发明的方法中至少使用要生产的醛作为目标物质。也就是说，可以降低如香草醛脱脱酶，苯甲醇脱脱酶和肉桂醇脱氢酶等芳香醇脱氢酶的活性，分别用于生产芳香醛，如香草醛，苯甲醛和肉桂醛。具体而言，例如，当生产香草醛时，可以降低NCgl0324蛋白和NCgl0313蛋白中任一种或两者的活性，或可以降低至少NCgl0324蛋白的活性。而且，具体而言，当产生苯甲醛时，可以降低NCg10324蛋白和NCgl2709蛋白中的任一种或两者的活性。另外，具体而言，当产生肉桂酸时，可以降低NCg10324蛋白和NCgl2709蛋白中任一种或两者的活性。NCgl0324蛋白可具有香草醇脱氢酶活性，苯甲醇脱氢酶活性和肉桂醇脱脱酶活性的全部。NCgl2709蛋白可以具有苯甲醇脱氢酶活性和肉桂醇脱氢酶活性。
ADH基因可以是上述例示的任何ADH基因(即NCgl0324基因，NCgl0313基因，NCgl2709基因，NCgl0219基因和NCgl2382基因)的变体，只要其原始功能得以维持即可。类似地，ADH可以是上述例示的任何ADH(即NCgl0324蛋白质，NCgl0313蛋白质，NCgl2709蛋白质，NCgl0219蛋白质和NCgl2382蛋白质)的变体，只要其原始功能得以维持即可。维持其原始功能的变体也可以称为“保守变体”。也就是说，术语“NCgl0324基因”，“NCgl0313基因”，“NCgl2709基因”，“NCgl0219基因”和“NCgl2382基因”不仅包括上面例示的NCgl0324基因，NCgl0313基因，NCgl2709基因，NCgl0219基因和NCgl2382基因，但也包括其各自的保守变体。类似地，术语“NCgl0324蛋白质”，“NCgl0313蛋白质”，“NCgl2709蛋白质”，“NCgl0219蛋白质”和“NCgl2382蛋白质”不仅包括上面例示的NCgl0324蛋白质，NCgl0313蛋白质，NCgl2709蛋白质，NCgl0219蛋白质和NCgl2382蛋白质，但也包括其各自的保守变体。保守变体的实例包括例如上文例示的ADH基因或ADH的同源物和人工修饰形式。
表述“保持原始功能”是指基因或蛋白质的变体具有对应于原始基因或蛋白质的功能(例如活性或性质)的功能(例如活性或性质)。用于基因的表述“保持原始功能”是指该基因的变体编码维持原始功能的蛋白质。也就是说，用于ADH基因的表述“保持原始功能”意味着基因的变体编码ADH。用于ADH的表述“保持原始功能”意味着蛋白质的变体具有ADH活性。
以下将解释保守变体的实例。
ADH基因的同源物或ADH的同源物可以使用上述例示的ADH基因的任何核苷酸序列或上文例示的任何ADH氨基酸序列作为查询序列通过例如BLAST搜索或FASTA搜索从公共数据库容易地获得。此外，ADH基因的同源物可以通过例如使用棒状杆菌细菌等生物体的染色体作为模板和基于上述例示的ADH基因的任何核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物的PCR获得。
ADH基因可以是编码具有任何上述氨基酸序列的蛋白质的基因(例如对于NCgl0324蛋白,NCgl0313蛋白,NCgl2709蛋白,NCgl0219蛋白和NCgl2382蛋白分别为以SEQID NO:66,68,70,72和74所示的氨基酸序列)，包括在一个或几个位置处一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入和/或添加，只要维持原始功能即可。例如，编码的蛋白质可以具有延伸的或缺失的N端和/或C端。尽管以上使用的术语“一个或几个”所表示的数目可以随蛋白质的三维结构中的氨基酸残基的位置或氨基酸残基的类型而不同，具体而言，它例如为1至50,1至40或1至30，优选1至20，更优选1至10，还更优选1至5，特别优选1至3。
一个或几个氨基酸残基的上述取代，缺失，插入和/或添加各自是保持蛋白质原始功能的保守突变。保守性突变的典型实例是保守性替代。如果取代位点是芳香氨基酸，则保守取代是其中取代在Phe，Trp和Tyr之间相互发生的突变；如果它是疏水性氨基酸，则保守取代是取代在Leu，Ile和Val之间相互发生的突变；如果它是极性氨基酸；则保守取代是取代在Gln和Asn之间相互发生的突变；如果它是碱性氨基酸，则保守取代是取代在Lys，Arg和His之间相互发生的突变；如果它是酸性氨基酸，则保守取代是取代在Asp和Glu之间相互发生的突变；以及如果它是具有羟基的氨基酸，则保守取代是取代在Ser和Thr之间相互发生的突变。认为是保守性取代的取代的实例包括具体地，Ser或Thr取代Ala，Gln，His，或Lys取代Arg，Glu，Gln，Lys，His，或Asp取代Asn，Asn，Glu，或Gln取代Asp，Ser或Ala取代Cys，Asn，Glu，Lys，His，Asp，或Arg取代Gln，Gly，Asn，Gln，Lys，或Asp取代Glu，Pro取代Gly，Asn，Lys，Gln，Arg，或Tyr取代His，Leu，Met，Val，或Phe取代Ile，Ile，Met，Val，或Phe取代Leu，Asn，Glu，Gln，His，或Arg取代Lys，Ile，Leu，Val，或Phe取代Met，Trp，Tyr，Met，Ile，或Leu取代Phe，Thr或Ala取代Ser，Ser或Ala取代Thr，Phe或Tyr取代Trp，His，Phe，或Trp取代Tyr，以及Met，Ile，或Leu取代Val。此外，如上所述的氨基酸残基的此类取代，缺失，插入，添加等包括由于个体差异引起的天然存在的突变或者该基因来源(突变体或变体)的生物体的物种的差异。
此外，ADH基因可以是编码与上述任何氨基酸序列的总氨基酸序列显示例如50％或更多，65％或更多，或80％或更多，优选90％或更多，更优选95％或更多，更优选为97％或更多，特别优选为99％或更多的同源性的氨基酸序列的蛋白质的基因，只要保持原有的功能。另外，在本说明书中，“同源性”是指“同一性”。
此外，ADH基因可以是能够在严格条件下与可以从任何前述核苷酸序列(例如，对于NCgl0324基因,NCgl0313基因,NCgl2709基因,NCgl0219基因,和NCgl2382基因分别为以SEQ ID NOS:65,67,69,71,和73所示的核苷酸序列)制备的探针，例如与任何上述核苷酸序列的全部序列或部分序列互补的序列杂交的基因(例如DNA)，只要保持原始功能。“严格条件”是指形成所谓特异性杂合物，并且不形成非特异性杂合物的条件。严格条件的实例包括高度同源的DNA彼此杂交(例如，不小于50％,65％,或80％同源，优选不小于90％同源，更优选不小于95％同源，仍更优选不小于97％同源，特别优选不小于99％同源的DNA彼此杂交，并且同源性小于上述项的DNA不彼此杂交)的那些条件，或典型的Southern杂交的清洗条件，即在与1x SSC，0.1％SDS于60℃，优选0.1x SSC，0.1％SDS于60℃，更优选0.1x SSC，0.1％SDS于68℃对应的盐浓度和温度清洗1次，优选2或3次的条件。
用于上述杂交的探针可以是与如上述的基因互补的序列的一部分。此类探针可以使用基于已知基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有任何上述基因的DNA片段作为模板通过PCR制备。作为探针，例如可以使用长度约300bp的DNA片段。当使用长度为约300bp的DNA片段作为探针时，具体而言，杂交的清洗条件可以是例如50℃，2xSSC和0.1％SDS。
此外，由于关于密码子简并性的性质随宿主而变化，ADH基因可以包括相应等同密码子对任意密码子的替换。也就是说，由于遗传密码的简并性，ADH基因可以是以上例示的任何ADH基因的变体。
例如，可以通过使用数学算法来确定两个序列之间的序列同一性的百分比。此类数学算法的非限制性实例包括Myers and Miller(1988)CABIOS4:11-17的算法、Needlemanand Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-453的同源性比对算法、Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444-2448的同源性筛选方法、和Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264的算法的修改形式，诸如记载于Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877的。
通过使用基于此类数学算法的程序，可以执行用于确定序列同一性的序列比较(即比对)。该程序可以由计算机适当地执行。此类程序的实例包括但不限于PC/Gene程序的CLUSTAL(可从Intelligenetics,Mountain View,Calif.获得)，ALIGN程序(版本2.0)以及Wisconsin Genetics Software Package,版本8(可从Genetics Computer Group(GCG),575Science Drive,Madison,Wis.,USA获得)的GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以通过使用例如初始参数来执行。CLUSTAL程序充分记载于Higgins etal.(1988)Gene 73:237-244(1988),Higgins et al.(1989)CABIOS 5:151-153,Corpet etal.(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90,Huang et al.(1992)CABIOS 8:155-65,以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-331。
为了获得与靶核苷酸序列同源的核苷酸序列，具体而言，例如，可以通过使用BLASTN程序以100的得分和12的字长来进行BLAST核苷酸搜索。为了获得与靶蛋白质同源的氨基酸序列，特别地，例如可以通过以50的得分和3的字长使用BLASTX程序进行BLAST蛋白质搜索。关于BLAST核苷酸搜索和BLAST蛋白质搜索，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。另外，为了比较目的，可以使用Gapped BLAST(BLAST 2.0)以获得包含缺口的比对。另外，可以使用PSI-BLAST来执行重复搜索以检测序列之间的远距离关系。关于Gapped BLAST和PSI-BLAST，参见Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3389。当使用BLAST、Gapped BLAST或PSI-BLAST时，可以使用每个程序的初始参数(例如核苷酸序列的BLASTN和氨基酸序列的BLASTX)。比对也可以手动执行。
两个序列之间的序列同一性计算为在比对两个序列以便彼此最大限度配合时两个序列中匹配的残基的比率。
前述关于基因和蛋白质的保守变体的描述可以加以必要的修改应用于任意蛋白质的变体，例如目标物质生物合成酶和编码它们的基因。
<1-3>增加蛋白质活性的方法
以下，将解释用于增加蛋白质活性的方法。
表述“蛋白质的活性增加”是指与非修饰菌株相比，蛋白质的活性增加。具体而言，表述“蛋白质的活性增加”可以意味着与非修饰菌株相比，每细胞的蛋白质的活性增加。本文中使用的术语“非修饰菌株”是指尚未被修饰以便增加目标蛋白质活性的对照菌株。非修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。非修饰菌株的具体实例包括细菌物种的相应类型菌株。非修饰菌株的具体实例还包括以上关于细菌描述所例示的菌株。也就是说，在一个实施方案中，与类型菌株，即棒状杆菌细菌所属物种的类型菌株相比，蛋白质的活性可以增加。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13869相比，蛋白质的活性也可以增加。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒状杆菌ATCC13032相比，蛋白质的活性也可以增加。“蛋白质活性的增加”的状态也可以表达为“蛋白质的活性增强”。更具体地说，表述“蛋白质的活性增加”可以意味着与非修饰菌株相比每细胞的蛋白质的分子数目增加，和/或蛋白质的每个分子的功能增加。也就是说，表述“蛋白质活性增加”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，还可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)，蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。此外，“蛋白质的活性增加”的状态不仅包括目标蛋白质的活性在固有具有目标蛋白质的活性的菌株中增加的状态，而且还包括将目标蛋白质的活性赋予不固有地具有目标蛋白质活性的菌株的状态。此外，只要蛋白质的活性最终增加，宿主中固有地包含的目标蛋白质的活性可以减弱和/或消除，然后可以将适当类型的目标蛋白质赋予宿主。
蛋白质活性增加的程度不受特别限制，只要蛋白质的活性与非修饰菌株相比增加即可。蛋白质的活性可以增加至例如非修饰菌株的1.2倍或更多，1.5倍或更多，2倍或更多，或3倍或更多。此外，当非修饰菌株不具有目标蛋白质的活性时，足够的是由于导入编码蛋白质的基因而产生蛋白质，并且例如，蛋白质可以以一定程度生产，使得可以测量到其活性。
提高蛋白质活性的修饰可以通过例如增加编码该蛋白质的基因的表达来实现。表述“基因的表达增加”意指与非修饰菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，基因的表达增加。具体而言，表述“基因表达增加”可以意味着每个细胞的基因表达量与非修饰菌株相比增加。更具体地，表述“基因表达增加”可以意味着基因的转录量(即mRNA的量)增加，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质量)增加。“基因表达增加”的状态也称为“基因表达增强”。基因的表达可以增加至例如非修饰菌株的表达的1.2倍或更多，1.5倍或更多，2倍或更多，或3倍或更多。此外，“基因表达增加”的状态不仅包括目标基因的表达量在固有表达目标基因的菌株中增加的状态，而且还包括将基因导入到不固有地表达目标基因并在其中表达的菌株。也就是说，短语“基因表达增加”也可以意指例如，将目标基因导入不拥有该基因的菌株中并在其中表达。
例如，可以通过增加基因的拷贝数来增加基因的表达。
通过将基因导入宿主的染色体可以增加基因的拷贝数。例如可以通过使用同源重组(Miller,J.H.,Experiments in Molecular Genetics,1972,Cold Spring HarborLaboratory)将基因导入染色体。使用同源重组的基因转移方法的实例包括使用线性DNA的方法，诸如Red驱动的整合(Datsenko,K.A.,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，使用含有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，使用不具有在宿主中起作用的复制起点的自杀载体的方法，使用噬菌体的转导方法。只能引入一个拷贝或两个或更多个基因拷贝。例如，通过使用以染色体上的多个拷贝存在的序列作为靶标进行同源重组，可以将多个拷贝的基因导入染色体。以多个拷贝存在于染色体上的此类序列的实例包括重复DNA和位于转座子两端的反向重复序列。或者，可以通过使用染色体上的适当序列，如对于产生目标物质不必要的基因作为靶标进行同源重组。另外，也可以用转座子或Mini-Mu(日本专利公开(Kokai)No.2-109985,美国专利No.5,882,888,EP805867 B1)将基因随机引入染色体。
可以通过使用具有与全部基因或其一部分互补的序列的探针进行Southern杂交、使用基于该基因序列制备的引物的PCR等确认靶基因对染色体的引入。
此外，通过将含有该基因的载体导入宿主中，也可以增加基因的拷贝数。例如，通过将含有靶基因的DNA片段与在宿主中起作用的载体连接以构建该基因的表达载体，并用该表达载体转化宿主，可以增加靶基因的拷贝数。可以通过例如使用具有靶基因的微生物的基因组DNA作为模板的PCR获得含有靶基因的DNA片段。作为载体，可以使用宿主细胞中可自主复制的载体。该载体优选是多拷贝载体。此外，载体优选具有用于选择转化体的标志物如抗生素抗性基因。此外，载体可以具有用于表达引入的基因的启动子和/或终止子。载体可以是例如源自细菌质粒的载体，源自酵母质粒的载体，源自噬菌体的载体，粘粒，噬菌粒等。可在棒状杆菌细菌中自主复制的载体的具体实例包括例如pHM1519(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；pAM330(Agric.Biol.Chem.,48,2901-2903(1984))；通过改善这些质粒获得并具有药物抗性基因的质粒；日本专利公开(Kokai)No.3-210184中描述的质粒pCRY30；日本专利公开(Kokai)No.2-72876和美国专利No.5,185,262中描述的质粒pCRY21，pCRY2KE，pCRY2KX，pCRY31，pCRY3KE和pCRY3KX；日本专利公开(Kokai)No.1-191686中描述的质粒pCRY2和pCRY3；日本专利公开(Kokai)No.58-192900中描述的pAJ655，pAJ611和pAJ1844；日本专利公开(Kokai)No.57-134500中描述的pCG1；日本专利公开(Kokai)No.58-35197中描述的pCG2；日本专利公开(Kokai)No.57-183799中描述的pCG4和pCG11；日本专利公开(Kokai)No.10-215883中描述的pVK7；WO2007/046389中描述的pVK9；WO2013/069634中描述的pVS7；和日本专利公开(Kokai)No.9-070291中描述的pVC7。
当引入基因时，宿主可表达含有基因是足够的。具体而言，宿主含有基因以便其在宿主中起作用的启动子的控制下表达是足够的。术语“在宿主中起作用的启动子”是指在宿主中显示启动子活性的启动子。启动子可以是源自宿主的启动子或异源启动子。启动子可以是待导入基因的天然启动子或另一基因的启动子。作为启动子，例如也可以使用如后述的更强的启动子。
终止基因转录的终止子可以位于基因的下游。终止子没有特别限制，只要其在宿主中起作用。终止子可以是源自宿主的终止子或异源终止子。终止子可以是待导入基因的天然终止子或另一基因的终止子。
在"Fundamental Microbiology Vol.8,Genetic Engineering,KYORITSUSHUPPAN CO.,LTD,1987"中详细公开了可用于各种微生物中的载体，启动子和终止子，并且可以使用那些。
此外，当引入两个或更多个基因时，基因各自被宿主可表达含有是足够的。例如，所有基因可以由单个表达载体或染色体携带。此外，基因可以分别由两个或更多个表达载体携带，或者分开由单一或两个或更多个表达载体和染色体携带。也可以引入由两个或更多个基因构成的操纵子。“导入2个或更多个基因”的情况包括例如导入编码2种或更多种蛋白质(酶等)的相应基因的情况，导入编码构成单一蛋白质复合物(例如酶复合物)的2种或更多种亚基的相应基因的情况以及上述情况的组合。
待导入的基因没有特别限制，只要它编码在宿主中起作用的蛋白即可。待导入的基因可以是源自宿主的基因，或者可以是异源基因。可以例如使用基于该基因的核苷酸序列设计的引物，并使用具有该基因的生物体的基因组DNA，携带该基因的质粒等作为模板通过PCR获得待导入的基因。待导入的基因也可以完全合成，例如基于该基因的核苷酸序列(Gene,60(1),115-127(1987))。获得的基因可以原样使用，或者根据需要在修饰后使用。也就是说，可以通过修饰基因来获得基因的变体。基因可以通过已知技术进行修饰。例如，可以通过位点特异性突变方法将目标突变引入DNA的目标位点。也就是说，可以通过位点特异性突变方法修饰基因的编码区，使得编码蛋白的特定位点包括氨基酸残基的取代，缺失，插入或添加。位点特异性突变方法的实例包括利用PCR的方法(Higuchi,R.,61,于PCRTechnology,Erlich,H.A.Eds.,Stockton Press(1989)；Carter,P.,Meth.in Enzymol.,154,382(1987))和利用噬菌体的方法(Kramer,W.and Frits,H.J.,Meth.于Enzymol.,154,350(1987)；Kunkel,T.A.et al.,Meth.in Enzymol.,154,367(1987))。或者，可以完全合成基因的变体。
另外，当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可以修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白质的活性最终增加。也就是说，例如，当通过增加基因的表达来增加蛋白质的活性时，可以增强编码亚基的多个基因的部分或全部的表达。通常优选增强编码亚基的多个基因全部的表达。此外，构成该复合物的亚基可以源自单一种类的生物体或两种或更多种生物体，只要该复合物具有目标蛋白质的功能即可。也就是说，例如，可以将编码多个亚基的相同生物体的基因引入宿主，或者可以将编码多个亚基的不同生物体的基因引入宿主中。
此外，通过提高基因的转录效率可以增加基因的表达。另外，通过提高基因的翻译效率也可以增加基因的表达。基因的转录效率和基因的翻译效率可以通过例如修饰基因的表达控制序列来改善。术语“表达控制序列”统称是指影响基因表达的位点。表达控制序列的实例包括例如启动子，Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))和RBS与起始密码子之间的间隔物区。可以通过使用启动子搜索载体或基因分析软件如GENETYX来鉴定表达控制序列。这些表达调控序列可以通过例如使用温度敏感性载体的方法或Red驱动整合方法(WO2005/010175)进行修饰。
通过例如用更强的启动子取代染色体上的基因的启动子可以提高基因的转录效率。术语“更强的启动子”是指与基因的固有存在的野生型启动子相比，提供改善的基因转录的启动子。可用于棒状杆菌细菌的更强启动子的实例包括例如在棒状杆菌细菌中用乙酸、乙醇、丙酮酸等可诱导的人工修饰的P54-6启动子(Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,674-679(2000)),pta,aceA,aceB,adh,和amyE启动子，以及cspB，SOD和tuf(EF-Tu)启动子，它们是能够在棒状杆菌细菌中提供大表达量的有力启动子(Journal of Biotechnology,104(2003)311-323；Appl.Environ.Microbiol.,2005Dec；71(12):8587-96)以及lac启动子，tac启动子和trc启动子。此外，作为更强的启动子，通过使用各种报道基因也可以获得高活性类型的现有启动子。例如，通过使启动子区中的-35和-10区更接近共有序列，可以增强启动子的活性(WO00/18935)。高活性型启动子的实例包括各种tac样启动子(KatashkinaJI et al.,Russian Federation Patent Application No.2006134574)。在Goldstein etal.(Prokaryotic Promoters in Biotechnology,Biotechnol.Annu.Rev.,1,105-128(1995))的论文等中描述了评估启动子强度的方法和强启动子的实例。
例如，通过用更强的SD序列替换染色体上的基因的Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))，可以提高基因的翻译效率。“更强的SD序列”是指与基因固有存在的野生型SD序列相比提供改进的mRNA翻译的SD序列。更强的SD序列的实例包括例如源自噬菌体T7的基因10的RBS(Olins P.O.et al,Gene,1988,73,227-235)。此外，已知在RBS和起始密码子之间的间隔物区中，特别是在紧邻起始密码子上游的序列(5'-UTR)中，几个核苷酸的取代，插入或缺失显著影响mRNA的稳定性和翻译效率，因此，通过修饰它们也可以提高基因的翻译效率。
基因的翻译效率也可以通过例如修饰密码子来改善。例如，通过用更频繁使用的同义密码子取代基因中存在的稀有密码子，可以提高基因的翻译效率。也就是说，可以修饰待导入的基因，例如，从而含有根据在待使用的宿主中观察到的密码子频率的最佳的密码子。例如，可以通过用于将目标突变引入DNA的目标位点的位点特异性突变方法替换密码子。或者，可以完全合成替换目标密码子的基因片段。“密码子选择数据库”(http://www.kazusa.or.jp/codon；Nakamura,Y.et al,Nucl.Acids Res.,28,292(2000))中公开了各种生物体中的密码子的频率。
此外，基因的表达还可以通过扩增增加基因表达的调节子或删除或减弱减少基因表达的调节子来增加。
可以独立使用或以任意组合使用如上所述用于增加基因表达的此类方法。
此外，也可以通过例如增强酶的比活性来获得增加蛋白质活性的修饰。特定活性的增强还包括减少或消除反馈抑制。通过例如搜索各种生物体可以获得显示增强的比活性的蛋白质。此外，通过向现有蛋白质中引入突变也可以获得高活性类型的现有蛋白质。待导入的突变可以是例如在蛋白质的一个或几个位置上一个或几个氨基酸残基的取代，缺失，插入或添加。可以通过例如如上所述的此类位点特异性突变方法来引入突变。突变也可以通过例如诱变处理来引入。诱变处理的实例包括X射线照射，紫外线照射和用突变剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)处理。此外，可以通过用羟胺在体外直接处理DNA来诱导随机突变。比活性的增强可以独立使用，或者可以与如上述用于增强基因表达的此类方法任意组合使用。
用于转化的方法不受特别限制，并且可以使用常规已知的方法。可以通过使用例如原生质体方法(Gene,39,281-286(1985))，电穿孔方法(Bio/Technology,7,1067-1070(1989))或电脉冲法(日本专利公开(Kokai)No.2-207791)进行棒状杆菌细菌的转化。
可以通过测量蛋白质的活性来确认蛋白质活性的增加。
通过确认编码蛋白质的基因的表达增加，也可以确认蛋白质活性的增加。可以通过确认基因转录量的增加或通过确认从该基因表达的蛋白质量的增加来确认基因表达的增加。
可以通过比较从基因转录的mRNA的量与非修饰菌株如野生型菌株或亲本菌株的量来确认基因转录量的增加。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交，RT-PCR等(Sambrook,J.,et al.,Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量可以增加到例如非修饰菌株的量的1.2倍或更多，1.5倍或更多，2倍或更多或3倍或更多。
可以通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)来确认蛋白质量的增加。蛋白质的量可以增加到例如非修饰菌株的量的1.2倍或更多，1.5倍或更多，2倍或更多或3倍或更多。
上述提高蛋白质活性的方法可用于提高任意蛋白质如目标物质生物合成酶，磷酸泛酰巯基乙胺基化酶和物质摄取系统的活性，和增强任意基因如编码那些任意蛋白质的基因的表达。
<1-4>降低蛋白质活性的方法
以下，将解释用于降低蛋白质诸如ADH的活性的方法。
表述“蛋白质的活性降低”是指与非修饰菌株相比蛋白质的活性降低。具体而言，表述“蛋白质的活性降低”可以意味着与非修饰菌株相比，每个细胞的蛋白质的活性降低。本文使用的术语“非修饰菌株”是指没有被修饰以使目的蛋白质的活性降低的对照菌株。非修饰菌株的实例包括野生型菌株和亲本菌株。非修饰菌株的具体实例包括细菌物种的相应类型菌株。非修饰菌株的具体实例还包括以上关于细菌描述所例示的菌株。也就是说，在一个实施方案中，与类型菌株，即棒状杆菌细菌所属物种的类型菌株相比，可以降低蛋白质的活性。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869相比，蛋白质的活性也可以降低。在另一个实施方案中，与谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032相比，蛋白质的活性也可以降低。“蛋白质活性降低”的状态还包括蛋白质的活性已经完全消失的状态。更具体地说，表述“蛋白质的活性降低”可以意味着与非修饰的菌株相比每个细胞的蛋白质的分子数目减少，和/或蛋白质的每个分子的功能降低。也就是说，表述“蛋白质的活性降低”中的术语“活性”不限于蛋白质的催化活性，而且还可以指编码蛋白质的基因的转录量(即mRNA的量)或蛋白质的翻译量(即蛋白质的量)。“每个细胞的蛋白质的分子数目减少”的状态还包括完全不存在蛋白质的状态。“蛋白质的每个分子的功能降低”的状态也包括每个蛋白质分子的功能完全消失的状态。蛋白质活性降低的程度没有特别限制，只要活性与非修饰菌株的活性相比降低即可。蛋白质的活性可以降低到例如非修饰菌株的蛋白质活性的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
可以通过例如减少编码蛋白质的基因的表达来实现用于降低蛋白质活性的修饰。表述“基因的表达降低”是指与非修饰菌株如野生型菌株和亲本菌株相比，该基因的表达降低。具体而言，表述“基因表达降低”可以意味着与非修饰菌株相比，每个细胞的基因表达降低。更具体地说，表述“基因表达降低”可以意味着基因的转录量(即mRNA的量)减少，和/或基因的翻译量(即从基因表达的蛋白质量)减少。“基因表达降低”的状态也包括基因完全不表达的状态。“基因表达降低”的状态也称为“基因表达减弱”。基因的表达可以降低到例如非修饰菌株的表达的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
基因表达的降低可以是由于例如转录效率降低，翻译效率降低或其组合。可以通过修饰基因的表达控制序列诸如启动子，Shine-Dalgarno(SD)序列(也称为核糖体结合位点(RBS))，和基因的RBS和起始密码子之间的间隔物区来降低基因的表达。当修饰表达控制序列时，修饰表达控制序列的优选一个或多个核苷酸，更优选两个或更多个核苷酸，特别优选三个或更多个核苷酸。例如，通过用更弱的启动子替换染色体上基因的启动子，可以降低基因的转录效率。术语“更弱的启动子”是指与基因固有存在的野生型启动子相比，提供基因的减弱转录的启动子。更弱启动子的实例包括例如诱导型启动子。也就是说，诱导型启动子可以在非诱导条件下，例如在不存在相应诱导物的情况下，起到更弱启动子的作用。此外，可以删除表达控制序列的一部分或全部。基因的表达还可以通过例如操纵负责表达控制的因子来降低。负责表达控制的因子的实例包括负责转录或翻译控制的低分子(诱导剂，抑制剂等)，负责转录或翻译控制的蛋白质(转录因子等)，负责转录或翻译控制的核酸(siRNA等)，等等。此外，通过例如对基因的编码区引入降低基因表达的突变，也可以降低基因的表达。例如，通过用在宿主中不太频繁使用的同义密码子替换基因编码区中的密码子，可以降低基因的表达。此外，例如，如后所述，基因表达可以由于基因的破坏而降低。
用于降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如破坏编码该蛋白质的基因来获得。表述“基因受到破坏”是指基因被修饰以便不产生通常可以发挥功能的蛋白质。“不产生通常可以发挥功能的蛋白质”的状态包括完全不从基因产生蛋白质的状态和从基因产生每个分子的功能(例如活性或性质)降低或消除的蛋白质的状态。
可以通过例如删除染色体上基因的部分或全部编码区获得基因的破坏。此外，可以删除包括染色体上基因上游和下游序列的整个基因。只要可以降低蛋白质的活性，待删除的区域可以是任何区域，例如N端区域，内部区域或C端区域。删除更长的区域通常可以更确定地使基因失活。此外，优选的是，要删除的区域的上游和下游序列的阅读框不相同。
例如，也可以通过对染色体上基因的编码区引入用于氨基酸取代的突变(错义突变)，终止密码子(无义突变)，添加或缺失一个或两个核苷酸残基的移码突变等获得基因的破坏(Journal of Biological Chemistry,272:8611-8617(1997)；Proceedings of theNational Academy of Sciences,USA,95 5511-5515(1998)；Journal of BiologicalChemistry,26 116,20833-20839(1991))。
通过例如将另一个序列插入到染色体上的基因的编码区中也可以获得基因的破坏。插入的位点可以位于基因的任何区域，并且插入更长的区域通常可以更确定地使基因失活。优选的是插入位点上游和下游序列的阅读框不相同。其他序列没有特别限制，只要选择降低或消除所编码蛋白质活性的序列即可，并且其实例包括例如标志物基因如抗生素抗性基因，以及可用于产生目标物质的基因。
如上所述的染色体上基因的此类修饰可以如下获得：通过例如制备修饰为它不能产生通常发挥功能的蛋白质的缺陷型基因，并用含有缺陷型基因的重组DNA转化宿主在染色体上引起缺陷型基因和野生型基因之间的同源重组，从而用该缺陷型基因取代染色体上的野生型基因。在该程序中，如果重组DNA中包括根据宿主特征如营养缺陷选择的标志物基因，则操作变得更容易。缺陷型基因的实例包括包含全部或部分基因缺失的基因，包含错义突变的基因，包括无义突变的基因，包含移码突变的基因，以及包含插入转座子或标志物基因的基因。由缺陷型基因编码的蛋白质即使产生也具有与野生型蛋白质不同的构象，因此其功能降低或消除。已经建立了基于使用同源重组的基因取代的此类基因破坏，并且存在使用线性DNA的方法，诸如称为“Red驱动整合”的方法(Datsenko,K.A,and Wanner,B.L.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:6640-6645(2000))，以及利用Red驱动的整合与源自λ噬菌体的切除系统的组合的方法(Cho,E.H.,Gumport,R.I.,Gardner,J.F.,J.Bacteriol.,184:5200-5203(2002))(参考WO2005/010175)，使用具有温度敏感性复制起点的质粒的方法，使用能够接合转移的质粒的方法，利用没有在宿主中起作用的复制起点的自杀载体的方法(美国专利号6,303,383，日本专利公开(Kokai)No.05-007491)，等等。
用于降低蛋白质活性的修饰也可以通过例如诱变处理来获得。诱变处理的实例包括X射线或紫外线的照射和用突变剂如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)，甲磺酸乙酯(EMS)和甲磺酸甲酯(MMS)处理。
当蛋白质作为由多个亚基组成的复合物起作用时，可以修饰多个亚基的部分或全部，只要蛋白质的活性最终降低。也就是说，例如，可以破坏编码相应亚基的多个基因的部分或全部等。此外，当蛋白质存在多种同工酶时，多种同工酶的部分或全部活性可以降低，只要蛋白质的活性最终降低。也就是说，例如，可以破坏编码相应同功酶的多个基因的部分或全部等。
可以通过测量蛋白质的活性确认蛋白质活性的降低。
蛋白质活性的降低也可以通过确认编码该蛋白质的基因的表达的降低来确认。基因表达的降低可以通过确认基因转录量的减少或从基因表达的蛋白质量的降低来确认。
通过比较从基因转录的mRNA的量与非修饰菌株中观察到的量，可以确认基因转录量的降低。用于评估mRNA量的方法的实例包括Northern杂交，RT-PCR等(MolecularCloning,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(USA),2001)。mRNA的量优选降低到例如在非修饰菌株中观察到的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
通过使用抗体的Western印迹法(Molecular Cloning,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor(USA)2001)可以确认蛋白质量的减少。蛋白质的量优选降低到例如在非修饰菌株中观察到的量的50％或更少，20％或更少，10％或更少，5％或更少，或0％。
可以根据用于破坏的手段通过确定基因的部分或全部的核苷酸序列，基因的限制酶图谱，全长等来确认基因的破坏。
除了ADH活性的降低以外，如上所述的降低蛋白质活性的此类方法还可以适用于任意蛋白质诸如副产物生成酶的活性降低，以及任意基因诸如编码那些任意蛋白的基因的表达降低。
<2>本发明的方法
本发明的方法是使用本发明的细菌生产目标物质的方法。
<2-1>发酵方法
可以通过例如本发明的细菌的发酵来生产目标物质。也就是说，本发明的方法的实施方案可以是通过发酵本发明的细菌来生产目标物质的方法。此实施方案也称为“发酵方法”。此外，通过发酵本发明的细菌生产目标物质的步骤也称为“发酵步骤”。
可以通过培养本发明的细菌来进行发酵步骤。具体而言，在发酵方法中，可以从碳源生产目标物质。也就是说，发酵步骤可以是例如在培养基，诸如含有碳源的培养基中培养本发明的细菌以在培养基中生产和积累目标物质的步骤。也就是说，发酵方法可以是用于产生目标物质的方法，包括在培养基，诸如含有碳源的培养基中培养本发明的细菌以在培养基中产生并积累目标物质。
要使用的培养基没有特别限制，只要本发明的细菌可以在其中增殖并产生目标物质即可。作为培养基，例如可以使用用于培养诸如棒状细菌等细菌的常用培养基。培养基可以根据需要含有碳源，氮源，磷酸盐源，硫源，以及其他培养基组分，如各种有机组分和无机组分。培养基成分的类型和浓度可以根据诸如要使用的细菌的类型等各种条件适当确定。
碳源没有特别限制，只要本发明的细菌可以利用它并产生目标物质即可。碳源的具体实例包括例如糖类，诸如葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，赤糖糊(blackstrap molasses)，淀粉的水解物和生物质的水解物；有机酸如乙酸，柠檬酸，琥珀酸和葡糖酸；醇如乙醇，甘油和粗甘油；和脂肪酸。作为碳源，可以优选使用植物来源的材料。植物的实例包括例如玉米，稻，小麦，大豆，甘蔗，甜菜和棉。植物来源材料的实例包括例如器官，诸如根，茎，干，枝，叶，花和种子，包括它们的植物体和这些植物器官的分解产物。植物来源材料的在其使用时的形式没有特别限定，并且可以它们可以以诸如未加工产物，汁，研磨产物，纯化产物等任何形式使用。戊糖如木糖，己糖如葡萄糖或它们的混合物可从例如植物生物质获得并使用。具体而言，可以通过将植物生物质进行处理，诸如蒸汽处理，浓酸水解，稀酸水解，纤维素酶等酶水解，碱处理而得到这些糖类。由于半纤维素与纤维素相比通常更容易水解，因此可预先水解植物生物质中的半纤维素以释放戊糖，然后可以水解纤维素以产生己糖。此外，木糖可以通过例如通过对本发明的细菌赋予用于将己糖如葡萄糖转化为木糖的途径从己糖转化供应。作为碳源，可以使用一种碳源，或者可以组合使用两种或更多种碳源。
培养基中碳源的浓度没有特别限制，只要本发明的细菌可以增殖并产生目标物质即可。培养基中碳源的浓度可以在使得目标物质的生产不受抑制的范围内尽可能高。碳源在培养基中的初始浓度通常可以是例如5至30％(w/v)，优选10至20％(w/v)。此外，可以根据需要对培养基额外供应碳源。例如，可以与伴随发酵进展的碳源的减少或消减成比例地对培养基额外供应碳源。虽然可以暂时消减碳源，但是只要最终可以生产目标物质，可以优选进行培养以便不消减碳源或不继续消减碳源。
氮源的具体实例包括例如铵盐如硫酸铵，氯化铵和磷酸铵，有机氮源如蛋白胨，酵母提取物，肉膏和大豆蛋白分解产物，氨和尿素。用于pH调节的氨气和氨水也可用作氮源。作为氮源，可以使用一种氮源，也可以组合使用两种或更多种的氮源。
磷酸盐源的具体实例包括例如磷酸盐如磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，以及磷酸聚合物如焦磷酸。作为磷酸盐源，可以使用一种磷酸盐源，或者可以组合使用两种或更多种磷酸盐源。
硫源的具体实例包括例如无机硫化合物如硫酸盐，硫代硫酸盐和亚硫酸盐，以及含硫氨基酸如半胱氨酸，胱氨酸和谷胱甘肽。作为硫源，可以使用一种硫源，或者可以组合使用两种或更多种硫源。
其他各种有机和无机组分的具体实例包括例如无机盐如氯化钠和氯化钾；微量金属如铁，锰，镁和钙；维生素如维生素B1，维生素B2，维生素B6，烟酸，烟酰胺和维生素B12；氨基酸；核酸；和含有这些的有机成分如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物和大豆蛋白分解产物。作为其他各种有机和无机组分，可以使用一种组分，或者可以组合使用两种或更多种组分。
此外，当使用需要营养物如氨基酸用于生长的营养缺陷型突变株时，优选将此类所需营养物补充到培养基中。此外，可以将用于生产目标物质的组件补充到培养基。此类组分的具体实例包括例如甲基供体例如SAM及其前体例如甲硫氨酸。
培养条件没有特别限制，只要本发明的细菌可以增殖并且产生目标物质即可。培养可以用例如用于培养诸如棒状杆菌细菌等细菌的通常条件进行。培养条件可以根据诸如使用的细菌的种类等各种条件适当确定。
培养可以通过使用液体培养基来进行。在培养时，例如，可以将在诸如琼脂培养基等固体培养基上培养的本发明的细菌直接接种到液体培养基中，或者将在液体培养基中作为种子培养物培养的本发明的细菌接种到液体培养基中进行主要培养。也就是说，培养可以作为种子培养和主要培养分开进行。在此类情况下，种子培养和主要培养的培养条件可以是相同的或者可以是不相同。至少在主要培养过程中产生目标物质是足够的。培养开始时培养基中含有的本发明细菌的量没有特别限制。例如，显示OD660为4-100的种子培养物可以在开始培养时以0.1-100质量％，优选1-50质量％的量添加到用于主要培养的培养基中。
培养可以以分批培养，补料分批培养，连续培养或这些的组合进行。在培养开始时使用的培养基也称为“起始培养基”。在补料分批培养或连续培养中供应至培养系统(例如发酵罐)的培养基也称为“补料培养基”。为了在补料分批培养或者连续培养中向培养系统供应补料培养基也称为“补料”。此外，当作为种子培养和主要培养分开进行培养时，种子培养和主要培养的培养方案可以相同或可以不同。例如，种子培养和主要培养两者都可以作为分批培养进行。或者，例如，种子培养可以作为分批培养进行，并且主要培养可以以补料分批培养或连续培养进行。
在本发明中，各种组分诸如碳源可以包含在起始培养基，补料培养基或两者中。也就是说，各种组分诸如碳源可以在培养期间独立地或以任意组合的方式额外供给到培养基。这些组分可以供应一次或多次，或者可以连续供应。起始培养基中包含的组分的类型可以与补料培养基中包含的组分的类型相同或不同。此外，起始培养基中包含的组分的浓度可以与补料培养基中包含的组分的浓度相同或不同。此外，可以使用两种或更多种含有不同类型和/或不同浓度组分的补料培养基。例如，当间歇进行两次或更多次补料时，补料培养基中包含的组分的类型和/或浓度对于每次补料可以是相同的或者可以是不同的。
培养可以例如在需氧条件下进行。术语“需氧条件”可以指其中培养基中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高，或优选1.5ppm或更高的条件。可以将氧浓度控制为例如饱和氧浓度的1-50％，优选约5％。培养可以例如在通气或摇动下进行。培养基的pH值可以是例如3至10，优选4.0至9.5。培养基的pH可以根据需要在培养过程中进行调整。培养基的pH可以通过使用各种碱性和酸性物质如氨气，氨水，碳酸钠，碳酸氢钠，碳酸钾，碳酸氢钾，碳酸镁，氢氧化钠，氢氧化钙和氢氧化镁来调节。培养温度可以是例如20至45℃，优选25至37℃。培养时间可以是例如10至120小时。例如，可以继续培养直到培养基中含有的碳源被消耗，或者直到本发明的细菌的活性丧失。
通过在诸如上文所述的条件下培养本发明的细菌，在培养基中积累目标物质。
可以通过用于检测或鉴定化合物的已知方法来确认目标物质的产生。此类方法的实例包括例如HPLC，UPLC，LC/MS，GC/MS和NMR。这些方法可以独立使用，或者可以以适当的组合使用。这些方法也可以用于确定培养基中存在的各种组分的浓度。
生产的目标物质可以适当收集。也就是说，发酵方法可以进一步包括从培养基(即培养肉汤)中收集目标物质。目标物质可以通过用于分离和纯化化合物的已知方法收集。此类方法的实例包括例如离子交换树脂法，膜处理，沉淀，蒸馏和结晶。目标物质也可以通过用有机溶剂如乙酸乙酯萃取或通过蒸汽蒸馏来收集。这些方法可以独立使用，或者可以以适当的组合使用。
此外，当目标物质沉积在培养基中时，它可以通过例如离心或过滤收集。在培养基中溶解的目标物质结晶后，可以将沉积在培养基中的目标物质和溶解在培养基中的目标物质一起分离。
除了目标物质之外，收集的目标物质可以包含例如细菌细胞，培养基组分，水分和细菌的副产物代谢物。收集的目标物质的纯度可以是例如30％(w/w)或更高，50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高，80％(w/w)或更高，90％(w/w)或更高，或95％(w/w)或更高。
<2-2>生物转化方法
目标物质也可以通过例如使用本发明的细菌的生物转化来产生。也就是说，本发明的方法的另一个实施方案可以是使用本发明的细菌通过生物转化来产生目标物质的方法。该实施方案也称为“生物转换方法”。此外，使用本发明的细菌通过生物转化来产生目标物质的步骤也称为“生物转化步骤”。
具体而言，在生物转化方法中，目标物质可以从目标物质的前体产生。更具体地说，在生物转化方法中，通过使用本发明的细菌，可以通过将目标物质的前体转化为目标物质来生产目标物质。也就是说，生物转化步骤可以是通过使用本发明的细菌将目标物质的前体转化为目标物质的步骤。
目标物质的前体也简称为“前体”。前体的实例包括目标物质的生物合成途径的中间体，如关于目标物质生物合成酶的描述所述的那些。前体的具体实例包括例如原儿茶酸，原儿茶醛，香草酸，苯甲酸，L-苯丙氨酸和肉桂酸。原儿茶酸，原儿茶醛和香草酸各自可以用作生产例如香草醛的前体。苯甲酸可以用作生产例如苯甲醛的前体。L-苯丙氨酸和肉桂酸各自可以用作生产例如肉桂醛的前体。作为前体，可以使用一种前体，或者可以组合使用两种或更多种前体。在前体是可以形成盐的化合物的情况下，前体可以作为游离化合物，其盐或其混合物使用。也就是说，术语“前体”是指游离形式的前体，其盐或其混合物，除非另有说明。盐的实例包括例如硫酸盐，盐酸盐，碳酸盐，铵盐，钠盐和钾盐。作为前体的盐，可以使用一种盐，或者可以组合使用两种或更多种盐。
作为前体，可以使用商业产品，或者可以使用适当制备和获得的产品。也就是说，生物转化方法可以进一步包括生产前体。生产前体的方法没有特别限定，例如可以使用已知的方法。前体可以通过例如化学合成法，酶法，生物转化法，发酵法或它们的组合来生产。也就是说，例如，目标物质的前体可以使用酶(也称为“前体生物合成酶”)从其另外的前体产生，所述酶催化此类另外的前体转化成目标物质的前体。此外，例如，通过使用具有前体生产能力的微生物，可以从碳源或此类另外的前体生产目标物质的前体。术语“具有前体生产能力的微生物”是指能够从碳源或其另外的前体生成目标物质的前体的微生物。例如，根据酶法或生物转化法生产原儿茶酸的方法的实例包括使用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)KS-0180(日本专利公开(Kokai)No.7-75589)将对甲酚转化为原儿茶酸的方法，使用NADH依赖性对羟基苯甲酸羟化酶将对羟基苯甲酸转化为原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.5-244941)，通过在含有对苯二甲酸的培养基中培养含有参与从对苯二甲酸生成原儿茶酸的反应的基因的转化体来生产原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.2007-104942)，以及通过使用具有原儿茶酸生产能力并且具有原儿茶酸5-氧化酶活性降低或该活性缺乏的微生物从其前体生产原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.2010-207094)。此外，通过发酵生产原儿茶酸的方法的实例包括通过使用短杆菌属细菌和乙酸作为碳源生产原儿茶酸的方法(日本专利公开(Kokai)No.50-89592)，通过使用导入有编码3-二氢莽草酸脱氢酶的基因的埃希氏菌属或克雷伯氏菌属细菌和葡萄糖作为碳源生产原儿茶酸的方法(美国专利号5,272,073)。此外，香草酸可以通过根据使用OMT的酶法或使用具有OMT的微生物的生物转化法使用原儿茶酸作为前体(J.Am.CHm.Soc.,1998,Vol.120)或根据使用假单胞菌属种AV10的生物转化方法使用阿魏酸作为前体(J.App.Microbiol.,2013,Vol.116,p903-910)生产。此外，原儿茶醛可以通过使用原儿茶酸作为前体根据使用ACAR的酶法或使用具有ACAR的微生物的生物转化法来生产。生产的前体可以原样或者根据需要进行适当的处理如浓缩，稀释，干燥，分馏，提取和纯化后用于生物转化方法。也就是说，作为前体，例如可以使用纯化至所需程度的纯化产物，或者可以使用含有前体的材料。含有前体的材料没有特别限制，只要本发明的细菌可以使用前体即可。含有前体的材料的具体实例包括通过培养具有前体生产能力的微生物获得的培养肉汤，与培养肉汤分离的培养上清液及其加工产物如其浓缩产物(如浓缩液体)和其干燥产物。
在一个实施方案中，生物转化步骤可以通过例如培养本发明的细菌来进行。该实施方案也称为“生物转换方法的第一实施方案”。也就是说，生物转化步骤可以是例如在含有目标物质的前体的培养基中培养本发明的细菌以将该前体转化为目标物质的步骤。生物转化步骤具体可以是在含有目标物质的前体的培养基中培养本发明的细菌以在培养基中产生并积累目标物质的步骤。
要使用的培养基没有特别限制，只要培养基含有目标物质的前体，并且本发明的细菌可以在其中增殖并产生目标物质。培养条件没有特别限制，只要本发明的细菌可以增殖并且产生目标物质即可。关于发酵方法所提及的培养的描述，诸如关于培养基和培养条件的描述可以在必要修改后适用于生物转化方法的第一实施方案中的培养，只是培养基在此实施方案中含有前体。
前体可以在整个培养期内包含在培养基中，或者可以在培养的部分时期期间包含在培养基中。也就是说，短语“在含有前体的培养基中培养细菌”并不一定意味着培养基中在整个培养期内都含有前体。例如，从培养开始起培养基中可以含有或可以不含前体。当在培养开始时培养基中不含前体时，在培养开始后将前体提供给培养基。供给的时机可以根据诸如培养期的长度等各种条件适当确定。例如，在本发明的细菌充分生长后，可以将前体供给到培养基中。此外，在任何情况下，可以根据需要将前体额外供给培养基。例如，可以与伴随目标物质生成的前体的减少或消减成比例地对培养基额外供应碳源。用于将前体提供给培养基的手段没有特别限制。例如，可以通过将含有前体的补料培养基补料到培养基来将前体供应给培养基。此外，例如，本发明的细菌和具有前体生产能力的微生物可以共培养以允许具有前体生产能力的微生物在培养基中产生前体，从而将前体供应给培养基。这些供应手段可以独立使用，或者可以以适当的组合使用。前体在培养基中的浓度没有特别限制，只要本发明的细菌可以使用该前体作为目标物质的原料即可。前体在培养基中的浓度例如可以为0.1g/L或更高，1g/L或更高，2g/L或更高，5g/L或更高，10g/L或更高，或者15g/L或更高，或者可以是200g/L或更低，100g/L或更低，50g/L或更低，或者20g/L或更低，或者可以在由其组合限定的范围内(按游离化合物的重量计)。在整个培养期期间，培养基中可以以或不以上文例示的范围内的浓度含有前体。例如，在培养开始时培养基中可以以上文例示的范围内的浓度含有前体，或者可以将其供给到培养基，从而在培养开始后获得上文例示的范围。在培养分别作为种子培养和主要培养进行的情况下，至少在主要培养期间产生目标物质是足够的。因此，足够的是至少在主要培养期间，即在主要培养的整个时期内或在主要培养的部分时期期间，培养基中含有前体，并且也就是说，在种子培养期间培养基中可以含有或可以不含前体。在此类情况下，关于培养的术语，如“培养期(培养时期)”和“培养开始”可以理解为与主要培养有关的术语。
在另一个实施方案中，生物转化步骤也可以通过例如使用本发明的细菌的细胞来进行。该实施方案也称为“生物转换方法的第二实施方案”。也就是说，转化步骤可以是例如通过使用本发明的细菌的细胞将反应混合物中的目标物质的前体转化成目标物质的步骤。转化步骤具体可以是使本发明的细菌的细胞作用于反应混合物中的目标物质的前体以在反应混合物中生成并积累目标物质的步骤。通过使用此类细胞进行的生物转化步骤也称为“转化反应”。
本发明的细菌的细胞可以通过培养本发明的细菌来获得。用于获得细胞的培养方法没有特别限制，只要本发明的细菌可以增殖即可。在用于获得细胞的培养时，前体可以包含或可以不包含在培养基中。而且，在用于获得细胞的培养时，培养基中可以产生或可以不产生目标物质。关于发酵方法中提及的培养的描述，例如关于培养基和培养条件的描述可以在必要修改后应用于获得用于生物转化方法的第二实施方案的细胞的培养。
细胞可以在包含在培养基(培养肉汤)中时，或者在从培养基(培养肉汤)中收集后用于转化反应。也可以根据需要在进行处理后将细胞用于转化反应。也就是说，细胞的实例包括含有细胞的培养肉汤，从培养肉汤收集的细胞或其加工产物。加工产物的实例包括通过对细胞(诸如含有细胞的培养肉汤或从培养肉汤收集的细胞)进行处理而获得的产物。这些形式的细胞可以独立使用，或者可以以适当的组合使用。
从培养基中收集细胞的方法没有特别限制，例如可以使用已知的方法。此类方法的实例包括例如自发沉淀，离心和过滤。也可以使用絮凝剂。这些方法可以独立使用，或者可以以适当的组合使用。收集的细胞可以根据需要通过使用合适的培养基进行清洗。收集的细胞可以根据需要通过使用适当的培养基重悬浮。可用于清洗或悬浮细胞的培养基的实例包括例如水性介质(水性溶剂)，如水和缓冲水溶液。
细胞处理的实例包括例如稀释，冷凝，在载体如丙烯酰胺和角叉菜胶上固定化，冷冻和融化处理，以及增加细胞膜通透性的处理。例如，可以通过使用表面活性剂或有机溶剂来增加细胞膜的通透性。这些处理可以独立使用，或者可以以适当的组合使用。
用于转换反应的细胞没有特别限制，只要具有目标物质生产能力的细胞。优选细胞保持其代谢活性。表述“细胞保持其代谢活性”可以表示细胞具有利用碳源产生或再生产生目标物质所需物质的能力。此类物质的实例包括例如ATP，电子供体如NADH和NADPH，以及甲基供体如SAM。细胞可以具有或可以不具有增殖能力。
转化反应可以在适当的反应混合物中进行。具体而言，转化反应可以通过使细胞和前体共存于适当的反应混合物中来进行。转换反应可以通过分批方法进行或可以通过柱方法进行。在分批法的情况下，转化反应可以通过例如将本发明的细菌的细胞和前体混合在反应容器中所含的反应混合物中来进行。转换反应可以静态进行，或者可以在搅拌或摇动反应混合物的情况下进行。在柱方法的情况下，转化反应可以通过例如使含有前体的反应混合物通过填充有固定化细胞的柱来进行。反应混合物的实例包括基于水性介质(水性溶剂)如水和水性缓冲液的那些。
除了前体之外，反应混合物可以根据需要含有除前体之外的组分。除前体以外的成分的实例包括ATP，电子供体诸如NADH，NADPH，甲基供体诸如SAM，金属离子，缓冲剂，表面活性剂，有机溶剂，碳源，磷酸盐源，和其它各种培养基成分。也就是说，例如，含有前体的培养基也可以用作反应混合物。也就是说，关于生物转化方法的第一实施方案中提及的培养基的描述也可以在必要修改后适用于生物转化方法的第二实施方案中的反应混合物。包含在反应混合物中的组分的类型和浓度可以根据各种条件来确定，例如要使用的前体的类型和要使用的细胞的形式。
转化反应的条件(溶解氧浓度，反应混合物的pH，反应温度，反应时间，各种成分的浓度等)没有特别限制，只要产生目标物质。转化反应可以用例如用于利用微生物细胞诸如静止细胞进行物质转换的通常条件来进行。转化反应的条件可以根据各种条件来确定，例如要使用的细菌的类型。转化反应可以例如在需氧条件下进行。术语“需氧条件”可以指其中反应混合物中的溶解氧浓度为0.33ppm或更高，或优选1.5ppm或更高的条件。氧浓度可以控制为例如饱和氧浓度的1-50％，优选约5％。反应混合物的pH值通常可以是例如6.0至10.0，优选6.5至9.0。反应温度通常可以是例如15至50℃，优选15至45℃，更优选20至40℃。反应时间可以是例如5分钟至200小时。在柱方法的情况下，反应混合物的加载速率可以是例如使得反应时间落入上述例示的反应时间范围内的速率。此外，转化反应也可以在例如培养条件下进行，例如用于培养诸如棒状杆菌细菌等细菌的通常条件。在转化反应期间，细胞可以增殖或可以不增殖。也就是说，关于生物转化方法的第一实施方案中提及的培养条件的描述也可以在必要修改后适用于生物转化方法的第二实施方案中转化反应的条件，只是细胞可以或不可以在此实施方案中增殖。在此类情况下，用于获得细胞的培养条件和转化反应的条件可以相同或不同。前体在反应混合物中的浓度例如可以为0.1g/L或更高，1g/L或更高，2g/L或更高，5g/L或更高，10g/L或更高，或者15g/L或更高，或者可以是200g/L或更低，100g/L或更低，50g/L或更低，或者20g/L或更低，或者可以在由其组合限定的范围内(按游离化合物的重量计)。例如，反应混合物中细胞的密度可以是1或更高，或者可以是300或更低，或者可以在其组合限定的范围内。
在转化反应期间，可以将细胞，前体和其他组分独立地或以其任何任意组合额外提供给反应混合物。例如，可以与伴随目标物质产生的前体的减少或消耗成比例将前体额外地提供给培养基。这些组分可以供应一次或多次，或者可以连续供应。
用于向反应混合物供应诸如前体的各种组分的手段没有特别限制。这些组分各自可以通过例如直接将它们加入到反应混合物中而供应到反应混合物中。此外，例如，可以将本发明的细菌和具有前体生产能力的微生物共培养，以使具有前体生产能力的微生物在反应混合物中产生前体，从而将前体提供给反应混合物。此外，例如，组分如ATP，电子给体和甲基供体可以各自在反应混合物中产生或再生，可以在本发明的细菌的细胞中产生或再生，或者可以通过不同细胞之间的偶联反应产生或再生。例如，当本发明细菌的细胞保持其代谢活性时，它们可以通过使用碳源在它们内部产生或再生诸如ATP，电子供体和甲基供体等组分。另外，ATP生成或再生方法的实例包括例如通过使用棒状杆菌属细菌从碳源提供ATP的方法(Hori,H.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,48(6):693-698(1997))，通过使用酵母细胞和葡萄糖再生ATP的方法(Yamamoto,S et al.,Biosci.Biotechnol.Biochem.,69(4):784-789(2005))，使用磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶再生ATP的方法(C.Aug'e and Ch.Gautheron,Tetrahedron Lett.,29:789-790(1988))，以及通过使用多磷酸和多磷酸激酶再生ATP的方法(Murata,K.et al.,Agric.Biol.Chem.,52(6):1471-1477(1988))。
此外，从转换反应的开始到结束，反应条件可以是恒定的，或者它们可以在转化反应期间改变。表述“反应条件在转化反应期间改变”不仅包括反应条件在时间上变化的情况，而且还包括反应条件在空间上变化的情况。表述“反应条件在空间上变化”意指，例如，当通过柱法进行转化反应时，诸如反应温度和孔密度等反应条件随流动中的位置而不同。
通过如上所述进行生物转化步骤获得含有目标物质的培养基(即培养肉汤)或反应混合物。目标物质生产的确认和目标物质的收集可以按照与上述发酵方法相同的方式进行。也就是说，生物转化方法可以进一步包括从培养基(即培养肉汤)或反应混合物中收集目标物质。除了目标物质之外，收集的目标物质可以包含例如细菌细胞，培养基组分，反应混合物组分，水分和细菌的副产物代谢物。收集的目标物质的纯度可以是例如30％(w/w)或更高，50％(w/w)或更高，70％(w/w)或更高，80％(w/w)或更高，90％(w/w)或更高，或95％(w/w)或更高。
<3>本发明的筛选方法
本发明的筛选方法是用于筛选醛抗性菌株的方法，其包括在含有醛的培养基中培养微生物并选择醛抗性菌株。
用作醛抗性菌株的候选物的微生物没有特别限制。微生物的实例包括细菌和酵母。
细菌的实例包括属于肠杆菌科和棒状杆菌细菌的细菌。属于肠杆菌科的细菌的实例包括属于埃希氏菌属(Escherichia)，肠杆菌属(Enterobacter)，泛菌属(Pantoea)，克雷伯氏菌属(Klebsiella)，沙雷氏菌属(Serratia)，欧文氏菌属(Erwinia)，发光杆菌属(Photorhabdus)，普罗威登斯菌属(Providencia)，沙门氏菌属(Salmonella)，摩根氏菌属(Morganella)等的细菌。棒状杆菌细菌的实例包括如上所述的棒状杆菌细菌。()
酵母的实例包括属于酵母属(Saccharomyces)，假丝酵母属(Candida)，毕赤酵母属(Pichia)，汉逊酵母属(Hansenula)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)等的酵母。
用作醛抗性菌株的候选物的微生物可以是野生型菌株或可以是修饰菌株。修饰菌株的实例包括已被修饰以使醇脱氢酶的活性降低和/或副产物生成酶的活性降低的菌株。另外，用作醛抗性菌株的候选物的微生物可以是或者可以不是分离菌株。例如，含有微生物的样品，例如从自然界获得的土壤样品和水样品，也可以用作醛抗性菌株的候选物。也就是说，用作醛抗性菌株的候选物的术语“微生物”也可以包括含有微生物的此类样品。
使用的培养基没有特别限制，只要培养基含有醛，并且醛抗性菌株可以在其中增殖即可。作为培养基，例如，可以使用通过向用于培养诸如细菌和酵母等微生物的常规培养基中添加醛而得到的培养基。培养基成分的种类和浓度可以根据诸如要使用的微生物的类型等各种条件适当确定。
用于筛选的醛的实例包括在本发明的方法中作为目标物质例示的醛，例如，芳香醛如香草醛，苯甲醛和肉桂醛。作为醛，可以使用一种醛，或者可以组合使用两种或多种醛。
作为醛，可以使用商业产品，或者可以使用适当制备并且获得的醛。用于生产醛的方法没有特别限制，并且例如可以使用已知的方法。可以通过例如化学合成法，酶法，生物转化法，发酵法或这些的组合来制备醛。可以通过例如本发明的方法来生成醛。
培养基中的醛浓度没有特别限制，只要可以评估醛抗性。培养基中的醛浓度例如可以为2g/L或更高，3g/L或更高，4g/L或更高，5g/L或更高，6g/L或更高或者可以是10g/L或更低，或者可以在由其组合限定的范围内。醛可以在整个培养期间包含在培养基中，或者可以仅在培养的部分时段期间包含在培养基中。也就是说，短语“在含有醛的培养基中培养微生物”并不一定意味着在整个培养期间培养基中含有醛。例如，可以从开始培养起在培养基中含有醛，或者可以在培养开始后微生物增殖期期间供应给培养基。可以在例如微生物的指数生长期期间将醛供应到培养基中。在整个培养期内，培养基中可以以上文例示的范围内的浓度包含或不包含醛。例如，可以在开始培养时将醛以上文例示的范围内的浓度包含在培养基中，或者可以将其供给到培养基中，使得在培养开始后获得上文例示的范围内的浓度。
培养条件没有特别限制，只要醛抗性菌株可以增殖。可以用例如用于培养诸如细菌和酵母等微生物的通常条件进行培养。培养条件可根据各种条件适当确定，例如待用作候选物的微生物的类型。
关于发酵方法中提及的培养的描述，例如关于培养基和培养条件的描述可以在必要修改后适用于在本发明的筛选方法中的培养，例如培养基和培养条件，只是在筛选方法中使用含有醛的培养基。
可以根据培养结果选择醛抗性菌株。也就是说，可以根据培养基含有醛的时期期间，即在从培养开始起培养基中含有醛的情况下在培养开始后的时期期间，或者在培养开始后对培养基供应醛的情况下在补充醛后的时期期间，基于微生物生长的程度选择醛抗性菌株。例如，在培养基含有醛的时期期间观察到微生物的生长的情况下，可以将微生物鉴定为醛抗性菌株。另外，例如，在培养基含有醛的时期期间以一定程度或更高观察到微生物的生长的情况下，可以将微生物鉴定为醛抗性菌株。“一定程度”可以根据到各种条件如微生物的类型和培养条件确定。例如，在从开始培养或补充醛到一定时间点的时段期间微生物细胞量增加到1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、或1000倍的情况下，可以将微生物鉴定为醛抗性菌株。例如，以培养基OD 600nm的增加值测量微生物细胞数量的增加。“一定时间点”可以根据诸如微生物的类型，培养条件等各种条件来决定。例如，“一定时间点”可以是开始培养或补充醛后10小时，20小时或30小时。具体而言，例如，在将微生物接种到含有初始浓度为2g/L或更高的醛的培养基中以获得0.01-0.1的初始OD600nm时，微生物生长以在培养开始后30小时获得OD 600nm为1的情况下，可以将微生物鉴定为醛抗性菌株。
实施例
以下，参照实施例更具体地说明本发明。但是，本发明不受这些实施例的限制。
参考例：由大肠杆菌生产香草醛
在该参考例中，从大肠杆菌JM109作为亲本菌株构建其中缺失yqhD基因以减少香草醇的副产物，并且扩增芳香族羧酸还原酶(ACAR)基因和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPT)基因以提高香草酸向香草醛的转化的菌株，并且用构建的菌株进行香草醛生产。
<1>大肠杆菌JM109ΔyqhD菌株的构建
yqhD基因编码NADP依赖性醇脱氢酶，并且该蛋白质是参与香草醛向香草醇的转化的酶(J.Am.Chem.Soc.,136,11644(2014))。因此，为了通过阻断香草醛向香草醇的转化来增强香草醛的积累，构建了大肠杆菌JM109的ayqhD基因缺陷菌株。首先，通过使用pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)的DNA片段作为模板，和SEQ ID NO:1和2的合成DNA作为引物的PCR，获得用于缺失yqhD基因的片段，其由以下述次序连接的下列各项组成：yqhD基因的orf的上游区、attRλ序列、氯霉素抗性基因、attLλ序列、和yqhD基因的orf的下游区。SEQID NO:1在5'端侧的50个残基对应于yqhD基因的orf的上游序列，并且其余部分对应于attRλ序列。SEQ ID NO:2在5'端侧的50个残基对应于yqhD基因的orf的下游序列，并且其余部分对应于attLλ序列。然后，用pKD46质粒转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,pp.6640-6645)，将其应用于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基，在30℃下培养过夜以获得单菌落，并且获得大肠杆菌JM109/pKD46菌株作为转化体。将大肠杆菌JM109/pKD46菌株在含有100μg/mL氨苄青霉素和50mM阿拉伯糖的LB培养基中培养，并通过电脉冲方法引入用于缺失yqhD基因的片段。将细胞应用于含有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基，并在30℃下培养。通过使用出现的菌落作为模板和SEQ ID NO:3和4的合成DNA作为引物进行PCR，并基于扩增片段的大小获得用氯霉素抗性基因替换yqhD基因的大肠杆菌JM109ΔyqhD::CmR/pKD46菌株。此外，在42℃下培养大肠杆菌JM109ΔyqhD::CmR/pKD46菌株，并且基于氨苄青霉素抗性的丧失获得其中消除了pKD46的大肠杆菌JM109ΔyqhD::CmR菌株。将大肠杆菌JM109ΔyqhD::CmR菌株在含有25μg/mL氯霉素的LB培养基中培养，并且通过电脉冲法引入pMW-int-xis质粒(WO2007/037460，日本专利公开(Kokai)No.2005-058827)。将细胞应用于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基，并在30℃下培养以获得菌落。将得到的多个菌落在琼脂培养基上于30℃再次培养，并且鉴定在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上增殖，但是在含有100μg/mL氨苄青霉素和25μg/mL氯霉素的LB琼脂培养基上不增殖的菌落。也在37℃平行培养菌落，并且选择在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上不增殖但在不含氨苄青霉素的LB琼脂培养基上增殖的菌落(其对氯霉素的易感性已经在上文分别确认)以获得其中消除了氯霉素抗性基因和pMX-int-xis的菌株。将由此获得的菌株命名为大肠杆菌JM109ΔyqhD菌株。
<2>用于扩增ACAR基因的质粒pEPlac-car的构建
通过以下方法构建用于扩增巴西诺卡氏菌ATCC 700358的ACAR基因的质粒pEPlac-car。
巴西诺卡菌ATCC 700358的ACAR基因的核苷酸序列以SEQ ID NO:75所示，并且由该基因编码的ACAR的氨基酸序列以SEQ ID NO:76所示。将SEQ ID NO:76所示的氨基酸序列的N端Met残基设计为缺失，然后将ACAR的如此缩短的氨基酸序列的N-末端区设计为以SEQID NO:78所示的氨基酸序列(17aa)延伸，其由以SEQ ID NO:77所示的核苷酸序列编码，从而设计巴西诺卡菌ATCC 700358(SEQ ID NO:48)的变体ACAR和编码它的变体ACAR基因(SEQID NO:47)。以SEQ ID NO:78所示的氨基酸序列与另一巴西诺卡氏菌菌株(NCBI参考序列：WP_042262686.1和GI:754904305)的ACAR同源物的N端区域的氨基酸序列(17aa)具有100％的同一性。
具有以SEQ ID NO:47所示的核苷酸序列的变体ACAR基因针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，并在3'和5'末端分别引入了具有NdeI和SacI限制性位点的核苷酸序列。在下文中，密码子优化的变体ACAR基因也简称为“ACAR基因”。使用由ATG Service Gen(Russian Federation,Saint-Petersburg)提供的服务，化学合成包含侧翼有NdeI和SacI的ACAR基因的DNA片段。包含侧翼有NdeI和SacI的ACAR基因的DNA片段的核苷酸序列以SEQID NO:79所示。DNA片段从基因制造商作为质粒的一部分获得。
为了在大肠杆菌细胞中表达ACAR基因，将获得的DNA片段(SEQ ID NO:79)在pELAC载体(SEQ ID NO:80；Smirnov S.V.et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,88(3):719-726)的NdeI和SacI限制性位点处再克隆。通过用含有PlacUV5启动子的合成BglII-XbaI片段替换pET22b(+)(Novagen)的BglII-XbaI片段构建pELAC载体。为了将DNA片段插入pELAC，按供应商推荐的那样使用T4DNA连接酶(Fermentas,Lithuania)进行连接反应。用乙醇处理连接混合物，将获得的沉淀物溶解在水中，并使用电穿孔将其导入大肠杆菌TG1细胞中。将细胞应用于补充有氨苄青霉素(Ap,200mg/L)的LA板上(Sambrook J.and RussellD.W.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual(3rded.),Cold Spring HarborLaboratory Press,2001)，并在37℃下培养过夜。使用PCR分析获得的菌落以选择所需的克隆。PCR条件如下：在95℃初始变性5分钟；然后30个循环：95℃30秒，54℃30秒，72℃1分钟；在72℃下最终延伸5分钟。也就是说，使用引物对P1(SEQ ID NO:81)/P5(SEQ ID NO:82)和P4(SEQ ID NO:83)/P6(SEQ ID NO:84)来选择含有ACAR基因的菌落。当使用针对ACAR基因的5'端部分的载体特异性引物P1和反向引物P5时，获得DNA片段(917bp)。当使用针对ACAR基因的3'端部分的载体特异性引物P4和引物P6时，获得DNA片段(1378bp)。从选择的菌落中提取含有ACAR基因的质粒，并命名为pEPlac-car。
<3>用于扩增entD基因的质粒pMW218::Ptac10000-entD的构建
entD基因编码PPT，其通过磷酸泛酰巯基乙胺化将ACAR(催化将香草酸转化为香草醛的反应)转化成其活性类型(J.Biol.Chem.,2007,Vol.282,No.1,pp.478-485)。因此，为了提高ACAR活性，通过以下方法构建用于扩增entD基因的质粒pMW218::Ptac10000-entD。
通过使用含有λattL-Kmr-λattR-Ptac(WO2008/090770A1)的DNA片段为模板，和SEQ ID NO:5和6的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有tac启动子区域的PCR产物。分别地，也通过使用大肠杆菌MG1655菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:7和8的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有entD基因的orf的PCR产物。SEQ ID NO:6和7的序列彼此部分互补。然后，将含有tac启动子区域的PCR产物和含有entD基因的orf的PCR产物以近似等摩尔量混合，并通过使用In Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)插入用EcoRI和SalI处理的pMW218载体(Nippon Gene)。利用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞，将细胞应用于含有100μMIPTG，40μg/mL X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基，并培养过夜。然后，挑取出现的白色菌落，分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒，并将其中插入靶PCR产物(含有在tac启动子区域下游连接的entD基因的orf的PCR产物)的质粒命名为pMW218::Ptac10000-entD。
<4>大肠杆菌JM109ΔyqhD/pMW218::Ptac10000-entD+pEPlac-car菌株的构建
通过电脉冲法将pMW218::Ptac10000-entD和pEPlac-car导入大肠杆菌JM109ΔyqhD菌株中。将细胞应用于含有25μg/ml卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基，并在37℃下培养。将生长的菌株在该琼脂培养基上纯化，并且命名为大肠杆菌JM109ΔyqhD/pMW218::Ptac10000-entD+pEPlac-car菌株。
<5>大肠杆菌JM109ΔyqhD/pMW218::Ptac10000-entD+pEPlac-car菌株的香草醛生产
将通过在含有25μg/ml卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基上培养获得的大肠杆菌JM109ΔyqhD/pMW218::Ptac10000-entD+pEPlac-car菌株的细胞接种到试管中含有的4mL LB培养基中，在37℃下振荡培养约16小时作为预培养物。将所得到的预培养肉汤的全部体积添加到200ml含于坂口(Sakaguchi)烧瓶中的LB培养基中，在需氧条件下于37℃进行培养直到600nm处的OD变为0.5，然后以1mM加入IPTG，并在37℃下进一步振荡培养2小时。然后，将获得的培养肉汤以8000rpm离心5分钟，除去上清液，用无菌生理盐水清洗细胞。清洗后，将全部量的细胞悬浮于5ml香草醛生产培养基(16g/L香草酸，40g/L葡萄糖，100mM Na2HPO4-12H2O，100mM TES缓冲液(用KOH调节到pH6.6)，60g/L CaCO3(用180℃的热空气灭菌3小时，然后混合))，并在30℃下振荡培养约20小时。
培养完成后，用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)分析培养基中残余葡萄糖的浓度。还通过用以下条件使用超高效液相色谱NEXERAX2System(SHIMADZU)分析了培养基中香草酸和香草醛的量。通过使用分光光度计U-2900(HITACHI)测量细胞密度(OD)。
UPLC分析的条件
柱：KINETEX 2.6μm XB-C18,150x 30mm(Phenomenex)
烘箱温度：40℃
流动相(A)：0.1％三氟乙酸
流动相(B)：0.1％三氟乙酸/80％乙腈
梯度程序(时间，A(％)，B(％))：(0,90,10)->(3,80,20)
流速：1.5ml/分钟
结果示于图1。大肠杆菌JM109ΔyqhD/pMW218::Ptac10000-entD+pEPlac-car菌株(其是yqhD基因缺陷并且其中ACAR基因和entD基因得到扩增)在约8小时中累积约6.6g/L香草醛。然而，此后，香草醛的积累量几乎没有增加，但香草醇的副产量增加了。
实施例1：筛选香草醛抗性菌株
<1>筛选香草醛抗性菌株(野生型菌株)
为了获得与用大肠杆菌获得的香草醛积累量相比改善的香草醛积累量，进行香草醛抗性菌株的筛选。具体地，通过使用大肠杆菌MG1655菌株作为对照菌株，调查了菠萝成团泛菌(Pantoea ananatis)No.359菌株(AJ13355菌株，FERM BP-6614)，菠萝成团泛菌SC17(0)菌株(VKPM B-9246)，产气肠杆菌G243株(AJ110637，FERM BP-10955)，谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC13869)，通过缺失2256菌株的香草醛利用能力而得到的谷氨酸棒状杆菌2256ΔvanABK菌株(后述)，酿酒酵母S228C菌株(ATCC 26108)的香草醛抗性。作为培养基，使用用于大肠杆菌，菠萝成团泛菌和产气肠杆菌的LB培养基，用于谷氨酸棒状杆菌的CM2B培养基(10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，5g/LNaCl，10μg/L生物素，pH 7.0，用KOH调节)和用于酿酒酵母的YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L细菌蛋白胨，20g/L葡萄糖)，它们都含有0、1或2g/L的香草醛。培养温度设定为30℃(酿酒酵母)，31.5℃(谷氨酸棒状杆菌)，34℃(产气肠杆菌，菠萝成团泛菌)或37℃(大肠杆菌)，并在需氧条件下进行培养。图2显示了细菌的结果，并且在图3中显示了酿酒酵母的结果。菠萝成团泛菌SC17(0)菌株和酿酒酵母S228C菌株在1μg/L的香草醛存在下生长，但它们在2g/L香草醛的存在下根本不生长。相反，可以确认即使在2g/L香草醛的存在下，谷氨酸棒状杆菌2256菌株和产气肠杆菌G243菌株也生长。基于上述结果，选择谷氨酸棒状杆菌2256菌株和产气肠杆菌G243菌株作为比大肠杆菌显示更高的香草醛抗性的菌株。
<2>筛选香草醛抗性菌株(显示减少的香草醇副产物的菌株)
调查了显示香草醇副生产减少的棒状杆菌细菌的香草醛抗性。具体而言，通过使用大肠杆菌JM109ΔyqhD菌株(显示减少的香草醇副生产的菌株)和酿酒酵母S228C菌株(野生型菌株)作为对照菌株，调查了谷氨酸棒状杆菌FKFC14菌株(后面解释)(其是显示减少的香草醇副生产的棒状杆菌细菌菌株)的香草醛抗性。使用用于大肠杆菌JM109ΔyqhD菌株的LBGM9培养基(10g/L细菌用胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，6g/L Na2HPO4，3g/LKH2PO4，0.5g/L NaCl，1g/L NH4Cl，5g/L葡萄糖，15g/L琼脂)和用于谷氨酸棒状杆菌FKFC14菌株的含有30g/L葡萄糖的CM2B培养基，并且进行培养直到600nm的OD变为约2。然后，香草醛以0、3或6g/L的浓度加入，并检查生长。至于酿酒酵母S228C菌株，使用葡萄糖浓度变为30g/L的YPD培养基培养直至600nm的OD变为约2，补充葡萄糖以获得20g/L的葡萄糖浓度，进一步培养1小时，然后以浓度0、3或6g/L加入香草醛，并检查生长。
结果显示在图4中。证明了谷氨酸棒状杆菌FKFC14菌株(其是显示香草醇副生产减少的棒状杆菌细菌菌株)比大肠杆菌JM109ΔyqhD菌株(显示减少的香草醇副生产的菌株)和酿酒酵母S228C菌株(野生型菌株)显示更高的香草醛抗性。
实施例2：谷氨酸棒状杆菌的香草醛生产
在该实施例中，从谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC 13869)作为亲本菌株构建扩增ACAR基因和entD基因(PPT基因)的菌株，并用构建的菌株进行香草醛的生产。
<1>用于扩增ACAR基因和entD基因的质粒pVK9::Ptuf-car+entD的构建
通过以下步骤构建用于表达源自巴西诺卡菌的ACAR基因和源自大肠杆菌的entD基因的质粒pVK9::Ptuf-car+entD。
通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA为模板和SEQ ID NO:9和10的合成DNA为引物进行PCR，以获得含有延伸因子Tu基因的启动子区域和SD序列的PCR产物。通过使用pEPlac-car质粒(参考例)为模板和SEQ ID NO:11和12的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有ACAR基因的orf的PCR产物。通过使用大肠杆菌MG1655株的基因组DNA为模板和SEQID NO:13和14的合成DNA为引物进行PCR，以获得含有entD基因的orf和SD序列的PCR产物。然后，使用In Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)将这些片段插入用BamHI和PstI处理的pVK9载体(WO2007/046389)中。pVK9是棒状杆菌细菌和大肠杆菌的穿梭载体。通过使用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo)的感受态细胞，并将细胞应用于含有100μM IPTG，40μg/mL X-Gal和25μg/mL卡那霉素的LB培养基，并且培养过夜。然后，挑出出现的白色菌落，并且分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒，并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pVK9::Ptuf-car+entD。在pVK9::Ptuf-car+entD中，ACAR基因和entD基因构成操纵子结构，并且由tuf启动子表达。
<2>谷氨酸棒状杆菌2256/pVK9::Ptuf-car+entD菌株的构建
通过电脉冲方法将pVK9::Ptuf-car+entD导入谷氨酸棒状杆菌2256菌株(野生型菌株)中。将细胞应用于含有25μg/ml卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基(5g/L葡萄糖，10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4，0.4g/LMgSO4-7H2O，0.01g/L FeSO4-7H2O，0.01g/LMnSO4-4-5H2O，3g/L尿素，1.2g/L大豆水解物，10μg/L生物素，15g/L琼脂，pH7.5，用NaOH调节)，并在31.5℃下培养。在相同的琼脂培养基上纯化生长的菌株，并命名为2256/pVK9::Ptuf-car+entD菌株。
<3>谷氨酸棒状杆菌2256/pVK9::Ptuf-car+entD菌株的香草醛生产
将通过在CM-Dex琼脂培养基上培养获得的谷氨酸棒状杆菌2256/pVK9::Ptuf-car+entD菌株的细胞接种到试管中4mL含有25μg/ml卡那霉素，2.5g/L果糖，2g/L琥珀酸和4g/L葡糖酸的CM-Dex培养基(具有与CM-Dex琼脂培养基的组成相同的组成，只是它不含琼脂)，并且在31.5℃下振荡培养约16小时作为预培养物。将所得到的预培养肉汤的全部体积加入Sakaguchi烧瓶中含有的200ml含有2.5g/L果糖，2g/L琥珀酸和4g/L葡糖酸的CM-Dex培养基，在31.5℃下在需氧条件下进行振荡培养，直到600nm处的OD变为1.5。然后，将获得的培养肉汤以8000rpm离心5分钟，除去上清液，并且用无菌生理盐水清洗细胞。清洗后，将全部体积的细胞悬浮于5ml香草醛生产培养基(16g/L香草酸，70g/L葡萄糖，100mM Na2HPO4-12H2O，100mM TES缓冲液(用KOH调节到pH6.6)，60g/L CaCO3(用180℃的热空气灭菌3小时，然后混合))，并且在30℃下振荡培养20小时。
培养完成后，用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)分析培养基中残余葡萄糖的浓度。还用以下条件使用超高效液相色谱NEXERA X2 System(SHIMADZU)分析培养基中香草酸和香草醛的量。通过使用分光光度计U-2900(HITACHI)测量细胞密度(OD)。
UPLC分析的条件
柱：KINETEX 2.6μm XB-C18,150x 30mm(Phenomenex)
烘箱温度：40℃
流动相(A)：0.1％三氟乙酸
流动相(B)：0.1％三氟乙酸/80％乙腈
梯度程序(时间，A(％)，B(％))：(0,90,10)->(3,80,20)
流速：1.5ml/min
表1中显示了结果。通过扩增用作亲本菌株的野生菌株中的ACAR基因和entD基因获得的2256/pVK9::Ptuf-car+entD菌株根本不产生香草醛，但是积累香草醇14.1g/L。也就是说，提示将所有生成的香草醛转化为香草醇。
[表1]
表1：谷氨酸棒状杆菌2256/pVK9::Ptuf-car+entD菌株的香草醛生产(±S.E.)
Figure BDA0001638671300000561
实施例3：醇脱氢酶同源基因缺失对谷氨酸棒状杆菌的香草醛生产的影响
在该实施例中，从谷氨酸棒状杆菌2256菌株(ATCC 13869)作为亲本菌株构建醇脱氢酶同源基因缺陷菌株，并用构建的菌株进行香草醛生产。
<1>香草醛利用基因缺陷菌株(FKS0165菌株)的构建
已经报道了在棒状杆菌细菌中，香草醛按香草醛->香草酸->原儿茶酸的顺序代谢，并利用(Current Microbiology,2005,Vol.51,pp.59-65)。从香草酸到原儿茶酸的转化反应由香草酸脱甲基酶催化。vanA基因和vanB基因分别编码香草酸脱甲基酶的亚基A和亚基B。vanK基因编码香草酸摄取系统，并与vanAB基因一起构成vanABK操纵子(M.T.Chaudhry,et al.,Microbiology,2007,153:857-865)。因此，首先通过缺失vanABK操纵子从谷氨酸棒状杆菌2256菌株构建香草醛利用能力缺陷菌株(FKS0165菌株)。程序如下所示。
<1-1>用于缺失vanABK基因的质粒pBS4SΔvanABK56的构建
通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板，和SEQ ID NO:15和16的合成DNA作为引物进行PCR，以获得含有vanA基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:17和18的合成DNA作为引物进行PCR，以获得含有vanK基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQ ID NO:16和17的序列彼此部分互补。然后，以近似等摩尔量混合含有vanA基因的N端侧编码区的PCR产物和含有vanK基因的C端侧编码区的PCR产物，并通过使用In Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞，并且将细胞应用于含有100μM IPTG，40μg/mL X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基，并培养过夜。然后，挑取出现的白色菌落，并且分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒，并将插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔvanABK56。
<1-2>FKS0165菌株的构建
上面获得的pBS4SΔvanABK56不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域。因此，如果用该质粒转化棒状杆菌细菌，则出现了通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株以作为转化体，但它以非常低的频率发生。因此，通过电脉冲法将pBS4SΔvanABK56导入谷氨酸棒状杆菌2256菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认生长的菌株是一次重组菌株，其中通过同源重组将pBS4SΔvanABK56掺入基因组中。此一次重组的菌株具有野生型vanABK基因和缺陷型vanABK基因两者。
将一次重组菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，并将该培养肉汤应用于S10琼脂培养基(100g/L蔗糖，10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4,0.4g/L MgSO4-7H2O,0.01g/L FeSO4-7H2O,0.01g/L MnSO4-4-5H2O，3g/L尿素，1.2g/L大豆蛋白水解物溶液，10μg/L生物素，20μg/L琼脂，用NaOH调节至pH7.5，并在120℃下高压灭菌20分钟)，并在31.5℃下培养。在出现的菌落中，在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。通过从纯化的菌株中制备基因组DNA，并使用它用SEQ ID NO:19和20的合成DNA作为引物进行PCR，确认了vanABK基因的缺失，并将该菌株命名为FKS0165菌株。
<2>醇脱氢酶同源基因缺陷菌株(FKFC14菌株)的构建
随后，通过使用谷氨酸棒状杆菌菌株FKS0165作为亲本株，通过以下程序构建菌株FKFC14，其是醇脱氢酶同源基因(即NCgl0324基因(adhC)、NCgl0313基因(adhE)、和NCgl2709gene(adhA))缺陷的。
<2-1>FKFC5菌株(FKS0165ΔNCgl0324菌株)的构建
<2-1-1>用于缺失NCgl0324基因的质粒pBS4SΔ2256adhC的构建
通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板，和SEQ ID NO:21和22的合成DNA作为引物进行PCR，以获得含有NCgl0324基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板，和SEQ ID NO:23和24的合成DNA作为引物进行PCR，以获得含有NCgl0324基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQ ID NO:22和23的序列彼此部分互补。然后，将约等摩尔量的含有NCgl0324基因的N端侧编码区的PCR产物和含有NCgl0324基因的C端侧编码区的PCR产物混合，并通过使用In Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞，并且将细胞应用于含有100μM IPTG，40μg/mL X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基，并培养过夜。然后，挑取出现的白色菌落，分离成单菌落以获得转化体。从所获得的转化体中提取质粒，并将其中插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256adhC。
<2-1-2>FKFC5菌株(FKS0165ΔNCgl0324菌株)的构建
由于上述获得的pBS4SΔ2256adhC不含使质粒能够在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状杆菌细菌，则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现，尽管它以非常低的频率发生。因此，通过电脉冲法将pBS4SΔ2256adhC导入谷氨酸棒状杆菌FKS0165菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认，生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhC掺入基因组中的一次重组菌株。此一次重组菌株具有野生型NCgl0324基因和缺陷型NCgl0324基因两者。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，在CM-Dex琼脂培养基上纯化显示卡那霉素易感性的菌株。从纯化的菌株制备基因组DNA，并用SEQ ID NO:25和26的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCg10324基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC5菌株。
<2-2>FKFC11菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313菌株)的构建
<2-2-1>用于缺失NCgl0313基因的质粒pBS4SΔ2256adhE的构建
通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:27和28的合成DNA作为引物进行PCR，以获得含有NCgl0313基因的N端侧编码区的PCR产物。分别通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA为模板和SEQ ID NO:29和30的合成DNA为引物进行PCR，以获得含有NCgl0313基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQ ID NO:28和29的序列彼此部分互补。然后，将约等摩尔量的含有NCgl0313基因的N端侧编码区的PCR产物和含有NCgl0313基因的C端侧编码区的PCR产物混合，并通过使用In Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)将其插入用BamHI和PstI处理的pBS4S载体(WO2007/046389)中。利用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞，并且将细胞应用于含有100μM IPTG，40μg/mL X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基，并培养过夜。然后，挑取出现的白色菌落，并且分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒，并将其中插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256adhE。
<2-2-2>FKFC11菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313株)的构建
由于上述获得的pBS4SΔ2256adhE不含有使质粒能够在棒状杆菌细菌细胞中的自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状杆菌，则通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株作为转化体出现，尽管它在非常低的频率发生。因此，通过电脉冲方法将pBS4SΔ2256adhE导入谷氨酸棒状杆菌FKFC5菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR证实，生长的菌株是一次重组菌株，其中通过同源重组将pBS4SΔ2256adhE掺入基因组中。此一次重组菌株具有野生型NCgl0313基因和缺陷型NCgl0313基因。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基上，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株制备基因组DNA，并使用SEQ ID NO:31和32的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl0313基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC11菌株。
<2-3>FKFC14菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709株)的构建
<2-3-1>用于缺失NCgl2709基因的质粒pBS4SΔ2256adhA的构建
通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:33和34的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有NCgl2709的N端侧编码区的PCR产物基因。分别通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA为模板和SEQ ID NO:35和36的合成DNA作为引物进行PCR，以得到含有NCgl2709基因的C端侧编码区的PCR产物。SEQ ID NO:34和35的序列彼此部分互补。然后，将约等摩尔量的含有NCgl2709基因的N端侧编码区的PCR产物和含有NCgl2709基因的C端侧编码区的PCR产物混合，并通过使用In Fusion HD克隆试剂盒(Clontech)插入到用BamHI和PstI处理的pBS4S载体中。利用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞，并且将细胞应用于含有100μM IPTG，40μg/mL X-Gal和40μg/mL卡那霉素的LB培养基，并培养过夜。然后，挑取出现的白色菌落，分离成单菌落以获得转化体。从获得的转化体中提取质粒，并将其中插入了靶PCR产物的质粒命名为pBS4SΔ2256adhA。
<2-3-2>FKFC14菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl0313ΔNCgl2709菌株)的构建
由于上文获得的pBS4SΔ2256adhA不含能够使质粒在棒状杆菌细菌细胞中自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状杆菌，则出现了通过同源重组将该质粒掺入基因组的菌株以作为转化体，尽管它在非常低的频率发生。因此，通过电脉冲法将pBS4SΔ2256adhA导入谷氨酸棒状杆菌FKFC11菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认，生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhA掺入基因组中的一次重组菌株。该一次重组菌株具有野生型NCgl2709基因和缺陷型NCgl2709基因两者。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基上，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株制备基因组DNA，并用SEQ ID NO:37和38的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl2709基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC14菌株。
<3>香草醛生产菌株的构建
<3-1>用于表达vanK基因的质粒pVS7::Plac-vanK的构建
vanK基因编码香草酸摄取系统。因此，为了改善香草酸的摄取，通过以下程序构建了用于表达谷氨酸棒状杆菌2256菌株的vanK基因的质粒pVS7::Plac-vanK。谷氨酸棒状杆菌2256菌株的vanK基因的核苷酸序列和由该基因编码的VanK蛋白的氨基酸序列分别如SEQID NO:53和54所示。
通过使用谷氨酸棒状杆菌2256菌株的基因组DNA作为模板和SEQ ID NO:39和40的合成DNA作为引物进行PCR以获得含有vanK的ORF和SD的PCR产物基因。然后，使用In FusionHD克隆试剂盒(Clontech)将PCR产物插入用BamHI和PstI处理的pVS7载体(WO2013/069634)中。pVS7载体是棒状杆菌细菌和大肠杆菌的穿梭载体。通过使用该DNA，转化大肠杆菌JM109(Takara Bio)的感受态细胞，并将细胞应用于含有100μM IPTG,40μg/mL ofX-Gal和50μg/mL壮观霉素的LB培养基，并且培养过夜。然后，挑取出现的白色菌落，分离成单菌落以获得转化体。从所得到的转化体中提取质粒，将插入了靶PCR产物的质粒命名为pVS7::Plac-vanK。在pVS7::Plac-vanK中，克隆的vanK基因由源自pVS7载体的lac启动子表达。
<3-2>引入pVK9::Ptuf-car+entD和pVS7::Plac-vanK
通过电脉冲方法将pVS7::Plac-vanK和pVK9或pVK9::Ptuf-car+entD导入谷氨酸棒状杆菌FKFC14菌株。将细胞应用于含有25μg/ml卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。在相同的琼脂培养基上纯化生长的菌株，分别命名为FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9菌株和FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9::Ptuf-car+entD菌株。
<4>NCgl2709，NCgl0324和NCgl0313基因缺失对香草醛产生的影响
通过在CM-Dex琼脂培养基上培养获得的FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9菌株和FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9::Ptuf-car+entD菌株的细胞各自接种到试管中含有的含有50μg/mL壮观霉素，25μg/ml卡那霉素，2.5g/L果糖，2g/L琥珀酸和4g/L葡糖酸的CM-Dex培养基中，在31.5℃下振荡培养约16小时作为预培养物。将所得到的预培养肉汤的全部体积加入Sakaguchi烧瓶中包含的200ml含有2.5g/L果糖，2g/L琥珀酸和4g/L葡糖酸的CM-Dex培养基中，在31.5℃下在需氧条件下振荡进行培养，直到在600nm处的OD变为0.625。然后，将获得的培养肉汤以7000rpm离心5分钟，除去上清液，用无菌生理盐水清洗细胞。然后，将1.5ml无菌生理盐水加入到细胞中，并将细胞悬浮于其中。将全部体积的悬浮液与3.5ml香草醛生产培养基(香草酸12g/L，葡萄糖40g/L，100mM Na2HPO4-12H2O，100mM TES缓冲液(用KOH调节至pH 6.6))，30g/L的CaCO3(用180℃的热空气灭菌3小时，然后混合)，并在30℃下振荡培养约20小时。
培养完成后，用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)分析培养基中残余葡萄糖的浓度。还用以下条件使用超高效液相色谱NEXERA X2 System(SHIMADZU)分析培养基中香草酸和香草醛的量。通过使用分光光度计U-2900(HITACHI)测量细胞密度(OD)。
UPLC分析的条件
柱：KINETEX 2.6μm XB-C18,150x 30mm(Phenomenex)
烘箱温度：40℃
流动相(A)：0.1％三氟乙酸
流动相(B)：0.1％三氟乙酸/80％乙腈
梯度程序(时间，A(％),B(％)):(0,90,10)->(3,80,20)
流速：1.5ml/min
表2中显示了结果。作为对照的FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9菌株不产生香草醛，但是FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9::Ptuf-car+entD菌株(其中扩增ACAR基因和entD基因)积累约10g/L香草醛，这意味着香草醛积累量与使用大肠杆菌作为宿主的情况(参考例)相比显著改善。此外，对于FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9菌株和FKFC14/pVS7::Plac-vanK+pVK9::Ptuf-car+entD菌株(其是醇脱氢酶同源基因，NCgl2709基因，NCgl0324基因和NCgl0313基因缺陷的)中的任一种，根本检测不到香草醇的副生产。基于上述结果，揭示了(1)在棒状杆菌细菌中，NCgl2709基因，NCgl0324基因和NCgl0313基因中的一个或多个编码用于从香草醛转化为香草醇的酶，并且缺失这些基因消除香草醇的副生产，和(2)棒状杆菌细菌具有高香草醛生产能力。
[表2]
表2：谷氨酸棒状杆菌的ADH基因缺陷菌株产生的香草醛
Figure BDA0001638671300000621
Figure BDA0001638671300000631
N.D.:未检出
实施例4：鉴定参与香草醇生产的基因
然后，为了鉴定NCgl0324，NCgl0313和NCgl2709基因中参与香草醇生产的基因，构建了单基因缺失菌株和双基因缺失菌株。
<1>醇脱氢酶同源基因缺陷的菌株的构建
<1-1>FKFC1菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0313)的构建
由于上文获得的pBS4SΔ2256adhE(实施例3<2-2-1>)不含使质粒能够在棒状杆菌细菌细胞中的自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状杆菌细菌，则出现了通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株以作为转化体，尽管它以非常低的频率发生。因此，通过电脉冲法将pBS4SΔ2256adhE导入谷氨酸棒状杆菌FKS0165菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认，生长的菌株是一次重组菌株，其中通过同源重组将pBS4SΔ2256adhE掺入基因组中。该一次重组菌株具有野生型NCgl0313基因和缺陷型NCgl0313基因两者。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基上，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株中制备基因组DNA，并使用SEQ ID NO:31和32的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl0313基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC1菌株。
<1-2>FKFC3菌株(2256ΔvanABKΔNCgl2709)的构建
由于上文获得的pBS4SΔ2256adhA(实施例3<2-3-1>)不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中的自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状细菌，则出现了通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株以作为转化体，尽管它以非常低的频率发生。因此，通过电脉冲方法将pBS4SΔ2256adhA导入谷氨酸棒状杆菌FKS0165菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认，生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhA掺入基因组中的一次重组菌株。该一次重组菌株具有野生型NCgl2709基因和缺陷型NCgl2709基因两者。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基上，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株中制备基因组DNA，并使用SEQ ID NO:37和38的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl2709基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC3菌株。
<1-3>FKFC7菌株(2256ΔvanABKΔNCgl0324ΔNCgl2709)的构建
由于上文获得的pBS4SΔ2256adhA(实施例3<2-3-1>)不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中的自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状细菌，则出现了通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株以作为转化体，尽管它以非常低的频率发生。因此，通过电脉冲方法将pBS4SΔ2256adhA导入谷氨酸棒状杆菌FKFC5菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认，生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhA掺入基因组中的一次重组菌株。该一次重组菌株具有野生型NCgl2709基因和缺陷型NCgl2709基因两者。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基上，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株中制备基因组DNA，并使用SEQ ID NO:37和38的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl2709基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC7菌株。
<1-4>FKFC9菌株(2256ΔvanABKΔNCgl2709ΔNCgl0313)的构建
由于上文获得的pBS4SΔ2256adhE(实施例3<2-2-1>)不含能使质粒在棒状杆菌细菌细胞中的自主复制的区域，如果用该质粒转化棒状细菌，则出现了通过同源重组将该质粒掺入基因组中的菌株以作为转化体，尽管它以非常低的频率发生。因此，通过电脉冲方法将pBS4SΔ2256adhE导入谷氨酸棒状杆菌FKFC3菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素的CM-Dex琼脂培养基，并在31.5℃下培养。通过PCR确认，生长的菌株是通过同源重组将pBS4SΔ2256adhE掺入基因组中的一次重组菌株。该一次重组菌株具有野生型NCgl0313基因和缺陷型NCgl0313基因两者。
将一次重组的菌株在CM-Dex液体培养基中培养过夜，将培养基施加到S10琼脂培养基上，并在31.5℃下进行培养。在出现的菌落中，显示卡那霉素易感性的菌株在CM-Dex琼脂培养基上纯化。从纯化的菌株中制备基因组DNA，并使用SEQ ID NO:31和32的合成DNA作为引物进行PCR以确认NCgl0313基因的缺失，并将该菌株命名为FKFC9菌株。
<2>香草醇生产实验
在香草醛的存在下分别培养谷氨酸棒状杆菌FKS0165,FKFC1,FKFC3,FKFC5,FKFC7,FKFC9,FKFC11,和FKFC14菌株，并且测定香草醇的产生量，从而鉴定参与香草醇生产的基因。
使用含有1g/L香草醛的CM2B液体培养基在30℃进行约24小时的培养。
培养完成后，用以下条件使用超高效液相色谱NEXERA X2System(SHIMADZU)分析培养基中香草醛和香草醇的量。通过使用分光光度计U-2900(HITACHI)测量细胞密度(OD)。
UPLC分析的条件
柱：KINETEX 2.6μm XB-C18,150x 30mm(Phenomenex)
烘箱温度：40℃
流动相(A)：0.1％三氟乙酸
流动相(B)：0.1％三氟乙酸/80％乙腈
梯度程序(时间，A(％),B(％)):(0,90,10)->(3,80,20)
流速：1.5ml/min
结果，仅仅对NCgl0324缺陷型菌株根本检测不到香草醇(图5)。根据结果，揭示了NCgl0324基因参与从香草醛向香草醇的转化。
实施例5：由谷氨酸棒状杆菌的ADH基因缺陷型菌株的苯甲醛生产和肉桂醛生产
在该实施例中，用谷氨酸棒状杆菌的ADH基因缺陷型菌株进行苯甲醛生产和肉桂醛生产。
<1>芳香醛生产菌株的构建
<1-1>用于共表达ACAR和PPT基因的质粒的构建
通过以下程序构建用于共表达Gordonia effusa的ACAR基因(Ge_ACAR，密码子优化的)和大肠杆菌的PPT基因(entD)的质粒pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD。
用BamHI和PstI处理pVK9载体(WO2007/046389)，并用包含由以下顺序的Tuf*启动子，SD序列，Ge_ACAR(密码子优化的)，SD序列和大肠杆菌entD基因组成的人工操纵子的DNA片段插入，以获得质粒pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD。含有该质粒的插入DNA片段的部分的核苷酸序列以SEQ ID NO:99所示，其中插入的DNA片段对应于位置16-4517。Ge_ACAR(密码子优化的)已经针对大肠杆菌的密码子选择进行了密码子优化。Ge_ACAR的核苷酸序列(密码子优化的)以SEQ ID NO:100显示。
<1-2>芳香醛生产菌株的构建
通过电脉冲方法将质粒pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD和质粒pVS7::Plac-vanK导入谷氨酸棒状杆菌FKS0165,FKFC1,FKFC3,FKFC5,FKFC7,FKFC9,FKFC11,和FKFC14菌株。将细胞应用于含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的CM-Dex SGFC琼脂培养基(2.5g/L葡萄糖，2.5g/L果糖，10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4,0.4g/L MgSO4-7H2O,0.01g/L FeSO4-7H2O,0.01g/L MnSO4-4-5H2O,2g/L琥珀酸二钠六水合物，4g/L葡糖酸钠，3g/L尿素，1.2g/L大豆水解物，10μg/L生物素，15g/L琼脂，用NaOH调节至pH7.5)，并在31.5℃。在相同的琼脂培养基上纯化生长的菌株，分别命名为FKS0165/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entDpVS7-vanK,FKFC1/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC3/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC5/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC7/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC9/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC11/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,和FKFC14/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK。将这些菌株分别接种到试管中包含的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的4mL CM-DexSGFC培养基(具有与CM-Dex SGFC琼脂培养基相同的组成，只是它不含琼脂)，并且在31.5℃振荡培养约16小时。将得到的培养肉汤的0.75mL等分试样与0.75mL的40％甘油水溶液混合，以得到甘油原液，贮存于-80℃。
<2>用于谷氨酸棒状杆菌的ADH基因缺陷菌株的苯甲醛生产量的比较
将构建的芳香醛生产菌株的每种甘油原液的20μL等分试样施加到含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的CM-Dex SGFC琼脂培养基上，并在31.5℃培养20小时作为预培养物。将获得的细胞悬浮在无菌生理盐水中。测量细胞悬浮液的光密度(OD)，并用生理盐水稀释细胞悬浮液以获得在600nm的OD为83。将稀释的细胞悬液的1.5mL等分试样接种到试管中包含的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的3.5mL苯甲醛生产培养基(14.3g/L苯甲酸，85.7g/L葡萄糖，10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4,0.4g/LMgSO4-7H2O,0.01g/L FeSO4-7H2O,0.01g/L MnSO4-4-5H2O,3g/L尿素，1.2g/L大豆水解物，10μg/L生物素，用KOH调节至pH 7.4，然后与8.6g/L CaCO3(在180℃的热空气中灭菌3小时)混合)，并在30℃下振荡培养4小时。
在培养开始和完成时，用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)分析培养基中的葡萄糖浓度。还用以下条件使用高效液相色谱GL7700 System(GL Science)分析培养基中的苯甲酸，苯甲醛和苯甲醇的浓度。
UPLC分析的条件
柱：CAPCELL PAK C18MG II 3μm,150x 4.6mm(SHISEIDO)
烘箱温度：40℃
流动相(A)：10mM K2HPO4/10mM KH2PO4
流动相(B)：100％乙腈
梯度程序(时间，A(％),B(％)):(0,98,2)->(2,98,2)->(16,50,50)->(16.01,98,2)
流速：1ml/min
表3中显示了结果。与对照菌株FKS0165/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entDpVS7-vanK相比，对NCgl0324和NCgl2709基因中的任一种缺陷型的菌株，即FKFC3/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC5/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC9/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK，和FKFC11/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK观察到增加的苯甲醛生产量。另外，对NCgl0324和NCgl2709基因两者缺陷型的菌株，即FKFC7/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK和FKFC14/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK观察到苯甲醛的生产量进一步增加和苯甲醇的生产量减少。从这些结果中揭示了NCgl0324和NCgl2709基因参与从苯甲醛向苯甲醇的转化。
[表3]
表3：由谷氨酸棒状杆菌的ADH基因缺陷型菌株的苯甲醛生产
Figure BDA0001638671300000671
Figure BDA0001638671300000681
<3>谷氨酸棒状杆菌ADH基因缺陷型菌株的肉桂醛生产量的比较
将构建的芳香醛生产菌株的每种甘油原液的20μL等分试样施加到含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的CM-Dex SGFC琼脂培养基上，并在31.5℃下培养20小时作为预培养物。将获得的细胞悬浮在无菌生理盐水中。测量细胞悬浮液的光密度(OD)，并用生理盐水稀释细胞悬浮液以获得在600nm处的OD为83。将稀释的细胞悬液的1.5mL等分试样接种到试管中包含的含有25μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的3.5mL肉桂醛生产培养基(14.3g/L肉桂酸，85.7g/L葡萄糖，10g/L聚胨，10g/L酵母提取物，1g/L KH2PO4,0.4g/LMgSO4-7H2O,0.01g/L FeSO4-7H2O,0.01g/L MnSO4-4-5H2O,3g/L尿素，1.2g/L大豆水解物，10μg/L生物素，用KOH调节至pH 7.4，然后与8.6g/LCaCO3(在180℃热空气中灭菌3小时)混合，并在室温下静置温育5分钟。
温育完成后，用Biotech Analyzer AS-310(Sakura SI)分析培养基中的葡萄糖浓度。还用以下条件使用超高效液相色谱NEXERA X2System(SHIMADZU)分析了肉桂酸，肉桂醛和肉桂醇在培养基中的浓度。
UPLC分析的条件
柱：KINETEX 2.6μm联苯，100x 3.0mm(Phenomenex)
烘箱温度：40℃
流动相(A)：磷酸钠缓冲液pH2.6(10mM PO4 3-)
流动相(B)：甲醇
梯度程序(时间，A(％),B(％)):(0,75,25)->(8,35,65)
流速：1ml/min
表4中显示了结果。与对照菌株FKS0165/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entDpVS7-vanK相比，对NCgl0324和NCgl2709基因中的任一种缺陷型的菌株，即FKFC3/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC5/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,FKFC9/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK,和FKFC11/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK观察到肉桂醛生产量的增加。另外，对NCgl0324和NCgl2709基因两者缺陷型的菌株，即FKFC7/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK和FKFC14/pVK9::Ptuf*-Ge_ACAR-entD pVS7-vanK观察到肉桂醛生产量的进一步增加和肉桂醇的生产量减少。从这些结果可以看出，NCgl0324和NCgl2709基因参与肉桂醛向肉桂醇的转化。
[表4]
表4：谷氨酸棒状杆菌的ADH基因缺陷菌株的肉桂醛生产
Figure BDA0001638671300000691
Figure BDA0001638671300000701
[工业适用性]
根据本发明，可以改善棒状杆菌细菌用于生产目标物质，即芳香醛诸如香草醛的能力，并且可以有效生产目标物质。特别地，根据本发明，可以在不使用用于减轻目标物质的毒素的手段，诸如双层发酵和树脂的情况下有效生产目标物质。
序列表的解释
SEQ ID NO:1-40：引物
41-44：人的OMT基因的转录物变体1至4的核苷酸序列
45：人的OMT同种型(MB-COMT)的氨基酸序列
46：人的OMT同种型(S-COMT)的氨基酸序列
47：巴西诺卡菌的变体ACAR基因的核苷酸序列
48：巴西诺卡菌的变体ACAR蛋白的氨基酸序列
49：大肠杆菌MG1655的entD基因的核苷酸序列
50：大肠杆菌MG1655的EntD蛋白的氨基酸序列
51：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的PPT基因的核苷酸序列
52：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的PPT蛋白的氨基酸序列
53：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的vanK基因的核苷酸序列
54：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的VanK蛋白的氨基酸序列
55：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的pcaK基因的核苷酸序列
56：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的PcaK蛋白的氨基酸序列
57：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的vanA基因的核苷酸序列
58：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的VanA蛋白的氨基酸序列
59：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的vanB基因的核苷酸序列
60：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的VanB蛋白的氨基酸序列
61：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的pcaG基因的核苷酸序列
62：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的PcaG蛋白的氨基酸序列
63：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的pcaH基因的核苷酸序列
64：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的PcaH蛋白的氨基酸序列
65：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的NCgl0324基因的核苷酸序列
66：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的NCgl0324蛋白的氨基酸序列
67：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的NCgl0313基因的核苷酸序列
68：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的NCgl0313蛋白的氨基酸序列
69：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的NCgl2709基因的核苷酸序列
70：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13869(谷氨酸棒状杆菌2256)的NCgl2709蛋白的氨基酸序列
71：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的NCgl0219基因的核苷酸序列
72：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的NCgl0219蛋白的氨基酸序列
73：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的NCgl2382基因的核苷酸序列
74：谷氨酸棒状杆菌ATCC 13032的NCgl2382蛋白的氨基酸序列
75：巴西诺卡菌的ACAR基因的核苷酸序列
76：巴西诺卡菌的ACAR蛋白的氨基酸序列
77：巴西诺卡菌的ACAR基因同源物的核苷酸序列，片段
78：巴西诺卡菌的ACAR基因同源物的氨基酸序列，片段
79：巴西诺卡菌的密码子优化的变体ACAR基因的核苷酸序列，侧翼有NdeI和SacI
80：pELAC载体
81-84：引物
85:大肠杆菌MG1655的aroG基因的核苷酸序列
86:大肠杆菌MG1655的AroG蛋白的氨基酸序列
87:大肠杆菌MG1655的aroB基因的核苷酸序列
88:大肠杆菌MG1655的AroB蛋白的氨基酸序列
89:大肠杆菌MG1655的aroD基因的核苷酸序列
90:大肠杆菌MG1655的AroD蛋白的氨基酸序列
91:苏云金芽孢杆菌BMB171的asbF基因的核苷酸序列
92:苏云金芽孢杆菌BMB171的AsbF蛋白的氨基酸序列
93:大肠杆菌MG1655的tyrR基因的核苷酸序列
94:大肠杆菌MG1655的TyrR蛋白的氨基酸序列
95:Niastella koreensis的OMT基因的核苷酸序列
96:Niastella koreensis的OMT的氨基酸序列
97:Gordonia effusa的ACAR基因的核苷酸序列
98:Gordonia effusa的ACAR蛋白的氨基酸序列
99：含有Gordonia effusa的ACAR基因(密码子优化的)和大肠杆菌的entD基因的DNA片段的核苷酸序列
100：针对大肠杆菌的密码子选择进行了密码子优化的Gordonia effusa的ACAR基因的核苷酸序列
101：大肠杆菌MG1655的aroE基因的核苷酸序列
102：大肠杆菌MG1655的AroE蛋白的氨基酸序列。
序列表
<110> 味之素株式会社
<120> 用于生产醛的方法
<130> D735-16285
<150> RU2015146077
<151> 2015-10-27
<160> 102
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
caggcagatc gttctctgcc ctcatattgg cccagcaaag ggagcaagta tctagacgct 60
caagttag 68
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
cttaagtctg gacgaaatgc ccgaaaacga aagtttgagg cgtaaaaagc agatcttgaa 60
gcctgctttt ttatac 76
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
agaaataggc aagacattgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggattagcca tacgttcctc 20
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
ccatgattac gaattccccc tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat g 51
<210> 6
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
cgaccatatt cgagatcctg tgtgaaattg ttatccgc 38
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 7
tctcgaatat ggtcgatatg 20
<210> 8
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 8
atgcctgcag gtcgaccgca tatccggttg tcagg 35
<210> 9
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 9
ccaagcttgc atgccagatc gtttagatcc gaagg 35
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 10
tgtatgtcct cctggacttc 20
<210> 11
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 11
ccaggaggac atacaatggc aactgacagc aggag 35
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
gtatgtcctc ctttataaca gacctaaatg acg 33
<210> 13
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
aaaggaggac atacaatggt cgatatgaaa actacg 36
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
cggtacccgg ggatcccgca tatccggttg tcagg 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
cggtacccgg ggatccttac ttccgcgtat ccaac 35
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 16
ctaggaatcg cggccggtga actcctaaag aactatataa c 41
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 17
ggccgcgatt cctagcatgc 20
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 18
ccaagcttgc atgccagtca tcatcaacgg tgccg 35
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 19
atctccgcag aagacgtact g 21
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 20
tccgatcatg tatgacctcc 20
<210> 21
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 21
cggtacccgg ggatcggcat agtgcttcca acgctc 36
<210> 22
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
tagctccact caagattcct cgatattacc tacagg 36
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
tcttgagtgg agctagggcc 20
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
ccaagcttgc atgcccatat agagcccagg agctctc 37
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
cgccgcaaag tccaaataga aag 23
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
ggattcttcc tgaactcagc 20
<210> 27
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
cggtacccgg ggatcgggct cgtcctgaaa ttgcac 36
<210> 28
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
tccgtcgtga gccatgttgt gcccacgaga ctacc 35
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 29
atggctcacg acggattgcg 20
<210> 30
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 30
ccaagcttgc atgcccggtt gcagccttca taaacg 36
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 31
agaccaatga gtacccaacc g 21
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 32
tcagcgtctg gctcagctac 20
<210> 33
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 33
cggtacccgg ggatcaaccc cagctcaaat aacacc 36
<210> 34
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 34
tttcaacaca atccgtcctt ctcgcttgga ttacttg 37
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 35
cggattgtgt tgaaattgct ctg 23
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 36
ccaagcttgc atgcctcacc acgggaatct tcagg 35
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 37
ccggactggg gtgtgttttg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 38
cccggaaaat acggtatagc 20
<210> 39
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 39
ccaagcttgc atgccaggag gattataatg cgcctgcgtg tctcgag 47
<210> 40
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 40
cggtacccgg ggatccaact acgcggcgac gtac 34
<210> 41
<211> 2304
<212> DNA
<213> 人
<400> 41
cggcctgcgt ccgccaccgg aagcgccctc ctaatccccg cagcgccacc gccattgccg 60
ccatcgtcgt ggggcttctg gggcagctag ggctgcccgc cgcgctgcct gcgccggacc 120
ggggcgggtc cagtcccggg cgggccgtcg cgggagagaa ataacatctg ctttgctgcc 180
gagctcagag gagaccccag acccctcccg cagccagagg gctggagcct gctcagaggt 240
gctttgaaga tgccggaggc cccgcctctg ctgttggcag ctgtgttgct gggcctggtg 300
ctgctggtgg tgctgctgct gcttctgagg cactggggct ggggcctgtg ccttatcggc 360
tggaacgagt tcatcctgca gcccatccac aacctgctca tgggtgacac caaggagcag 420
cgcatcctga accacgtgct gcagcatgcg gagcccggga acgcacagag cgtgctggag 480
gccattgaca cctactgcga gcagaaggag tgggccatga acgtgggcga caagaaaggc 540
aagatcgtgg acgccgtgat tcaggagcac cagccctccg tgctgctgga gctgggggcc 600
tactgtggct actcagctgt gcgcatggcc cgcctgctgt caccaggggc gaggctcatc 660
accatcgaga tcaaccccga ctgtgccgcc atcacccagc ggatggtgga tttcgctggc 720
gtgaaggaca aggtcaccct tgtggttgga gcgtcccagg acatcatccc ccagctgaag 780
aagaagtatg atgtggacac actggacatg gtcttcctcg accactggaa ggaccggtac 840
ctgccggaca cgcttctctt ggaggaatgt ggcctgctgc ggaaggggac agtgctactg 900
gctgacaacg tgatctgccc aggtgcgcca gacttcctag cacacgtgcg cgggagcagc 960
tgctttgagt gcacacacta ccaatcgttc ctggaataca gggaggtggt ggacggcctg 1020
gagaaggcca tctacaaggg cccaggcagc gaagcagggc cctgactgcc cccccggccc 1080
ccctctcggg ctctctcacc cagcctggta ctgaaggtgc cagacgtgct cctgctgacc 1140
ttctgcggct ccgggctgtg tcctaaatgc aaagcacacc tcggccgagg cctgcgccct 1200
gacatgctaa cctctctgaa ctgcaacact ggattgttct tttttaagac tcaatcatga 1260
cttctttact aacactggct agctatatta tcttatatac taatatcatg ttttaaaaat 1320
ataaaataga aattaagaat ctaaatattt agatataact cgacttagta catccttctc 1380
aactgccatt cccctgctgc ccttgacttg ggcaccaaac attcaaagct ccccttgacg 1440
gacgctaacg ctaagggcgg ggcccctagc tggctgggtt ctgggtggca cgcctggccc 1500
actggcctcc cagccacagt ggtgcagagg tcagccctcc tgcagctagg ccaggggcac 1560
ctgttagccc catggggacg actgccggcc tgggaaacga agaggagtca gccagcattc 1620
acacctttct gaccaagcag gcgctgggga caggtggacc ccgcagcagc accagcccct 1680
ctgggcccca tgtggcacag agtggaagca tctccttccc tactccccac tgggccttgc 1740
ttacagaaga ggcaatggct cagaccagct cccgcatccc tgtagttgcc tccctggccc 1800
atgagtgagg atgcagtgct ggtttctgcc cacctacacc tagagctgtc cccatctcct 1860
ccaaggggtc agactgctag ccacctcaga ggctccaagg gcccagttcc caggcccagg 1920
acaggaatca accctgtgct agctgagttc acctgcaccg agaccagccc ctagccaaga 1980
ttctactcct gggctcaagg cctggctagc ccccagccag cccactccta tggatagaca 2040
gaccagtgag cccaagtgga caagtttggg gccacccagg gaccagaaac agagcctctg 2100
caggacacag cagatgggca cctgggacca cctccaccca gggccctgcc ccagacgcgc 2160
agaggcccga cacaagggag aagccagcca cttgtgccag acctgagtgg cagaaagcaa 2220
aaagttcctt tgctgcttta atttttaaat tttcttacaa aaatttaggt gtttaccaat 2280
agtcttattt tggcttattt ttaa 2304
<210> 42
<211> 2262
<212> DNA
<213> 人
<400> 42
ctcccacggg aggagcaaga acacagaaca gagggggcaa gacagctcca ccaggagtca 60
ggagtgaatc ccctctggga acgaggcact aggaagaaga acttccagcc caggagaaat 120
aacatctgct ttgctgccga gctcagagga gaccccagac ccctcccgca gccagagggc 180
tggagcctgc tcagaggtgc tttgaagatg ccggaggccc cgcctctgct gttggcagct 240
gtgttgctgg gcctggtgct gctggtggtg ctgctgctgc ttctgaggca ctggggctgg 300
ggcctgtgcc ttatcggctg gaacgagttc atcctgcagc ccatccacaa cctgctcatg 360
ggtgacacca aggagcagcg catcctgaac cacgtgctgc agcatgcgga gcccgggaac 420
gcacagagcg tgctggaggc cattgacacc tactgcgagc agaaggagtg ggccatgaac 480
gtgggcgaca agaaaggcaa gatcgtggac gccgtgattc aggagcacca gccctccgtg 540
ctgctggagc tgggggccta ctgtggctac tcagctgtgc gcatggcccg cctgctgtca 600
ccaggggcga ggctcatcac catcgagatc aaccccgact gtgccgccat cacccagcgg 660
atggtggatt tcgctggcgt gaaggacaag gtcacccttg tggttggagc gtcccaggac 720
atcatccccc agctgaagaa gaagtatgat gtggacacac tggacatggt cttcctcgac 780
cactggaagg accggtacct gccggacacg cttctcttgg aggaatgtgg cctgctgcgg 840
aaggggacag tgctactggc tgacaacgtg atctgcccag gtgcgccaga cttcctagca 900
cacgtgcgcg ggagcagctg ctttgagtgc acacactacc aatcgttcct ggaatacagg 960
gaggtggtgg acggcctgga gaaggccatc tacaagggcc caggcagcga agcagggccc 1020
tgactgcccc cccggccccc ctctcgggct ctctcaccca gcctggtact gaaggtgcca 1080
gacgtgctcc tgctgacctt ctgcggctcc gggctgtgtc ctaaatgcaa agcacacctc 1140
ggccgaggcc tgcgccctga catgctaacc tctctgaact gcaacactgg attgttcttt 1200
tttaagactc aatcatgact tctttactaa cactggctag ctatattatc ttatatacta 1260
atatcatgtt ttaaaaatat aaaatagaaa ttaagaatct aaatatttag atataactcg 1320
acttagtaca tccttctcaa ctgccattcc cctgctgccc ttgacttggg caccaaacat 1380
tcaaagctcc ccttgacgga cgctaacgct aagggcgggg cccctagctg gctgggttct 1440
gggtggcacg cctggcccac tggcctccca gccacagtgg tgcagaggtc agccctcctg 1500
cagctaggcc aggggcacct gttagcccca tggggacgac tgccggcctg ggaaacgaag 1560
aggagtcagc cagcattcac acctttctga ccaagcaggc gctggggaca ggtggacccc 1620
gcagcagcac cagcccctct gggccccatg tggcacagag tggaagcatc tccttcccta 1680
ctccccactg ggccttgctt acagaagagg caatggctca gaccagctcc cgcatccctg 1740
tagttgcctc cctggcccat gagtgaggat gcagtgctgg tttctgccca cctacaccta 1800
gagctgtccc catctcctcc aaggggtcag actgctagcc acctcagagg ctccaagggc 1860
ccagttccca ggcccaggac aggaatcaac cctgtgctag ctgagttcac ctgcaccgag 1920
accagcccct agccaagatt ctactcctgg gctcaaggcc tggctagccc ccagccagcc 1980
cactcctatg gatagacaga ccagtgagcc caagtggaca agtttggggc cacccaggga 2040
ccagaaacag agcctctgca ggacacagca gatgggcacc tgggaccacc tccacccagg 2100
gccctgcccc agacgcgcag aggcccgaca caagggagaa gccagccact tgtgccagac 2160
ctgagtggca gaaagcaaaa agttcctttg ctgctttaat ttttaaattt tcttacaaaa 2220
atttaggtgt ttaccaatag tcttattttg gcttattttt aa 2262
<210> 43
<211> 2279
<212> DNA
<213> 人
<400> 43
tggagataac acggatcgct gtgtacactg tgtgctccgg ttgttgcatc cgagggttga 60
tcggatggtg gttcccatcc agatccaagt cctggcccct gatcacagag aaacacagct 120
ggacattaaa gtgaaataac atctgctttg ctgccgagct cagaggagac cccagacccc 180
tcccgcagcc agagggctgg agcctgctca gaggtgcttt gaagatgccg gaggccccgc 240
ctctgctgtt ggcagctgtg ttgctgggcc tggtgctgct ggtggtgctg ctgctgcttc 300
tgaggcactg gggctggggc ctgtgcctta tcggctggaa cgagttcatc ctgcagccca 360
tccacaacct gctcatgggt gacaccaagg agcagcgcat cctgaaccac gtgctgcagc 420
atgcggagcc cgggaacgca cagagcgtgc tggaggccat tgacacctac tgcgagcaga 480
aggagtgggc catgaacgtg ggcgacaaga aaggcaagat cgtggacgcc gtgattcagg 540
agcaccagcc ctccgtgctg ctggagctgg gggcctactg tggctactca gctgtgcgca 600
tggcccgcct gctgtcacca ggggcgaggc tcatcaccat cgagatcaac cccgactgtg 660
ccgccatcac ccagcggatg gtggatttcg ctggcgtgaa ggacaaggtc acccttgtgg 720
ttggagcgtc ccaggacatc atcccccagc tgaagaagaa gtatgatgtg gacacactgg 780
acatggtctt cctcgaccac tggaaggacc ggtacctgcc ggacacgctt ctcttggagg 840
aatgtggcct gctgcggaag gggacagtgc tactggctga caacgtgatc tgcccaggtg 900
cgccagactt cctagcacac gtgcgcggga gcagctgctt tgagtgcaca cactaccaat 960
cgttcctgga atacagggag gtggtggacg gcctggagaa ggccatctac aagggcccag 1020
gcagcgaagc agggccctga ctgccccccc ggcccccctc tcgggctctc tcacccagcc 1080
tggtactgaa ggtgccagac gtgctcctgc tgaccttctg cggctccggg ctgtgtccta 1140
aatgcaaagc acacctcggc cgaggcctgc gccctgacat gctaacctct ctgaactgca 1200
acactggatt gttctttttt aagactcaat catgacttct ttactaacac tggctagcta 1260
tattatctta tatactaata tcatgtttta aaaatataaa atagaaatta agaatctaaa 1320
tatttagata taactcgact tagtacatcc ttctcaactg ccattcccct gctgcccttg 1380
acttgggcac caaacattca aagctcccct tgacggacgc taacgctaag ggcggggccc 1440
ctagctggct gggttctggg tggcacgcct ggcccactgg cctcccagcc acagtggtgc 1500
agaggtcagc cctcctgcag ctaggccagg ggcacctgtt agccccatgg ggacgactgc 1560
cggcctggga aacgaagagg agtcagccag cattcacacc tttctgacca agcaggcgct 1620
ggggacaggt ggaccccgca gcagcaccag cccctctggg ccccatgtgg cacagagtgg 1680
aagcatctcc ttccctactc cccactgggc cttgcttaca gaagaggcaa tggctcagac 1740
cagctcccgc atccctgtag ttgcctccct ggcccatgag tgaggatgca gtgctggttt 1800
ctgcccacct acacctagag ctgtccccat ctcctccaag gggtcagact gctagccacc 1860
tcagaggctc caagggccca gttcccaggc ccaggacagg aatcaaccct gtgctagctg 1920
agttcacctg caccgagacc agcccctagc caagattcta ctcctgggct caaggcctgg 1980
ctagccccca gccagcccac tcctatggat agacagacca gtgagcccaa gtggacaagt 2040
ttggggccac ccagggacca gaaacagagc ctctgcagga cacagcagat gggcacctgg 2100
gaccacctcc acccagggcc ctgccccaga cgcgcagagg cccgacacaa gggagaagcc 2160
agccacttgt gccagacctg agtggcagaa agcaaaaagt tcctttgctg ctttaatttt 2220
taaattttct tacaaaaatt taggtgttta ccaatagtct tattttggct tatttttaa 2279
<210> 44
<211> 2035
<212> DNA
<213> 人
<400> 44
gctgttggca gctgtgttgc tgggcctggt gctgctggtg gtgctgctgc tgcttctgag 60
gcactggggc tggggcctgt gccttatcgg ctggaacgag ttcatcctgc agcccatcca 120
caacctgctc atgggtgaca ccaaggagca gcgcatcctg aaccacgtgc tgcagcatgc 180
ggagcccggg aacgcacaga gcgtgctgga ggccattgac acctactgcg agcagaagga 240
gtgggccatg aacgtgggcg acaagaaagg caagatcgtg gacgccgtga ttcaggagca 300
ccagccctcc gtgctgctgg agctgggggc ctactgtggc tactcagctg tgcgcatggc 360
ccgcctgctg tcaccagggg cgaggctcat caccatcgag atcaaccccg actgtgccgc 420
catcacccag cggatggtgg atttcgctgg cgtgaaggac aaggtcaccc ttgtggttgg 480
agcgtcccag gacatcatcc cccagctgaa gaagaagtat gatgtggaca cactggacat 540
ggtcttcctc gaccactgga aggaccggta cctgccggac acgcttctct tggaggaatg 600
tggcctgctg cggaagggga cagtgctact ggctgacaac gtgatctgcc caggtgcgcc 660
agacttccta gcacacgtgc gcgggagcag ctgctttgag tgcacacact accaatcgtt 720
cctggaatac agggaggtgg tggacggcct ggagaaggcc atctacaagg gcccaggcag 780
cgaagcaggg ccctgactgc ccccccggcc cccctctcgg gctctctcac ccagcctggt 840
actgaaggtg ccagacgtgc tcctgctgac cttctgcggc tccgggctgt gtcctaaatg 900
caaagcacac ctcggccgag gcctgcgccc tgacatgcta acctctctga actgcaacac 960
tggattgttc ttttttaaga ctcaatcatg acttctttac taacactggc tagctatatt 1020
atcttatata ctaatatcat gttttaaaaa tataaaatag aaattaagaa tctaaatatt 1080
tagatataac tcgacttagt acatccttct caactgccat tcccctgctg cccttgactt 1140
gggcaccaaa cattcaaagc tccccttgac ggacgctaac gctaagggcg gggcccctag 1200
ctggctgggt tctgggtggc acgcctggcc cactggcctc ccagccacag tggtgcagag 1260
gtcagccctc ctgcagctag gccaggggca cctgttagcc ccatggggac gactgccggc 1320
ctgggaaacg aagaggagtc agccagcatt cacacctttc tgaccaagca ggcgctgggg 1380
acaggtggac cccgcagcag caccagcccc tctgggcccc atgtggcaca gagtggaagc 1440
atctccttcc ctactcccca ctgggccttg cttacagaag aggcaatggc tcagaccagc 1500
tcccgcatcc ctgtagttgc ctccctggcc catgagtgag gatgcagtgc tggtttctgc 1560
ccacctacac ctagagctgt ccccatctcc tccaaggggt cagactgcta gccacctcag 1620
aggctccaag ggcccagttc ccaggcccag gacaggaatc aaccctgtgc tagctgagtt 1680
cacctgcacc gagaccagcc cctagccaag attctactcc tgggctcaag gcctggctag 1740
cccccagcca gcccactcct atggatagac agaccagtga gcccaagtgg acaagtttgg 1800
ggccacccag ggaccagaaa cagagcctct gcaggacaca gcagatgggc acctgggacc 1860
acctccaccc agggccctgc cccagacgcg cagaggcccg acacaaggga gaagccagcc 1920
acttgtgcca gacctgagtg gcagaaagca aaaagttcct ttgctgcttt aatttttaaa 1980
ttttcttaca aaaatttagg tgtttaccaa tagtcttatt ttggcttatt tttaa 2035
<210> 45
<211> 271
<212> PRT
<213> 人
<400> 45
Met Pro Glu Ala Pro Pro Leu Leu Leu Ala Ala Val Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Arg His Trp Gly Trp Gly
20 25 30
Leu Cys Leu Ile Gly Trp Asn Glu Phe Ile Leu Gln Pro Ile His Asn
35 40 45
Leu Leu Met Gly Asp Thr Lys Glu Gln Arg Ile Leu Asn His Val Leu
50 55 60
Gln His Ala Glu Pro Gly Asn Ala Gln Ser Val Leu Glu Ala Ile Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Cys Glu Gln Lys Glu Trp Ala Met Asn Val Gly Asp Lys Lys
85 90 95
Gly Lys Ile Val Asp Ala Val Ile Gln Glu His Gln Pro Ser Val Leu
100 105 110
Leu Glu Leu Gly Ala Tyr Cys Gly Tyr Ser Ala Val Arg Met Ala Arg
115 120 125
Leu Leu Ser Pro Gly Ala Arg Leu Ile Thr Ile Glu Ile Asn Pro Asp
130 135 140
Cys Ala Ala Ile Thr Gln Arg Met Val Asp Phe Ala Gly Val Lys Asp
145 150 155 160
Lys Val Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Gln Asp Ile Ile Pro Gln Leu
165 170 175
Lys Lys Lys Tyr Asp Val Asp Thr Leu Asp Met Val Phe Leu Asp His
180 185 190
Trp Lys Asp Arg Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Leu Leu Glu Glu Cys Gly
195 200 205
Leu Leu Arg Lys Gly Thr Val Leu Leu Ala Asp Asn Val Ile Cys Pro
210 215 220
Gly Ala Pro Asp Phe Leu Ala His Val Arg Gly Ser Ser Cys Phe Glu
225 230 235 240
Cys Thr His Tyr Gln Ser Phe Leu Glu Tyr Arg Glu Val Val Asp Gly
245 250 255
Leu Glu Lys Ala Ile Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro
260 265 270
<210> 46
<211> 221
<212> PRT
<213> 人
<400> 46
Met Gly Asp Thr Lys Glu Gln Arg Ile Leu Asn His Val Leu Gln His
1 5 10 15
Ala Glu Pro Gly Asn Ala Gln Ser Val Leu Glu Ala Ile Asp Thr Tyr
20 25 30
Cys Glu Gln Lys Glu Trp Ala Met Asn Val Gly Asp Lys Lys Gly Lys
35 40 45
Ile Val Asp Ala Val Ile Gln Glu His Gln Pro Ser Val Leu Leu Glu
50 55 60
Leu Gly Ala Tyr Cys Gly Tyr Ser Ala Val Arg Met Ala Arg Leu Leu
65 70 75 80
Ser Pro Gly Ala Arg Leu Ile Thr Ile Glu Ile Asn Pro Asp Cys Ala
85 90 95
Ala Ile Thr Gln Arg Met Val Asp Phe Ala Gly Val Lys Asp Lys Val
100 105 110
Thr Leu Val Val Gly Ala Ser Gln Asp Ile Ile Pro Gln Leu Lys Lys
115 120 125
Lys Tyr Asp Val Asp Thr Leu Asp Met Val Phe Leu Asp His Trp Lys
130 135 140
Asp Arg Tyr Leu Pro Asp Thr Leu Leu Leu Glu Glu Cys Gly Leu Leu
145 150 155 160
Arg Lys Gly Thr Val Leu Leu Ala Asp Asn Val Ile Cys Pro Gly Ala
165 170 175
Pro Asp Phe Leu Ala His Val Arg Gly Ser Ser Cys Phe Glu Cys Thr
180 185 190
His Tyr Gln Ser Phe Leu Glu Tyr Arg Glu Val Val Asp Gly Leu Glu
195 200 205
Lys Ala Ile Tyr Lys Gly Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro
210 215 220
<210> 47
<211> 3501
<212> DNA
<213> 巴西诺卡菌
<400> 47
atggcgactg attcgcgaag cgatcggcta cggcgtcgaa ttgcacagtt gttcgccgag 60
gacgagcagg tgaaagccgc ggtgccggac caggaggtgg tcgaggcgat ccgggcgccc 120
ggcctgcgcc tggcacagat catggccacc gtgatggagc gctatgcgga ccgccccgcg 180
gtgggacagc gggcgagcga gccggtcacc gagagcggtc gcaccacctt ccggctgctc 240
ccggaattcg agaccctgac ctaccgcgag ctgtgggcgc gcgtccgcgc ggtggccgcc 300
gcgtggcacg gagatgccga aaggcctttg cgggccgggg atttcgttgc tctgctgggt 360
ttcgccggca tcgattacgg caccctcgat ctcgcgaaca tccatctcgg cctcgtcacg 420
gtgccgctgc aatccggcgc cacggccccg caactcgccg cgatcctggc cgagaccacg 480
ccccgggtgc tggccgcgac acccgaccat ctcgatatcg ccgtcgaatt gctgaccggg 540
ggagcctcgc cggaacggct ggtggtattc gactaccgcc ccgcggacga cgatcaccgg 600
gcggcgctcg agtccgcgcg cagacggttg agcgacgcgg gcagtgcggt ggtggtcgag 660
acgctcgacg cggtccgcgc ccgcggcagc gaattgccgg ccgcgccgct gttcgttccc 720
gccgcggacg aggacccgct ggctctgctc atctacacct ccggcagcac cggcacgcct 780
aagggcgcca tgtacaccga aagactgaac cgcacgacgt ggctgagcgg ggcgaaaggc 840
gtcggcctca cgctcggcta catgccgatg agtcatattg ccgggcgggc ctcgttcgcc 900
ggtgtgctgg cccgcggcgg cacggtctac ttcaccgccc gcagcgatat gtcgacgctg 960
ttcgaagatc tggccctggt gcggccgacc gagatgttct tcgtcccgcg cgtgtgcgac 1020
atgatcttcc agcgctatca ggccgaactg tcgcggcgcg cgcccgccgc ggccgcgagc 1080
ccggaactcg agcaggaact gaagaccgaa ctgcgcttgt ccgcggtcgg ggaccgctta 1140
ctcggggcga tcgcgggcag cgcgccgctg tcggccgaga tgcgggagtt catggagtcg 1200
ctgctggatc tggaactgca cgacggctac ggctcgaccg aggcgggtat cggcgtactg 1260
caagacaata tcgtccagcg tccgccggtc atcgattaca agctcgtcga cgtgccggaa 1320
ttgggctact tccggacgga ccagccgcat ccccgcggtg agttgctgtt gaaaaccgaa 1380
gggatgattc cgggctactt ccggcggccc gaggtgaccg cggagatctt cgacgaggac 1440
ggtttctaca ggaccggtga catcgtcgcc gaactcgaac cggatcggct gatctacctg 1500
gaccgccgca acaatgtgct gaaactggcc cagggcgagt tcgtcacggt cgcccatctg 1560
gaagcggtgt tcgcgaccag tccgctgatc cggcagatct acatctacgg caacagcgag 1620
cgctcgttcc tgctggcggt gatcgtgccc accgcggacg cgctggccga cggtgtcacc 1680
gacgcgctga acacggcgct gaccgaatcc ttgcgacagc tcgcgaaaga agccgggctg 1740
caatcctatg agctgccgcg cgagttcctg gtcgaaaccg aaccgttcac cgtcgagaac 1800
ggtctgctct ccggtatcgc gaaactgttg cggcccaagc tcaaggagca ctacggcgag 1860
cgactcgagc agctgtaccg cgatatcgag gcgaaccgca acgacgagct gatcgagctg 1920
cggcgcaccg cggccgagct gccggtgctc gaaaccgtca cgcgggctgc acgttcgatg 1980
ctcggactgg ccgcgtcgga gttgcggccg gacgcgcatt tcaccgatct cggcggtgat 2040
tcactgtccg cgctgtcgtt ttcgaccctg ctgcaggaca tgctcgaggt cgaggtcccg 2100
gtcggtgtca tcgtgagccc cgccaactcg ctcgccgatc tggcgaaata catcgaggcc 2160
gaacggcatt cgggggtgcg gcggccgagc ctgatctcgg tgcacggtcc cggcaccgag 2220
atccgtgccg ccgatctcac cctggacaag ttcatcgacg agcgcaccct cgctgccgcg 2280
aaagcggttc cggccgcgcc ggcccaggcg cagaccgtcc tgctcaccgg ggcgaacggc 2340
tatctcggcc gcttcctgtg cctggaatgg ctgcagcgac tggaccagac cggcggcacg 2400
ctggtctgca tcgtgcgcgg taccgacgcg gccgccgcgc ggaagcgcct ggatgcggtg 2460
ttcgacagcg gtgatccgga gctgctcgac cactaccgga agctggccgc cgagcacctc 2520
gaggtgctcg cgggcgatat cggcgacccg aatctcggcc tggacgaagc gacttggcag 2580
cggctcgccg cgaccgtcga cctgatcgtg caccccgccg ccctcgtcaa ccatgtgctg 2640
ccgtacagcc agctgttcgg gccgaatgtg gtcggcaccg ccgagatcat ccggctggcc 2700
atcaccgagc gccgtaagcc cgtgacgtac ctgtcgacgg tcgcggtggc cgcacaggtc 2760
gatcccgccg gcttcgacga ggagcgcgat atccgggaga tgagcgcggt gcgctccatc 2820
gacgccgggt acgcgaacgg ttacggcaac agcaagtggg ccggcgaggt gctgctgcgc 2880
gaggcccatg atctgtgcgg gctgccggtc gccgtgttcc gctcggacat gatcctggcg 2940
cacagcaaat acgtcggtca gctcaacgtc cccgatgtgt tcacccggct catcctgagc 3000
ctggcgctca ccggcatcgc accgtattcg ttctacggga cggacagcgc cgggcagcgc 3060
aggcgggccc actacgacgg tctgcccgcc gatttcgtcg ccgaggcgat caccaccctc 3120
ggcgcgcgag ccgagtcggg gttccatacc tacgacgtgt ggaacccgta cgacgacggc 3180
atctcgctgg acgaattcgt cgactggctc ggcgatttcg gcgtgccgat ccagcggatc 3240
gacgactacg acgaatggtt ccggcgtttc gagaccgcga tccgcgcgct gcccgaaaag 3300
cagcgcgatg cttcgctgct accgctgctg gacgcacacc ggcggccact gcgcgcggtg 3360
cgcggttcgc tgttgcccgc caagaacttc caggcggcgg tgcagtccgc gcggatcggc 3420
cccgatcagg acatcccgca tctttccccg cagttgatcg acaagtacgt caccgacctg 3480
cgccacctcg gcctgctctg a 3501
<210> 48
<211> 1166
<212> PRT
<213> 巴西诺卡菌
<400> 48
Met Ala Thr Asp Ser Arg Ser Asp Arg Leu Arg Arg Arg Ile Ala Gln
1 5 10 15
Leu Phe Ala Glu Asp Glu Gln Val Lys Ala Ala Val Pro Asp Gln Glu
20 25 30
Val Val Glu Ala Ile Arg Ala Pro Gly Leu Arg Leu Ala Gln Ile Met
35 40 45
Ala Thr Val Met Glu Arg Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Val Gly Gln Arg
50 55 60
Ala Ser Glu Pro Val Thr Glu Ser Gly Arg Thr Thr Phe Arg Leu Leu
65 70 75 80
Pro Glu Phe Glu Thr Leu Thr Tyr Arg Glu Leu Trp Ala Arg Val Arg
85 90 95
Ala Val Ala Ala Ala Trp His Gly Asp Ala Glu Arg Pro Leu Arg Ala
100 105 110
Gly Asp Phe Val Ala Leu Leu Gly Phe Ala Gly Ile Asp Tyr Gly Thr
115 120 125
Leu Asp Leu Ala Asn Ile His Leu Gly Leu Val Thr Val Pro Leu Gln
130 135 140
Ser Gly Ala Thr Ala Pro Gln Leu Ala Ala Ile Leu Ala Glu Thr Thr
145 150 155 160
Pro Arg Val Leu Ala Ala Thr Pro Asp His Leu Asp Ile Ala Val Glu
165 170 175
Leu Leu Thr Gly Gly Ala Ser Pro Glu Arg Leu Val Val Phe Asp Tyr
180 185 190
Arg Pro Ala Asp Asp Asp His Arg Ala Ala Leu Glu Ser Ala Arg Arg
195 200 205
Arg Leu Ser Asp Ala Gly Ser Ala Val Val Val Glu Thr Leu Asp Ala
210 215 220
Val Arg Ala Arg Gly Ser Glu Leu Pro Ala Ala Pro Leu Phe Val Pro
225 230 235 240
Ala Ala Asp Glu Asp Pro Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser
245 250 255
Thr Gly Thr Pro Lys Gly Ala Met Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Arg Thr
260 265 270
Thr Trp Leu Ser Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Thr Leu Gly Tyr Met
275 280 285
Pro Met Ser His Ile Ala Gly Arg Ala Ser Phe Ala Gly Val Leu Ala
290 295 300
Arg Gly Gly Thr Val Tyr Phe Thr Ala Arg Ser Asp Met Ser Thr Leu
305 310 315 320
Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu Met Phe Phe Val Pro
325 330 335
Arg Val Cys Asp Met Ile Phe Gln Arg Tyr Gln Ala Glu Leu Ser Arg
340 345 350
Arg Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Leu Glu Gln Glu Leu Lys
355 360 365
Thr Glu Leu Arg Leu Ser Ala Val Gly Asp Arg Leu Leu Gly Ala Ile
370 375 380
Ala Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Met Arg Glu Phe Met Glu Ser
385 390 395 400
Leu Leu Asp Leu Glu Leu His Asp Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala Gly
405 410 415
Ile Gly Val Leu Gln Asp Asn Ile Val Gln Arg Pro Pro Val Ile Asp
420 425 430
Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Arg Thr Asp Gln
435 440 445
Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Leu Lys Thr Glu Gly Met Ile Pro
450 455 460
Gly Tyr Phe Arg Arg Pro Glu Val Thr Ala Glu Ile Phe Asp Glu Asp
465 470 475 480
Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Val Ala Glu Leu Glu Pro Asp Arg
485 490 495
Leu Ile Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys Leu Ala Gln Gly
500 505 510
Glu Phe Val Thr Val Ala His Leu Glu Ala Val Phe Ala Thr Ser Pro
515 520 525
Leu Ile Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Glu Arg Ser Phe Leu
530 535 540
Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Ala Asp Ala Leu Ala Asp Gly Val Thr
545 550 555 560
Asp Ala Leu Asn Thr Ala Leu Thr Glu Ser Leu Arg Gln Leu Ala Lys
565 570 575
Glu Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Leu Pro Arg Glu Phe Leu Val Glu
580 585 590
Thr Glu Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Gly Ile Ala Lys
595 600 605
Leu Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg Leu Glu Gln
610 615 620
Leu Tyr Arg Asp Ile Glu Ala Asn Arg Asn Asp Glu Leu Ile Glu Leu
625 630 635 640
Arg Arg Thr Ala Ala Glu Leu Pro Val Leu Glu Thr Val Thr Arg Ala
645 650 655
Ala Arg Ser Met Leu Gly Leu Ala Ala Ser Glu Leu Arg Pro Asp Ala
660 665 670
His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser
675 680 685
Thr Leu Leu Gln Asp Met Leu Glu Val Glu Val Pro Val Gly Val Ile
690 695 700
Val Ser Pro Ala Asn Ser Leu Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Glu Ala
705 710 715 720
Glu Arg His Ser Gly Val Arg Arg Pro Ser Leu Ile Ser Val His Gly
725 730 735
Pro Gly Thr Glu Ile Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile
740 745 750
Asp Glu Arg Thr Leu Ala Ala Ala Lys Ala Val Pro Ala Ala Pro Ala
755 760 765
Gln Ala Gln Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Arg
770 775 780
Phe Leu Cys Leu Glu Trp Leu Gln Arg Leu Asp Gln Thr Gly Gly Thr
785 790 795 800
Leu Val Cys Ile Val Arg Gly Thr Asp Ala Ala Ala Ala Arg Lys Arg
805 810 815
Leu Asp Ala Val Phe Asp Ser Gly Asp Pro Glu Leu Leu Asp His Tyr
820 825 830
Arg Lys Leu Ala Ala Glu His Leu Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly
835 840 845
Asp Pro Asn Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Gln Arg Leu Ala Ala
850 855 860
Thr Val Asp Leu Ile Val His Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu
865 870 875 880
Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Ile
885 890 895
Ile Arg Leu Ala Ile Thr Glu Arg Arg Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser
900 905 910
Thr Val Ala Val Ala Ala Gln Val Asp Pro Ala Gly Phe Asp Glu Glu
915 920 925
Arg Asp Ile Arg Glu Met Ser Ala Val Arg Ser Ile Asp Ala Gly Tyr
930 935 940
Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg
945 950 955 960
Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu Pro Val Ala Val Phe Arg Ser Asp
965 970 975
Met Ile Leu Ala His Ser Lys Tyr Val Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp
980 985 990
Val Phe Thr Arg Leu Ile Leu Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ile Ala Pro
995 1000 1005
Tyr Ser Phe Tyr Gly Thr Asp Ser Ala Gly Gln Arg Arg Arg Ala
1010 1015 1020
His Tyr Asp Gly Leu Pro Ala Asp Phe Val Ala Glu Ala Ile Thr
1025 1030 1035
Thr Leu Gly Ala Arg Ala Glu Ser Gly Phe His Thr Tyr Asp Val
1040 1045 1050
Trp Asn Pro Tyr Asp Asp Gly Ile Ser Leu Asp Glu Phe Val Asp
1055 1060 1065
Trp Leu Gly Asp Phe Gly Val Pro Ile Gln Arg Ile Asp Asp Tyr
1070 1075 1080
Asp Glu Trp Phe Arg Arg Phe Glu Thr Ala Ile Arg Ala Leu Pro
1085 1090 1095
Glu Lys Gln Arg Asp Ala Ser Leu Leu Pro Leu Leu Asp Ala His
1100 1105 1110
Arg Arg Pro Leu Arg Ala Val Arg Gly Ser Leu Leu Pro Ala Lys
1115 1120 1125
Asn Phe Gln Ala Ala Val Gln Ser Ala Arg Ile Gly Pro Asp Gln
1130 1135 1140
Asp Ile Pro His Leu Ser Pro Gln Leu Ile Asp Lys Tyr Val Thr
1145 1150 1155
Asp Leu Arg His Leu Gly Leu Leu
1160 1165
<210> 49
<211> 621
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 49
atgaaaacta cgcatacctc cctccccttt gccggacata cgctgcattt tgttgagttc 60
gatccggcga atttttgtga gcaggattta ctctggctgc cgcactacgc acaactgcaa 120
cacgctggac gtaaacgtaa aacagagcat ttagccggac ggatcgctgc tgtttatgct 180
ttgcgggaat atggctataa atgtgtgccc gcaatcggcg agctacgcca acctgtctgg 240
cctgcggagg tatacggcag tattagccac tgtgggacta cggcattagc cgtggtatct 300
cgtcaaccga ttggcattga tatagaagaa attttttctg tacaaaccgc aagagaattg 360
acagacaaca ttattacacc agcggaacac gagcgactcg cagactgcgg tttagccttt 420
tctctggcgc tgacactggc attttccgcc aaagagagcg catttaaggc aagtgagatc 480
caaactgatg caggttttct ggactatcag ataattagct ggaataaaca gcaggtcatc 540
attcatcgtg agaatgagat gtttgctgtg cactggcaga taaaagaaaa gatagtcata 600
acgctgtgcc aacacgatta a 621
<210> 50
<211> 206
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 50
Met Lys Thr Thr His Thr Ser Leu Pro Phe Ala Gly His Thr Leu His
1 5 10 15
Phe Val Glu Phe Asp Pro Ala Asn Phe Cys Glu Gln Asp Leu Leu Trp
20 25 30
Leu Pro His Tyr Ala Gln Leu Gln His Ala Gly Arg Lys Arg Lys Thr
35 40 45
Glu His Leu Ala Gly Arg Ile Ala Ala Val Tyr Ala Leu Arg Glu Tyr
50 55 60
Gly Tyr Lys Cys Val Pro Ala Ile Gly Glu Leu Arg Gln Pro Val Trp
65 70 75 80
Pro Ala Glu Val Tyr Gly Ser Ile Ser His Cys Gly Thr Thr Ala Leu
85 90 95
Ala Val Val Ser Arg Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Glu Ile Phe
100 105 110
Ser Val Gln Thr Ala Arg Glu Leu Thr Asp Asn Ile Ile Thr Pro Ala
115 120 125
Glu His Glu Arg Leu Ala Asp Cys Gly Leu Ala Phe Ser Leu Ala Leu
130 135 140
Thr Leu Ala Phe Ser Ala Lys Glu Ser Ala Phe Lys Ala Ser Glu Ile
145 150 155 160
Gln Thr Asp Ala Gly Phe Leu Asp Tyr Gln Ile Ile Ser Trp Asn Lys
165 170 175
Gln Gln Val Ile Ile His Arg Glu Asn Glu Met Phe Ala Val His Trp
180 185 190
Gln Ile Lys Glu Lys Ile Val Ile Thr Leu Cys Gln His Asp
195 200 205
<210> 51
<211> 654
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 51
atgctggatg agtctttgtt tccaaattcg gcaaagtttt ctttcattaa aactggcgat 60
gctgttaatt tagaccattt ccatcagttg catccgttgg aaaaggcact ggtagcgcac 120
tcggttgata ttagaaaagc agagtttgga gatgccaggt ggtgtgcaca tcaggcactc 180
caagctttgg gacgagatag cggtgatccc attttgcgtg gggaacgagg aatgccattg 240
tggccttctt cggtgtctgg ttcattgacc cacactgacg gattccgagc tgctgttgtg 300
gcgccacgat tgttggtgcg ttctatggga ttggatgccg aacctgcgga gccgttgccc 360
aaggatgttt tgggttcaat cgctcgggtg ggggagattc ctcaacttaa gcgcttggag 420
gaacaaggtg tgcactgcgc ggatcgcctg ctgttttgtg ccaaggaagc aacatacaaa 480
gcgtggttcc cgctgacgca taggtggctt ggttttgaac aagctgagat cgacttgcgt 540
gatgatggca cttttgtgtc ctatttgctg gttcgaccaa ctccagtgcc gtttatttca 600
ggtaaatggg tactgcgtga tggttatgtc atagctgcga ctgcagtgac ttga 654
<210> 52
<211> 217
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 52
Met Leu Asp Glu Ser Leu Phe Pro Asn Ser Ala Lys Phe Ser Phe Ile
1 5 10 15
Lys Thr Gly Asp Ala Val Asn Leu Asp His Phe His Gln Leu His Pro
20 25 30
Leu Glu Lys Ala Leu Val Ala His Ser Val Asp Ile Arg Lys Ala Glu
35 40 45
Phe Gly Asp Ala Arg Trp Cys Ala His Gln Ala Leu Gln Ala Leu Gly
50 55 60
Arg Asp Ser Gly Asp Pro Ile Leu Arg Gly Glu Arg Gly Met Pro Leu
65 70 75 80
Trp Pro Ser Ser Val Ser Gly Ser Leu Thr His Thr Asp Gly Phe Arg
85 90 95
Ala Ala Val Val Ala Pro Arg Leu Leu Val Arg Ser Met Gly Leu Asp
100 105 110
Ala Glu Pro Ala Glu Pro Leu Pro Lys Asp Val Leu Gly Ser Ile Ala
115 120 125
Arg Val Gly Glu Ile Pro Gln Leu Lys Arg Leu Glu Glu Gln Gly Val
130 135 140
His Cys Ala Asp Arg Leu Leu Phe Cys Ala Lys Glu Ala Thr Tyr Lys
145 150 155 160
Ala Trp Phe Pro Leu Thr His Arg Trp Leu Gly Phe Glu Gln Ala Glu
165 170 175
Ile Asp Leu Arg Asp Asp Gly Thr Phe Val Ser Tyr Leu Leu Val Arg
180 185 190
Pro Thr Pro Val Pro Phe Ile Ser Gly Lys Trp Val Leu Arg Asp Gly
195 200 205
Tyr Val Ile Ala Ala Thr Ala Val Thr
210 215
<210> 53
<211> 1428
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 53
atgcgcctgc gtgtctcgag tagtctcctc cccttcctcg tccccaacct cgaccattac 60
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ttcctgccag aatccgttga ttggctgagc actcgccgcc ctgcgggcgc tcgcgacaag 720
atcaattaca ttgcgcgccg cctgggcaaa gtcggtacct ttgagcttcc aggcgaacaa 780
agcttgtcga cgaaaaaagc cggtctccaa tcgtatgcag tgctcgttaa caaagagaac 840
cgtggaacca gcatcaagct gtgggttgcg ttcggcatcg tgatgttcgg cttctacttc 900
gccaacactt ggaccccgaa gctgctcgtg gaaaccggaa tgtcagaaca gcagggcatc 960
atcggtggtt tgatgttgtc catgggtgga gcattcggtt ccctgctcta cggtttcctc 1020
accaccaagt tcagctcccg aaacacactg atgaccttca tggtgctgtc cggcctgacg 1080
ctgatcctgt tcatttcctc cacctctgtt ccatccatcg cgtttgccag cggcgttgtc 1140
gtgggcatgc tgatcaatgg ttgtgtggct ggtctgtaca ccctgtcccc acagctgtac 1200
tccgctgaag tacgcaccac tggtgtgggc gctgcgattg gtatgggtcg tgtcggtgcg 1260
atttccgcgc cactgctggt gggtagcctg ctggattctg gctggtcccc aacgcagctg 1320
tatgttggtg tggcagtgat tgttattgcc ggtgcaaccg cattgattgg gatgcgcact 1380
caggcagtag ccgtcgaaaa gcagcctgaa gccctagcga ccaaatag 1428
<210> 54
<211> 475
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 54
Met Arg Leu Arg Val Ser Ser Ser Leu Leu Pro Phe Leu Val Pro Asn
1 5 10 15
Leu Asp His Tyr Gly Arg Pro Leu Leu Lys Glu Pro Gly Met Asp Ile
20 25 30
Arg Gln Thr Ile Asn Asp Thr Ala Met Ser Arg Tyr Gln Trp Phe Ile
35 40 45
Val Phe Ile Ala Val Leu Leu Asn Ala Leu Asp Gly Phe Asp Val Leu
50 55 60
Ala Met Ser Phe Thr Ala Asn Ala Val Thr Glu Glu Phe Gly Leu Ser
65 70 75 80
Gly Ser Gln Leu Gly Val Leu Leu Ser Ser Ala Leu Phe Gly Met Thr
85 90 95
Ala Gly Ser Leu Leu Phe Gly Pro Ile Gly Asp Arg Phe Gly Arg Lys
100 105 110
Asn Ala Leu Met Ile Ala Leu Leu Phe Asn Val Val Gly Leu Val Leu
115 120 125
Ser Ala Thr Ala Gln Ser Ala Gly Gln Leu Gly Val Trp Arg Leu Ile
130 135 140
Thr Gly Ile Gly Ile Gly Gly Ile Leu Ala Cys Ile Thr Val Val Ile
145 150 155 160
Ser Glu Phe Ser Asn Asn Lys Asn Arg Gly Met Ala Met Ser Ile Tyr
165 170 175
Ala Ala Gly Tyr Gly Ile Gly Ala Ser Leu Gly Gly Phe Gly Ala Ala
180 185 190
Gln Leu Ile Pro Thr Phe Gly Trp Arg Ser Val Phe Ala Ala Gly Ala
195 200 205
Ile Ala Thr Gly Ile Ala Thr Ile Ala Thr Phe Phe Phe Leu Pro Glu
210 215 220
Ser Val Asp Trp Leu Ser Thr Arg Arg Pro Ala Gly Ala Arg Asp Lys
225 230 235 240
Ile Asn Tyr Ile Ala Arg Arg Leu Gly Lys Val Gly Thr Phe Glu Leu
245 250 255
Pro Gly Glu Gln Ser Leu Ser Thr Lys Lys Ala Gly Leu Gln Ser Tyr
260 265 270
Ala Val Leu Val Asn Lys Glu Asn Arg Gly Thr Ser Ile Lys Leu Trp
275 280 285
Val Ala Phe Gly Ile Val Met Phe Gly Phe Tyr Phe Ala Asn Thr Trp
290 295 300
Thr Pro Lys Leu Leu Val Glu Thr Gly Met Ser Glu Gln Gln Gly Ile
305 310 315 320
Ile Gly Gly Leu Met Leu Ser Met Gly Gly Ala Phe Gly Ser Leu Leu
325 330 335
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340 345 350
Phe Met Val Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ile Leu Phe Ile Ser Ser Thr
355 360 365
Ser Val Pro Ser Ile Ala Phe Ala Ser Gly Val Val Val Gly Met Leu
370 375 380
Ile Asn Gly Cys Val Ala Gly Leu Tyr Thr Leu Ser Pro Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Ala Glu Val Arg Thr Thr Gly Val Gly Ala Ala Ile Gly Met Gly
405 410 415
Arg Val Gly Ala Ile Ser Ala Pro Leu Leu Val Gly Ser Leu Leu Asp
420 425 430
Ser Gly Trp Ser Pro Thr Gln Leu Tyr Val Gly Val Ala Val Ile Val
435 440 445
Ile Ala Gly Ala Thr Ala Leu Ile Gly Met Arg Thr Gln Ala Val Ala
450 455 460
Val Glu Lys Gln Pro Glu Ala Leu Ala Thr Lys
465 470 475
<210> 55
<211> 1296
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 55
gtgtcaacga ccaccccaac ccgcgcaacc aaaagtgtcg gaacagttct cgcactcctg 60
tggttcgcaa ttgtcctcga cggctttgac ctagtcgtcc tgggcgcaac aatcccgtcc 120
atgctggagg atcccgcgtg ggatctcact gctggacagg ccacacagat ttccaccatc 180
ggcctcgtcg gcatgaccat cggcgcactg accattggtt tcttaactga ccgtctgggt 240
cgacgccgcg tcatgctgtt ctctgtggca gtgttttctg tattcaccct cctgctggca 300
ttcaccacca acgtccagct cttcagcctg tggcgtttcc tcgcaggtgt tggccttggt 360
ggagcactcc ccaccgcaat tgccatggtg accgagtttc gccccggcac caaagcgggc 420
tctgcatcaa ctaccttgat gaccggatac cacgtcgggg cagtagcaac cgctttcctt 480
ggtctcttcc ttatcgacgg ctttggttgg cactccatgt tcatcgcagg cgctgtgcca 540
ggactactcc tgctgccact gctgtatttc ttccttccag aatccccgca gtacctcaaa 600
atctccggca agttggatga ggcgcaggca gttgcagcat cttatggact ttccctggat 660
gatgatcttg atcgcgaaca cgaagaagaa cttggcgagt cctcctcact ttcctccctg 720
ttcaagccct cgttccgccg caacaccctg gcgatttggg gcacctcatt catgggactc 780
ctcctggtct acggcctgaa cacatggctg ccacaaatca tgcgccaagc agactacgac 840
atgggtaact ccctgggctt cctcatggtt cttaacatcg gcgcagtgat cggcctttat 900
attgcagggc gaattgccga taagaactcc cctcgcaaaa cagcactcgt atggttcgtg 960
ttctctgcat ttttcctcgc actacttgct gtccggatgc cactgatcgg tctgtatggc 1020
atcgtgctgc tcaccggcat ctttgtgttc agctcccagg tactcatcta cgccttcgtt 1080
ggtgagaatc accctgccaa gatgcgtgca actgccatgg gattctccgc aggaattggt 1140
cgcctcggcg cgatctcggg tccgttgctg ggcggcctgc ttgtcagtgc caaccttgct 1200
tacccatggg gcttcttcgc cttcgctggc gttggactgc tgggcgcgct gattttctcc 1260
gcatcgaaga ctctgaggca tcgcgagaac gcttag 1296
<210> 56
<211> 431
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 56
Met Ser Thr Thr Thr Pro Thr Arg Ala Thr Lys Ser Val Gly Thr Val
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Trp Phe Ala Ile Val Leu Asp Gly Phe Asp Leu Val
20 25 30
Val Leu Gly Ala Thr Ile Pro Ser Met Leu Glu Asp Pro Ala Trp Asp
35 40 45
Leu Thr Ala Gly Gln Ala Thr Gln Ile Ser Thr Ile Gly Leu Val Gly
50 55 60
Met Thr Ile Gly Ala Leu Thr Ile Gly Phe Leu Thr Asp Arg Leu Gly
65 70 75 80
Arg Arg Arg Val Met Leu Phe Ser Val Ala Val Phe Ser Val Phe Thr
85 90 95
Leu Leu Leu Ala Phe Thr Thr Asn Val Gln Leu Phe Ser Leu Trp Arg
100 105 110
Phe Leu Ala Gly Val Gly Leu Gly Gly Ala Leu Pro Thr Ala Ile Ala
115 120 125
Met Val Thr Glu Phe Arg Pro Gly Thr Lys Ala Gly Ser Ala Ser Thr
130 135 140
Thr Leu Met Thr Gly Tyr His Val Gly Ala Val Ala Thr Ala Phe Leu
145 150 155 160
Gly Leu Phe Leu Ile Asp Gly Phe Gly Trp His Ser Met Phe Ile Ala
165 170 175
Gly Ala Val Pro Gly Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Tyr Phe Phe Leu
180 185 190
Pro Glu Ser Pro Gln Tyr Leu Lys Ile Ser Gly Lys Leu Asp Glu Ala
195 200 205
Gln Ala Val Ala Ala Ser Tyr Gly Leu Ser Leu Asp Asp Asp Leu Asp
210 215 220
Arg Glu His Glu Glu Glu Leu Gly Glu Ser Ser Ser Leu Ser Ser Leu
225 230 235 240
Phe Lys Pro Ser Phe Arg Arg Asn Thr Leu Ala Ile Trp Gly Thr Ser
245 250 255
Phe Met Gly Leu Leu Leu Val Tyr Gly Leu Asn Thr Trp Leu Pro Gln
260 265 270
Ile Met Arg Gln Ala Asp Tyr Asp Met Gly Asn Ser Leu Gly Phe Leu
275 280 285
Met Val Leu Asn Ile Gly Ala Val Ile Gly Leu Tyr Ile Ala Gly Arg
290 295 300
Ile Ala Asp Lys Asn Ser Pro Arg Lys Thr Ala Leu Val Trp Phe Val
305 310 315 320
Phe Ser Ala Phe Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Arg Met Pro Leu Ile
325 330 335
Gly Leu Tyr Gly Ile Val Leu Leu Thr Gly Ile Phe Val Phe Ser Ser
340 345 350
Gln Val Leu Ile Tyr Ala Phe Val Gly Glu Asn His Pro Ala Lys Met
355 360 365
Arg Ala Thr Ala Met Gly Phe Ser Ala Gly Ile Gly Arg Leu Gly Ala
370 375 380
Ile Ser Gly Pro Leu Leu Gly Gly Leu Leu Val Ser Ala Asn Leu Ala
385 390 395 400
Tyr Pro Trp Gly Phe Phe Ala Phe Ala Gly Val Gly Leu Leu Gly Ala
405 410 415
Leu Ile Phe Ser Ala Ser Lys Thr Leu Arg His Arg Glu Asn Ala
420 425 430
<210> 57
<211> 1131
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 57
atgacactgt ccgaacgcaa gctcaccacc accgccaaga ttcttcccca cccactcaac 60
gcctggtacg tcgccgcttg ggattatgaa gtcacatcta aaaagcccat ggccaggaca 120
atcgccaaca aaccactcgc tttgtaccgc accaaagatg gccgagccgt tgcccttgca 180
gacgcctgct ggcaccgcct cgcaccgcta tccaagggaa aactcgtggg cacagacgga 240
atccaatgcc cttatcacgg cttggagtac aactccgcgg gccgctgcat gaaaatgccc 300
gcgcaggaaa ccctcaaccc gtcagcagcc gtcaactcct accccgtggt ggaagcccac 360
cgctttgtgt gggtgtggct gggcgatccc acattggcag atcccaccca agtacccgat 420
atgcaccaga tgagccaccc cgaatgggca ggcgatggac gcaccatctc cgctgactgc 480
aactaccaat tagtgctgga caacttgatg gacctcaccc acgaagaatt cgtgcactcc 540
tccagcatcg gccaagacga acttagtgaa tcagagttcg tggtcaccca cactgaagat 600
tccgtgacgg tcacccgctg gatgcatgac atagatgcac caccgttttg gcaaaagaac 660
atgaatgata agttcccagg atttgaaggc aaggtggatc gttggcagat catccactac 720
tactaccctt ccaccatctg cattgatgtt ggtgtagcaa aggctggaac cggcgcgcag 780
gaaggcgacc gcagccaggg cgttaatggg tatgtaatga acaccattac cccagattca 840
gatcgttcct ctcattactt ctgggcattc atgcgcaact accgcctgga aagccaaacc 900
atcaccaccc agctgcgcga cggtgtatcc ggtgtattca aagaagacga agacatgctg 960
accgctcagc aagatgccat cgacgccaac accgactatg agttttacag cctcaacatt 1020
gatgccggtg gcatgtgggt gcgccgaatc ctcgaggaag cactctccaa ggaaggccga 1080
ctggatatcc ccaccacatt cccccgcgca acaccgaagc cggaggcata a 1131
<210> 58
<211> 376
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 58
Met Thr Leu Ser Glu Arg Lys Leu Thr Thr Thr Ala Lys Ile Leu Pro
1 5 10 15
His Pro Leu Asn Ala Trp Tyr Val Ala Ala Trp Asp Tyr Glu Val Thr
20 25 30
Ser Lys Lys Pro Met Ala Arg Thr Ile Ala Asn Lys Pro Leu Ala Leu
35 40 45
Tyr Arg Thr Lys Asp Gly Arg Ala Val Ala Leu Ala Asp Ala Cys Trp
50 55 60
His Arg Leu Ala Pro Leu Ser Lys Gly Lys Leu Val Gly Thr Asp Gly
65 70 75 80
Ile Gln Cys Pro Tyr His Gly Leu Glu Tyr Asn Ser Ala Gly Arg Cys
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Met Lys Met Pro Ala Gln Glu Thr Leu Asn Pro Ser Ala Ala Val Asn
100 105 110
Ser Tyr Pro Val Val Glu Ala His Arg Phe Val Trp Val Trp Leu Gly
115 120 125
Asp Pro Thr Leu Ala Asp Pro Thr Gln Val Pro Asp Met His Gln Met
130 135 140
Ser His Pro Glu Trp Ala Gly Asp Gly Arg Thr Ile Ser Ala Asp Cys
145 150 155 160
Asn Tyr Gln Leu Val Leu Asp Asn Leu Met Asp Leu Thr His Glu Glu
165 170 175
Phe Val His Ser Ser Ser Ile Gly Gln Asp Glu Leu Ser Glu Ser Glu
180 185 190
Phe Val Val Thr His Thr Glu Asp Ser Val Thr Val Thr Arg Trp Met
195 200 205
His Asp Ile Asp Ala Pro Pro Phe Trp Gln Lys Asn Met Asn Asp Lys
210 215 220
Phe Pro Gly Phe Glu Gly Lys Val Asp Arg Trp Gln Ile Ile His Tyr
225 230 235 240
Tyr Tyr Pro Ser Thr Ile Cys Ile Asp Val Gly Val Ala Lys Ala Gly
245 250 255
Thr Gly Ala Gln Glu Gly Asp Arg Ser Gln Gly Val Asn Gly Tyr Val
260 265 270
Met Asn Thr Ile Thr Pro Asp Ser Asp Arg Ser Ser His Tyr Phe Trp
275 280 285
Ala Phe Met Arg Asn Tyr Arg Leu Glu Ser Gln Thr Ile Thr Thr Gln
290 295 300
Leu Arg Asp Gly Val Ser Gly Val Phe Lys Glu Asp Glu Asp Met Leu
305 310 315 320
Thr Ala Gln Gln Asp Ala Ile Asp Ala Asn Thr Asp Tyr Glu Phe Tyr
325 330 335
Ser Leu Asn Ile Asp Ala Gly Gly Met Trp Val Arg Arg Ile Leu Glu
340 345 350
Glu Ala Leu Ser Lys Glu Gly Arg Leu Asp Ile Pro Thr Thr Phe Pro
355 360 365
Arg Ala Thr Pro Lys Pro Glu Ala
370 375
<210> 59
<211> 978
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 59
atgaactcgc aatggcaaga tgcacatgtt gtttccagcg aaatcatcgc tgcagacatt 60
cgacgaatag aactatcccc gaaatttgcg attccagtaa aacccggcga acatctcaag 120
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tttcctctcc gcgtgggtgc gcctgagtat gtacttgttg ccggcggaat tggaatcaca 360
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gcagcacgca gccttgatgc catggcttac aaagatgagc tcgtggcaga acacggcgac 480
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cggcgcgcat ggaacacccg cggacttgac cccaccaatc tgcgtttcga aacgtttgga 660
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gccacagtca acaaggatga aagcatgctg gaggctttgc aaaaggctgg ggcgaatatg 780
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acggtcgccc tctcctaa 978
<210> 60
<211> 325
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 60
Met Asn Ser Gln Trp Gln Asp Ala His Val Val Ser Ser Glu Ile Ile
1 5 10 15
Ala Ala Asp Ile Arg Arg Ile Glu Leu Ser Pro Lys Phe Ala Ile Pro
20 25 30
Val Lys Pro Gly Glu His Leu Lys Ile Met Val Pro Leu Lys Thr Gly
35 40 45
Gln Glu Lys Arg Ser Tyr Ser Ile Val Asp Ala Arg His Asp Gly Ser
50 55 60
Thr Leu Ala Leu Ser Val Leu Lys Thr Arg Asn Ser Arg Gly Gly Ser
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Glu Phe Met His Thr Leu Arg Ala Gly Asp Thr Val Thr Val Ser Arg
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Pro Ser Gln Asp Phe Pro Leu Arg Val Gly Ala Pro Glu Tyr Val Leu
100 105 110
Val Ala Gly Gly Ile Gly Ile Thr Ala Ile Arg Ser Met Ala Ser Leu
115 120 125
Leu Lys Lys Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Ile His Phe Ala Ala Arg Ser
130 135 140
Leu Asp Ala Met Ala Tyr Lys Asp Glu Leu Val Ala Glu His Gly Asp
145 150 155 160
Lys Leu His Leu His Leu Asp Ser Glu Gly Thr Thr Ile Asp Val Pro
165 170 175
Ala Leu Ile Glu Thr Leu Asn Pro His Thr Glu Leu Tyr Met Cys Gly
180 185 190
Pro Ile Arg Leu Met Asp Ala Ile Arg Arg Ala Trp Asn Thr Arg Gly
195 200 205
Leu Asp Pro Thr Asn Leu Arg Phe Glu Thr Phe Gly Asn Ser Gly Trp
210 215 220
Phe Ser Pro Glu Val Phe His Ile Gln Val Pro Glu Leu Gly Leu His
225 230 235 240
Ala Thr Val Asn Lys Asp Glu Ser Met Leu Glu Ala Leu Gln Lys Ala
245 250 255
Gly Ala Asn Met Met Phe Asp Cys Arg Lys Gly Glu Cys Gly Leu Cys
260 265 270
Gln Val Arg Val Leu Glu Val Asp Gly Gln Val Asp His Arg Asp Val
275 280 285
Phe Phe Ser Asp Arg Gln Lys Glu Ser Asp Ala Lys Ala Cys Ala Cys
290 295 300
Val Ser Arg Val Val Ser Ser Pro Ser Ser Ser Pro Thr Ser Thr Ile
305 310 315 320
Thr Val Ala Leu Ser
325
<210> 61
<211> 615
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 61
atgattgata cagggaagaa cggcgagttc cgctacgagc agtcgaatat catcgatcag 60
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<210> 62
<211> 204
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 62
Met Ile Asp Thr Gly Lys Asn Gly Glu Phe Arg Tyr Glu Gln Ser Asn
1 5 10 15
Ile Ile Asp Gln Asn Glu Ala Glu Phe Gly Ile Thr Pro Ser Gln Thr
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Val Gly Pro Tyr Val His Ile Gly Leu Thr Leu Glu Gly Ala Glu His
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Leu Val Glu Pro Gly Ser Glu Gly Ala Val Ser Phe Thr Val Ser Ala
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Gln Ala Asp Pro Glu Gly Ile His Asn Ser Asp Leu Asp Pro Asn Arg
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Thr Ala Pro Ala Thr Ala Asp Gly Phe Arg Gly Leu Gly Arg Ala Met
100 105 110
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115 120 125
Phe Ala Asp Glu Ala Pro His Phe Lys Val Gly Val Phe Ala Arg Gly
130 135 140
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Leu Val Ala Gln Lys Thr Asp Asp Gly Phe Arg Phe Asp Ile Thr Val
180 185 190
Gln Ala Glu Asp Asn Glu Thr Pro Phe Phe Gly Leu
195 200
<210> 63
<211> 693
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 63
atggacatcc cacacttcgc cccgacggga ggcgaatact ccccactgca cttcccggag 60
taccggacca ccatcaagcg caacccaagc aacgatctca tcatggttcc tagtcgcctc 120
ggcgagtcca cgggacctgt cttcggcgac cgcgacttgg gagacatcga caacgacatg 180
accaaggtga acggtggcga ggctatcggc cagcgcatct tcgttcacgg ccgtgtcctc 240
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ggccgttacc gccacaagaa tgactcctgg ccagcgccac tggatccaca cttcaacggt 360
gttgcacgta ctctcaccga caaggacggc cagtaccact tctggaccgt tatgccaggt 420
aattaccctt ggggtaacca ccacaacgca tggcgcccgg cgcacattca cttctcgctc 480
tatggtcgtc agtttacgga gcgtctggtc acccagatgt acttcccgaa cgatccattg 540
ttcttccagg atccgatcta caacgcggtg ccaaagggtg cacgtgagcg catgatcgca 600
acgttcgact atgacgagac ccgtgaaaac ttcgcgcttg gttacaagtt cgacatcgtc 660
cttcgtggcc gcaacgccac cccatttgag taa 693
<210> 64
<211> 230
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 64
Met Asp Ile Pro His Phe Ala Pro Thr Gly Gly Glu Tyr Ser Pro Leu
1 5 10 15
His Phe Pro Glu Tyr Arg Thr Thr Ile Lys Arg Asn Pro Ser Asn Asp
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Leu Ile Met Val Pro Ser Arg Leu Gly Glu Ser Thr Gly Pro Val Phe
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Gly Asp Arg Asp Leu Gly Asp Ile Asp Asn Asp Met Thr Lys Val Asn
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Gly Gly Glu Ala Ile Gly Gln Arg Ile Phe Val His Gly Arg Val Leu
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Gly Phe Asp Gly Lys Pro Val Pro His Thr Leu Val Glu Ala Trp Gln
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Ala Asn Ala Ala Gly Arg Tyr Arg His Lys Asn Asp Ser Trp Pro Ala
100 105 110
Pro Leu Asp Pro His Phe Asn Gly Val Ala Arg Thr Leu Thr Asp Lys
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Asp Gly Gln Tyr His Phe Trp Thr Val Met Pro Gly Asn Tyr Pro Trp
130 135 140
Gly Asn His His Asn Ala Trp Arg Pro Ala His Ile His Phe Ser Leu
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Tyr Gly Arg Gln Phe Thr Glu Arg Leu Val Thr Gln Met Tyr Phe Pro
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Asn Asp Pro Leu Phe Phe Gln Asp Pro Ile Tyr Asn Ala Val Pro Lys
180 185 190
Gly Ala Arg Glu Arg Met Ile Ala Thr Phe Asp Tyr Asp Glu Thr Arg
195 200 205
Glu Asn Phe Ala Leu Gly Tyr Lys Phe Asp Ile Val Leu Arg Gly Arg
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Asn Ala Thr Pro Phe Glu
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<210> 65
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<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 65
atgagcatcc aagtaaaagc actccagaaa accggccccg aagcaccttt cgaggtcaaa 60
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<211> 353
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 66
Met Ser Ile Gln Val Lys Ala Leu Gln Lys Thr Gly Pro Glu Ala Pro
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
Glu Ile Ala Gly Val Val Ser Ala Val Gly Ser Asp Val Thr Lys Trp
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Lys Val Gly Asp Arg Val Gly Val Gly Cys Leu Val Asn Ser Cys Gly
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100 105 110
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165 170 175
Asp Lys Val Ala Val Met Gly Leu Gly Gly Leu Gly His Met Gly Val
180 185 190
Gln Ile Ala Ala Ala Lys Gly Ala Asp Val Thr Val Leu Ser Arg Ser
195 200 205
Leu Arg Lys Ala Glu Leu Ala Lys Glu Leu Gly Ala Ala Arg Thr Leu
210 215 220
Ala Thr Ser Asp Glu Asp Phe Phe Thr Glu His Ala Gly Glu Phe Asp
225 230 235 240
Phe Ile Leu Asn Thr Ile Ser Ala Ser Ile Pro Val Asp Lys Tyr Leu
245 250 255
Ser Leu Leu Lys Pro His Gly Val Met Ala Val Val Gly Leu Pro Pro
260 265 270
Glu Lys Gln Pro Leu Ser Phe Gly Ala Leu Ile Gly Gly Gly Lys Val
275 280 285
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Asp Phe Cys Ala Lys His Gly Leu Gly Ala Met Ile Glu Thr Val Gly
305 310 315 320
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Val
<210> 67
<211> 1113
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 67
gtgtccatga gcactgtcgt gcctggaatt gtcgccctgt ccaagggggc accggtagaa 60
aaagtaaacg ttgttgtccc tgatccaggt gctaacgatg tcatcgtcaa gattcaggcc 120
tgcggtgtgt gccacaccga cttggcctac cgcgatggcg atatttcaga tgagttccct 180
tacctcctcg gccacgaggc agcaggtatt gttgaggagg taggcgagtc cgtcacccac 240
gttgaggtcg gcgatttcgt catcttgaac tggcgtgcag tgtgcggcga gtgccgtgca 300
tgtaagaagg gcgagccaaa gtactgcttt aacacccaca acgcatctaa gaagatgacc 360
ctggaagacg gcaccgagct gtccccagca ctgggtattg gcgcgttctt ggaaaagacc 420
ctggtccacg aaggccagtg caccaaggtt aaccctgagg aagatccagc agcagctggc 480
cttctgggtt gcggcatcat ggcaggtctt ggtgctgcgg taaacaccgg tgatattaag 540
cgcggcgagt ccgtggcagt cttcggcctt ggtggcgtgg gcatggcagc tattgctggc 600
gccaagattg ctggtgcatc gaagattatt gctgttgata tcgatgagaa gaagttggag 660
tgggcgaagg aattcggcgc aacccacacc attaattcct ctggtcttgg tggcgagggt 720
gatgcctctg aggtcgtggc aaaggttcgt gagctcactg atggtttcgg tactgacgtc 780
tccatcgatg cggtaggcat catgccgacc tggcagcagg cgttttactc ccgtgatcat 840
gcaggccgca tggtgatggt gggcgttcca aacctgacgt ctcgcgtaga tgttcctgcg 900
attgattttt acggtcgcgg tggctctgtg cgccctgcat ggtacggcga ctgcctgcct 960
gagcgtgatt tcccaactta tgtggatctg cacctgcagg gtcgtttccc gctggataag 1020
tttgtttctg agcgtattgg tcttgatgat gttgaagagg ctttcaacac catgaaggct 1080
ggcgacgtgc tgcgttctgt ggtggagatc taa 1113
<210> 68
<211> 370
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 68
Met Ser Met Ser Thr Val Val Pro Gly Ile Val Ala Leu Ser Lys Gly
1 5 10 15
Ala Pro Val Glu Lys Val Asn Val Val Val Pro Asp Pro Gly Ala Asn
20 25 30
Asp Val Ile Val Lys Ile Gln Ala Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu
35 40 45
Ala Tyr Arg Asp Gly Asp Ile Ser Asp Glu Phe Pro Tyr Leu Leu Gly
50 55 60
His Glu Ala Ala Gly Ile Val Glu Glu Val Gly Glu Ser Val Thr His
65 70 75 80
Val Glu Val Gly Asp Phe Val Ile Leu Asn Trp Arg Ala Val Cys Gly
85 90 95
Glu Cys Arg Ala Cys Lys Lys Gly Glu Pro Lys Tyr Cys Phe Asn Thr
100 105 110
His Asn Ala Ser Lys Lys Met Thr Leu Glu Asp Gly Thr Glu Leu Ser
115 120 125
Pro Ala Leu Gly Ile Gly Ala Phe Leu Glu Lys Thr Leu Val His Glu
130 135 140
Gly Gln Cys Thr Lys Val Asn Pro Glu Glu Asp Pro Ala Ala Ala Gly
145 150 155 160
Leu Leu Gly Cys Gly Ile Met Ala Gly Leu Gly Ala Ala Val Asn Thr
165 170 175
Gly Asp Ile Lys Arg Gly Glu Ser Val Ala Val Phe Gly Leu Gly Gly
180 185 190
Val Gly Met Ala Ala Ile Ala Gly Ala Lys Ile Ala Gly Ala Ser Lys
195 200 205
Ile Ile Ala Val Asp Ile Asp Glu Lys Lys Leu Glu Trp Ala Lys Glu
210 215 220
Phe Gly Ala Thr His Thr Ile Asn Ser Ser Gly Leu Gly Gly Glu Gly
225 230 235 240
Asp Ala Ser Glu Val Val Ala Lys Val Arg Glu Leu Thr Asp Gly Phe
245 250 255
Gly Thr Asp Val Ser Ile Asp Ala Val Gly Ile Met Pro Thr Trp Gln
260 265 270
Gln Ala Phe Tyr Ser Arg Asp His Ala Gly Arg Met Val Met Val Gly
275 280 285
Val Pro Asn Leu Thr Ser Arg Val Asp Val Pro Ala Ile Asp Phe Tyr
290 295 300
Gly Arg Gly Gly Ser Val Arg Pro Ala Trp Tyr Gly Asp Cys Leu Pro
305 310 315 320
Glu Arg Asp Phe Pro Thr Tyr Val Asp Leu His Leu Gln Gly Arg Phe
325 330 335
Pro Leu Asp Lys Phe Val Ser Glu Arg Ile Gly Leu Asp Asp Val Glu
340 345 350
Glu Ala Phe Asn Thr Met Lys Ala Gly Asp Val Leu Arg Ser Val Val
355 360 365
Glu Ile
370
<210> 69
<211> 1047
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 69
gtgagtttta tgaccactgc tgcaccccaa gaatttaccg ctgctgttgt tgaaaaattc 60
ggtcatgacg tgaccgtgaa ggatattgac cttccaaagc cagggccaca ccaggcattg 120
gtgaaggtac tcacctccgg catctgccac accgacctcc acgccttgga gggcgattgg 180
ccagtaaagc cggaaccacc attcgtacca ggacacgaag gtgtaggtga agttgttgag 240
ctcggaccag gtgaacacga tgtgaaggtc ggcgatattg tcggcaatgc gtggctctgg 300
tcagcgtgcg gcacctgcga atactgcatc acaggcaggg aaactcagtg taacgaagct 360
gagtacggtg gctacaccca aaatggatcc ttcggccagt acatgctggt ggatacccga 420
tacgccgctc gcatcccaga cggcgtggac tacctcgaag cagcgccaat tctgtgtgca 480
ggcgtgactg tctacaaggc actcaaagtc tctgaaaccc gcccgggcca attcatggtg 540
atctccggtg tcggcggact tggccacatc gcagtccaat acgcagcggc gatgggcatg 600
cgtgtcattg cggtagatat tgccgaggac aagctggaac ttgcccgtaa gcacggtgcg 660
gaatttaccg tgaatgcgcg taatgaagat ccaggcgaag ctgtacagaa gtacaccaac 720
ggtggcgcac acggcgtgct tgtgactgca gttcacgagg cagcattcgg ccaggcactg 780
gatatggctc gacgtgcagg aacaattgtg ttcaacggtc tgccaccggg agagttccca 840
gcatccgtgt tcaacatcgt attcaagggc ctgaccatcc gtggatccct cgtgggaacc 900
cgccaagact tggccgaagc gctcgatttc tttgcacgcg gactaatcaa gccaaccgtg 960
agtgagtgct ccctcgatga ggtcaatgga gttcttgacc gcatgcgaaa cggcaagatc 1020
gatggtcgtg tggcgattcg tttctaa 1047
<210> 70
<211> 348
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 70
Met Ser Phe Met Thr Thr Ala Ala Pro Gln Glu Phe Thr Ala Ala Val
1 5 10 15
Val Glu Lys Phe Gly His Asp Val Thr Val Lys Asp Ile Asp Leu Pro
20 25 30
Lys Pro Gly Pro His Gln Ala Leu Val Lys Val Leu Thr Ser Gly Ile
35 40 45
Cys His Thr Asp Leu His Ala Leu Glu Gly Asp Trp Pro Val Lys Pro
50 55 60
Glu Pro Pro Phe Val Pro Gly His Glu Gly Val Gly Glu Val Val Glu
65 70 75 80
Leu Gly Pro Gly Glu His Asp Val Lys Val Gly Asp Ile Val Gly Asn
85 90 95
Ala Trp Leu Trp Ser Ala Cys Gly Thr Cys Glu Tyr Cys Ile Thr Gly
100 105 110
Arg Glu Thr Gln Cys Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Gly Tyr Thr Gln Asn
115 120 125
Gly Ser Phe Gly Gln Tyr Met Leu Val Asp Thr Arg Tyr Ala Ala Arg
130 135 140
Ile Pro Asp Gly Val Asp Tyr Leu Glu Ala Ala Pro Ile Leu Cys Ala
145 150 155 160
Gly Val Thr Val Tyr Lys Ala Leu Lys Val Ser Glu Thr Arg Pro Gly
165 170 175
Gln Phe Met Val Ile Ser Gly Val Gly Gly Leu Gly His Ile Ala Val
180 185 190
Gln Tyr Ala Ala Ala Met Gly Met Arg Val Ile Ala Val Asp Ile Ala
195 200 205
Glu Asp Lys Leu Glu Leu Ala Arg Lys His Gly Ala Glu Phe Thr Val
210 215 220
Asn Ala Arg Asn Glu Asp Pro Gly Glu Ala Val Gln Lys Tyr Thr Asn
225 230 235 240
Gly Gly Ala His Gly Val Leu Val Thr Ala Val His Glu Ala Ala Phe
245 250 255
Gly Gln Ala Leu Asp Met Ala Arg Arg Ala Gly Thr Ile Val Phe Asn
260 265 270
Gly Leu Pro Pro Gly Glu Phe Pro Ala Ser Val Phe Asn Ile Val Phe
275 280 285
Lys Gly Leu Thr Ile Arg Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln Asp Leu
290 295 300
Ala Glu Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Ile Lys Pro Thr Val
305 310 315 320
Ser Glu Cys Ser Leu Asp Glu Val Asn Gly Val Leu Asp Arg Met Arg
325 330 335
Asn Gly Lys Ile Asp Gly Arg Val Ala Ile Arg Phe
340 345
<210> 71
<211> 1020
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 71
atgcccaaat acattgccat gcaggtatcc gaatccggtg caccgttagc cgcgaatctc 60
gtgcaacctg ctccgttgaa atcgagggaa gtccgcgtgg aaatcgctgc tagtggtgtg 120
tgccatgcag atattggcac ggcagcagca tcggggaagc acactgtttt tcctgttacc 180
cctggtcatg agattgcagg aaccatcgcg gaaattggtg aaaacgtatc tcggtggacg 240
gttggtgatc gcgttgcaat cggttggttt ggtggcaatt gcggtgactg cgctttttgt 300
cgtgcaggtg atcctgtgca ttgcagagag cggaagattc ctggcgtttc ttatgcgggt 360
ggttgggcac agaatattgt tgttccagcg gaggctcttg ctgcgattcc agatggcatg 420
gacttttacg aggccgcccc gatgggctgc gcaggtgtga caacattcaa tgcgttgcga 480
aacctgaagc tggatcccgg tgcggctgtc gcggtctttg gaatcggcgg tttagtgcgc 540
ctagctattc agtttgctgc gaaaatgggt tatcgaacca tcaccatcgc ccgcggttta 600
gagcgtgagg agctagctag gcaacttggc gccaaccact acatcgatag caatgatctg 660
caccctggcc aggcgttatt tgaacttggc ggggctgact tgatcttgtc tactgcgtcc 720
accacggagc ctctttcgga gttgtctacc ggtctttcta ttggcgggca gctaaccatt 780
atcggagttg atgggggaga tatcaccgtt tcggcagccc aattgatgat gaaccgtcag 840
atcatcacag gtcacctcac tggaagtgcg aatgacacgg aacagactat gaaatttgct 900
catctccatg gcgtgaaacc gcttattgaa cggatgcctc tcgatcaagc caacgaggct 960
attgcacgta tttcagctgg taaaccacgt ttccgtattg tcttggagcc gaattcataa 1020
<210> 72
<211> 339
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 72
Met Pro Lys Tyr Ile Ala Met Gln Val Ser Glu Ser Gly Ala Pro Leu
1 5 10 15
Ala Ala Asn Leu Val Gln Pro Ala Pro Leu Lys Ser Arg Glu Val Arg
20 25 30
Val Glu Ile Ala Ala Ser Gly Val Cys His Ala Asp Ile Gly Thr Ala
35 40 45
Ala Ala Ser Gly Lys His Thr Val Phe Pro Val Thr Pro Gly His Glu
50 55 60
Ile Ala Gly Thr Ile Ala Glu Ile Gly Glu Asn Val Ser Arg Trp Thr
65 70 75 80
Val Gly Asp Arg Val Ala Ile Gly Trp Phe Gly Gly Asn Cys Gly Asp
85 90 95
Cys Ala Phe Cys Arg Ala Gly Asp Pro Val His Cys Arg Glu Arg Lys
100 105 110
Ile Pro Gly Val Ser Tyr Ala Gly Gly Trp Ala Gln Asn Ile Val Val
115 120 125
Pro Ala Glu Ala Leu Ala Ala Ile Pro Asp Gly Met Asp Phe Tyr Glu
130 135 140
Ala Ala Pro Met Gly Cys Ala Gly Val Thr Thr Phe Asn Ala Leu Arg
145 150 155 160
Asn Leu Lys Leu Asp Pro Gly Ala Ala Val Ala Val Phe Gly Ile Gly
165 170 175
Gly Leu Val Arg Leu Ala Ile Gln Phe Ala Ala Lys Met Gly Tyr Arg
180 185 190
Thr Ile Thr Ile Ala Arg Gly Leu Glu Arg Glu Glu Leu Ala Arg Gln
195 200 205
Leu Gly Ala Asn His Tyr Ile Asp Ser Asn Asp Leu His Pro Gly Gln
210 215 220
Ala Leu Phe Glu Leu Gly Gly Ala Asp Leu Ile Leu Ser Thr Ala Ser
225 230 235 240
Thr Thr Glu Pro Leu Ser Glu Leu Ser Thr Gly Leu Ser Ile Gly Gly
245 250 255
Gln Leu Thr Ile Ile Gly Val Asp Gly Gly Asp Ile Thr Val Ser Ala
260 265 270
Ala Gln Leu Met Met Asn Arg Gln Ile Ile Thr Gly His Leu Thr Gly
275 280 285
Ser Ala Asn Asp Thr Glu Gln Thr Met Lys Phe Ala His Leu His Gly
290 295 300
Val Lys Pro Leu Ile Glu Arg Met Pro Leu Asp Gln Ala Asn Glu Ala
305 310 315 320
Ile Ala Arg Ile Ser Ala Gly Lys Pro Arg Phe Arg Ile Val Leu Glu
325 330 335
Pro Asn Ser
<210> 73
<211> 879
<212> DNA
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 73
atgcaaaccc ttgctgctat tgttcgtgcc acgaagcaac cttttgagat caccaccatt 60
gatctggatg caccacgacc agatgaagtt caaatccgtg ttattgctgc cggagtgcgc 120
cacactgacg caattgttcg tgatcagatt tacccaactt ttcttcccgc agttttcggc 180
cacgaaggcg ccggagtagt tgtcgccgtg ggttctgcag tcacctcggt gaaaccagat 240
gacaaggtag tgctgggatt caactcttgt ggccagtgct tgaagtgttt gggcggtaag 300
cctgcgtact gtgagaaatt ctatgaccgc aacttcgcat gcacccgcga tgccgggcac 360
actactttgt ttacccgtgc aacaaaagag caggcagagg ccatcatcga cacccttgat 420
gatgttttct acgatgcgga tgcgggtttc ctggcatacc cagcaactcc cccagaggct 480
tcgggagtaa gcgtgttggt tgtcgcggct ggtacctctg atctccccca agcaaaggaa 540
gcactacaca ctgcctccta cttggggcgc tccacctcac tgattgttga ttttggagtg 600
gctggcatcc accgcctgct ttcatacgaa gaagaactcc gcgctgcggg cgtgctcatc 660
gttgccgctg gaatggatgg tgcgctaccc ggagttgtcg caggcttagt gtccgcacct 720
gtcgtcgcac tgccaacctc cgtgggatac ggcgcaggtg ctggaggaat cgcaccactt 780
ctgaccatgc ttaacgcctg cgcgccggga gttggagtgg tcaacattga taacggctat 840
ggagcaggac acctggctgc gcagattgcg gcgaggtaa 879
<210> 74
<211> 292
<212> PRT
<213> 谷氨酸棒状杆菌
<400> 74
Met Gln Thr Leu Ala Ala Ile Val Arg Ala Thr Lys Gln Pro Phe Glu
1 5 10 15
Ile Thr Thr Ile Asp Leu Asp Ala Pro Arg Pro Asp Glu Val Gln Ile
20 25 30
Arg Val Ile Ala Ala Gly Val Arg His Thr Asp Ala Ile Val Arg Asp
35 40 45
Gln Ile Tyr Pro Thr Phe Leu Pro Ala Val Phe Gly His Glu Gly Ala
50 55 60
Gly Val Val Val Ala Val Gly Ser Ala Val Thr Ser Val Lys Pro Asp
65 70 75 80
Asp Lys Val Val Leu Gly Phe Asn Ser Cys Gly Gln Cys Leu Lys Cys
85 90 95
Leu Gly Gly Lys Pro Ala Tyr Cys Glu Lys Phe Tyr Asp Arg Asn Phe
100 105 110
Ala Cys Thr Arg Asp Ala Gly His Thr Thr Leu Phe Thr Arg Ala Thr
115 120 125
Lys Glu Gln Ala Glu Ala Ile Ile Asp Thr Leu Asp Asp Val Phe Tyr
130 135 140
Asp Ala Asp Ala Gly Phe Leu Ala Tyr Pro Ala Thr Pro Pro Glu Ala
145 150 155 160
Ser Gly Val Ser Val Leu Val Val Ala Ala Gly Thr Ser Asp Leu Pro
165 170 175
Gln Ala Lys Glu Ala Leu His Thr Ala Ser Tyr Leu Gly Arg Ser Thr
180 185 190
Ser Leu Ile Val Asp Phe Gly Val Ala Gly Ile His Arg Leu Leu Ser
195 200 205
Tyr Glu Glu Glu Leu Arg Ala Ala Gly Val Leu Ile Val Ala Ala Gly
210 215 220
Met Asp Gly Ala Leu Pro Gly Val Val Ala Gly Leu Val Ser Ala Pro
225 230 235 240
Val Val Ala Leu Pro Thr Ser Val Gly Tyr Gly Ala Gly Ala Gly Gly
245 250 255
Ile Ala Pro Leu Leu Thr Met Leu Asn Ala Cys Ala Pro Gly Val Gly
260 265 270
Val Val Asn Ile Asp Asn Gly Tyr Gly Ala Gly His Leu Ala Ala Gln
275 280 285
Ile Ala Ala Arg
290
<210> 75
<211> 3453
<212> DNA
<213> 巴西诺卡菌
<400> 75
ttgttcgccg aggacgagca ggtgaaagcc gcggtgccgg accaggaggt ggtcgaggcg 60
atccgggcgc ccggcctgcg cctggcacag atcatggcca ccgtgatgga gcgctatgcg 120
gaccgccccg cggtgggaca gcgggcgagc gagccggtca ccgagagcgg tcgcaccacc 180
ttccggctgc tcccggaatt cgagaccctg acctaccgcg agctgtgggc gcgcgtccgc 240
gcggtggccg ccgcgtggca cggagatgcc gaaaggcctt tgcgggccgg ggatttcgtt 300
gctctgctgg gtttcgccgg catcgattac ggcaccctcg atctcgcgaa catccatctc 360
ggcctcgtca cggtgccgct gcaatccggc gccacggccc cgcaactcgc cgcgatcctg 420
gccgagacca cgccccgggt gctggccgcg acacccgacc atctcgatat cgccgtcgaa 480
ttgctgaccg ggggagcctc gccggaacgg ctggtggtat tcgactaccg ccccgcggac 540
gacgatcacc gggcggcgct cgagtccgcg cgcagacggt tgagcgacgc gggcagtgcg 600
gtggtggtcg agacgctcga cgcggtccgc gcccgcggca gcgaattgcc ggccgcgccg 660
ctgttcgttc ccgccgcgga cgaggacccg ctggctctgc tcatctacac ctccggcagc 720
accggcacgc ctaagggcgc catgtacacc gaaagactga accgcacgac gtggctgagc 780
ggggcgaaag gcgtcggcct cacgctcggc tacatgccga tgagtcatat tgccgggcgg 840
gcctcgttcg ccggtgtgct ggcccgcggc ggcacggtct acttcaccgc ccgcagcgat 900
atgtcgacgc tgttcgaaga tctggccctg gtgcggccga ccgagatgtt cttcgtcccg 960
cgcgtgtgcg acatgatctt ccagcgctat caggccgaac tgtcgcggcg cgcgcccgcc 1020
gcggccgcga gcccggaact cgagcaggaa ctgaagaccg aactgcgctt gtccgcggtc 1080
ggggaccgct tactcggggc gatcgcgggc agcgcgccgc tgtcggccga gatgcgggag 1140
ttcatggagt cgctgctgga tctggaactg cacgacggct acggctcgac cgaggcgggt 1200
atcggcgtac tgcaagacaa tatcgtccag cgtccgccgg tcatcgatta caagctcgtc 1260
gacgtgccgg aattgggcta cttccggacg gaccagccgc atccccgcgg tgagttgctg 1320
ttgaaaaccg aagggatgat tccgggctac ttccggcggc ccgaggtgac cgcggagatc 1380
ttcgacgagg acggtttcta caggaccggt gacatcgtcg ccgaactcga accggatcgg 1440
ctgatctacc tggaccgccg caacaatgtg ctgaaactgg cccagggcga gttcgtcacg 1500
gtcgcccatc tggaagcggt gttcgcgacc agtccgctga tccggcagat ctacatctac 1560
ggcaacagcg agcgctcgtt cctgctggcg gtgatcgtgc ccaccgcgga cgcgctggcc 1620
gacggtgtca ccgacgcgct gaacacggcg ctgaccgaat ccttgcgaca gctcgcgaaa 1680
gaagccgggc tgcaatccta tgagctgccg cgcgagttcc tggtcgaaac cgaaccgttc 1740
accgtcgaga acggtctgct ctccggtatc gcgaaactgt tgcggcccaa gctcaaggag 1800
cactacggcg agcgactcga gcagctgtac cgcgatatcg aggcgaaccg caacgacgag 1860
ctgatcgagc tgcggcgcac cgcggccgag ctgccggtgc tcgaaaccgt cacgcgggct 1920
gcacgttcga tgctcggact ggccgcgtcg gagttgcggc cggacgcgca tttcaccgat 1980
ctcggcggtg attcactgtc cgcgctgtcg ttttcgaccc tgctgcagga catgctcgag 2040
gtcgaggtcc cggtcggtgt catcgtgagc cccgccaact cgctcgccga tctggcgaaa 2100
tacatcgagg ccgaacggca ttcgggggtg cggcggccga gcctgatctc ggtgcacggt 2160
cccggcaccg agatccgtgc cgccgatctc accctggaca agttcatcga cgagcgcacc 2220
ctcgctgccg cgaaagcggt tccggccgcg ccggcccagg cgcagaccgt cctgctcacc 2280
ggggcgaacg gctatctcgg ccgcttcctg tgcctggaat ggctgcagcg actggaccag 2340
accggcggca cgctggtctg catcgtgcgc ggtaccgacg cggccgccgc gcggaagcgc 2400
ctggatgcgg tgttcgacag cggtgatccg gagctgctcg accactaccg gaagctggcc 2460
gccgagcacc tcgaggtgct cgcgggcgat atcggcgacc cgaatctcgg cctggacgaa 2520
gcgacttggc agcggctcgc cgcgaccgtc gacctgatcg tgcaccccgc cgccctcgtc 2580
aaccatgtgc tgccgtacag ccagctgttc gggccgaatg tggtcggcac cgccgagatc 2640
atccggctgg ccatcaccga gcgccgtaag cccgtgacgt acctgtcgac ggtcgcggtg 2700
gccgcacagg tcgatcccgc cggcttcgac gaggagcgcg atatccggga gatgagcgcg 2760
gtgcgctcca tcgacgccgg gtacgcgaac ggttacggca acagcaagtg ggccggcgag 2820
gtgctgctgc gcgaggccca tgatctgtgc gggctgccgg tcgccgtgtt ccgctcggac 2880
atgatcctgg cgcacagcaa atacgtcggt cagctcaacg tccccgatgt gttcacccgg 2940
ctcatcctga gcctggcgct caccggcatc gcaccgtatt cgttctacgg gacggacagc 3000
gccgggcagc gcaggcgggc ccactacgac ggtctgcccg ccgatttcgt cgccgaggcg 3060
atcaccaccc tcggcgcgcg agccgagtcg gggttccata cctacgacgt gtggaacccg 3120
tacgacgacg gcatctcgct ggacgaattc gtcgactggc tcggcgattt cggcgtgccg 3180
atccagcgga tcgacgacta cgacgaatgg ttccggcgtt tcgagaccgc gatccgcgcg 3240
ctgcccgaaa agcagcgcga tgcttcgctg ctaccgctgc tggacgcaca ccggcggcca 3300
ctgcgcgcgg tgcgcggttc gctgttgccc gccaagaact tccaggcggc ggtgcagtcc 3360
gcgcggatcg gccccgatca ggacatcccg catctttccc cgcagttgat cgacaagtac 3420
gtcaccgacc tgcgccacct cggcctgctc tga 3453
<210> 76
<211> 1150
<212> PRT
<213> 巴西诺卡菌
<400> 76
Met Phe Ala Glu Asp Glu Gln Val Lys Ala Ala Val Pro Asp Gln Glu
1 5 10 15
Val Val Glu Ala Ile Arg Ala Pro Gly Leu Arg Leu Ala Gln Ile Met
20 25 30
Ala Thr Val Met Glu Arg Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Val Gly Gln Arg
35 40 45
Ala Ser Glu Pro Val Thr Glu Ser Gly Arg Thr Thr Phe Arg Leu Leu
50 55 60
Pro Glu Phe Glu Thr Leu Thr Tyr Arg Glu Leu Trp Ala Arg Val Arg
65 70 75 80
Ala Val Ala Ala Ala Trp His Gly Asp Ala Glu Arg Pro Leu Arg Ala
85 90 95
Gly Asp Phe Val Ala Leu Leu Gly Phe Ala Gly Ile Asp Tyr Gly Thr
100 105 110
Leu Asp Leu Ala Asn Ile His Leu Gly Leu Val Thr Val Pro Leu Gln
115 120 125
Ser Gly Ala Thr Ala Pro Gln Leu Ala Ala Ile Leu Ala Glu Thr Thr
130 135 140
Pro Arg Val Leu Ala Ala Thr Pro Asp His Leu Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Leu Leu Thr Gly Gly Ala Ser Pro Glu Arg Leu Val Val Phe Asp Tyr
165 170 175
Arg Pro Ala Asp Asp Asp His Arg Ala Ala Leu Glu Ser Ala Arg Arg
180 185 190
Arg Leu Ser Asp Ala Gly Ser Ala Val Val Val Glu Thr Leu Asp Ala
195 200 205
Val Arg Ala Arg Gly Ser Glu Leu Pro Ala Ala Pro Leu Phe Val Pro
210 215 220
Ala Ala Asp Glu Asp Pro Leu Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser
225 230 235 240
Thr Gly Thr Pro Lys Gly Ala Met Tyr Thr Glu Arg Leu Asn Arg Thr
245 250 255
Thr Trp Leu Ser Gly Ala Lys Gly Val Gly Leu Thr Leu Gly Tyr Met
260 265 270
Pro Met Ser His Ile Ala Gly Arg Ala Ser Phe Ala Gly Val Leu Ala
275 280 285
Arg Gly Gly Thr Val Tyr Phe Thr Ala Arg Ser Asp Met Ser Thr Leu
290 295 300
Phe Glu Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu Met Phe Phe Val Pro
305 310 315 320
Arg Val Cys Asp Met Ile Phe Gln Arg Tyr Gln Ala Glu Leu Ser Arg
325 330 335
Arg Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ser Pro Glu Leu Glu Gln Glu Leu Lys
340 345 350
Thr Glu Leu Arg Leu Ser Ala Val Gly Asp Arg Leu Leu Gly Ala Ile
355 360 365
Ala Gly Ser Ala Pro Leu Ser Ala Glu Met Arg Glu Phe Met Glu Ser
370 375 380
Leu Leu Asp Leu Glu Leu His Asp Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala Gly
385 390 395 400
Ile Gly Val Leu Gln Asp Asn Ile Val Gln Arg Pro Pro Val Ile Asp
405 410 415
Tyr Lys Leu Val Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Arg Thr Asp Gln
420 425 430
Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Leu Lys Thr Glu Gly Met Ile Pro
435 440 445
Gly Tyr Phe Arg Arg Pro Glu Val Thr Ala Glu Ile Phe Asp Glu Asp
450 455 460
Gly Phe Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Val Ala Glu Leu Glu Pro Asp Arg
465 470 475 480
Leu Ile Tyr Leu Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys Leu Ala Gln Gly
485 490 495
Glu Phe Val Thr Val Ala His Leu Glu Ala Val Phe Ala Thr Ser Pro
500 505 510
Leu Ile Arg Gln Ile Tyr Ile Tyr Gly Asn Ser Glu Arg Ser Phe Leu
515 520 525
Leu Ala Val Ile Val Pro Thr Ala Asp Ala Leu Ala Asp Gly Val Thr
530 535 540
Asp Ala Leu Asn Thr Ala Leu Thr Glu Ser Leu Arg Gln Leu Ala Lys
545 550 555 560
Glu Ala Gly Leu Gln Ser Tyr Glu Leu Pro Arg Glu Phe Leu Val Glu
565 570 575
Thr Glu Pro Phe Thr Val Glu Asn Gly Leu Leu Ser Gly Ile Ala Lys
580 585 590
Leu Leu Arg Pro Lys Leu Lys Glu His Tyr Gly Glu Arg Leu Glu Gln
595 600 605
Leu Tyr Arg Asp Ile Glu Ala Asn Arg Asn Asp Glu Leu Ile Glu Leu
610 615 620
Arg Arg Thr Ala Ala Glu Leu Pro Val Leu Glu Thr Val Thr Arg Ala
625 630 635 640
Ala Arg Ser Met Leu Gly Leu Ala Ala Ser Glu Leu Arg Pro Asp Ala
645 650 655
His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Ser Phe Ser
660 665 670
Thr Leu Leu Gln Asp Met Leu Glu Val Glu Val Pro Val Gly Val Ile
675 680 685
Val Ser Pro Ala Asn Ser Leu Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Glu Ala
690 695 700
Glu Arg His Ser Gly Val Arg Arg Pro Ser Leu Ile Ser Val His Gly
705 710 715 720
Pro Gly Thr Glu Ile Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile
725 730 735
Asp Glu Arg Thr Leu Ala Ala Ala Lys Ala Val Pro Ala Ala Pro Ala
740 745 750
Gln Ala Gln Thr Val Leu Leu Thr Gly Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Arg
755 760 765
Phe Leu Cys Leu Glu Trp Leu Gln Arg Leu Asp Gln Thr Gly Gly Thr
770 775 780
Leu Val Cys Ile Val Arg Gly Thr Asp Ala Ala Ala Ala Arg Lys Arg
785 790 795 800
Leu Asp Ala Val Phe Asp Ser Gly Asp Pro Glu Leu Leu Asp His Tyr
805 810 815
Arg Lys Leu Ala Ala Glu His Leu Glu Val Leu Ala Gly Asp Ile Gly
820 825 830
Asp Pro Asn Leu Gly Leu Asp Glu Ala Thr Trp Gln Arg Leu Ala Ala
835 840 845
Thr Val Asp Leu Ile Val His Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu
850 855 860
Pro Tyr Ser Gln Leu Phe Gly Pro Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Ile
865 870 875 880
Ile Arg Leu Ala Ile Thr Glu Arg Arg Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser
885 890 895
Thr Val Ala Val Ala Ala Gln Val Asp Pro Ala Gly Phe Asp Glu Glu
900 905 910
Arg Asp Ile Arg Glu Met Ser Ala Val Arg Ser Ile Asp Ala Gly Tyr
915 920 925
Ala Asn Gly Tyr Gly Asn Ser Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg
930 935 940
Glu Ala His Asp Leu Cys Gly Leu Pro Val Ala Val Phe Arg Ser Asp
945 950 955 960
Met Ile Leu Ala His Ser Lys Tyr Val Gly Gln Leu Asn Val Pro Asp
965 970 975
Val Phe Thr Arg Leu Ile Leu Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ile Ala Pro
980 985 990
Tyr Ser Phe Tyr Gly Thr Asp Ser Ala Gly Gln Arg Arg Arg Ala His
995 1000 1005
Tyr Asp Gly Leu Pro Ala Asp Phe Val Ala Glu Ala Ile Thr Thr
1010 1015 1020
Leu Gly Ala Arg Ala Glu Ser Gly Phe His Thr Tyr Asp Val Trp
1025 1030 1035
Asn Pro Tyr Asp Asp Gly Ile Ser Leu Asp Glu Phe Val Asp Trp
1040 1045 1050
Leu Gly Asp Phe Gly Val Pro Ile Gln Arg Ile Asp Asp Tyr Asp
1055 1060 1065
Glu Trp Phe Arg Arg Phe Glu Thr Ala Ile Arg Ala Leu Pro Glu
1070 1075 1080
Lys Gln Arg Asp Ala Ser Leu Leu Pro Leu Leu Asp Ala His Arg
1085 1090 1095
Arg Pro Leu Arg Ala Val Arg Gly Ser Leu Leu Pro Ala Lys Asn
1100 1105 1110
Phe Gln Ala Ala Val Gln Ser Ala Arg Ile Gly Pro Asp Gln Asp
1115 1120 1125
Ile Pro His Leu Ser Pro Gln Leu Ile Asp Lys Tyr Val Thr Asp
1130 1135 1140
Leu Arg His Leu Gly Leu Leu
1145 1150
<210> 77
<211> 51
<212> DNA
<213> 巴西诺卡菌
<400> 77
atggcgactg attcgcgaag cgatcggcta cggcgtcgaa ttgcacagtt g 51
<210> 78
<211> 17
<212> PRT
<213> 巴西诺卡菌
<400> 78
Met Ala Thr Asp Ser Arg Ser Asp Arg Leu Arg Arg Arg Ile Ala Gln
1 5 10 15
Leu
<210> 79
<211> 3510
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含密码子优化的fadD9基因和限制性位点的DNA片段的核苷酸序列
<400> 79
catatggcaa ctgacagcag gagcgaccgt ctacgtaggc ggatagctca gctatttgca 60
gaagatgaac aggttaaggc agcagttccg gatcaggaag ttgttgaagc aattcgtgca 120
cctggtctgc gtctggctca gattatggca accgtgatgg aacgttacgc agatcgtcct 180
gcagttgggc agcgtgcaag cgaaccggtt accgaaagcg ggcgtaccac ctttcgtctg 240
ttaccggagt ttgaaaccct gacctatcgt gaactgtggg cacgtgtgcg tgcagttgca 300
gcagcatggc atggggacgc agagaggccc ttacgtgcag gagactttgt cgctctgctg 360
gggtttgcag gtattgacta tggtacctta gacttagcaa atattcacct gggtttagtt 420
accgttccgc tgcaaagcgg tgcaactgca ccgcaactgg cagcaattct ggcagaaacc 480
acccctcgtg ttctggcagc aactcctgat cacctggaca ttgcagtaga gctactgacc 540
ggaggggcaa gcccggagcg tctggttgtc tttgactatc gtcctgcaga tgatgaccat 600
cgtgcagcat tagaaagcgc acgtaggcgt ctaagcgatg caggttcggc agttgttgtt 660
gaaaccttag atgcagtccg tgcacgcggt agcgagctac cggcagcacc gctgtttgtc 720
cctgcagcag atgaagatcc gctggctctg ttaatttaca ccagcggtag caccgggacc 780
cccaaaggtg caatgtatac cgagaggctg aatcgtacta cgtggctgag cggtgcaaag 840
ggtgttggtt taaccttagg ttatatgccg atgtcgcaca tagcaggacg tgcatcattt 900
gcaggggttc tggcacgcgg tggtaccgtt tattttaccg cacgcagcga catgagcacc 960
ctgtttgagg acctggcact ggttcgtccg accgaaatgt tttttgttcc gcgtgtttgt 1020
gacatgattt ttcaacgtta ccaggcagag ctgagccggc gtgcacctgc agcagcagca 1080
agcccggagt tagaacagga gctgaaaacc gagctgcgtc taagcgcagt cggagatcgt 1140
ctattagggg caattgcagg tagcgcaccg ctgagcgcag aaatgcgtga atttatggaa 1200
agcctgctgg acctggagct gcatgacggt tatggtagca ccgaagcagg gattggtgtc 1260
ctgcaagata acattgttca gaggccgccg gttattgact ataaattagt tgatgttccg 1320
gagctaggtt attttcgtac ggatcagccg caccctcgtg gggaactact gctaaagacc 1380
gagggaatga taccgggtta ttttcgtcgt cctgaagtta ccgcagaaat ttttgacgaa 1440
gatgggtttt acaggaccgg ggatattgtt gcagagttag agccggaccg tctgatttac 1500
cttgatcgtc gtaataacgt tctgaagctg gcacagggtg aatttgttac cgttgcacac 1560
ctggaggcag tttttgcaac ctcgccgctg attcgtcaga tttacattta cggtaatagc 1620
gaacgtagct ttctgctggc agttattgtt cctaccgcag atgcactggc agatggggtt 1680
accgatgcac tgaataccgc actgaccgag agcctaaggc agttagcaaa ggaggcagga 1740
ctgcaaagct acgaactgcc gcgtgaattt ctggttgaga ccgagccgtt taccgtagaa 1800
aatgggctgt taagcgggat tgcaaagctg ctacgtccta aattaaaaga acattacggt 1860
gaaaggttag aacagctgta tcgtgacatt gaggcaaatc gtaatgatga actgattgag 1920
ctgcgtcgta ccgcagcaga actgccggtt ttagagaccg taacccgtgc tgctaggagc 1980
atgttagggc tggcagcaag cgaactacgt ccggatgcac actttaccga cttaggtggg 2040
gactcgctga gcgcactgag cttcagcacc ctgctgcagg atatgttaga agttgaagtt 2100
ccggttgggg ttattgttag ccctgcaaat agcttagcag acctggcaaa gtatattgag 2160
gcagagcgtc acagcggagt tcgtcgtccg agcctgatta gcgttcatgg gcctggtacc 2220
gaaattaggg cagcagactt aaccctggat aaatttattg acgaacgtac cttagctgca 2280
gcaaaggcag tcccggcagc accggcacag gcacagaccg tactgttaac cggagcaaat 2340
ggttacctgg gtcgttttct gtgtctggag tggctgcaga ggctggatca gaccgggggg 2400
accctggttt gtattgttcg tgggaccgat gcagcagcag cacgcaaacg tctggacgca 2460
gtttttgaca gcggggaccc ggagctgtta gatcattacc gtaaactggc agcagaacat 2520
ttagaagttt tagcaggtga cattggtgat ccgaacttag gtctggatga ggcaacttgg 2580
cagcgtttag cagcaaccgt cgatctgatt gttcatcctg cagcattagt taatcacgtt 2640
ctgccgtata gccagctgtt tggaccgaac gttgttggta ccgcagaaat tattcgtctg 2700
gcaattaccg aacgtaggaa acctgttacc tatctgagca ccgttgcagt tgcagctcag 2760
gttgacccgg caggttttga cgaagaacgt gacattcgtg aaatgagcgc agttcgtagc 2820
attgacgcag gatatgcaaa tgggtatggt aatagcaaat gggcaggtga agttctgctg 2880
cgtgaagcac acgatctgtg tggactgccg gttgcagttt ttcgtagcga tatgattctg 2940
gcacatagca agtatgttgg gcagttaaat gttcctgacg tttttacccg tttaattctg 3000
agcctggcat taaccgggat tgctccgtac agcttttacg gaaccgatag cgcaggacag 3060
cgtaggcgtg cacattacga cgggctgcct gcagactttg ttgcagaagc aattaccacc 3120
ttaggtgcaa gggcagaaag cggatttcac acctatgatg tttggaatcc gtatgatgat 3180
ggtattagcc tggatgagtt tgttgattgg ttaggtgact ttggtgttcc gattcagcgt 3240
attgacgact atgatgagtg gtttcgtagg tttgaaaccg caattcgtgc actgcctgag 3300
aaacagcgtg acgctagcct gctaccgctg ctggatgctc atcgtcgtcc cctgcgtgca 3360
gttcgtggga gcctgctacc tgcaaaaaat tttcaagcag cagttcagag cgcacgcatt 3420
ggtcctgacc aggatattcc gcacctaagc ccgcagctaa ttgacaaata tgttaccgat 3480
ctgcgtcatt taggtctgtt ataagagctc 3510
<210> 80
<211> 6557
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pELAC载体的核苷酸序列
<400> 80
tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60
cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120
ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180
gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240
acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300
ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360
ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420
acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540
tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600
gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660
ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720
agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780
agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840
tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900
tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960
cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020
aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080
tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140
tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200
ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260
ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320
cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380
gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440
actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500
aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560
caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620
aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680
accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740
aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800
ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860
agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920
accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980
gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040
tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100
cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160
cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220
cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280
ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340
taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400
gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460
tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520
cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580
gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640
gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700
catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760
tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820
ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880
tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940
ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000
aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060
gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag 3180
acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac 3240
cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca 3300
cccgtggggc cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg 3360
gaccagtgac gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc 3420
cgatcatcgt cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg 3480
gcacctgtcc tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca 3540
tgccccgcgc ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgag 3600
atcccggtgc ctaatgagtg agctaactta cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt 3660
tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 3720
gcggtttgcg tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc 3780
tgattgccct tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc 3840
cccagcaggc gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct 3900
tcggtatcgt cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta 3960
atggcgcgca ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg 4020
atgccctcat tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct 4080
tcccgttccg ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga 4140
cgcagacgcg ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc 4200
aatgcgacca gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg 4260
ttgatgggtg tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct 4320
tccacagcaa tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt 4380
tgcgcgagaa gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc 4440
gacaccacca cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc 4500
gacggcgcgt gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc 4560
gccagttgtt gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact 4620
ttttcccgcg ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga 4680
taagagacac cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc 4740
ctgaattgac tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcgccattcg 4800
atggtgtccg ggatctcgac gctctccctt atgcgactcc tgcattagga agcagcccag 4860
tagtaggttg aggccgttga gcaccgccgc cgcaaggaat ggtgcatgca aggagatggc 4920
gcccaacagt cccccggcca cggggcctgc caccataccc acgccgaaac aagcgctcat 4980
gagcccgaag tggcgagccc gatcttcccc atcggtgatg tcggcgatat aggcgccagc 5040
aaccgcacct gtggcgccgg tgatgccggc cacgatgcgt ccggcgtaga ggatcgagat 5100
ctgcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 5160
ctttacactt tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 5220
acacaggatc tagatttaag aaggagatat acatatggcc gaagaaggta aactggtaat 5280
ctggattaac ggcgataaag gctataacgg tctcgctgaa gtcggtaaga aattcgagaa 5340
agataccgga attaaagtca ccgttgagca tccggataaa ctggaagaga aattcccaca 5400
ggttgcggca acaggcgatg gccctgacat tatcttctgg gcacacgacc gctttggtgg 5460
ctacgctcaa tctggcctgt tggctgaaat caccccggac aaagcgttcc aggacaagct 5520
gtatccgttt acctgggatg ccgtacgtta caacggcaag ctgattgctt acccgatcgc 5580
tgttgaagcg ttatcgctga tttataacaa agatctgctg ccgaacccgc caaaaacctg 5640
ggaagagatc ccggcgctgg ataaagaact gaaagcgaaa ggtaagagcg cgctgatgtt 5700
caacctgcaa gaaccgtact tcacctggcc gctgattgct gctgacgggg gttatgcgtt 5760
caagtatgaa aacggcaagt acgacattaa agacgtgggc gtggataacg ctggcgcgaa 5820
agcgggtctg accttcctgg ttgacctgat taaaaacaaa cacatgaatg cagacaccga 5880
ttactccatc gcagaagctg cctttaataa aggcgaaaca gcgatgacca tcaacggccc 5940
gtgggcatgg tccaacatcg acaccagcaa agtgaattat ggtgtaacgg tactgccgac 6000
cttcaagggt caaccatcca aaccgttcgt tggcgtgctg agcgcaggta ttaacgccgc 6060
cagtccgaac aaagagctgg caaaagagtt cctcgaaaac tatctgctga ctgatgaagg 6120
tctggaagcg gttaataaag acaaaccgct gggtgccgta gcgctgaagt cttacgagga 6180
agagttggcg aaagatccac gtattgccgc cactatggaa aacgcccaga aaggtgaaat 6240
catgccgaac atcccgcaga tgtccgcttt ctggtatgcc gtgcgtactg cggtgatcaa 6300
cgccgccagc ggtcgtcaga ctgtcgatga agccctgaaa gacgcgcaga ctaaggatcc 6360
gaattcgagc tccgtcgaca agcttgcggc cgcactcgag caccaccacc accaccactg 6420
agatccggct gctaacaaag cccgaaagga agctgagttg gctgctgcca ccgctgagca 6480
ataactagca taaccccttg gggcctctaa acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg 6540
aggaactata tccggat 6557
<210> 81
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 P1
<400> 81
cgtggctggc ctggttc 17
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 P5
<400> 82
cgtccccatg ccatgctgc 19
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 P4
<400> 83
cgctgttgag atccagttcg 20
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 P6
<400> 84
gcacattacg acgggctgc 19
<210> 85
<211> 1053
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 85
atgaattatc agaacgacga tttacgcatc aaagaaatca aagagttact tcctcctgtc 60
gcattgctgg aaaaattccc cgctactgaa aatgccgcga atacggttgc ccatgcccga 120
aaagcgatcc ataagatcct gaaaggtaat gatgatcgcc tgttggttgt gattggccca 180
tgctcaattc atgatcctgt cgcggcaaaa gagtatgcca ctcgcttgct ggcgctgcgt 240
gaagagctga aagatgagct ggaaatcgta atgcgcgtct attttgaaaa gccgcgtacc 300
acggtgggct ggaaagggct gattaacgat ccgcatatgg ataatagctt ccagatcaac 360
gacggtctgc gtatagcccg taaattgctg cttgatatta acgacagcgg tctgccagcg 420
gcaggtgagt ttctcgatat gatcacccca caatatctcg ctgacctgat gagctggggc 480
gcaattggcg cacgtaccac cgaatcgcag gtgcaccgcg aactggcatc agggctttct 540
tgtccggtcg gcttcaaaaa tggcaccgac ggtacgatta aagtggctat cgatgccatt 600
aatgccgccg gtgcgccgca ctgcttcctg tccgtaacga aatgggggca ttcggcgatt 660
gtgaatacca gcggtaacgg cgattgccat atcattctgc gcggcggtaa agagcctaac 720
tacagcgcga agcacgttgc tgaagtgaaa gaagggctga acaaagcagg cctgccagca 780
caggtgatga tcgatttcag ccatgctaac tcgtccaaac aattcaaaaa gcagatggat 840
gtttgtgctg acgtttgcca gcagattgcc ggtggcgaaa aggccattat tggcgtgatg 900
gtggaaagcc atctggtgga aggcaatcag agcctcgaga gcggggagcc gctggcctac 960
ggtaagagca tcaccgatgc ctgcatcggc tgggaagata ccgatgctct gttacgtcaa 1020
ctggcgaatg cagtaaaagc gcgtcgcggg taa 1053
<210> 86
<211> 350
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 86
Met Asn Tyr Gln Asn Asp Asp Leu Arg Ile Lys Glu Ile Lys Glu Leu
1 5 10 15
Leu Pro Pro Val Ala Leu Leu Glu Lys Phe Pro Ala Thr Glu Asn Ala
20 25 30
Ala Asn Thr Val Ala His Ala Arg Lys Ala Ile His Lys Ile Leu Lys
35 40 45
Gly Asn Asp Asp Arg Leu Leu Val Val Ile Gly Pro Cys Ser Ile His
50 55 60
Asp Pro Val Ala Ala Lys Glu Tyr Ala Thr Arg Leu Leu Ala Leu Arg
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Asp Glu Leu Glu Ile Val Met Arg Val Tyr Phe Glu
85 90 95
Lys Pro Arg Thr Thr Val Gly Trp Lys Gly Leu Ile Asn Asp Pro His
100 105 110
Met Asp Asn Ser Phe Gln Ile Asn Asp Gly Leu Arg Ile Ala Arg Lys
115 120 125
Leu Leu Leu Asp Ile Asn Asp Ser Gly Leu Pro Ala Ala Gly Glu Phe
130 135 140
Leu Asp Met Ile Thr Pro Gln Tyr Leu Ala Asp Leu Met Ser Trp Gly
145 150 155 160
Ala Ile Gly Ala Arg Thr Thr Glu Ser Gln Val His Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ser Gly Leu Ser Cys Pro Val Gly Phe Lys Asn Gly Thr Asp Gly Thr
180 185 190
Ile Lys Val Ala Ile Asp Ala Ile Asn Ala Ala Gly Ala Pro His Cys
195 200 205
Phe Leu Ser Val Thr Lys Trp Gly His Ser Ala Ile Val Asn Thr Ser
210 215 220
Gly Asn Gly Asp Cys His Ile Ile Leu Arg Gly Gly Lys Glu Pro Asn
225 230 235 240
Tyr Ser Ala Lys His Val Ala Glu Val Lys Glu Gly Leu Asn Lys Ala
245 250 255
Gly Leu Pro Ala Gln Val Met Ile Asp Phe Ser His Ala Asn Ser Ser
260 265 270
Lys Gln Phe Lys Lys Gln Met Asp Val Cys Ala Asp Val Cys Gln Gln
275 280 285
Ile Ala Gly Gly Glu Lys Ala Ile Ile Gly Val Met Val Glu Ser His
290 295 300
Leu Val Glu Gly Asn Gln Ser Leu Glu Ser Gly Glu Pro Leu Ala Tyr
305 310 315 320
Gly Lys Ser Ile Thr Asp Ala Cys Ile Gly Trp Glu Asp Thr Asp Ala
325 330 335
Leu Leu Arg Gln Leu Ala Asn Ala Val Lys Ala Arg Arg Gly
340 345 350
<210> 87
<211> 1089
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 87
atggagagga ttgtcgttac tctcggggaa cgtagttacc caattaccat cgcatctggt 60
ttgtttaatg aaccagcttc attcttaccg ctgaaatcgg gcgagcaggt catgttggtc 120
accaacgaaa ccctggctcc tctgtatctc gataaggtcc gcggcgtact tgaacaggcg 180
ggtgttaacg tcgatagcgt tatcctccct gacggcgagc agtataaaag cctggctgta 240
ctcgataccg tctttacggc gttgttacaa aaaccgcatg gtcgcgatac tacgctggtg 300
gcgcttggcg gcggcgtagt gggcgatctg accggcttcg cggcggcgag ttatcagcgc 360
ggtgtccgtt tcattcaagt cccgacgacg ttactgtcgc aggtcgattc ctccgttggc 420
ggcaaaactg cggtcaacca tcccctcggt aaaaacatga ttggcgcgtt ctaccaacct 480
gcttcagtgg tggtggatct cgactgtctg aaaacgcttc ccccgcgtga gttagcgtcg 540
gggctggcag aagtcatcaa atacggcatt attcttgacg gtgcgttttt taactggctg 600
gaagagaatc tggatgcgtt gttgcgtctg gacggtccgg caatggcgta ctgtattcgc 660
cgttgttgtg aactgaaggc agaagttgtc gccgccgacg agcgcgaaac cgggttacgt 720
gctttactga atctgggaca cacctttggt catgccattg aagctgaaat ggggtatggc 780
aattggttac atggtgaagc ggtcgctgcg ggtatggtga tggcggcgcg gacgtcggaa 840
cgtctcgggc agtttagttc tgccgaaacg cagcgtatta taaccctgct caagcgggct 900
gggttaccgg tcaatgggcc gcgcgaaatg tccgcgcagg cgtatttacc gcatatgctg 960
cgtgacaaga aagtccttgc gggagagatg cgcttaattc ttccgttggc aattggtaag 1020
agtgaagttc gcagcggcgt ttcgcacgag cttgttctta acgccattgc cgattgtcaa 1080
tcagcgtaa 1089
<210> 88
<211> 362
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 88
Met Glu Arg Ile Val Val Thr Leu Gly Glu Arg Ser Tyr Pro Ile Thr
1 5 10 15
Ile Ala Ser Gly Leu Phe Asn Glu Pro Ala Ser Phe Leu Pro Leu Lys
20 25 30
Ser Gly Glu Gln Val Met Leu Val Thr Asn Glu Thr Leu Ala Pro Leu
35 40 45
Tyr Leu Asp Lys Val Arg Gly Val Leu Glu Gln Ala Gly Val Asn Val
50 55 60
Asp Ser Val Ile Leu Pro Asp Gly Glu Gln Tyr Lys Ser Leu Ala Val
65 70 75 80
Leu Asp Thr Val Phe Thr Ala Leu Leu Gln Lys Pro His Gly Arg Asp
85 90 95
Thr Thr Leu Val Ala Leu Gly Gly Gly Val Val Gly Asp Leu Thr Gly
100 105 110
Phe Ala Ala Ala Ser Tyr Gln Arg Gly Val Arg Phe Ile Gln Val Pro
115 120 125
Thr Thr Leu Leu Ser Gln Val Asp Ser Ser Val Gly Gly Lys Thr Ala
130 135 140
Val Asn His Pro Leu Gly Lys Asn Met Ile Gly Ala Phe Tyr Gln Pro
145 150 155 160
Ala Ser Val Val Val Asp Leu Asp Cys Leu Lys Thr Leu Pro Pro Arg
165 170 175
Glu Leu Ala Ser Gly Leu Ala Glu Val Ile Lys Tyr Gly Ile Ile Leu
180 185 190
Asp Gly Ala Phe Phe Asn Trp Leu Glu Glu Asn Leu Asp Ala Leu Leu
195 200 205
Arg Leu Asp Gly Pro Ala Met Ala Tyr Cys Ile Arg Arg Cys Cys Glu
210 215 220
Leu Lys Ala Glu Val Val Ala Ala Asp Glu Arg Glu Thr Gly Leu Arg
225 230 235 240
Ala Leu Leu Asn Leu Gly His Thr Phe Gly His Ala Ile Glu Ala Glu
245 250 255
Met Gly Tyr Gly Asn Trp Leu His Gly Glu Ala Val Ala Ala Gly Met
260 265 270
Val Met Ala Ala Arg Thr Ser Glu Arg Leu Gly Gln Phe Ser Ser Ala
275 280 285
Glu Thr Gln Arg Ile Ile Thr Leu Leu Lys Arg Ala Gly Leu Pro Val
290 295 300
Asn Gly Pro Arg Glu Met Ser Ala Gln Ala Tyr Leu Pro His Met Leu
305 310 315 320
Arg Asp Lys Lys Val Leu Ala Gly Glu Met Arg Leu Ile Leu Pro Leu
325 330 335
Ala Ile Gly Lys Ser Glu Val Arg Ser Gly Val Ser His Glu Leu Val
340 345 350
Leu Asn Ala Ile Ala Asp Cys Gln Ser Ala
355 360
<210> 89
<211> 759
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 89
atgaaaaccg taactgtaaa agatctcgtc attggtacgg gcgcacctaa aatcatcgtc 60
tcgctgatgg cgaaagatat cgccagcgtg aaatccgaag ctctcgccta tcgtgaagcg 120
gactttgata ttctggaatg gcgtgtggac cactatgccg acctctccaa tgtggagtct 180
gtcatggcgg cagcaaaaat tctccgtgag accatgccag aaaaaccgct gctgtttacc 240
ttccgcagtg ccaaagaagg cggcgagcag gcgatttcca ccgaggctta tattgcactc 300
aatcgtgcag ccatcgacag cggcctggtt gatatgatcg atctggagtt atttaccggt 360
gatgatcagg ttaaagaaac cgtcgcctac gcccacgcgc atgatgtgaa agtagtcatg 420
tccaaccatg acttccataa aacgccggaa gccgaagaaa tcattgcccg tctgcgcaaa 480
atgcaatcct tcgacgccga tattcctaag attgcgctga tgccgcaaag taccagcgat 540
gtgctgacgt tgcttgccgc gaccctggag atgcaggagc agtatgccga tcgtccaatt 600
atcacgatgt cgatggcaaa aactggcgta atttctcgtc tggctggtga agtatttggc 660
tcggcggcaa cttttggtgc ggtaaaaaaa gcgtctgcgc cagggcaaat ctcggtaaat 720
gatttgcgca cggtattaac tattttacac caggcataa 759
<210> 90
<211> 252
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 90
Met Lys Thr Val Thr Val Lys Asp Leu Val Ile Gly Thr Gly Ala Pro
1 5 10 15
Lys Ile Ile Val Ser Leu Met Ala Lys Asp Ile Ala Ser Val Lys Ser
20 25 30
Glu Ala Leu Ala Tyr Arg Glu Ala Asp Phe Asp Ile Leu Glu Trp Arg
35 40 45
Val Asp His Tyr Ala Asp Leu Ser Asn Val Glu Ser Val Met Ala Ala
50 55 60
Ala Lys Ile Leu Arg Glu Thr Met Pro Glu Lys Pro Leu Leu Phe Thr
65 70 75 80
Phe Arg Ser Ala Lys Glu Gly Gly Glu Gln Ala Ile Ser Thr Glu Ala
85 90 95
Tyr Ile Ala Leu Asn Arg Ala Ala Ile Asp Ser Gly Leu Val Asp Met
100 105 110
Ile Asp Leu Glu Leu Phe Thr Gly Asp Asp Gln Val Lys Glu Thr Val
115 120 125
Ala Tyr Ala His Ala His Asp Val Lys Val Val Met Ser Asn His Asp
130 135 140
Phe His Lys Thr Pro Glu Ala Glu Glu Ile Ile Ala Arg Leu Arg Lys
145 150 155 160
Met Gln Ser Phe Asp Ala Asp Ile Pro Lys Ile Ala Leu Met Pro Gln
165 170 175
Ser Thr Ser Asp Val Leu Thr Leu Leu Ala Ala Thr Leu Glu Met Gln
180 185 190
Glu Gln Tyr Ala Asp Arg Pro Ile Ile Thr Met Ser Met Ala Lys Thr
195 200 205
Gly Val Ile Ser Arg Leu Ala Gly Glu Val Phe Gly Ser Ala Ala Thr
210 215 220
Phe Gly Ala Val Lys Lys Ala Ser Ala Pro Gly Gln Ile Ser Val Asn
225 230 235 240
Asp Leu Arg Thr Val Leu Thr Ile Leu His Gln Ala
245 250
<210> 91
<211> 843
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 91
atgaaatatt cgctatgtac catttcattt cgtcatcaat taatttcatt tactgatatt 60
gttcaatttg catatgaaaa cggttttgaa ggaattgaat tatgggggac gcatgcacaa 120
aatttgtaca tgcaagaacg tgaaacgaca gaacgagaat tgaattttct aaaggataaa 180
aacttagaaa ttacgatgat aagtgattac ttagatatat cattatcagc agattttgaa 240
aaaacgatag agaaaagtga acaacttgta gtactagcta attggtttaa tacgaataaa 300
attcgcacgt ttgctgggca aaaagggagc aaggacttct cggaacaaga gagaaaagag 360
tatgtgaagc gaatacgtaa gatttgtgat gtgtttgctc agaacaatat gtatgtgctg 420
ttagaaacac atcccaatac actaacggac acattgcctt ctactataga gttattagaa 480
gaagtaaacc atccgaattt aaaaataaat cttgattttc ttcatatatg ggagtctggc 540
gcagatccaa tagacagttt ccatcgatta aagccgtgga cactacatta ccattttaag 600
aatatatctt cagcggatta tttgcatgtg tttgaaccta ataatgtata tgctgcagca 660
ggaagtcgta taggtatggt tccgttattt gaaggtattg taaattatga tgagattatt 720
caggaagtga gaaatacgga tctttttgct tccttagaat ggtttggaca taattcaaaa 780
gagatattaa aagaagaaat gaaagtatta ataaatagaa aattagaagt agtaacttcg 840
taa 843
<210> 92
<211> 280
<212> PRT
<213> 苏云金芽孢杆菌
<400> 92
Met Lys Tyr Ser Leu Cys Thr Ile Ser Phe Arg His Gln Leu Ile Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asp Ile Val Gln Phe Ala Tyr Glu Asn Gly Phe Glu Gly Ile
20 25 30
Glu Leu Trp Gly Thr His Ala Gln Asn Leu Tyr Met Gln Glu Arg Glu
35 40 45
Thr Thr Glu Arg Glu Leu Asn Phe Leu Lys Asp Lys Asn Leu Glu Ile
50 55 60
Thr Met Ile Ser Asp Tyr Leu Asp Ile Ser Leu Ser Ala Asp Phe Glu
65 70 75 80
Lys Thr Ile Glu Lys Ser Glu Gln Leu Val Val Leu Ala Asn Trp Phe
85 90 95
Asn Thr Asn Lys Ile Arg Thr Phe Ala Gly Gln Lys Gly Ser Lys Asp
100 105 110
Phe Ser Glu Gln Glu Arg Lys Glu Tyr Val Lys Arg Ile Arg Lys Ile
115 120 125
Cys Asp Val Phe Ala Gln Asn Asn Met Tyr Val Leu Leu Glu Thr His
130 135 140
Pro Asn Thr Leu Thr Asp Thr Leu Pro Ser Thr Ile Glu Leu Leu Glu
145 150 155 160
Glu Val Asn His Pro Asn Leu Lys Ile Asn Leu Asp Phe Leu His Ile
165 170 175
Trp Glu Ser Gly Ala Asp Pro Ile Asp Ser Phe His Arg Leu Lys Pro
180 185 190
Trp Thr Leu His Tyr His Phe Lys Asn Ile Ser Ser Ala Asp Tyr Leu
195 200 205
His Val Phe Glu Pro Asn Asn Val Tyr Ala Ala Ala Gly Ser Arg Ile
210 215 220
Gly Met Val Pro Leu Phe Glu Gly Ile Val Asn Tyr Asp Glu Ile Ile
225 230 235 240
Gln Glu Val Arg Asn Thr Asp Leu Phe Ala Ser Leu Glu Trp Phe Gly
245 250 255
His Asn Ser Lys Glu Ile Leu Lys Glu Glu Met Lys Val Leu Ile Asn
260 265 270
Arg Lys Leu Glu Val Val Thr Ser
275 280
<210> 93
<211> 1542
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 93
atgcgtctgg aagtcttttg tgaagaccga ctcggtctga cccgcgaatt actcgatcta 60
ctcgtgctaa gaggcattga tttacgcggt attgagattg atcccattgg gcgaatctac 120
ctcaattttg ctgaactgga gtttgagagt ttcagcagtc tgatggccga aatacgccgt 180
attgcgggtg ttaccgatgt gcgtactgtc ccgtggatgc cttccgaacg tgagcatctg 240
gcgttgagcg cgttactgga ggcgttgcct gaacctgtgc tctctgtcga tatgaaaagc 300
aaagtggata tggcgaaccc ggcgagctgt cagctttttg ggcaaaaatt ggatcgcctg 360
cgcaaccata ccgccgcaca attgattaac ggctttaatt ttttacgttg gctggaaagc 420
gaaccgcaag attcgcataa cgagcatgtc gttattaatg ggcagaattt cctgatggag 480
attacgcctg tttatcttca ggatgaaaat gatcaacacg tcctgaccgg tgcggtggtg 540
atgttgcgat caacgattcg tatgggccgc cagttgcaaa atgtcgccgc ccaggacgtc 600
agcgccttca gtcaaattgt cgccgtcagc ccgaaaatga agcatgttgt cgaacaggcg 660
cagaaactgg cgatgctaag cgcgccgctg ctgattacgg gtgacacagg tacaggtaaa 720
gatctctttg cctacgcctg ccatcaggca agccccagag cgggcaaacc ttacctggcg 780
ctgaactgtg cgtctatacc ggaagatgcg gtcgagagtg aactgtttgg tcatgctccg 840
gaagggaaga aaggattctt tgagcaggcg aacggtggtt cggtgctgtt ggatgaaata 900
ggggaaatgt caccacggat gcaggcgaaa ttactgcgtt tccttaatga tggcactttc 960
cgtcgggttg gcgaagacca tgaggtgcat gtcgatgtgc gggtgatttg cgctacgcag 1020
aagaatctgg tcgaactggt gcaaaaaggc atgttccgtg aagatctcta ttatcgtctg 1080
aacgtgttga cgctcaatct gccgccgcta cgtgactgtc cgcaggacat catgccgtta 1140
actgagctgt tcgtcgcccg ctttgccgac gagcagggcg tgccgcgtcc gaaactggcc 1200
gctgacctga atactgtact tacgcgttat gcgtggccgg gaaatgtgcg gcagttaaag 1260
aacgctatct atcgcgcact gacacaactg gacggttatg agctgcgtcc acaggatatt 1320
ttgttgccgg attatgacgc cgcaacggta gccgtgggcg aagatgcgat ggaaggttcg 1380
ctggacgaaa tcaccagccg ttttgaacgc tcggtattaa cccagcttta tcgcaattat 1440
cccagcacgc gcaaactggc aaaacgtctc ggcgtttcac ataccgcgat tgccaataag 1500
ttgcgggaat atggtctgag tcagaagaag aacgaagagt aa 1542
<210> 94
<211> 513
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 94
Met Arg Leu Glu Val Phe Cys Glu Asp Arg Leu Gly Leu Thr Arg Glu
1 5 10 15
Leu Leu Asp Leu Leu Val Leu Arg Gly Ile Asp Leu Arg Gly Ile Glu
20 25 30
Ile Asp Pro Ile Gly Arg Ile Tyr Leu Asn Phe Ala Glu Leu Glu Phe
35 40 45
Glu Ser Phe Ser Ser Leu Met Ala Glu Ile Arg Arg Ile Ala Gly Val
50 55 60
Thr Asp Val Arg Thr Val Pro Trp Met Pro Ser Glu Arg Glu His Leu
65 70 75 80
Ala Leu Ser Ala Leu Leu Glu Ala Leu Pro Glu Pro Val Leu Ser Val
85 90 95
Asp Met Lys Ser Lys Val Asp Met Ala Asn Pro Ala Ser Cys Gln Leu
100 105 110
Phe Gly Gln Lys Leu Asp Arg Leu Arg Asn His Thr Ala Ala Gln Leu
115 120 125
Ile Asn Gly Phe Asn Phe Leu Arg Trp Leu Glu Ser Glu Pro Gln Asp
130 135 140
Ser His Asn Glu His Val Val Ile Asn Gly Gln Asn Phe Leu Met Glu
145 150 155 160
Ile Thr Pro Val Tyr Leu Gln Asp Glu Asn Asp Gln His Val Leu Thr
165 170 175
Gly Ala Val Val Met Leu Arg Ser Thr Ile Arg Met Gly Arg Gln Leu
180 185 190
Gln Asn Val Ala Ala Gln Asp Val Ser Ala Phe Ser Gln Ile Val Ala
195 200 205
Val Ser Pro Lys Met Lys His Val Val Glu Gln Ala Gln Lys Leu Ala
210 215 220
Met Leu Ser Ala Pro Leu Leu Ile Thr Gly Asp Thr Gly Thr Gly Lys
225 230 235 240
Asp Leu Phe Ala Tyr Ala Cys His Gln Ala Ser Pro Arg Ala Gly Lys
245 250 255
Pro Tyr Leu Ala Leu Asn Cys Ala Ser Ile Pro Glu Asp Ala Val Glu
260 265 270
Ser Glu Leu Phe Gly His Ala Pro Glu Gly Lys Lys Gly Phe Phe Glu
275 280 285
Gln Ala Asn Gly Gly Ser Val Leu Leu Asp Glu Ile Gly Glu Met Ser
290 295 300
Pro Arg Met Gln Ala Lys Leu Leu Arg Phe Leu Asn Asp Gly Thr Phe
305 310 315 320
Arg Arg Val Gly Glu Asp His Glu Val His Val Asp Val Arg Val Ile
325 330 335
Cys Ala Thr Gln Lys Asn Leu Val Glu Leu Val Gln Lys Gly Met Phe
340 345 350
Arg Glu Asp Leu Tyr Tyr Arg Leu Asn Val Leu Thr Leu Asn Leu Pro
355 360 365
Pro Leu Arg Asp Cys Pro Gln Asp Ile Met Pro Leu Thr Glu Leu Phe
370 375 380
Val Ala Arg Phe Ala Asp Glu Gln Gly Val Pro Arg Pro Lys Leu Ala
385 390 395 400
Ala Asp Leu Asn Thr Val Leu Thr Arg Tyr Ala Trp Pro Gly Asn Val
405 410 415
Arg Gln Leu Lys Asn Ala Ile Tyr Arg Ala Leu Thr Gln Leu Asp Gly
420 425 430
Tyr Glu Leu Arg Pro Gln Asp Ile Leu Leu Pro Asp Tyr Asp Ala Ala
435 440 445
Thr Val Ala Val Gly Glu Asp Ala Met Glu Gly Ser Leu Asp Glu Ile
450 455 460
Thr Ser Arg Phe Glu Arg Ser Val Leu Thr Gln Leu Tyr Arg Asn Tyr
465 470 475 480
Pro Ser Thr Arg Lys Leu Ala Lys Arg Leu Gly Val Ser His Thr Ala
485 490 495
Ile Ala Asn Lys Leu Arg Glu Tyr Gly Leu Ser Gln Lys Lys Asn Glu
500 505 510
Glu
<210> 95
<211> 666
<212> DNA
<213> Niastella koreensis
<400> 95
atgaataatc aaatttttga atccgttgac cattatatca gcgatttact gggttacgaa 60
gacgatgcat tgcttgccgc caccaattca ttagccgaag caggcatgcc tgccatcagc 120
gtatcaccca accagggcaa gtttctgcaa ttactggccc aattgtgcca ggcaaaaaat 180
atcctggagc tgggcacact ggcaggctac agcaccattt ggatggcccg ggccttaccc 240
aaaaacggcc ggctcatcac ccttgaatat gaccccaaac atgcggccgt tgcacaaaaa 300
aatatcgacc gggccggcct tacttcacaa gtacagatca gaaccggtaa agcaattgac 360
atattaccgc aattagtgga agaaggcgcc ggaccttttg atatgatctt tatcgatgcc 420
gataaaccac cttacaccga atattttcaa tgggcgcttc ggttatcacg tcccggtaca 480
ctcatcgtgg ccgataatgt gatccgtgat ggcaaagtgc tggatgaaaa cagtacggag 540
cctgctgtac agggcgcaag acgtttcaat gccatgctgg gcgccaatac cgccgttgac 600
gccaccattc ttcaaatggt aggtgtaaaa gaatacgatg gaatggcttt ggccatagta 660
aaataa 666
<210> 96
<211> 221
<212> PRT
<213> Niastella koreensis
<400> 96
Met Asn Asn Gln Ile Phe Glu Ser Val Asp His Tyr Ile Ser Asp Leu
1 5 10 15
Leu Gly Tyr Glu Asp Asp Ala Leu Leu Ala Ala Thr Asn Ser Leu Ala
20 25 30
Glu Ala Gly Met Pro Ala Ile Ser Val Ser Pro Asn Gln Gly Lys Phe
35 40 45
Leu Gln Leu Leu Ala Gln Leu Cys Gln Ala Lys Asn Ile Leu Glu Leu
50 55 60
Gly Thr Leu Ala Gly Tyr Ser Thr Ile Trp Met Ala Arg Ala Leu Pro
65 70 75 80
Lys Asn Gly Arg Leu Ile Thr Leu Glu Tyr Asp Pro Lys His Ala Ala
85 90 95
Val Ala Gln Lys Asn Ile Asp Arg Ala Gly Leu Thr Ser Gln Val Gln
100 105 110
Ile Arg Thr Gly Lys Ala Ile Asp Ile Leu Pro Gln Leu Val Glu Glu
115 120 125
Gly Ala Gly Pro Phe Asp Met Ile Phe Ile Asp Ala Asp Lys Pro Pro
130 135 140
Tyr Thr Glu Tyr Phe Gln Trp Ala Leu Arg Leu Ser Arg Pro Gly Thr
145 150 155 160
Leu Ile Val Ala Asp Asn Val Ile Arg Asp Gly Lys Val Leu Asp Glu
165 170 175
Asn Ser Thr Glu Pro Ala Val Gln Gly Ala Arg Arg Phe Asn Ala Met
180 185 190
Leu Gly Ala Asn Thr Ala Val Asp Ala Thr Ile Leu Gln Met Val Gly
195 200 205
Val Lys Glu Tyr Asp Gly Met Ala Leu Ala Ile Val Lys
210 215 220
<210> 97
<211> 3387
<212> DNA
<213> Gordonia effusa
<400> 97
atgtctgacc agcccaacgc gcttccgtct gccatcgagc cgctgaaccc cgatcctcaa 60
gcgacagagc agatctcgca ctgtgcgacg attgccgaac ttgtccgggt tctcgccgag 120
agctacggtg atcgccccgc gctgggttgg cgaaacaata gtgatccctc gtcctggcat 180
tcgatgactt accgagatct cgctgagcgg gcggattcca tggcgcgact tctccattcg 240
acacttggcg tcgccgagaa cgaccgggtg gcgacggtgg gcttcactag cgcggagtac 300
accatcgcct cgcttgccgt cggcacgctc ggcgcgatgg aggtaccact gcaaaacgcc 360
gggtccgtcg acgtctgggc cgcaatcctc accgaaaccg actgtgtgag cgcggttgtc 420
gcggccgatc aactgccttc gatcgctcgg ctggccgaat cgggcaccta caccggcctg 480
cgacatgtgc tggtcttcga catcggctcg cgcgacggaa ccacgctcga tgacgcggca 540
cgacgactgg tcgctgcggg cacccaggtg catctccgcc agcccggcgc cgagccgacg 600
acaccgccgg ctccactgcc ccagatcacg gccaaccccg accgcgtcgc cctcctcatc 660
tacacctccg gtagcaccgg agcccccaaa ggcgccatgt acaccgaaac cgcggtgacc 720
cggttattcc aatcgggact cagcggcttg gggcgcgcca ccgacggtca cggctggatc 780
accctgaact tcatgccgat gagccacgtg atgggacgca gcactctgtg gcaaaccctg 840
ggaaatggtg gcaccgcgta cttcaccccg cgcgccgacc tcgccgagtt gctcaccgac 900
ctcgcagcgg tccagccgac cgacctgcaa ttcgtaccgc gcatctggga catgctgtac 960
caggagtacg tccgcctcac cgatcaggac gtcagtgaac aagacgccct cacccgtatg 1020
cgcgaacact atttcggtac ccggactgcc accgccatca ccggttccgc accgatctcc 1080
gatgaggttc ggcgtttcgt cgaagcgatg ctgccggttc cactcatcga aggctatgga 1140
agtaccgagg ccgccggcgt ctccatcgac ggccgcatcc agcgaccgcc ggtggtggat 1200
tacaagcttc tcgacgttcc tgaactcggc tacctgagca ccgatcggcc gcacccgcgc 1260
ggcgaactgc tcgtcaagac cgaccatatc ttcgcggggt actacaaccg tcccgacctc 1320
acctcatcgg tcttcgacga ccagggctac taccggacgg gcgacatcgt cgccgagacc 1380
ggcccagacc aaatcgagta tgtcgaccgc cggaacaacg tgatgaagct ttcgcagggt 1440
gagttcgtcg cgatcgccca catcgaggcg gtactgacca ccccgccgat ccagcaactg 1500
tacgtctacg gcaacagcgc gcggccctat ctgctcgcgg tcgtcgtgcc cacccccgag 1560
ttacgcgaac gacacgccga cgacaacgag ctgcgacgag aagtactgac ggcactgcgc 1620
tctcatggcg aacgtaatgg ccttgcggcc gtagagattc cgcgcgatgt gattgtcgaa 1680
cgcacgccgt tcagcctgga gaacggtctt cttaccggca tccgaaaact cgcgcgccca 1740
caactcaaag agcgctacgg cgctcggctg gaggccctct acgccgagct ggccgatagc 1800
cgtatcacca ggctgcgcga cgtcaaagcc gttgccgcac aacgctcaac ggtgacaacg 1860
gtcatcgacg tggtcacagc gatactcgac ctcgccgacg gggaggtcac ggccgcggca 1920
catttcaccg acctcggcgg agattccctc accgccgtca cggtcgggaa cgaactccgc 1980
gacatcttcg acgccgaagt accggtcggc gtcttgacca gcccgtcatc gacgctggcc 2040
gacatagccg aacatatcga cgggcgacac agcgaggccc ggccaaccgc ggaatcggtc 2100
cacggcaccg gaaccaccct tcgggcagcg gacctcactc tcgacaaatt cctcgacgag 2160
gagaccttgc gcgctgcgtc cgacgtgacg tcggctgcga ccgacgtacg gaccgtattc 2220
atcaccggcg caaccggatt cctcggtcgc tatctgacac tcgactggtt gcgtcggatg 2280
gcaaaagtcg gcggcacggt gatctgcctc gttcgaggtg cggacgatga tgccgcccgg 2340
gcgcgcctag acgcggcatt cgactccagc gatctatggt cggagtacca gcgactggcc 2400
aaagaccacc ttcgggttct cgccggcgac aaggactcgg atcacctcgc gctcacccca 2460
gacgtatggg atgaattggc aaagtccgtc gacctcatca tcgatcccgc ggcgctggtc 2520
aaccatgtgt tgccatatcg agaactattc ggacccaacg tatctggcac tgctgagctg 2580
atcagactcg cggtgacgac cacccgtaag ccatacgtgt atatctcaac ggtcggtgta 2640
ggcgaccagg tcgcgccggg atctttcacc gaggaccccg acatccgcga gatgagctcg 2700
gtacgcgaga ttaacgacac ttacgccaac ggatatggca acagcaaatg ggccggcgaa 2760
gtattgctcg cgcaggcgca cgaacgattt gagttaccgg tcagcgtctt tcgctgcgac 2820
atgatcgtcg ccgatgatca caccatcggg cagctgaacc tacctgacat gttcacgcgg 2880
ctactgatga gcgtgctcgc caccggcttg gcacctcgct ctttctatca actcgccacc 2940
gacggatcgg cacaggaggc ccacttcgat gctctgccgg tcgatttcct cgccgaagcg 3000
atcaacaccc tgtgggttaa ggacggagcc cgcaccttca acgcgatgaa cccgcacgcc 3060
gacggcatcg gattcgatca gtacattcgc tggctgatcg acagcggcga gcagatcagc 3120
cttgtagaca actatgacga ttggtatcgg cgattcggtg cggccctcgc cgatctgccg 3180
gaaaagcagc gacgcggatc gttgattccg ttgctgcaca actatgttca cccgatgacg 3240
ccgcacaatc gcggtatggc gtcggcggac cgattccacg acgcggtccg aaccgctggc 3300
gtcgggcagt cgtccgacat cccgcatatc acgccacaga tcatcgagaa ctacgcccgc 3360
agcctccgcg gtctcggggt gatctga 3387
<210> 98
<211> 1128
<212> PRT
<213> Gordonia effusa
<400> 98
Met Ser Asp Gln Pro Asn Ala Leu Pro Ser Ala Ile Glu Pro Leu Asn
1 5 10 15
Pro Asp Pro Gln Ala Thr Glu Gln Ile Ser His Cys Ala Thr Ile Ala
20 25 30
Glu Leu Val Arg Val Leu Ala Glu Ser Tyr Gly Asp Arg Pro Ala Leu
35 40 45
Gly Trp Arg Asn Asn Ser Asp Pro Ser Ser Trp His Ser Met Thr Tyr
50 55 60
Arg Asp Leu Ala Glu Arg Ala Asp Ser Met Ala Arg Leu Leu His Ser
65 70 75 80
Thr Leu Gly Val Ala Glu Asn Asp Arg Val Ala Thr Val Gly Phe Thr
85 90 95
Ser Ala Glu Tyr Thr Ile Ala Ser Leu Ala Val Gly Thr Leu Gly Ala
100 105 110
Met Glu Val Pro Leu Gln Asn Ala Gly Ser Val Asp Val Trp Ala Ala
115 120 125
Ile Leu Thr Glu Thr Asp Cys Val Ser Ala Val Val Ala Ala Asp Gln
130 135 140
Leu Pro Ser Ile Ala Arg Leu Ala Glu Ser Gly Thr Tyr Thr Gly Leu
145 150 155 160
Arg His Val Leu Val Phe Asp Ile Gly Ser Arg Asp Gly Thr Thr Leu
165 170 175
Asp Asp Ala Ala Arg Arg Leu Val Ala Ala Gly Thr Gln Val His Leu
180 185 190
Arg Gln Pro Gly Ala Glu Pro Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Pro Gln
195 200 205
Ile Thr Ala Asn Pro Asp Arg Val Ala Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly
210 215 220
Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met Tyr Thr Glu Thr Ala Val Thr
225 230 235 240
Arg Leu Phe Gln Ser Gly Leu Ser Gly Leu Gly Arg Ala Thr Asp Gly
245 250 255
His Gly Trp Ile Thr Leu Asn Phe Met Pro Met Ser His Val Met Gly
260 265 270
Arg Ser Thr Leu Trp Gln Thr Leu Gly Asn Gly Gly Thr Ala Tyr Phe
275 280 285
Thr Pro Arg Ala Asp Leu Ala Glu Leu Leu Thr Asp Leu Ala Ala Val
290 295 300
Gln Pro Thr Asp Leu Gln Phe Val Pro Arg Ile Trp Asp Met Leu Tyr
305 310 315 320
Gln Glu Tyr Val Arg Leu Thr Asp Gln Asp Val Ser Glu Gln Asp Ala
325 330 335
Leu Thr Arg Met Arg Glu His Tyr Phe Gly Thr Arg Thr Ala Thr Ala
340 345 350
Ile Thr Gly Ser Ala Pro Ile Ser Asp Glu Val Arg Arg Phe Val Glu
355 360 365
Ala Met Leu Pro Val Pro Leu Ile Glu Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala
370 375 380
Ala Gly Val Ser Ile Asp Gly Arg Ile Gln Arg Pro Pro Val Val Asp
385 390 395 400
Tyr Lys Leu Leu Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Leu Ser Thr Asp Arg
405 410 415
Pro His Pro Arg Gly Glu Leu Leu Val Lys Thr Asp His Ile Phe Ala
420 425 430
Gly Tyr Tyr Asn Arg Pro Asp Leu Thr Ser Ser Val Phe Asp Asp Gln
435 440 445
Gly Tyr Tyr Arg Thr Gly Asp Ile Val Ala Glu Thr Gly Pro Asp Gln
450 455 460
Ile Glu Tyr Val Asp Arg Arg Asn Asn Val Met Lys Leu Ser Gln Gly
465 470 475 480
Glu Phe Val Ala Ile Ala His Ile Glu Ala Val Leu Thr Thr Pro Pro
485 490 495
Ile Gln Gln Leu Tyr Val Tyr Gly Asn Ser Ala Arg Pro Tyr Leu Leu
500 505 510
Ala Val Val Val Pro Thr Pro Glu Leu Arg Glu Arg His Ala Asp Asp
515 520 525
Asn Glu Leu Arg Arg Glu Val Leu Thr Ala Leu Arg Ser His Gly Glu
530 535 540
Arg Asn Gly Leu Ala Ala Val Glu Ile Pro Arg Asp Val Ile Val Glu
545 550 555 560
Arg Thr Pro Phe Ser Leu Glu Asn Gly Leu Leu Thr Gly Ile Arg Lys
565 570 575
Leu Ala Arg Pro Gln Leu Lys Glu Arg Tyr Gly Ala Arg Leu Glu Ala
580 585 590
Leu Tyr Ala Glu Leu Ala Asp Ser Arg Ile Thr Arg Leu Arg Asp Val
595 600 605
Lys Ala Val Ala Ala Gln Arg Ser Thr Val Thr Thr Val Ile Asp Val
610 615 620
Val Thr Ala Ile Leu Asp Leu Ala Asp Gly Glu Val Thr Ala Ala Ala
625 630 635 640
His Phe Thr Asp Leu Gly Gly Asp Ser Leu Thr Ala Val Thr Val Gly
645 650 655
Asn Glu Leu Arg Asp Ile Phe Asp Ala Glu Val Pro Val Gly Val Leu
660 665 670
Thr Ser Pro Ser Ser Thr Leu Ala Asp Ile Ala Glu His Ile Asp Gly
675 680 685
Arg His Ser Glu Ala Arg Pro Thr Ala Glu Ser Val His Gly Thr Gly
690 695 700
Thr Thr Leu Arg Ala Ala Asp Leu Thr Leu Asp Lys Phe Leu Asp Glu
705 710 715 720
Glu Thr Leu Arg Ala Ala Ser Asp Val Thr Ser Ala Ala Thr Asp Val
725 730 735
Arg Thr Val Phe Ile Thr Gly Ala Thr Gly Phe Leu Gly Arg Tyr Leu
740 745 750
Thr Leu Asp Trp Leu Arg Arg Met Ala Lys Val Gly Gly Thr Val Ile
755 760 765
Cys Leu Val Arg Gly Ala Asp Asp Asp Ala Ala Arg Ala Arg Leu Asp
770 775 780
Ala Ala Phe Asp Ser Ser Asp Leu Trp Ser Glu Tyr Gln Arg Leu Ala
785 790 795 800
Lys Asp His Leu Arg Val Leu Ala Gly Asp Lys Asp Ser Asp His Leu
805 810 815
Ala Leu Thr Pro Asp Val Trp Asp Glu Leu Ala Lys Ser Val Asp Leu
820 825 830
Ile Ile Asp Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Arg Glu
835 840 845
Leu Phe Gly Pro Asn Val Ser Gly Thr Ala Glu Leu Ile Arg Leu Ala
850 855 860
Val Thr Thr Thr Arg Lys Pro Tyr Val Tyr Ile Ser Thr Val Gly Val
865 870 875 880
Gly Asp Gln Val Ala Pro Gly Ser Phe Thr Glu Asp Pro Asp Ile Arg
885 890 895
Glu Met Ser Ser Val Arg Glu Ile Asn Asp Thr Tyr Ala Asn Gly Tyr
900 905 910
Gly Asn Ser Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Ala Gln Ala His Glu
915 920 925
Arg Phe Glu Leu Pro Val Ser Val Phe Arg Cys Asp Met Ile Val Ala
930 935 940
Asp Asp His Thr Ile Gly Gln Leu Asn Leu Pro Asp Met Phe Thr Arg
945 950 955 960
Leu Leu Met Ser Val Leu Ala Thr Gly Leu Ala Pro Arg Ser Phe Tyr
965 970 975
Gln Leu Ala Thr Asp Gly Ser Ala Gln Glu Ala His Phe Asp Ala Leu
980 985 990
Pro Val Asp Phe Leu Ala Glu Ala Ile Asn Thr Leu Trp Val Lys Asp
995 1000 1005
Gly Ala Arg Thr Phe Asn Ala Met Asn Pro His Ala Asp Gly Ile
1010 1015 1020
Gly Phe Asp Gln Tyr Ile Arg Trp Leu Ile Asp Ser Gly Glu Gln
1025 1030 1035
Ile Ser Leu Val Asp Asn Tyr Asp Asp Trp Tyr Arg Arg Phe Gly
1040 1045 1050
Ala Ala Leu Ala Asp Leu Pro Glu Lys Gln Arg Arg Gly Ser Leu
1055 1060 1065
Ile Pro Leu Leu His Asn Tyr Val His Pro Met Thr Pro His Asn
1070 1075 1080
Arg Gly Met Ala Ser Ala Asp Arg Phe His Asp Ala Val Arg Thr
1085 1090 1095
Ala Gly Val Gly Gln Ser Ser Asp Ile Pro His Ile Thr Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Glu Asn Tyr Ala Arg Ser Leu Arg Gly Leu Gly Val Ile
1115 1120 1125
<210> 99
<211> 4522
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 含有Gordonia effusa的ACAR基因(密码子优化的)和大肠杆菌的entD基因的DNA片段的核苷酸序列
<400> 99
ccaagcttgc atgccagatc gtttagatcc gaaggaaaac gtcgaaaagc aatttgcttt 60
tcgacgcccc accccgcgcg ttttagcgtg tcagtagacg cgtagggtaa gtggggtagc 120
ggcttgttag atatcttgaa atcggctttc aacagcattg atttcgatgt atttagctgg 180
ccgtttgaga cgcgatgtcc acagggtagc tggtagtttg aaaatcaacg ccgttgccct 240
taggattcag taactggcac attttgtaat gcgctagatc tgtgtgccca gtcttccagg 300
ctgcttatca cagtgaaagc aaaaccaatt cgtggctgcg aaagtcgtag ccaccacgaa 360
gtccaggagg acatacaatg agcgatcagc cgaatgcact gccgagcgca attgaaccgc 420
tgaatccgga tccgcaggca accgagcaga ttagccattg tgcaaccatt gcagaactgg 480
ttcgtgttct ggcagaaagc tatggtgatc gtccggcact gggttggcgt aataatagcg 540
atccgagcag ctggcatagc atgacctatc gtgatctggc cgaacgtgca gatagcatgg 600
cacgtctgct gcatagcacc ctgggtgttg cagaaaatga tcgtgttgca accgttggtt 660
ttaccagcgc agaatatacc attgcaagcc tggcagttgg tacactgggt gcaatggaag 720
ttccgctgca gaatgcaggt agcgttgatg tttgggcagc aattctgacc gaaaccgatt 780
gtgttagcgc agttgttgca gcagatcagc tgccgagcat tgcccgtctg gcggaaagcg 840
gcacctatac cggtctgcgt catgttctgg tttttgatat tggtagccgt gatggcacca 900
ccctggatga tgcagcacgt cgtctggttg ccgcaggcac ccaggttcat ctgcgtcagc 960
ctggtgcaga accgaccacc cctccggcac cgctgccgca gattaccgca aacccggatc 1020
gtgtggcact gctgatttat accagcggta gcacaggtgc accgaaaggt gcaatgtata 1080
ccgaaacagc agttacccgt ctgtttcaga gcggtctgag tggtctgggt cgtgcaaccg 1140
atggtcatgg ttggattacc ctgaacttta tgccgatgag ccatgttatg ggtcgtagta 1200
ccctgtggca gaccctgggt aatggtggca ccgcatattt tacaccgcgt gcagatctgg 1260
ctgaactgct gaccgatctg gcagccgttc agccgacgga tctgcagttt gttccgcgta 1320
tttgggatat gctgtatcaa gaatatgttc gtctgacaga tcaggatgtt agcgaacagg 1380
atgcactgac ccgtatgcgt gaacattatt tcggcacccg taccgcaacc gcaattaccg 1440
gtagcgcacc gattagtgat gaagttcgtc gttttgttga agcaatgctg ccggttccgc 1500
tgattgaagg ttatggtagc accgaagcag ccggtgttag cattgatggt cgtattcagc 1560
gtccgcctgt tgttgattat aaactgctgg atgtgccgga actgggttat ctgagcaccg 1620
atcgtccgca tccgcgtggt gagctgctgg ttaaaaccga tcatattttt gccggttatt 1680
acaatcgtcc ggatctgacc agcagcgttt ttgatgatca gggttattat cgtaccggtg 1740
atattgttgc cgaaaccggt ccggatcaga ttgaatatgt tgatcgtcgt aacaacgtga 1800
tgaaactgag ccagggtgaa tttgttgcaa ttgcccatat tgaagcagtt ctgaccaccc 1860
caccgattca gcagctgtat gtttatggta atagcgcacg tccgtatctg ctggccgttg 1920
ttgttccgac accggaactg cgtgaacgtc atgcagatga taatgaactg cgtcgtgaag 1980
ttctgacagc actgcgtagc catggtgaac gtaatggtct ggcagcagtt gaaattccgc 2040
gtgatgttat tgttgaacgt accccgttta gcctggaaaa tggtctgctg acaggtattc 2100
gtaaactggc acgtccgcag ctgaaagaac gttatggtgc acgtctggaa gcactgtatg 2160
ccgaactggc cgatagccgt attacacgtc tgcgtgatgt gaaagcagtt gcagcccagc 2220
gtagcaccgt taccaccgtt attgatgttg ttaccgcaat tctggatctg gcggatggtg 2280
aagttaccgc agcagcacat tttacagatc tgggtggtga tagcctgacc gcagttaccg 2340
ttggtaacga actgcgcgat atttttgatg ccgaagttcc ggttggtgtg ctgaccagcc 2400
cgagcagtac cctggcagat attgcggaac atattgatgg ccgtcatagc gaagcacgtc 2460
cgaccgcaga aagcgttcat ggcaccggta caaccctgcg tgcagccgat ctgaccctgg 2520
ataaatttct ggatgaagaa acactgcgtg ccgcaagtga tgttaccagt gcagccaccg 2580
atgttcgtac cgtgtttatt accggtgcaa ccggttttct gggtcgctac ctgacactgg 2640
attggctgcg tcgtatggca aaagttggtg gtacagttat ttgtctggtg cgtggtgccg 2700
atgatgacgc agcccgtgcg cgtctggatg cagcatttga tagcagcgat ctgtggtctg 2760
aatatcagcg tctggcaaaa gatcatctgc gcgtgctggc aggcgataaa gatagcgatc 2820
atctggcact gacaccggat gtgtgggatg aactggcaaa aagcgttgat ctgattattg 2880
atccggcagc actggttaat catgtactgc cgtatcgcga actgtttggt ccgaatgtta 2940
gcggcaccgc agaactgatc cgtctggcag ttaccaccac ccgtaaaccg tatgtgtata 3000
tttcaaccgt gggtgttggt gatcaggttg ctccgggtag ctttaccgaa gatcctgata 3060
ttcgtgaaat gagcagcgtg cgtgaaatca atgataccta tgcaaatggt tacggcaata 3120
gcaaatgggc aggcgaagtt ctgctggcac aggcacatga acgttttgaa ctgccggtta 3180
gcgtttttcg ttgtgatatg attgttgcgg atgatcatac cattggtcag ctgaatctgc 3240
cggatatgtt tactcgcctg ctgatgagcg ttctggcaac aggtctggca ccgcgtagct 3300
tttatcagct ggcgaccgat ggtagtgcac aagaggcaca ttttgatgcg ctgccggtgg 3360
atttcctggc cgaagcaatt aatacactgt gggttaaaga tggtgcccgt acctttaatg 3420
caatgaatcc gcatgccgat ggtattggtt ttgatcagta tattcgttgg ctgattgata 3480
gcggtgaaca aattagcctg gtggataatt atgatgattg gtatcgtcgc tttggtgccg 3540
cactggcgga tctgcctgaa aaacagcgtc gtggtagcct gattccgctg ctgcacaatt 3600
atgttcatcc gatgacaccg cataatcgtg gtatggcaag cgcagatcgt tttcatgatg 3660
cagttcgtac agcaggcgtt ggtcagagca gcgatattcc gcatattacc cctcagatta 3720
ttgaaaatta tgcacgtagc ctgcgtggcc tgggtgtgat ttaaaggagg acatacaatg 3780
gtcgatatga aaactacgca tacctccctc ccctttgccg gacatacgct gcattttgtt 3840
gagttcgatc cggcgaattt ttgtgagcag gatttactct ggctgccgca ctacgcacaa 3900
ctgcaacacg ctggacgtaa acgtaaaaca gagcatttag ccggacggat cgctgctgtt 3960
tatgctttgc gggaatatgg ctataaatgt gtgcccgcaa tcggcgagct acgccaacct 4020
gtctggcctg cggaggtata cggcagtatt agccactgtg ggactacggc attagccgtg 4080
gtatctcgtc aaccgattgg cattgatata gaagaaattt tttctgtaca aaccgcaaga 4140
gaattgacag acaacattat tacaccagcg gaacacgagc gactcgcaga ctgcggttta 4200
gccttttctc tggcgctgac actggcattt tccgccaaag agagcgcatt taaggcaagt 4260
gagatccaaa ctgatgcagg ttttctggac tatcagataa ttagctggaa taaacagcag 4320
gtcatcattc atcgtgagaa tgagatgttt gctgtgcact ggcagataaa agaaaagata 4380
gtcataacgc tgtgccaaca cgattaattg acaacatctg gtacgattcg cccgcagcca 4440
tcactgacca cgggcgaaag tgtaaagcag gtgccttacc atcctgacct gacaaccgga 4500
tatgcgggat ccccgggtac cg 4522
<210> 100
<211> 3387
<212> DNA
<213> Gordonia effusa
<400> 100
atgagcgatc agccgaatgc actgccgagc gcaattgaac cgctgaatcc ggatccgcag 60
gcaaccgagc agattagcca ttgtgcaacc attgcagaac tggttcgtgt tctggcagaa 120
agctatggtg atcgtccggc actgggttgg cgtaataata gcgatccgag cagctggcat 180
agcatgacct atcgtgatct ggccgaacgt gcagatagca tggcacgtct gctgcatagc 240
accctgggtg ttgcagaaaa tgatcgtgtt gcaaccgttg gttttaccag cgcagaatat 300
accattgcaa gcctggcagt tggtacactg ggtgcaatgg aagttccgct gcagaatgca 360
ggtagcgttg atgtttgggc agcaattctg accgaaaccg attgtgttag cgcagttgtt 420
gcagcagatc agctgccgag cattgcccgt ctggcggaaa gcggcaccta taccggtctg 480
cgtcatgttc tggtttttga tattggtagc cgtgatggca ccaccctgga tgatgcagca 540
cgtcgtctgg ttgccgcagg cacccaggtt catctgcgtc agcctggtgc agaaccgacc 600
acccctccgg caccgctgcc gcagattacc gcaaacccgg atcgtgtggc actgctgatt 660
tataccagcg gtagcacagg tgcaccgaaa ggtgcaatgt ataccgaaac agcagttacc 720
cgtctgtttc agagcggtct gagtggtctg ggtcgtgcaa ccgatggtca tggttggatt 780
accctgaact ttatgccgat gagccatgtt atgggtcgta gtaccctgtg gcagaccctg 840
ggtaatggtg gcaccgcata ttttacaccg cgtgcagatc tggctgaact gctgaccgat 900
ctggcagccg ttcagccgac ggatctgcag tttgttccgc gtatttggga tatgctgtat 960
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cagctgaaag aacgttatgg tgcacgtctg gaagcactgt atgccgaact ggccgatagc 1800
cgtattacac gtctgcgtga tgtgaaagca gttgcagccc agcgtagcac cgttaccacc 1860
gttattgatg ttgttaccgc aattctggat ctggcggatg gtgaagttac cgcagcagca 1920
cattttacag atctgggtgg tgatagcctg accgcagtta ccgttggtaa cgaactgcgc 1980
gatatttttg atgccgaagt tccggttggt gtgctgacca gcccgagcag taccctggca 2040
gatattgcgg aacatattga tggccgtcat agcgaagcac gtccgaccgc agaaagcgtt 2100
catggcaccg gtacaaccct gcgtgcagcc gatctgaccc tggataaatt tctggatgaa 2160
gaaacactgc gtgccgcaag tgatgttacc agtgcagcca ccgatgttcg taccgtgttt 2220
attaccggtg caaccggttt tctgggtcgc tacctgacac tggattggct gcgtcgtatg 2280
gcaaaagttg gtggtacagt tatttgtctg gtgcgtggtg ccgatgatga cgcagcccgt 2340
gcgcgtctgg atgcagcatt tgatagcagc gatctgtggt ctgaatatca gcgtctggca 2400
aaagatcatc tgcgcgtgct ggcaggcgat aaagatagcg atcatctggc actgacaccg 2460
gatgtgtggg atgaactggc aaaaagcgtt gatctgatta ttgatccggc agcactggtt 2520
aatcatgtac tgccgtatcg cgaactgttt ggtccgaatg ttagcggcac cgcagaactg 2580
atccgtctgg cagttaccac cacccgtaaa ccgtatgtgt atatttcaac cgtgggtgtt 2640
ggtgatcagg ttgctccggg tagctttacc gaagatcctg atattcgtga aatgagcagc 2700
gtgcgtgaaa tcaatgatac ctatgcaaat ggttacggca atagcaaatg ggcaggcgaa 2760
gttctgctgg cacaggcaca tgaacgtttt gaactgccgg ttagcgtttt tcgttgtgat 2820
atgattgttg cggatgatca taccattggt cagctgaatc tgccggatat gtttactcgc 2880
ctgctgatga gcgttctggc aacaggtctg gcaccgcgta gcttttatca gctggcgacc 2940
gatggtagtg cacaagaggc acattttgat gcgctgccgg tggatttcct ggccgaagca 3000
attaatacac tgtgggttaa agatggtgcc cgtaccttta atgcaatgaa tccgcatgcc 3060
gatggtattg gttttgatca gtatattcgt tggctgattg atagcggtga acaaattagc 3120
ctggtggata attatgatga ttggtatcgt cgctttggtg ccgcactggc ggatctgcct 3180
gaaaaacagc gtcgtggtag cctgattccg ctgctgcaca attatgttca tccgatgaca 3240
ccgcataatc gtggtatggc aagcgcagat cgttttcatg atgcagttcg tacagcaggc 3300
gttggtcaga gcagcgatat tccgcatatt acccctcaga ttattgaaaa ttatgcacgt 3360
agcctgcgtg gcctgggtgt gatttaa 3387
<210> 101
<211> 819
<212> DNA
<213> 大肠杆菌
<400> 101
atggaaacct atgctgtttt tggtaatccg atagcccaca gcaaatcgcc attcattcat 60
cagcaatttg ctcagcaact gaatattgaa catccctatg ggcgcgtgtt ggcacccatc 120
aatgatttca tcaacacact gaacgctttc tttagtgctg gtggtaaagg tgcgaatgtg 180
acggtgcctt ttaaagaaga ggcttttgcc agagcggatg agcttactga acgggcagcg 240
ttggctggtg ctgttaatac cctcatgcgg ttagaagatg gacgcctgct gggtgacaat 300
accgatggtg taggcttgtt aagcgatctg gaacgtctgt cttttatccg ccctggttta 360
cgtattctgc ttatcggcgc tggtggagca tctcgcggcg tactactgcc actcctttcc 420
ctggactgtg cggtgacaat aactaatcgg acggtatccc gcgcggaaga gttggctaaa 480
ttgtttgcgc acactggcag tattcaggcg ttgagtatgg acgaactgga aggtcatgag 540
tttgatctca ttattaatgc aacatccagt ggcatcagtg gtgatattcc ggcgatcccg 600
tcatcgctca ttcatccagg catttattgc tatgacatgt tctatcagaa aggaaaaact 660
ccttttctgg catggtgtga gcagcgaggc tcaaagcgta atgctgatgg tttaggaatg 720
ctggtggcac aggcggctca tgcctttctt ctctggcacg gtgttctgcc tgacgtagaa 780
ccagttataa agcaattgca ggaggaattg tccgcgtga 819
<210> 102
<211> 272
<212> PRT
<213> 大肠杆菌
<400> 102
Met Glu Thr Tyr Ala Val Phe Gly Asn Pro Ile Ala His Ser Lys Ser
1 5 10 15
Pro Phe Ile His Gln Gln Phe Ala Gln Gln Leu Asn Ile Glu His Pro
20 25 30
Tyr Gly Arg Val Leu Ala Pro Ile Asn Asp Phe Ile Asn Thr Leu Asn
35 40 45
Ala Phe Phe Ser Ala Gly Gly Lys Gly Ala Asn Val Thr Val Pro Phe
50 55 60
Lys Glu Glu Ala Phe Ala Arg Ala Asp Glu Leu Thr Glu Arg Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ala Gly Ala Val Asn Thr Leu Met Arg Leu Glu Asp Gly Arg Leu
85 90 95
Leu Gly Asp Asn Thr Asp Gly Val Gly Leu Leu Ser Asp Leu Glu Arg
100 105 110
Leu Ser Phe Ile Arg Pro Gly Leu Arg Ile Leu Leu Ile Gly Ala Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Arg Gly Val Leu Leu Pro Leu Leu Ser Leu Asp Cys Ala
130 135 140
Val Thr Ile Thr Asn Arg Thr Val Ser Arg Ala Glu Glu Leu Ala Lys
145 150 155 160
Leu Phe Ala His Thr Gly Ser Ile Gln Ala Leu Ser Met Asp Glu Leu
165 170 175
Glu Gly His Glu Phe Asp Leu Ile Ile Asn Ala Thr Ser Ser Gly Ile
180 185 190
Ser Gly Asp Ile Pro Ala Ile Pro Ser Ser Leu Ile His Pro Gly Ile
195 200 205
Tyr Cys Tyr Asp Met Phe Tyr Gln Lys Gly Lys Thr Pro Phe Leu Ala
210 215 220
Trp Cys Glu Gln Arg Gly Ser Lys Arg Asn Ala Asp Gly Leu Gly Met
225 230 235 240
Leu Val Ala Gln Ala Ala His Ala Phe Leu Leu Trp His Gly Val Leu
245 250 255
Pro Asp Val Glu Pro Val Ile Lys Gln Leu Gln Glu Glu Leu Ser Ala
260 265 270

Claims (26)

1.具有生产目标物质的能力的棒状杆菌细菌(coryneform bacterium)，所述细菌已经以使醇脱氢酶的活性与非修饰菌株相比降低的方式进行了修饰，
其中所述醇脱氢酶是由NCgl0324基因编码的蛋白质，其中所述由NCgl0324基因编码的蛋白质是由SEQ ID NO:66的氨基酸序列组成的蛋白质，
其中所述棒状杆菌细菌属于棒杆菌属(genus Corynebacterium)，和
其中所述目标物质是由选自由以下组成的组的一种或多种类型的芳族醛组成：香草醛、苯甲醛、和肉桂醛。
2.根据权利要求1的细菌，其中所述细菌已被进一步修饰使得与非修饰菌株相比，由NCgl2709基因编码的蛋白质的活性是降低的。
3.根据权利要求2的细菌，其中所述由NCgl2709基因编码的蛋白质是由SEQ ID NO:70的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.根据权利要求1或2的细菌，其中通过降低所述NCgl0324基因的表达，或者通过破坏所述NCgl0324基因降低所述醇脱氢酶的活性。
5.根据权利要求2的细菌，其中通过降低所述NCgl2709基因的表达，或者通过破坏所述NCgl2709基因降低由NCgl2709基因编码的蛋白质的活性。
6.根据权利要求1或2的细菌，所述细菌已经以使参与所述目标物质生物合成的酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步修饰。
7.权利要求6的细菌，其中所述参与目标物质生物合成的酶由选自以下的一种或多种类型的酶组成：催化从所述目标物质的前体转化成所述目标物质的酶。
8.根据权利要求6的细菌，其中所述参与目标物质生物合成的酶由选自由以下组成的组的一种或多种类型的酶组成：3-脱氧-D-阿拉伯-庚酮糖酸7-磷酸合酶、3-脱氢奎尼酸合酶、3-脱氢奎尼酸脱水酶、3-脱氢莽草酸脱水酶、O-甲基转移酶、芳香族羧酸还原酶、和苯丙氨酸脱氨酶。
9.根据权利要求8的细菌，其中所述芳香族羧酸还原酶是由SEQ ID NO:48、76、或98的氨基酸序列组成的蛋白质。
10.根据权利要求1或2的细菌，所述细菌已经以使磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步修饰。
11.根据权利要求10的细菌，其中所述磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶是由SEQ ID NO:50或52的氨基酸序列组成的蛋白质。
12.根据权利要求1或2的细菌，所述细菌已经以使除所述目标物质以外的物质的摄取系统的活性与非修饰菌株相比增加的方式进行了进一步修饰。
13.根据权利要求12的细菌，其中所述摄取系统由选自由以下组成的组的一种或多种类型的摄取系统组成：香草酸摄取系统和原儿茶酸摄取系统。
14.根据权利要求13的细菌，其中所述香草酸摄取系统是由SEQ ID NO:54的氨基酸序列组成的蛋白质。
15.根据权利要求1或2的细菌，所述细菌已经以使参与除所述目标物质以外的物质的副生产的酶活性与非修饰菌株相比降低的方式进行了进一步修饰。
16.根据权利要求15的细菌，其中所述参与除目标物质以外的物质的副生产的酶由选自由以下组成的组的一种或多种类型的酶组成：香草酸脱甲基酶、原儿茶酸3,4-双加氧酶、和莽草酸脱氢酶。
17.根据权利要求16的细菌，其中所述香草酸脱甲基酶是由SEQ ID NO:58或60的氨基酸序列组成的蛋白质。
18.根据权利要求1或2的细菌，其中所述棒状杆菌细菌是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
19.用于生产目标物质的方法，所述方法包括下述步骤(A)：
(A)通过使用根据权利要求1至18中任一项的细菌生产所述目标物质，
其中所述目标物质是醛。
20.根据权利要求19的方法，其中通过下述步骤(B)来进行所述步骤(A)：
(B)在含有碳源的培养基中培养所述细菌以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。
21.根据权利要求19的方法，其中通过下述步骤(C)来进行所述步骤(A)：
(C)通过使用所述细菌将所述目标物质的前体转化成所述目标物质。
22.根据权利要求21的方法，其中通过下述(C1)来进行所述步骤(C)：
(C1)在含有所述前体的培养基中培养所述细菌以在所述培养基中生产并积累所述目标物质。
23.根据权利要求21的方法，其中通过下述(C2)来进行所述步骤(C)：
(C2)允许所述细菌的细胞作用于反应混合物中的所述前体以在所述反应混合物中生产并积累所述目标物质。
24.根据权利要求23的方法，其中所述细胞由所述细菌的培养肉汤、从所述培养肉汤收集的细胞、其加工产物、或其组合组成。
25.根据权利要求21至24中任一项的方法，其中所述前体由选自由以下组成的组的一种或多种类型的物质组成：原儿茶酸、香草酸、苯甲酸、L-苯丙氨酸、和肉桂酸。
26.根据权利要求19至24中任一项的方法，所述方法还包括从所述培养基或反应混合物收集所述目标物质。
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