KR20180008786A - 메타크릴산 및 그 유도체의 생물학적 제조 방법 - Google Patents

메타크릴산 및 그 유도체의 생물학적 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로서,
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 및/또는 그 유도체로 전환시키는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 상기 방법의 단계들을 수행하도록 된 미생물로 확장된다.

Description

메타크릴산 및 그 유도체의 생물학적 제조 방법
본 발명은 메타크릴산 및 그 유도체의 생물학적 제조 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 특정 효소적 전환을 사용하여, 메타크릴릴-CoA (methacrylyl-CoA)를 통해 이소부티릴-CoA (isobutyryl-CoA)로부터 메타크릴산을 형성하는 방법, 및 그로부터 생성된 폴리머 또는 코폴리머에 관한 것이다.
아크릴산 및 그 알킬 에스테르, 구체적으로 메타크릴산 (MAA) 및 그 메틸 에스테르인 메틸 메타크릴레이트 (MMA)는 화학 산업에서 중요한 모노머이다. 이들의 주요 응용분야는 다양한 적용을 위한 플라스틱 제조에 있다. 가장 주요한 중합 응용분야는 높은 광학적 투명도를 갖는 플라스틱의 제조를 위한 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA)의 주조, 성형 또는 압출이다. 뿐만 아니라, 많은 코폴리머들이 사용되고; 중요한 코폴리머는 메틸 메타크릴레이트 및 에틸 메타크릴레이트와 α-메틸 스티렌, 에틸 아크릴레이트 및 부틸 아크릴레이트의 코폴리머이다. 또한, 간단한 트란스에스테르화 (transesterification) 반응에 의하여, MMA가 다른 에스테르, 가령 부틸 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트 등으로 전환될 수 있다.
현재, MMA (및 MAA)는 수많은 화학적 절차들에 의해 제조되는데, 이 중 하나는 성공적인 '알파 공정 (Alpha process)'으로서, 포름알데히드와의 무수 반응에 의하여 에스테르, 메틸 프로피오네이트로부터 MMA가 수득되는 공정이다. 상기 알파 공정에서, 상기 메틸 프로피오네이트는 에틸렌의 카르보닐화에 의해 생성된다. 상기 에틸렌 공급원료 (feedstock)는 화석 연료로부터 유래된다. 최근에, 화학 산업용으로 지속 가능한 바이오매스 (biomass) 공급원료를 얻는 것이 바람직하게 되었다. 따라서, 상기 알파 공정의 사용을 대신하는 MMA로의 대안의 바이오매스 경로가 유리할 것이다.
그러므로, 본 발명의 일 목적은 전술한 문제점을 해결하고, 메타크릴산의 제조를 위한 생물학적 또는 일부 생물학적 방법을 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 산업적으로 적용가능한 수준으로 메타크릴산의 형성에 대해 이전에 고려되지 않은 신규한 효소 기질 조합을 적용하여, 이에 따라 핵심 모노머 가령 MMA에 대한 신규하고 실행가능한 바이오-기반의 경로를 제공하는 방법을 발견하였다.
이소부티릴-CoA의 메타크릴릴-CoA로의 산화는 발린 분해 I 경로에서 자연스럽게 발생하고, 상기 전환을 수행하는 효소가 일부 세포에서 관찰되어진 것이 알려져 있다. 이러한 시스템에서, 상기 전환은 상기 기질의 산화와 유비퀴논의 환원을 결합시키기 위한 해당하는 전자 전달 시스템을 필요로 하는 아실-CoA 데히드로게나제 (dehydrogenase) 효소를 통상적으로 사용하고, 이는 이후 재생된다.
WO201438216은 미생물로부터 메타크릴산을 생성하는 방법 및 알코올 아실 트란스퍼라제를 사용하여 상기 에스테르로의 메타크릴릴 CoA 전환이 개시되었다. 상기 문헌은 2-옥소이소발레르산에서 이소부티릴 CoA로 및 이소부티릴 CoA에서 메타크릴릴 CoA로의 소량의 전환을 개시하였다. 또한, 인 비보에서 메타크릴릴-CoA로부터 메타크릴산의 이론적 생성을 토의하였지만, 성공적으로 생성되지는 않았다.
그러나, WO201438216에서, 메타크릴산의 인 비보 생성의 유일한 예는 동일한 속인 로도코쿠스 박테리움 (Rhodococcus bacterium)의 숙주에서 재조합으로 발현되는 로도코쿠스 에리트로폴리스 (Rhodococcus erythropolis) 유래된 아실-CoA 데히드로게나제를 사용하였다. 슈도모나스 에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)에서 발견된 유사한 아실-CoA 데히드로게나제를 다른 숙주 생물체에서 이종으로 발현시키려는 다른 예는 메타크릴산을 생성하지 못했다. 숙주 생물체에서 이종의 아실-CoA 데히드로게나제의 상향-조절 (up-regulation) 또는 발현을 달성하기 어렵고, 아직 보고되어 있지 않다.
그러므로, 본 발명의 부가의 목적은 메타크릴산의 향상된 생성을 제공하는데 있다.
메타크릴산의 생성이 산물 또는 중간체로 수행되는 대사 경로는 알려져 있지 않다. 아실-CoA 티오에스테라제 (thioesterase) 효소는 구조적-관련된 기질의 가수분해를 촉매화하는 것이 알려져 있지만, 상기 효소는 매우 좁은 기질 특이성을 갖는 경향이 있고, 메타크릴릴-CoA의 가수분해에 대해 테스트되지 않았고 또는 이를 촉매화하지 않는다. 또한, 넓은 기질 특이성을 갖는 더 희귀한 품종은 필수 세포성 티오에스테르의 오프-타겟 (off-target) 가수분해에 의해 발현 숙주 세포와 같은 생물계에서 문제가 될 수 있다. 다시, 메타크릴릴-CoA의 가수분해를 촉매화하는 것이 알려져 있지 않다. 따라서, 상기 효소는 지금까지 메타크릴산의 생물학적 제조를 포함하는 산업적 용도로 사용하기에 적합한 것으로 입증되지 못했다.
그러므로, 본 발명의 부가의 목적은 상기 문제를 해결하고, 산업 공정에서 사용될 수 있고, 이소부티릴 CoA를 메타크릴릴 CoA로 전환시키는 기능을 하는 효소와 독립적으로 사용될 수 있는, 메타크릴릴-CoA의 메타크릴산으로의 실행가능한 효소 전환을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1 양태에 따르면, 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 제조하는 방법이 제공되고,
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 및/또는 그 유도체로 전환시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 제2 양태에 따르면, 메타크릴산을 제조하는 방법을 제공하고,
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로, 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT), 트란스퍼라제, 신테타제 (synthetase), 및/또는 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계를 포함한다.
바람직하게, 본 발명의 제2 양태의 방법에서, 상기 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 티오에스테라제, 더 바람직하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT), 적합하게 EC 그룹 3.1.2.23의 작용에 의해 전환된다. 가장 바람직하게, 상기 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 아트로박터 종 (Arthrobacter sp.) 균주 SU로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT의 작용에 의해 전환된다.
유익하게, 본 발명의 방법은, 화석 연료에 대한 산업 의존성을 감소시키고 및 지속가능성을 증가시킨, 주요 화학적 메타크릴산 및 그 알려져 있는 유도체를 제조하는 부가의 생물학적 경로를 제공한다.
상기 방법은 재생가능한 공급원료를 미생물 발효에 의해 이소부티릴-CoA로의 용이한 전환을 가능하게 하고, 단계 (a) 및 (b)를 촉매화하는 효소의 공동-발현 (co-expression)으로 MAA로의 직접 미생물 발효 경로를 제공할 것이다.
또한, 상기 방법은 단계 (a) 또는 (b)에 대해 효소를 사용하고, 이는 이전에 메타크릴산 제조에서 고려되지 않았고 자연적으로 발생하는 발린 경로에서 발견되지 않았다. 구체적으로, 단계 (a)를 위한 효소는 관련된 전자 전달 시스템을 필요로 하지 않고, 이소부티릴 CoA를 메타크릴릴 CoA로 전환시키는 작용을 하고, 단계 (b)를 위한 효소는 숙주 생물체에서 상기 중간체가 축적되는 문제를 피하기 위해 메타크릴릴 CoA에 대한 높은 기질 특이성을 갖는다. 그러므로, 단계 (a) 또는 (b)의 효소는 단독으로 일부 화학적 절차를 향상시키기 위해 사용되어 메타크릴산을 형성시키거나 또는 생물학적 과정을 향상시키기 위해 사용되어 메타크릴산을 형성시킬 수 있다. 대안으로, 단계 (a) 및 (b)의 효소 둘 다가 함께 사용되어, 산업적으로 적용가능한 수준으로 메타크릴산을 제조하기 위한 독립적인 생물학적 방법을 형성하고, 이는 이종 숙주 생물체에서 기능성이 있다.
효소
본 발명의 문맥에서 '생물학적 (biologically)'은 생물학적 촉매를 사용하는 것을 의미한다. 바람직하게 상기 생물학적 촉매는 효소이지만, 생물학적 공급원으로부터 유래된 임의의 촉매적 구조를 포함할 수 있다.
본 발명의 문맥에서 '화학적 (chemically)'은 효소와 같은 생물학적 촉매를 사용하는 것 이외의 화학적 수단을 사용하는 것을 의미한다.
상기 제1 양태와 관련하여, 단계 (b)가 생물학적 또는 화학적, 바람직하게 생물학적으로 수행될 수 있다.
상기 제2 양태와 관련하여, 단계 (a)가 생물학적 또는 화학적, 바람직하게 생물학적으로 수행될 수 있다.
바람직하게, 단계 (a) 및 단계 (b)가 하나 이상의 효소를 사용하여 효소적으로 수행되고, 상기 효소는 생물학적 촉매로 작용한다.
바람직하게 상기 옥시다제는 CH-CH 결합에서 작용하는, EC 넘버 1.3.x.x에 속하는 옥시다제, 더 바람직하게 전자 수용체로서 산소를 사용하여 CH-CH 결합에 작용하는, EC 넘버 EC 1.3.3.x에 속하는 옥시다제이다. 더욱 바람직하게, 상기 옥시다제는 아실-CoA 옥시다제, 적합하게 EC 넘버 EC 1.3.3.6에 속한다. 더 바람직하게 상기 아실-CoA 옥시다제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)로부터의 ACX4, 아트로박터 니코티아네 (Arthrobacter nicotianae)로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제, 비그나 라디아타 (Vigna radiata)로부터의 퍼옥시솜 (peroxisomal) 아실-CoA 옥시다제, 칸디다 종 (Candida sp .)으로부터의 아실-CoA 옥시다제 및 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis)로부터의 아실-CoA 옥시다제 4. 가장 바람직하게 상기 아실-CoA 옥시다제는 아라비돕시 스 탈리아나로부터의 ACX4이다.
대안으로, 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로 옥시도레덕타제 (oxidoreductase), 적합하게 EC 그룹 넘버 1.X.X.X의 작용에 의해 전환될 수 있다. 바람직하게, 상기 옥시도레덕타제는 전자 공여체의 CH-CH 기에 작용하는 옥시도레덕타제, 적합하게 EC 그룹 1.3.X.X이다. 더 바람직하게, 공여체의 CH-CH 기에 작용하는 상기 옥시도레덕타제는 FAD 의존성 옥시도레덕타제이고, 더욱 바람직하게 상기 옥시도레덕타제는 EC 그룹 1.3.8.X에 속하는 CoA 데히드로게나제이다. 더욱 바람직하게, 상기 옥시도레덕타제는 단쇄 아실-CoA 데히드로게나제, 적합하게 EC 그룹 1.3.8.1, 이소발레릴-CoA 데히드로게나제, 적합하게 EC 그룹 1.3.8.4, 2-메틸-분지쇄 아실-CoA 데히드로게나제, 적합하게 EC 그룹 1.3.8.5 또는 아실-CoA 데히드로게나제, 적합하게 EC 그룹 1.3.8.-, 가령 이소부티릴-CoA 데히드로게나제이다. 가장 바람직하게 상기 옥시도레덕타제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas 　 putida)로부터의 단쇄/분지쇄 아실-CoA 데히드로게나제, 호모 사피엔 스 (Homo sapiens)로부터의 이소부티릴-CoA 데히드로게나제, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 이소발레릴-CoA 데히드로게나제.
상기 CoA 데히드로게나제 효소는 일반적으로 상기 기질의 산화와 유비퀴논의 환원을 결합시키기 위해 관련된 전자 전달 시스템을 필요로 하고, 이는 그 후 재생된다. 이러한 전자 전달 시스템은 전자 이동 플라보단백질 (ETF) 및 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제 (ETFQO)로 구성된다. 상기 ETF는 상기 아실-CoA 데히드로게나제 효소 및 상기 ETFQO 둘 다와 호환가능해야 한다. 따라서, 아실-CoA 데히드로게나제가 사용되는 구현예에서, 하기 재생 시스템 중 하나가 바람직하게 사용된다:
일 구현예에서, 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로, 이소부티릴-CoA에 대한 활성 및 그 관련된 전자 전달 시스템을 갖는 내인성 CoA 데히드로게나제를 포함하는 숙주 미생물, 가령 예를 들면 슈도모나스 푸티다를 사용하여, 전환된다.
제2 구현예에서, 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로, 이종의 CoA 데히드로게나제와 동일한 생물체로부터 전자 전달 시스템의 단백질을 수반하는 이종 CoA 데히드로게나제 효소의 작용에 의해서 숙주 생물체에서 전환된다. 예를 들면, 상기 CoA 데히드로게나제 및 전자 전달 시스템 성분들은 호모 사피엔스, 슈도모나스 푸티다 , 파라코쿠스 데니트리피칸스 ( Paracoccus denitrificans ), 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래되고, 모두는 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli) (또는 또다른 숙주 생물체)에서 발현된다.
제3 구현예에서, 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로, 상이한 미생물로부터 또한 전자 전달 시스템 성분을 수반하는 이종 CoA 데히드로게나제 효소의 작용에 의해 숙주 생물체에서 전환되고, 이로써 상기 성분들이 서로 및 상기 CoA 데히드로게나제와 호환가능하다. 예를 들면, 호모 사피엔스로부터의 상기 CoA 데히드로게나제는, 로도박터 스페로이데스 (Rhodobacter sphaeroides)로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제와 호환가능한, 수스 스크로파 (Sus scrofa)의 전자 이동 플라보단백질과 호환가능하다. 대안으로, 에이. 탈리아나 (A. thaliana)의 ETF-유비퀴논 옥시도레덕타제는 알. 스페로이데스 (R. sphaeroides)의 ETF-유비퀴논 옥시도레덕타제와 양호한 서열 상동성을 갖기 때문에, 이소발레릴-CoA 데히드로게나제 및 에이. 탈리아나의 ETF는 이소부티릴-CoA의 산화를 위해 알. 스페로이데스로부터의 ETF-유비퀴논 옥시도레덕타제를 갖는 기능적 시스템을 형성할 수 있다. 마지막으로, 파라코쿠스 데니트리피칸스로부터의 ETF 및 ETF-유비퀴논 옥시도레덕타제는 또 다른 공급원, 가령 에이치. 사피엔스 (H. sapiens) 또는 다른 생물체로부터의 동종체로부터의 이소부티릴-CoA 데히드로게나제와, 피. 데니 트리피칸스 (P. denitrificans) ETF의 인간 및 돼지 (porcine) ETF와의 유사성에 의해서, 호환가능하다고 예측된다.
바람직하게 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 티오에스테르 히드롤라제 (또한 티오에스테라제로 알려짐), 적합하게 EC 그룹 3.1.2.X의 작용에 의해 전환된다. 더욱 바람직하게 상기 효소는 아실 CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.20, 3-히드록시이소부티릴-CoA 히드롤라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.4, ADP 의존성 아실-CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.18, 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.23, 또는 티오에스테라제, EC 그룹 3.1.2.-, 가령 예를 들면, 살리실로일-CoA 티오에스테라제이다. 더 바람직하게 상기 티오에스테라제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 아트로박터 종 (Arthrobacter sp.) 균주 SU로부터의 4HBT, 아트로박터 글로비포르미스 (Arthrobacter globiformis)로부터의 4HBT, 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp .) 균주 CBS-3으로부터의 4HBT, 에스케리치아 콜리로부터의 EntH, 이.콜리 (E. coli)로부터의 YciA, 헤모필루스 인플루엔제 (Haemophilus influenzae)로부터의 YciA, 에스케리치아 콜리로부터의 TesA 또는 에스케리치아 콜리로부터의 TesB, 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로부터의 FcoT. 더욱 바람직하게, 상기 티오에스테라제는 아실-CoA 티오에스테라제이다. 더욱 바람직하게, 상기 티오에스테라제는 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.23이다. 가장 바람직하게 상기 아실-CoA 티오에스테라제는 아트로박터 종 균주 SU로부터의 4HBT이다.
그러므로, 일 구현예에서, 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 작용에 의해 전환될 수 있고, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.23, 더 바람직하게 아트로박터 종 균주 SU로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT의 작용에 의해 전환될 수 있다.
일 구현예에서, 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로 아실-CoA 옥시다제, 적합하게 EC 그룹 넘버 1.3.3.6, 더 바람직하게 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4의 작용에 의해서 전환될 수 있고, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.23, 더 바람직하게 아트로박터 종 균주 SU로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT의 작용에 의해 전환될 수 있다.
대안으로, 메타크릴릴-CoA가 하기 효소적 경로 중 하나의 작용에 의해 메타크릴산으로 전환될 수 있다:
일 구현예에서, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 트란스퍼라제, 적합하게 EC 그룹 넘버 2.X.X.X의 작용에 의해 전환된다. 바람직하게 상기 트란스퍼라제는 황 함유 기를 전달하는 트란스퍼라제, 적합하게 EC 그룹 넘버 2.8.X.X이다. 더 바람직하게, 상기 트란스퍼라제는 CoA-트란스퍼라제, 적합하게 EC 그룹 넘버 2.8.3.X이다. 더욱 바람직하게, 상기 트란스퍼라제는 아세테이트-의존성 아실-CoA 트란스퍼라제 또는 아세토아세테이트-의존성 부티릭 (butyric)-CoA 트란스퍼라제, 적합하게 각각 EC 그룹 넘버 2.8.3.8 및 2.8.3.9이다. 가장 바람직하게 상기 트란스퍼라제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 클로스트리디움 종 (Clostridium sp.) SB4로부터의 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 클로스트리디움 스티클란디이 (Clostridium sticklandii)로부터의 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum) ATCC824로부터의 부티레이트:아세토아세테이트 CoA-트란스퍼라제, 에스케리치아 콜리로부터의 아세테이트 코엔자임 A 트란스퍼라제 ydiF.
본원에서 사용되는, 용어 리가제 (ligase), 신테타제 (synthetase), 및 신타제 (synthase)는 당 분야에서 이해되는 바와 같이 상호교환가능하게 사용된다.
제2 구현예에서, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 역방향으로 작용하는 신테타제, 적합하게 EC 그룹 넘버 6.X.X.X의 작용에 의해 전환된다. 바람직하게 상기 신테타제는 탄소-황 결합을 형성하는 신테타제, 적합하게 EC 그룹 넘버 6.2.X.X이다. 더 바람직하게 상기 신테타제는 산-티올 리가제 (ligase), 적합하게 EC 그룹 넘버 6.2.1.X이다. 가장 바람직하게, 상기 신테타제는 가역성 ADP 또는 GDP를 형성하는 아실-CoA 리가제, 가령 GDP를 형성하는 숙시네이트-CoA 신테타제, 적합하게 EC 그룹 6.2.1.4, ADP를 형성하는 숙시네이트-CoA 신테타제, EC 그룹 6.2.1.5, ADP를 형성하는 글루타레이트-CoA 신테타제, EC 6.2.1.6, ADP를 형성하는 말레이트-CoA 신테타제, EC 6.2.1.9, GDP를 형성하는 카르복실산-CoA 신테타제, EC 6.2.1.10, ADP를 형성하는 아세테이트-CoA 신테타제, EC 6.2.1.13 또는 ADP를 형성하는 시트레이트-CoA 신테타제, EC 6.2.1.18 이다.
제3 구현예에서, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로, EC 그룹 넘버 EC 2.X.X.X, 더 바람직하게 EC 그룹 넘버 EC 2.3.X.X, 더욱 바람직하게 EC 2.3.1.X, 가장 바람직하게 EC 그룹 넘버 2.3.1.8 또는 2.3.1.19에 속하는 포스포트란스아세틸라제 또는 포스포트란스부티릴라제와 유사한 포스포트란스아실라제, 및 EC 그룹 넘버 EC 2.X.X.X, 바람직하게 EC 2.7.X.X, 더 바람직하게 EC 2.7.2.X에 속하는 단쇄 지방산 키나제, 가장 바람직하게 EC 2.7.2.1의 아세테이트 키나제, EC 2.7.2.6의 포르메이트 키나제, EC 2.7.2.7의 부티레이트 키나제, EC 2.7.2.14의 분지쇄 지방산 키나제 또는 EC 2.7.2.15의 프로피오네이트 키나제의 조합 작용에 의해 전환된다. 바람직하게 상기 포스포트란스아실라제는 메타크릴릴-CoA 포스포트란스아실라제이다. 바람직하게 상기 단쇄 지방산 키나제는 가역성 메타크릴산 키나제이다. 가장 바람직하게 상기 포스포트란스아실라제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터의 포스포트란스부티릴라제. 가장 바람직하게 상기 단쇄 지방산 키나제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 스피로헤테 (Spirochete) MA-2로부터의 분지쇄 지방산 키나제, 터모토가 마리티마 (Thermotoga maritima)로부터의 부티레이트 키나제, 클로스트리디움 부티리 쿰으로부터의 부티레이트 키나제.
본 발명의 문맥에서, 용어 '그 유도체'는 메타크릴릴 CoA 또는 메타크릴산과 화학적으로 직접 관련이 있거나 또는 이를 포함하는 것으로, 가령 그 에스테르, 그 아실 할라이드, 그 무수물, 그 아미드, 그 니트릴, 그 락톤, 그 염, 그 복합체, 그 이성질체, 그 올리고머 또는 중합체 및 또한 이들의 임의의 치환된 버젼을 의미하고, 더 바람직하게, 이는 그 에스테르 또는 그 염을 의미한다.
바람직하게 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르이다. 바람직하게 상기 메타크릴산 에스테르는 알킬 메타크릴레이트, 더 바람직하게 저급 알킬 (C1-C20) 메타크릴레이트, 더욱 바람직하게, C1-C12 알킬 메타크릴레이트, 특히 C1-C4 알킬 에스테르, 가령 메틸, 에틸, 또는 부틸 메타크릴레이트, 또는 C4-C12 알킬 에스테르이다. 가장 바람직하게, 상기 메타크릴산 에스테르는 부틸 메타크릴레이트, 예를 들면 n-부틸메타크릴레이트이다.
상기 메타크릴산 에스테르가 상기 메타크릴릴-CoA로부터, 바람직하게 EC 그룹 넘버 EC2.X.X.X의 트란스퍼라제 효소, 더 바람직하게 EC 그룹 넘버 2.3.X.X의 아실 트란스퍼라제, 더욱 바람직하게 EC 그룹 넘버 EC2.3.1.84의 알코올 아실트란스퍼라제의 작용에 의해서, 생물학적으로 형성될 수 있다.
바람직하게, 메타크릴산 에스테르가 메타크릴릴-CoA로부터 형성될 때, 상기 메타크릴릴-CoA가 이소부티릴-CoA로부터 옥시다제의 작용에 의해 생물학적으로 형성된다.
그러므로, 본 발명의 제3 양태에 따르면, 하기 단계들을 포함하는 메타크릴산 에스테르를 제조하는 방법이 제공된다:
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 에스테르로 알코올 아실트란스퍼라제의 작용에 의해 전환시키는 단계.
바람직하게 상기 제3 양태의 옥시다제는, EC 넘버 1.3.x.x의, CH-CH 결합에 작용하는 옥시다제, 더 바람직하게 EC 넘버 EC 1.3.3.x의, 전자 수용체로서 산소를 사용하는 CH-CH 결합에 작용하는 옥시다제이다. 더욱 바람직하게, 상기 옥시다제는 아실-CoA 옥시다제, 적합하게 EC 넘버 EC 1.3.3.6이다. 더 바람직하게 상기 아실-CoA 옥시다제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4, 아트로박터 니코티아네로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제, 비그나 라디아타로부터의 퍼옥시솜 아실-CoA 옥시다제, 칸디다 종으로부터의 아실-CoA 옥시다제 및 칸디다 트로피칼리스로부터의 아실-CoA 옥시다제 4. 가장 바람직하게 상기 아실-CoA 옥시다제는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4이다.
바람직하게, 상기 제3 양태의 메타크릴산 에스테르는 알킬 메타크릴레이트, 더 바람직하게 저급 알킬 (C1-C20) 메타크릴레이트, 더욱 바람직하게, C1-C12 알킬 메타크릴레이트, 특히 C1-C4 알킬 에스테르, 가령 메틸, 에틸 또는 부틸 메타크릴레이트, 또는 C4-C12 알킬 에스테르이다. 가장 바람직하게, 상기 메타크릴산 에스테르는 부틸 메타크릴레이트, 예를 들면 n-부틸메타크릴레이트이다.
적합하게 상기 알코올 아실트란스퍼라제는 알코올 또는 페놀, 바람직하게 직쇄 또는 분지쇄 C1-20 비치환된 알코올, 아랄킬 알코올 또는 페놀, 및 특히 바람직하게 C1-8 또는 C1-4 알킬 알코올 가령 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올, tert-부탄올, n-펜틸알코올, 이소펜틸 알코올, tert-펜틸 알코올, n-헥실 알코올, 이소헥실 알코올, 2-헥실 알코올, 디메틸부틸 알코올, 에틸부틸 알코올, 헵틸 알코올, 옥틸 알코올, 2-에틸헥실 알코올; 벤질 알코올 또는 페놀의 존재 하에 작용한다. 바람직하게, 상기 알코올 아실트란스퍼라제는 알코올, 더 바람직하게 C1-C12 알코올, 더 바람직하게 C1 내지 C4 또는 C4-C12 알코올의 존재 하에, 더욱 바람직하게 부탄올, 가령 n-부탄올, 이소부탄올, sec-부탄올 또는 tert-부탄올의 존재 하에 작용한다. 가장 바람직하게, 상기 알코올 아실트란스퍼라제는 n-부탄올의 존재 하에 작용한다.
본원에서 용어 알코올은 히드록실기 (-OH 기)를 갖고, 메타크릴레이트와 에스테르기를 형성할 수 있는 종을 의미한다. 바람직하게, 상기 알코올은 C1 내지 C20 알칸올, 더 바람직하게 C1 내지 C12 알칸올, 더욱 바람직하게 C1 내지 C4 알칸올 또는 C4 내지 C12 알칸올, 가장 바람직하게 C4 알칸올일 수 있다.
바람직하게 상기 알코올 아실트란스퍼라제가 식물 기원, 더 바람직하게 진기베랄레스 (Zingiberales), 로살레스 (Rosales), 에리칼레스 (Ericales), 쿠쿠르비탈레스 (Cucurbitales), 브라스시칼레스 (Brassicales) 및 로랄레스 (Laurales)로 구성된 군으로부터 선택된 임의 목 (order)에 속하는 식물; 더욱 바람직하게 무사세에 (Musaceae), 로사세에 (Rosaceae), 에리카세에 (Ericaceae), 악티니디아세에 (Actinidiaceae), 쿠쿠르비타세에 (Cucurbitaceae), 카리카세에 (Caricaceae) 및 로라세에 (Lauraceae)로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 과 (family)에 속하는 식물; 더욱 바람직하게 무사 (Musa), 프라가리아 (Fragaria), 말루스 (Malus), 프루누스 (Prunus), 피루스 (Pyrus), 바시늄 (Vaccinium), 악티니디아 (Actinidia), 쿠쿠미스 (Cucumis), 카리카 (Carica) 및 페르세아 (Persea)로 구성된 군으로부터 선택된 임의의 속 (genus)에 속하는 식물; 더욱 바람직하게 바나나, 딸기, 사과, 매실 (Prunus mume), 서양배 (Pyrus communis), 블루베리, 키위, 멜론, 파파야 (papaya) 및 아보카도로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 식물로부터 유래된다. 가장 바람직하게, 상기 알코올 아실트란스퍼라제가 과일 기원 가령 사과, 멜론 또는 토마토 기원, 적합하게 사과 기원으로부터 유래된다.
그 생물학적 조직 또는 가공된 산물, 예컨대 알코올 아실트란스퍼라제가 존재하는, 과실, 잎, 꽃잎, 줄기, 씨앗, 과피 (fruit skin), 과육 (sarcocarp) 등이 사용될 수 있다. 대안으로, 상기 생물학적 조직으로부터 추출된 조질 (crude) 효소액, 정제된 효소 등이 사용될 수 있다. 대안으로, 상기 알코올 아실트란스퍼라제에 대한 유전자가 단리되고, 숙주 미생물로 그 안에서 발현을 위해 도입될 수 있다.
메타크릴릴 CoA를 메타크릴산 에스테르로 전환하기 위한 알코올 아실트란스퍼라제의 사용이 WO2014/038214에 충분히 개시되었고, 이 개시내용, 구체적으로 알코올 아실트란스퍼라제 유전자 및 그 서열, 및 상기 서열을 포함하는 벡터 플라스미드가 참조로 본원에 포함된다.
부가의 공정 단계
선택적으로, 본 발명의 제1 및 제2 양태의 공정은 단계 (b)에서 형성된 임의의 메타크릴산을 메타크릴산 에스테르로 전환시키는 단계 (c)를 더 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 메타크릴산 에스테르는 알킬 메타크릴레이트, 더 바람직하게 저급 알킬 (C1-C20) 메타크릴레이트, 더 바람직하게 C1-C12 알킬 메타크릴레이트, 더욱 바람직하게 C1-C4 또는 C4-C12 알킬 메타크릴레이트이다. 가장 바람직하게, 상기 메타크릴산 에스테르는 부틸 메타크릴레이트이다.
상기 단계 (c)에서 형성된 메타크릴산 에스테르가 생물학적 또는 화학적으로 형성될 수 있고, 바람직하게 상기는 생물학적으로 형성된다.
선택적으로, 단계 (c)가 적합한 알코올에 의한 에스테르화 반응에 의해서 화학적으로 수행될 수 있다. 에스테르화가 수행되는 반응 조건은 상당히 가변될 수 있다. 상기 반응은 실온에서 매우 느리게 진행되지만, 높은 온도에서 상당히 빠르게 진행된다. 통상적으로 상기 반응물 중 하나가 상기 반응을 유도하기 위해서 화학양론적 과량 (stoichiometric excess)으로 사용된다. 다른 반응물이 그 후 한계 시약 (limiting reagent)으로 불린다. 상기 한계 시약, 예컨대, 산, 알코올 또는 폴리올의 약 99%가 수 분 안에 에스테르로 전환될 수 있다. 한계 시약은 통상적으로 화학양론적 과량으로 존재하지 않는 시약이고, 예컨대, 폴리올 에스테르를 제조하기 위해 사용된 한계 시약은 폴리올이다.
알코올 및 유기산의 에스테르화가 가역적 반응이기 때문에, 상기 에스테르화 반응은 통상 완료되지 않는다. 그러나, 99% 이상의 전환율이, 에스테르화 생성물 중 적어도 하나, 통상적으로 물을 제거함으로써 달성될 수 있다. 상기 생성물들 중 하나가 다른 것 및 상기 시약보다 더 낮은 온도에서 끓는다면, 이러한 제거는 통상적으로 증류에 의해 달성된다. 상기 반응 영역으로부터 생성된 물을 제거하기 위한 다양한 증류 기술이 당분야에 알려져 있다. 물을 제거하는 일 방법은 상기 반응의 각 성분들보다 더 낮은 끓는점을 갖는 공비혼합물 (azeotrope)을 형성할 수 있는 액체 매질에서 상기 반응을 수행하는 것을 포함한다. 상기 시약 및 결과의 에스테르가 대기압에서 100℃ 이상의 끓는점을 갖는다면, 상기 반응 온도가 물을 제거하도록 간단하게 조정될 수 있고, 물과 공비혼합물을 형성할 수 있는 액체 매질을 필요로 하지 않는다. 또한, 상기 반응 혼합물로부터 물의 증류를 돕기 위해서 엔트레이너 (entrainer)가 사용될 수 있다. 비활성 물질 가령 시클로헥산, 헥산, 벤젠, 톨루엔, 또는 크실렌이 에스테르의 제조에서 엔트레이너로 사용될 수 있다. 또한, 낮은 끓는점을 갖는 반응물이 또한 엔트레이너로 사용될 수 있다. 후자의 경우에, 상기 엔트레이너로 사용된 반응물이 통상적으로 상기 반응에서 필요로 하는 화학양론적 정량보다 과량으로 상기 반응 혼합물에 충전된다. 물 제거를 사용하는 것을 포함하는 에스테르화 공정이 작동의 배치 (batch) 또는 연속 모드로 수행될 수 있다. 다양한 에스테르화 방법이 Volume 9 of the Kirk-Othmer Encyclopaedia of Chemical Technology, Fourth Edition (1994), pp. 762-768에 개시되었고, 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
기존의 배치 에스테르화 과정은 반응 사이클의 초기에 반응물 모두를 상기 반응기 (reactor)로 충전시키는 단계를 포함한다. 촉매적 에스테르화 방법에서, 상기 촉매는 통상적으로 상기 배치가 표적 온도에 도달한 후에 상기 반응 혼합물로 첨가된다. 상기 반응 혼합물이 그 후 더 가열될 수 있다. 상기 반응 혼합물의 끓는점에 도달할 때까지, 사용되는 경우 엔트레이너 및 부산물인 물이 상기 반응 혼합물로부터 끓는 온도로, 상기 반응 혼합물의 온도를 올린다. 통상적으로, 상기 오버헤드 증기가 응축되고, 상기 물이 상기 엔트레이너로부터 분리되고, 상기 엔트레이너가 상기 반응 용기로 리사이클링된다. 상기 반응 온도, 및 그러므로 반응 속도가 상기 반응 혼합물의 끓는점에 의해 제한된다. 더 낮은 끓는점을 갖는 반응물이 또한 상기 엔트레이너로 사용될 때, 그 농도는 상기 반응이 진행될 때 점차로 감소된다. 또한, 상기 반응물의 농도가 상기 반응 동안 감소되고, 이는 상기 반응 속도에 부정적인 영향을 준다. 그러므로, 엔트레이너가 사용되거나 또는 사용되지 않는 것과 상관없이, 특별히 열 유입 (heat input)이 상기 반응 과정 동안 계속된다면, 상기 반응 온도, 및 그러므로 상기 반응에 일정한 속도는 상기 반응이 진행될 때 증가한다.
바람직하게 단계 (c)가 EC 그룹 넘버 EC 3.1.x.x.의 에스테르 결합과 관련하여 작용하는 에스테라제 또는 히드롤라제 효소의 작용에 의해 생물학적으로 수행되고, 더 바람직하게, 상기 효소는 EC 3.1.1.X에 속하고, 에스테르 결합의 절단 및 형성의 촉매화에 관여하는 히드롤라제 부류의 효소이다. 미생물의 에스테라제의 최신 리뷰는 하기와 같다: Int .J. Curr . Microbiol . App . Sci (2013) 2(7): 135-146.
바람직하게 상기 방법은 이소부티릴-CoA를 제조하는, 더 바람직하게 2-케토이소발레르산으로부터, 및/또는 이소부티르산으로부터 이소부티릴-CoA를 제조하는 하나 이상의 부가의 단계(들)을 더 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 2-케토이소발레르산으로부터 이소부티릴-CoA를 제조하는 하나 이상의 부가의 단계(들)을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 부가의 단계(들)은 하기의 어느 것이다:
바람직하게 상기 방법은 2-케토이소발레르산을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 단계를 더 포함한다. 더 바람직하게 2-케토이소발레르산이 이소부티릴-CoA로, 알파 서브유닛 성분, 리포아미드 아실트란스퍼라제 성분 및 리포아미드 데히드로게나제 성분으로 구성된 분지쇄 케토산 데히드로게나제 효소 복합체에 의해 전환된다. 가장 바람직하게, 상기 데히드로게나제가 하기 효소들 중 어느 것으로부터 선택된다: 피. 푸티다 (P. putida)로부터의 분지쇄 케토산 데히드로게나제 (BCKD), 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)로부터의 BCKD, 피. 에우루기노사 (P. aeuruginosa)로부터의 BCKD, 에이. 탈리아나로부터의 BCKD, 스트렙토미세스 코엘리 콜라 (Streptomyces coelicolor)로부터의 BCKD 및 터무스 터모필루스 (Thermus thermophilus)로부터의 BCKD.
대안으로, 상기 2-케토이소발레르산의 이소부티릴-CoA로의 전환이 옥시도레덕타제 효소, 적합하게 EC 그룹 1.X.X.X, 바람직하게 공여체의 알데히드 또는 옥소기에 작용하는 옥시도레덕타제, 적합하게 EC 그룹 1.2.X.X, 더 바람직하게 공여체의 알데히드 또는 옥소기에 작용하는 옥시도레덕타제 효소에 의해서, 전자 수용체로서 철-황 단백질, 적합하게 EC 그룹 1.2.7.X, 가장 바람직하게 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제 (ketoisovalerate ferredoxin reductase) (또한 케토발린 페레독신 옥시도레덕타제로 알려짐), 적합하게 EC 그룹 넘버 1.2.7.7을 사용하여 촉매화될 수 있고, 이는 알파, 베타, 감마 및 델타 서브유닛으로 구성된 테트라머이다. 이러한 효소의 예로는 피로코쿠스 푸리오시스 (Pyrococcus furiosis)로부터의 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제; 피로코쿠스 종 ( Pyrococcus sp .)으로부터의 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제; 터모코쿠스 종 (Thermococcus sp)으로부터의 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제; 터모코쿠스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis)로부터의 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제; 터모코쿠스 프로푼두스 (Thermococcus profundus)로부터의 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제 및 메타노박테리움 터모오토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum)으로부터의 2-케토이소발레레이트 페레독신 레덕타제이다.
제2 구현예에서, 상기 방법은 이소부티르산으로부터 이소부티릴-CoA를 생성하는 하나 이상의 부가의 단계(들)을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 부가의 단계(들)은 하기의 어느 것이다:
바람직하게 상기 방법은 이소부티르산을 이소부티릴-CoA로 전환시키는 단계를 더 포함한다.
선택적으로, 이소부티르산이 이소부티릴-CoA로, 리가제 효소, 적합하게 EC 그룹 넘버 6.X.X.X, 바람직하게 EC 그룹 6.2.X.X의 탄소-황 결합을 형성하는 리가제, 더 바람직하게 EC 그룹 6.2.1.X의 산-티올을 형성하는 리가제, 더 바람직하게 GDP-형성, ADP 형성 또는 AMP 형성 리가제, 가령 AMP 형성 아세테이트-CoA 리가제, 적합하게 EC 그룹 6.2.1.1, 부티레이트-CoA 리가제, 적합하게 EC 그룹 6.2.1.2, 카르복실산-CoA 리가제, 적합하게 EC 그룹 6.2.1.10, ADP 형성 아세테이트-CoA 리가제, 적합하게 EC 그룹 6.2.1.13, 프로피오네이트-CoA 리가제, 적합하게 EC 그룹 6.2.1.17 또는 EC 그룹 6.2.1.-의 산-티올 리가제의 작용에 의해 전환된다. 가장 바람직하게 상기 리가제가 하기 효소 중 어느 것으로부터 선택된다: 슈도모나스 클 로로라피스 (Pseudomonas chlororaphis)로부터의 AcsA, 페실로미세스 바리오티 (Paecilomyces varioti)로부터의 부티릴-CoA 신테타제, 소 심장 미토콘트리아 (bovine heart mitochondria)로부터의 부티릴-CoA 신테타제.
제3 구현예에서, 상기 방법은 이소부티레이트로부터 이소부티릴-CoA를 제조하는 하나 이상의 부가의 단계(들)을 더 포함하고, 상기 하나 이상의 단계(들)은 하기의 어느 것이다:
바람직하게 상기 방법은 이소부티레이트를 이소부티릴-포스페이트로 전환시키는 단계, 및 이소부티릴-포스페이트를 이소부티릴-CoA로 전환시키는 단계를 더 포함한다.
바람직하게 상기 이소부티레이트가 이소부티릴-포스페이트로, 키나제 효소, 적합하게 EC 그룹 넘버 EC 2.X.X.X, 바람직하게 EC 2.7.X.X, 더 바람직하게 EC 그룹 넘버 EC 2.7.2.X, 가장 바람직하게 아세테이트 키나제, 적합하게 EC 그룹 2.7.2.1, EC 2.7.2.6의 포르메이트 키나제, EC 2.7.2.7의 부티레이트 키나제, EC 2.7.2.14의 분지쇄 지방산 키나제 또는 EC 2.7.2.15의 프로피오네이트 키나제에 의해 전환된다. 가장 바람직하게 상기 키나제가 하기 효소 중 어느 것으로부터 선택된다: 스피로헤테 MA-2로부터의 분지쇄 지방산 키나제, 시. 부티리쿰 (C. butyricum)으로부터의 부티레이트 키나제.
바람직하게 상기 이소부티릴-포스페이트가 이소부티릴-CoA로, EC 그룹 넘버 2.X.X.X의 트란스퍼라제 효소의 작용에 의해, 더 바람직하게 EC 그룹 넘버 2.3.X.X의 아실트란스퍼라제의 작용에 의해, 더욱 바람직하게 EC 그룹 넘버 2.3.1.X의, 아미노-아실기 이외의 기를 전달하는 아실트란스퍼라제, 더욱 바람직하게 각각 EC 그룹 넘버 2.3.1.8 및 2.3.1.19의 포스페이트 아세틸트란스퍼라제 또는 포스페이트 부티릴트란스퍼라제의 작용에 의해 전환된다. 더 바람직하게 상기 트란스퍼라제는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터의 포스페이트 부티릴트란스퍼라제 또는 바실루스 서브틸리스, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) ATCC13032, 터모토가 마리티마 및 클로스트리디움 클루이베리로부터의 포스페이트 아세틸트란스퍼라제이다. 상기 효소의 다른 공급원은 다른 혐기성 박테리아, 구체적으로 클로스트리디움 종 가령 클로스트리디움 파스테우리아눔 또는 클 로스트리디움 베이제린키이를 포함한다.
가장 바람직하게 상기 방법은 이소부티르산으로부터 이소부티릴-CoA를, 신테타제 효소, 바람직하게 이소부티릴-CoA 신테타제, 가장 바람직하게 피. 클로라피스 (P. chloraphis) B23으로부터의 이소부티릴-CoA 신테타제 (AcsA)의 작용에 의해, 제조하는 단계를 더 포함한다.
선택적으로, 상기 제1 및/또는 제2 및/또는 제3 구현예와 관련된 전술한 부가의 공정 단계들 중 어느 것이 조합될 수 있다.
미생물
상기 방법의 효소들이 하나 이상의 미생물 (들)내에 포함될 수 있거나, 또는 미생물 없이 존재할 수 있고, 예를 들면 반응 용기 내 또는 컬럼에 보유된 무-세포 (cell-free) 추출물 또는 정제된 효소로 존재할 수 있다.
바람직하게 상기 방법의 생물학적 전환이 하나 이상의 숙주 미생물(들)에서 수행된다. 더 바람직하게 생물학적 전환을 수행하기 위한 하나 이상의 효소가 하나 이상의 미생물(들) 내에 포함된다.
바람직하게 상기 하나 이상의 미생물(들)은 관련 단계(들)을 촉매화하기 위해 필요한 하나 이상의 효소들을 발현시킨다. 더 바람직하게, 상기 관련 단계(들) 및 임의의 부가의 효소적 단계가 상기 하나 이상의 미생물(들) 내에서 인 비보로 수행된다.
본 발명의 제4 양태에 따르면, 상기 제1, 제2 또는 제3 양태의 어느 방법에 따라 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 제조하는데 사용하기 위한 미생물이 제공된다.
상기 하나 이상의 미생물(들)은 하나 이상의 효소를 자연적으로 발현시킬 수 있거나, 또는 하나 이상의 효소들을 발현시키기 위해 유전적으로 조작될 수 있거나, 또는 야생형 또는 유전자 조작된 효소들의 조합을 발현시킬 수 있다. 이러한 유전자 조작된 생물체가 제조합 생물체로 개시될 수 있다.
상기 하나 이상의 미생물(들)이 상기 하나 이상의 효소들을 내인성으로 또는 이종으로, 또는 내인성 및 이종성 효소들의 조합을 발현시킬 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 '재조합 생물체 (recombinant organism)'는 상기 생물체로 인공적으로 제작되거나 또는 삽입되는 유전 물질을 포함하는 유전적으로 변형된 또는 조작된 생물체를 의미한다. 상기 유전 물질은 유전적으로 더 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있는 내인성 또는 이종 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 문맥에서, 용어 '내인성 (endogenous)'은 생물체의 동일한 종으로부터 유래되는 것을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 용어 '이종성 (heterologous)'은 생물체의 다른 종으로부터 유래된 것을 의미한다.
본 발명의 문맥에서, 미생물과 관련하여 사용되는 용어 '적응된 (adapted)'은 전술한 바와 같이 유전적으로 변형된 또는 조작된 생물체, 또는 생물체의 변이체 균주를 의미하고, 이는 예를 들면, 하나 이상의 효소를 자연적으로 발현시키는 것이 기반하여 선택된다.
상기 방법, 전술한 바와 같이 유전적으로 조작된 또는 변형된 방법의 어느 것에 사용되는 미생물(들)이 자연-발생하는 야생형 또는 비-자연 발생하는 재조합 미생물(들), 예를 들면 박테리아, 고세균 (archaea), 효모 (yeast), 진균 (fungus), 조류 (algae) 또는 발효 공정에 적용가능한 다양한 다른 미생물(들)의 변종 (variety) 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 제5 양태에 따르면, 메타크릴산을 제조하는 방법에 사용하기 위한 재조합 미생물이 제공되고, 상기 미생물은 하기 단계를 수행하도록 적응된다:
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로, 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 생물학적으로 전환시키는 단계로서, 상기 재조합 미생물은 에스케리치아 콜리인 것인 단계.
본 발명의 제6 양태에 따르면, 메타크릴산을 제조하는 방법에 사용하기 위한 미생물이 제공되고, 상기 미생물은 하기 단계를 수행하기 위해 하나 이상의 이종의 핵산에 의해 변형된다:
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 생물학적으로 전환시키는 단계.
본 발명의 제7 양태에 따르면, 하기 단계를 수행하도록 된 미생물이 제공된다:
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로, 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 및/또는 그 유도체로 생물학적으로 전환시키는 단계.
본 발명의 제8 양태에 따르면, 하기 단계를 수행하도록 된 미생물이 제공된다:
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로, 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT), 트란스퍼라제, 신테타제, 및/또는 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계.
본 발명의 부가의 양태에 따르면, 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT), 트란스퍼라제, 신테타제, 및/또는 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제의 발현에 의해, 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 전환시키도록 된 미생물이 제공된다.
본 발명의 부가의 양태에 따르면, 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 전환시키는 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산에 의해 변형된 미생물이 제공된다.
본 발명의 부가의 양태에 따르면, 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 에스테르로 전환시키는 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 재조합 핵산에 의해 변형된 미생물이 제공된다.
본 발명의 부가의 양태에 따르면, 부가의 양태에 따른 하나 이상의 효소(들)를 사용하는 메타크릴산을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 부가의 양태에 따르면, 부가의 양태에 따른 하나 이상의 효소(들)를 사용하는 메타크릴산 에스테르를 제조하는 방법이 제공된다.
상기 제1, 제2, 또는 제3 양태의 방법의 부가의 바람직한 특징이 상기에 정의된 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태의 미생물과 임의로 조합하여 조합될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 미생물(들)은 적어도 하기 효소들을 발현시킨다:
(a) (i) 아실-CoA 옥시다제; 및/또는
(ii) CoA 데히드로게나제; 및 임의로 (optionally) 하기의 하나 이상
(b) (i) 아실-CoA 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT); 및/또는
(ii) 아실-CoA 트란스퍼라제; 및/또는
(iii) 아실-CoA 신테타제; 및/또는
(iv) 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제; 및 임의로
(v) 알코올 아실트란스퍼라제.
일 구현예에서, 상기 미생물(들)은 적어도 하기 효소들을 발현시킨다:
(a) (i) 아실-CoA 옥시다제; 및 임의로 하기의 하나 이상
(b) (i) 아실-CoA 티오에스테라제; 및/또는
(ii) 아실-CoA 트란스퍼라제; 및/또는
(iii) 아실-CoA 신테타제; 및/또는
(iv) 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제; 및 임의로
(v) 알코올 아실트란스퍼라제.
상기 제4, 제5 또는 제8 양태의 일 구현예에서, 상기 미생물(들)은 적어도 하기 효소들을 발현시킨다:
(a) (i) 아실-CoA 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT); 및/또는
(ii) 아실-CoA 트란스퍼라제; 및/또는
(iii) 아실-CoA 신테타제; 및/또는
(iv) 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제; 및 임의로 하기의 하나 이상:
(b) (i) 아실-CoA 옥시다제; 및/또는
(ii) 아실-CoA 데히드로게나제; 및 더 임의로
(c) (i) 알코올 아실트란스퍼라제.
바람직하게, 존재하는 경우, 상기 CoA 데히드로게나제는 상보적 전자 전달 시스템을 수반한다.
바람직한 구현예에서, 상기 미생물(들)은 하기 효소들 중 적어도 하나를 발현시킨다:
(a) 아실-CoA 옥시다제, 가령 ACX4; 및
(b) 아실-CoA 티오에스테라제, 가령 4HBT.
더 바람직한 구현예에서, 상기 미생물(들)은 하기 효소들 중 적어도 하나를 발현시킨다:
(a) ACX4, 적합하게 에이. 탈리아나로부터의 ACX4; 및
(b) 4HBT, 적합하게 아트로박터 종으로부터의 4HBT.
일부 구현예에서, 상기 미생물이 하기 단계를 수행하도록 적응된다:
(a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로, 아실-CoA 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
(b) 메타크릴릴-CoA를 C1 내지 C20 메타크릴산 에스테르, 적합하게 C1 내지 C12 메타크릴산 에스테르, 가령 C1 내지 C4 또는 C4 내지 C12 메타크릴산 에스테르로, 알코올 아실트란스퍼라제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계.
바람직하게, 상기 메타크릴산 에스테르는 C1 내지 C20 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게 C1 내지 C12 메타크릴산 에스테르, 더욱 바람직하게 C1 내지 C4 또는 C4 내지 C12 메타크릴산 에스테르, 가장 바람직하게 부틸 메타크릴레이트이다.
상기 구현예에서, 상기 미생물은 에스케리치아 콜리일 수 있고 및/또는 상기 아실-CoA 옥시다제는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4이고 및/또는 상기 알코올 아실트란스퍼라제가 본원에 개시된 바와 같은 식물 기원, 예를 들면 과일 가령 사과로부터 유래되고 및/또는 상기 미생물은 재조합 미생물이다. 바람직하게 상기 미생물은 에스케리치아 콜리일 수 있고, 상기 아실-CoA 옥시다제는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4일 수 있고, 상기 알코올 아실트란스퍼라제가 사과, 멜론 또는 토마토 기원으로부터 유래될 수 있고, 및 상기 미생물은 재조합 생물체일 수 있다.
바람직하게 상기 미생물(들)은 상기 바람직한 또는 일부 구현예들의 상기 효소 (a) 및 (b)의 둘 다를 발현시킨다.
바람직하게 상기 미생물(들)은 하기 효소들의 하나 이상을 더 발현시킨다: 분지쇄 케토 산 데히드로게나제 효소 또는 ADP 형성, GDP 형성, 또는 AMP 형성 아실-CoA 신테타제/신타제/리가제; 또는 단쇄 지방산 키나제 및 포스포트란스아실라제.
더 바람직하게 상기 미생물(들)은 하나 이상의 하기 효소들을 더 발현시킨다: 2-케토이소발레레이트 데히드로게나제, 이소부티레이트-CoA 리가제, ADP 형성, GDP 형성 또는 AMP 형성 아실-CoA 신테타제/신타제/리가제, 또는 단쇄 지방산 키나제 및 포스포트란스아실라제.
가장 바람직하게, 상기 미생물(들)은 이소부티릴-CoA 신테타제, 구체적으로 슈도모나스 클로라피스, 구체적으로 슈도모나스 클로라피스 B23으로부터의 AcsA를 더 발현시킨다.
상기 제4, 제6, 제7, 제8 및 부가의 양태와 관련하여, 바람직하게 상기 숙주 미생물(들)은 박테리아이고, 적합한 박테리아의 예는 하기를 포함한다: 속 에스케리치아 (Escherichia), 엔테로박터 ( Enterobacter ), 판토에 ( Pantoea ), 클레브시엘라 ( Klebsiella ), 세라티아 (Serratia), 어위니아 ( Erwinia ), 살모넬라 (Salmonella), 모르가넬라 (Morganella) 등의 프로테오박테리아 (proteobacteria)에 속하는 엔테로박테리아 (enterobacteria), 속 브레비박테리움 (Brevibacterium), 코리네박테리움 또는 미크로박테리움 ( Microbacterium )에 속하는 소위 코리네형 (coryneform) 박테리아, 및 속 알리시클로바실루스 (Alicyclobacillus), 바실루스 (Bacillus), 히드로게노박터 ( Hydrogenobacter ), 메 타노코쿠스 (Methanococcus), 아세토박터 ( Acetobacter ), 아시네토박터 ( Acinetobacter ), 아그 로박테리움 (Agrobacterium), 악소르히조비움 ( Axorhizobium ), 아조토박터 (Azotobacter), 아나플라스마 ( Anaplasma ), 박테로이데스 ( Bacteroides ), 바르토넬 라 ( Bartonella ), 보르데텔라 ( Bordetella ), 보렐리아 ( Borrelia ), 브루셀라 (Brucella), 부르크홀데리아 ( Burkholderia ), 칼림마토박테리움 (Calymmatobacterium), 캄필로박터 ( Campylobacter ), 클라미디아 ( Chlamydia ), 클 라미도필라 (Chlamydophila), 클로스트리디움 , 콕시엘라 ( Coxiella ), 에를리치아 (Ehrlichia), 엔테로코쿠스 ( Enterococcus ), 프란시셀라 ( Francisella ), 푸소박테 리움 (Fusobacterium), 가르드네렐라 ( Gardnerella ), 헤모 필루스 ( Haemophilus ), 헬리코박터 (Helicobacter), 켈브시엘라 ( Kelbsiella ), 메타노박테리움 , 미크로코쿠스 ( Micrococcus ), 모락셀라 ( Moraxella ), 미코박테리움 (Mycobacterium), 미코플라스마 (Mycoplasma), 네이세리아 ( Neisseria ), 파스테우렐라 ( Pasteurella ), 펩 토스트렙토코쿠스 ( Peptostreptococcus ), 포르피로모나스 ( Porphyromonas ), 프레보 텔라 ( Prevotella ), 슈도모나스, 리조비움 ( Rhizobium ), 리케치아 (Rickettsia), 로칼리마에 (Rochalimaea), 로티아 ( Rothia ), 시겔라 (Shigella), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 스테노트로포모나스 ( Stenotrophomonas ), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 트레포네마 ( Treponema ), 비브리오 ( Vibrio ), 볼바치아 ( Wolbachia ), 여시니아 ( Yersinia ) 등에 속하는 박테리아.
예시되는 박테리아는 에스케리치아 콜리 , 클레브시엘라 옥시토카 , 아내로비 오스피릴룸 숙시니시프로두센스 ( Anaerobiospirillum succiniciproducens ), 악티노바실루스 숙시노게네스 ( Actinobacillus succinogenes ), 만하이미아 숙시니시프로두센스 ( Mannheimia succiniciproducens ), 리조비움 에틀리 , 바실루스 서브틸리스 , 코리네박테리움 글루타미쿰 , 글루코노박터 옥시단스 ( Gluconobacter oxydans ), 지 모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis ), 락토코쿠스 락티스 ( Lactococcus lactis), 락토바실루스 플란타룸 , 스트렙토미세스 코엘리콜라 , 클로스트리디움 아 세토부틸리쿰, 슈도모나스 플루오레센스 , 히드로게노박터 터모필루스 , 메타노코쿠스 잔나쉬이 및 슈도모나스 푸티다로부터 선택되는 종을 포함한다.
상기 제4, 제6, 제7, 제8 및 부가의 양태와 관련하여, 바람직하게 상기 박테리움은 에스케리치아 콜리이다.
예시되는 효모 또는 진균은 속 사카로미세스 (Saccharomyces), 쉬조사카로미 세스 ( Schizosaccharomyces ), 칸디다 ( Candida ), 클루이베로미세스 (Kluyveromyces), 아스페르길루스 ( Aspergillus ), 피치아 ( Pichia ), 크리트포코쿠 스 ( Crytpococcus ) 등에 속하는 것을 포함한다. 예시되는 효모 또는 진균 종은 사카로미세스 세레비지에 , 쉬조사카로미세스 폼베 , 클루이베로미세스 락티스 , 클루이 베로미세스 마르시아누스 , 아스페르길루스 테루스 , 아스페르길루스 니거 , 피치아 파스토리스 등으로부터 선택된 것을 포함한다.
상기 제4, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태의 어느 것의 하나 이상의 미생물(들)이 상기 본래 또는 유전 조작된 효소의 활성을 향상 또는 감소시키도록 유전적으로 변형될 수 있다.
바람직하게 상기 미생물(들)이 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생성을 향상시키도록 유전자 조작된다.
메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생성을 향상시키는 것은 당분야에 알려져 있는 다양한 유전자 조작 기술의 사용에 의해 기존의 세포성 대사 과정, 핵산 및/또는 단백질로 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생성을 향상시키는 것은 또한 미생물(들)에서 하나 이상의 이종 유전자를 발현시키도록 상기 미생물(들)을 변형시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기는 탄소 기반 공급원료로부터 메타크릴산으로의 원하는 경로의 효소를 코딩하는 유전자, 가령 본원에 개시된 것을 포함할 수 있거나, 또는 하기에 상세하게 토의되는 바와 같이 직접 또는 간접적인 경로에서 상기 효소의 기능화 및 발현을 촉진하도록 작용하는 다른 보조 유전자를 포함할 수 있다.
따라서, 상기 미생물(들)이 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생성을 위해 하나 이상의 유전자를 발현하도록 변형될 수 있고, 바람직하게, 상기 미생물(들)이 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생성을 향상시키도록 더 변형된다.
메타크릴산 및/또는 그 유도체를 생성하도록 변형된 상기 미생물(들) 내에서 발현될 수 있는 하나 이상의 유전자(들)은 하기 효소들 중 어느 것을 코딩하는 것을 포함한다: 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4, 아트로박터 니코티아네로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제, 비그나 라디아타로부터의 퍼옥시솜 아실-CoA 옥시다제, 칸디다 트로피칼리스로부터의 아실-CoA 옥시다제 4, 칸디다 종으로부터의 아실-CoA 옥시다제 및 넓은 기질 범위를 갖는 관련된 옥시다제, 아트로박터 종 (Arthrobacter sp)으로부터의 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제, 에스케리치아 콜리로부터의 YciA, 헤모필루스 인플루엔제로부터의 YciA, 에스케리치아 콜리로부터의 TesA, 에스케리치아 콜리로부터의 TesB, 아트로박터 글로비포르미스로부터의 4HBT, 슈도모나스 종 균주 CBS-3으로부터의 4HBT, 에스케리치아 콜리로부터의 EntH, 클로스트리디움 종 SB4로부터의 부티릴-CoA 아세토아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 클로스트리디움 스티클란디이로부터의 부티릴-CoA 아세토아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터의 부티레이트-아세토아세테이트 CoA-트란스퍼라제, 에스케리치아 콜리의 아세테이트 코엔자임 A 트란스퍼라제 ydiF, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터의 포스포트란스부티릴라제, 스피로헤테 MA-2로부터의 분지쇄 지방산 키나제, 터모토가 마리티마로부터의 부티레이트 키나제, 클로스트리디움 부티리쿰으로부터의 부티레이트 키나제, 슈도 모나스 푸티다로부터의 분지쇄 아실-CoA 데히드로게나제, 호모 사피엔스로부터의 이소부티릴-CoA 데히드로게나제, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 이소발레릴-CoA 데히드로게나제, 에이취 . 사피엔스로부터의 전자 이동 플라보단백질, 수스 스크로파로부터의 전자 이동 플라보단백질, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 전자 이동 플라보단백질, 슈도모나스 푸티다로부터의 전자 이동 플라보단백질, 파라코쿠스 데니트리피칸스로부터의 전자 이동 플라보단백질, 에이취 . 사피엔스로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제, 수스 스크로파로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제, 슈도모나스 푸티다로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제, 로도박터 스페로이데스로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제, 파라코쿠스 데니트리피칸스로부터의 전자 이동 플라보단백질 유비퀴논 옥시도레덕타제.
메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생성을 향상시키도록 변형된 상기 미생물(들)내에서 발현될 수 있는 하나 이상의 유전자(들)은 하기 효소들 중 어느 것을 코딩하는 것을 포함한다: 슈도모나스 클로로라피스로부터의 AcsA; 바실루스 서브틸리스로부터의 bkdA1, bkdA2, bkdB 및 lpdV , 슈도모나스 푸티다로부터의 bkdA1, bkdA2, bkdB 및 lpdV; 바실루스 서브틸리스로부터의 alsS, 에스케리치아 콜리로부터의 ilvD, 에스케리치아 콜리로부터의 ilvC, 에스케리치아 콜리로부터의 ilvB, 에스케 리치아 콜리로부터의 ilvN, 에스케리치아 콜리로부터의 ilvI , 에스케리치아 콜리로부터의 ilvG, 에스케리치아 콜리로부터의 ilvM, 에스케리치아 콜리로부터의 ilvH 및 G14D 및 S17F 돌연변이를 갖는 에스케리치아 콜리로부터의 ilvH, S34G, L48E 및 R49F 돌연변이를 갖고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰 R로부터의 ilvC, 코리네박테리움 R로부터의 ilvB 및 ilvN 및 G156E 돌연변이를 갖고 있는 코리네박테리움 R로부터의 ilvN 뿐만 아니라, 적절한 경우, 효소의 피드백 저해를 완화시키고 및 보조인자 의존성을 변경하도록 전술한 바와 같은 유사한 돌연변이를 갖는 다른 생물체로부터의 동종체.
본 발명은, 전술한 생합성 경로에서 동일한 기질 및/또는 중간체를 경쟁시킴으로써 메타크릴산 및/또는 그 유도체 이외의 화합물의 합성을 촉매화하는 효소의 활성을 감소 또는 제거하는 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 효소의 예로는 에 스케리치아 콜리로부터의 YciA, TesA, TesB, 및 에스케리치아 콜리에서 fadB, ilvA, panB, leuA, ygaZ, ygaH, aceF, aceE, lpdA, tpiA, pfkA, pfkB, mdh, poxB, ilvE, ldhA 및 lldD에 의해 코딩된 것, 뿐만 아니라 본원에 개시된 바와 같은 다른 숙주 균주에서 동종체를 포함한다.
본 발명은 전술한 생합성 경로에서 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 대사작용하거나 (metabolise) 또는 중간체를 대사작용하는 효소의 활성을 감소 또는 제거하는 변형을 더 포함할 수 있다. 대사작용과 관련된 이러한 효소의 예로는 이. 콜 리 (E. coli)에서 네이티브 (native) 발린 분해 경로의 효소, 또는 상기 조작된 경로의 티오에스테르 중간체를 소비할 수 있는 다른 티오에스테라제이다.
본 발명은 전술한 생합성 경로에서 중간체를 제거하는 다른 세포 기능에 관여하는 단백질의 활성을 감소 또는 제거하는 변형을 더 포함할 수 있다. 이러한 세포 기능의 예로는 액포 저장 (vacuolar storage) (예컨대, 효모에서) 또는 대사산물을 저장할 수 있는 다른 세포내 바디 (예컨대 박테리아성 미세구획), 대사산물을 내보낼 수 있는 트란스멤브레인 (transmembrane) 펌프 또는 포린 (porins)과 같은 박테리아 세포주변질 (periplasm) 또는 전달 기전을 포함할 수 있다.
단백질, 구체적으로 본 발명에 따른 미생물(들)에서 발현된 효소들을 코딩하는 유전자에 대한 핵산의 공급원은 예를들면 상기 코딩된 유전자 산물이 언급된 반응을 촉매화할 수 있는 임의의 종을 포함할 수 있다. 이러한 종은 원핵 및 진핵 생물체를 포함하고, 이는 하기에 한정되는 것은 아니지만, 고세균 및 유박테리아 (eubacteria)를 포함하는 박테리아, 및 효모, 식물, 곤충, 동물 및 사람을 포함하는 포유류를 포함하는 진핵생물 (eukaryotes)을 포함한다. 이러한 공급원에 대한 예시되는 종은, 예를 들면, 에스케리치아 콜리 , 호모 사피엔스, 프로피오니박테리움 프레덴레이치이 ( Propionibacterium fredenreichii ), 메틸로박테리움 엑스토 르쿠엔스 ( methyobacterium extorquens ), 시겔라 플렉스네리 , 살모넬라 엔테리카 , 여시니아 프레데리크세니이 , 프로피오니박테리움 아크네스, 라투스 노르베지쿠스 , 케노르하브디티스 엘레간스 , 바실루스 세레우스, 아시네토박터 칼코아세티쿠스 , 아시네토박터 바일리이 , 아시네토박터 종, 클로스트리디움 클루이베리 , 슈도모나스 종, 서무스 터모필루스 , 슈도모나스 에루기노사 , 슈도모나스 푸티다 , 오릭톨라구스 쿠니쿨루스 , 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 , 레우코노스톡 메센테로이데스 , 유박테 리움 바르케리 , 박테로이데스 카필로수스 , 아네로트룬쿠스 콜리호미니스 , 나트라나에로비우스 터모필루스 , 캄필로박터 제주니, 아라비돕시스 탈리아나 , 코리네박테리움 글루타미쿰 , 수스 스크로파 , 바실루스 서브틸루스 , 슈도모나스 플루오레센스 , 세라티아 마르세센스 , 스트렙토미세스 코엘리콜라 , 메틸리비움 페트롤레이필 룸, 스트렙토미세스 신나모넨시스 , 스트렙토미세스 아베르미틸리스 , 아르케오글로부스 풀지두스 , 할로아르쿨라 마리스모르투이 , 피로바쿨룸 에로필룸 , 사카로미세스 세레비 지에, 클로스트리디움 코클레아리움 , 클로스트리디움 테타노모르품 , 클로스 트리디움 테타니 , 시트로박터 아말로나티쿠스 , 랄스토니아 유트로파 , 무스 무스쿨 루스, 보스 타우루스 , 푸소박테리움 뉴클레아툼 , 모르가넬라 모르가니이 , 클로스트 리디움 파스테리아눔, 로도박터 스페로이데스 , 크산토박터 오토트로피쿠스 , 클로스트리디 움 프로피오니쿰 , 메가스페라 엘스데니이 , 아스페르길루스 테레우스 , 칸디다, 술폴 로부스 토코다이이 , 메탈로스페라 세듈라 , 클로로플렉수스 아우란티아쿠스 , 클로스트리디움 사카로페르부틸아세토니쿰 , 아시다미노코쿠스 페르멘탄스 , 헬리코박터 피 롤리, 뿐만 아니라 본원에 개시되거나 또는 해당하는 유전자에 대한 출처 생물체로서 이용가능한 다른 예시되는 종을 포함한다.
본 발명의 미생물(들)에서 발현될 수 있는 효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 또한 상기 효소의 변이체를 코딩하는 유전자, 예를 들어, 상기 폴리펩티드 서열에서 하나 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하는 변이체 효소를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 비변형된 (unmodified) 효소의 활성을 보유한다. 이러한 변이체 효소는 또한 비변형된 효소와 비교하여 감소된 효소 활성을 갖는 변이체 효소 및 변형된 알로스테릭 조절 (allosteric control)을 갖는 효소, 예를 들면 G14D 및 S17F 돌연변이를 갖는 에스케리치아 콜리로부터의 ilvH, S34G, L48E 및 R49F 돌연변이를 갖고 있는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 ilvC, 코리네박테리움 R로부터의 ilvB 및 ilvN, 및 G156E 돌연변이를 갖고 있는 코 리네박테리움 R로부터의 ilvN을 포함한다.
비-천연으로 발생하는 메타크릴산을 생성하는 미생물에서 단백질의 발현을 제작 및 테스트하는 방법이 예를 들면 당분야에 잘 알려져 있는 재조합 기술 및 검출 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1999)에 개시된 것으로부터 찾을 수 있다.
메타크릴산 및/또는 그 유도체 또는 그 형성에서의 중간체의 생성에 대한 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열이, 이에 한정되는 것은 아니지만, 콘쥬게이션, 전기천공, 화학적 형질전환, 형질도입, 형질감염 및 초음파 형질전환을 포함하는, 당분야에 잘 알려져 있는 기술을 사용하여 미생물 세포로 안정하게 또는 일시적으로 도입될 수 있다.
형질전환 방법의 예로는 수용체 (recipient) 미생물(들) 세포를 칼슘 클로리드로 처리하여 DNA의 투과성을 증가시키고, 성장 단계에 있는 세포로부터 수용성 세포 (competent cells)를 제조하고, 그 후 DNA로 형질전환시키는 단계를 포함할 수 있다. 대안으로, DNA-수용체 세포를 재조합 DNA를 쉽게 받아들일 수 있는 원형질체 (protoplasts) 또는 스페로플라스트 (spheroplasts)로 제조하고, 그 후 상기 재조합 DNA를, 바실루스 서브틸리스, 악티노미세테스 (actinomycetes) 및 효모로 적용가능하다고 알려져 있는 세포로 도입시키는 방법이 또한 사용될 수 있다. 또한, 미생물의 형질전환이 전기천공에 의해 또한 수행될 수 있다. 이러한 방법은 당분야에 잘 알려져 있다.
이. 콜리 또는 다른 원핵 미생물 세포에서 외인성 발현을 위해서, 진핵세포 핵산의 유전자 또는 cDNAs에서 일부 핵산 서열은 표적 시그날, 가령 N-말단 미토콘드리아성 또는 다른 표적 시그날을 코딩할 수 있고, 이는 원한다면 원핵 미생물 세포로 형질전환되기 전에 제거될 수 있다. 예를 들면, 미토콘드리아성 선두 서열 (mitochondrial leader sequence)의 제거는 이. 콜리에서 발현을 증가시킬 수 있다 (Hoffmeister et al., J. Biol. Chem. 280:4329-4338 (2005). 효모 또는 다른 진핵 미생물 세포에서 외인성 발현을 위해서, 유전자가 선두 서열의 부가 없이 시토졸 (cytosol)에서 발현될 수 있거나, 또는 미토콘드리아 또는 다른 세포기관 (organelles)에 표적화될 수 있거나, 또는 표적 세포기관에 대해 적합한 미토콘드리아성 표적화 또는 분비 시그날과 같은 적합한 표적화 서열의 부가에 의해서 분비에 대해 표적화된다. 그러므로, 표적화 서열을 제거 또는 포함하도록 핵산 서열에 대한 적합한 변형이 목적하는 특성을 부여하기 위해서 외인성 핵산 서열로 포함될 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 유전자가 당분야에 잘 알려져 있는 기술에 의해서 코돈 최적화되어서 상기 미생물(들)내에서 단백질의 최적화된 발현을 달성할 수 있다.
발현 벡터 또는 벡터들이 미생물(들)에서 기능하는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 본원에서 예시되는 바와 같은 하나 이상의 생합성 경로 효소(들)를 코딩하는 핵산을 포함하도록 제작될 수 있다. 본 발명의 미생물(들)에 사용하기 위해 적용가능한 발현 벡터는 예를 들면, 플라스미드, 코스미드 (cosmids), 파지 벡터 (phage vectors), 바이러스 벡터, 에피솜 (episomes) 및 인공 크로모좀을 포함하고, 숙주 크로모좀으로 안정한 통합을 위해 작동하는 벡터 및 선택 서열 또는 마커를 포함한다.
또한, 상기 발현 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자 및 적합한 발현 조절 서열을 포함할 수 있다. 선택가능한 마커 유전자는 또한 예를 들면 항생제 또는 독소에 내성을 제공하고, 영양요구성 결핍을 보완하거나, 또는 배양 배지에 없는 중요 영양분을 공급하는 것을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은, 당분야에 잘 알려져 있는, 구조성, 유도성 또는 억제성 프로모터, 전사 인헨서, 전사 종결인자, 번역 시그날 등을 포함할 수 있다. 둘 이상의 외인성 코딩 핵산 서열이 동시-발현되는 경우, 두 핵산 서열이 예를 들면 단일 발현 벡터 또는 개별 발현 벡터로 삽입될 수 있다. 단일 벡터 발현에 있어서, 상기 코딩 핵산이 하나의 공통 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있거나 또는 다른 발현 조절 서열, 가령 유도성 프로모터 및 구조성 프로모터에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 다수 유전자 또는 오페론 (operons)의 동시-발현을 위해서 둘 이상의 프로모터를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유전자/오페론이 하나 이상의 해당하는 프로모터를 갖는 하나 이상의 상이한 벡터에서 발현될 수 있다.
형질전환을 위해 사용되는 벡터는 미생물(들)의 세포에서 자체적으로 복제가능한 벡터일 수 있다. 이.콜리와 같은 엔테로박테리아세에 (Enterobacteriaceae) 박테리아의 박테리아에서 자체적으로 복제가능한 벡터의 예로는 플라스미드 벡터 pUC19, pUC18, pBR322, RSF1010, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, pSTV28, pSTV29, pET20b(+), pET28b(+) (pET 벡터는 Novagen으로부터 이용가능함), pLysS, (pHSG 및 pSTV 벡터는 Takara Bio Inc.로부터 이용가능함), pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 (pMW 벡터는 Nippon Gene Co., Ltd.로부터 이용가능함) 등 및 그 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 코리네형 박테리아에 대한 벡터는 pAM330 (일본특허 공개공보 제58-67699호), pHM1519 (일본특허 공개공보 제58-77895호), pSFK6 (일본특허 공개공보 제2000-262288호), pVK7 (USP2003-0175912A), pAJ655, pAJ611, pAJ1844 (일본특허 공개공보 제58-192900호), pCG1 (일본특허 공개공보 제57-134500호), pCG2 (일본특허 공개공보 제58-35197호), pCG4, pCG11 (일본특허 공개공보 제57-183799호), pHK4 (일본특허 공개공보 제5-7491호) 등을 포함할 수 있다. 또한, 효모에 대한 벡터는 효모 플라스미드, 가령 예를 들면 피치아 파스토리 스에 대해 pD902 또는 pD905, 또는 사카로미세스 세레비지에에 대해 pD1201, pD1204, pD1205, pD1207, pD1211, pD1214 pD1215, pD1217, pD1218, pD1221, pD1224, pD1225, pD1227, pD1231, pD1234, pD1235, pD1237을 포함할 수 있다. 유전자가 잘 알려진 방법을 사용하여 숙주 크로모좀으로 또한 통합될 수 있다 (예컨대 Datensko and Wanner (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645)).
효소 활성의 향상은, 게놈 DNA 또는 플라스미드에서 프로모터와 같은 표적 유전자의 발현 조절 서열을 적합한 강도를 갖는 프로모터로 대체시킴으로써 표적 유전자의 발현을 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, thr 프로모터, lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, pL 프로모터, tac 프로모터 등이 자주 사용되는 프로모터로 알려져 있다. 박테리아와 같은 미생물에서 높은 발현 활성을 갖는 프로모터의 예로는 신장 인자 (elongation factor) Tu (EF-Tu) 유전자, tuf의 프로모터, 코-샤페로닌 (co-chaperonin) GroES/EL을 코딩하는 유전자의 프로모터, 티오레독신 (thioredoxin) 레덕타제, 포스포글리세레이트 뮤타제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 등 (WO2006/028063, EP1697525)을 포함할 수 있다. 강한 프로모터 및 프로모터의 강도를 평가하는 방법의 예가 당분야에 잘 알려져 있다.
더욱이, WO 2000/18935에 개시된 바와 같이 유전자의 프로모터 영역에서 몇 개의 뉴클레오티드를 치환시켜서, 상기 프로모터는 적합한 강도를 가질 수 있다. 상기 발현 조절 서열의 치환이 예를 들면 온도 민감성 플라스미드를 사용하는 유전자 치환에서와 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 에스케리치아 콜리 또는 판토에 아나나티스에 사용될 수 있는 온도 민감성 복제 기원을 갖는 벡터의 예로는 예를 들면 국제공개 WO 1999/03988에 개시된 플라스미드 pMAN997, 그 유도체 등을 포함할 수 있다. 또한, 발현 조절 서열의 치환이 또한, λ-파지의 Red 리컴비나제 (recombinase)를 사용하는 "Red-유도 통합 (Red-driven integration)"으로 불리는 방법과 같은 선형 DNA를 사용하는 방법 (Datsenko, K. A. and Wanner, B. L. 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:6640-6645), Red-유도 통합과 λ-파지 절단성 시스템을 조합하는 방법 (Cho, E. H. et al. 2002. J. Bacteriol. 184:5200-5203) (WO2005/010175) 등에 의해 수행될 수 있다. 발현 조절 서열의 변형이 유전자 카피수를 증가시키면서 조합될 수 있다.
또한, 리보좀 결합 부위 (ribosome binding site: RBS) 및 개시 코돈 사이의 스페이서에서 몇 개의 뉴클레오티드의 치환, 구체적으로 상기 개시 코돈의 바로 상류의 서열은 mRNA 번역가능성 (translatability)에 중대한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 번역은 상기 서열을 변형시킴으로써 향상될 수 있다.
표적 유전자가 전술한 플라스미드 또는 크로모좀으로 도입될 때, 임의의 프로모터는, 사용된 미생물(들)에서 기능하는 프로모터가 선택되는 한 상기 유전자의 발현을 위해 사용될 수 있다. 상기 프로모터는 유전자의 네이티브 프로모터 또는 변형된 프로모터일 수 있다. 유전자의 발현이 또한 선택된 미생물(들)에서 강력하게 기능하는 프로모터를 적절하게 선택하거나, 또는 컨센서스 (consensus) 서열에 가까운 프로모터의 -35 내지 -10 영역에 근접시킴으로써 조절될 수 있다.
대사작용 또는 합성 경로에 관여하는 외인성 핵산 서열의 형질전환, 형질도입, 콘쥬게이션 또는 크로모좀 삽입이 당분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면 플라스미드 또는 크로모좀 DNA를 추출하고, 특정 표적 서열의 폴리머라제 사슬 증폭, 또는 제한 맵핑 (restriction mapping), 추가의 핵산 분석 가령 노던 블롯 (Northern blots) 또는 mRNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR) 증폭, 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 또는 효소 활성 측정, 또는 유전자 산물의 발현에 대한 면역블로팅 (immunoblotting), 또는 도입된 핵산 서열 또는 그 해당하는 유전자 산물의 발현을 테스트하기 위한 다른 적합한 분석 방법을 포함한다. 상기 외인성 핵산이 원하는 유전자 산물을 제조하기 위해 충분한 양으로 발현된다고 당분야의 통상의 지식을 가진 자는 이해할 것이고, 발현 수준이 당분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 충분한 발현을 수득하도록 최적화될 수 있다고 더 이해된다.
선택적으로, 본 발명의 방법 중 어느 것에 사용하기 위한 상기 제4, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태의 하나 이상의 미생물(들)이 하기의 세포 기능에 참여하는 효소 또는 단백질의 활성을 감소 또는 제거하도록 더 변형될 수 있다:
(i) 메타크릴산 생성 경로로부터 물질을 우회시키고 (divert); 및/또는
(ii) 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 대사작용시킴 (metabolises).
전술한 효소 또는 단백질의 활성을 감소 또는 제거하기 위해서, 상기 효소 또는 단백질의 세포내 활성을 감소 또는 제거하기 위한 돌연변이가 전술한 효소 또는 단백질의 유전자로, 종래의 랜덤 또는 부위 지향된 (site directed) 돌연변이화 (mutagenesis) 또는 유전자 조작 기술에 의해 도입될 수 있다. 상기 돌연변이화의 예로는 예를 들면 X-선 또는 자외선 조사, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 뮤타겐 (mutagen)으로의 처리, 고 충실도 (high fidelity) 또는 오차-유발 (error-prone) 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 인 비트로 부위 지향된 또는 램덤 돌연변이화 등을 포함할 수 있다. 상기 돌연변이가 도입되는 유전자에서 부위는 상기 효소 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역 또는 프로모터와 같은 발현 조절 영역일 수 있다. 유전자 조작 기술의 예로는 유전자 재조합, 형질도입, 세포 융합, 유전자 녹아웃 (gene knockouts) 등을 포함할 수 있다.
목적하는 효소 또는 단백질의 세포내 활성의 감소 또는 제거 및 감소 정도가 후보 균주로부터 수득된 세포 추출물 또는 그 정제된 분획에서 효소 또는 단백질 활성을 측정하고, 이를 야생형 균주의 것과 비교하거나, 또는 전체 세포에 의한 표적 산물의 형성을 측정함으로써 확인될 수 있다.
메타크릴산 및/또는 그 유도체 생성 능력 및/또는 그 중간체를 부여 또는 향상시키는 다른 방법의 예로는 메타크릴산 또는 유기산 유사체, 호흡 저해제 등에 대해 저항성을 부여하고 및 세포벽 합성 저해제에 민감성을 부여하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 예를 들면 독성 물질의 증가되는 농도에서 성장시킴으로써 내성 세포를 선택하고, 모노플루오로아세트산 내성을 부여하고, 아데닌 내성 또는 티민 내성을 부여하고, 우레아제 (urease)를 감쇠시키고, 말론산 내성을 부여하고, 벤조피론 또는 나프토퀴논에 대한 내성을 부여하고, HOQNO 내성을 부여하고, 알파-케토말론산 내성을 부여하고, 구아니딘 저항성을 부여하고, 페니실린에 대한 민감성을 부여하고 및 당분야에 알려져 있는 바와 같은 것 등을 포함할 수 있다.
이러한 내성 박테리아의 예로는 하기 균주를 포함할 수 있다: 브레비박테리움 플라붐 AJ3949 FERM BP-2632; 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11628 FERM P-5736; 브레비박테리움 플라붐 AJ11355 FERM P-5007; 코리네박테리움 글루타미쿰 AJ11368 FERM P-5020; 브레비박테리움 플라붐 AJ11217 FERM P-4318; 코리네박테리 움 글루타미쿰 AJ11218 FERM P-4319; 브레비박테리움 플라붐 AJ11564 FERM P-5472; 브레비박테리움 플라붐 AJ11439 FERM P-5136; 코리네박테리움 글루타미쿰 H7684 FERM BP-3004; 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11426 FERM P-5123; 코리네박테 리움 글루타미쿰 AJ11440 FERM P-5137; 및 브레비박테리움 락토퍼멘툼 AJ11796 FERM P-6402.
메타크릴산 및/또는 그 유도체 생성 능력 및/또는 그 중간체를 부여 또는 향상시키는 부가의 방법은 하향-조절제/저해제에 대한 내성을 부여하고, 상향-조절제/활성제에 대한 민감성을 부여하거나 또는 다른 화합물에 의한 효소의 알로스테릭 활성화에 대한 필요성을 완화시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들면, 발린에 의해 슈도모나스 푸티다로부터 분지쇄 케토산 데히드로게나제의 알로스테릭 활성화에 대한 필요성의 완화 또는 에스케리치아 콜리로부터 아세토락테이트 신타제의 알로스테릭 저해의 완화를 포함한다.
발효
따라서, 전술한 본 발명의 방법이 메타크릴산 에스테르와 같은 메타크릴릴-CoA 중간체 및/또는 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 생성할 수 있는 본 발명의 제4, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태들의 미생물(들)을 적절한 배지에서 배양시킴으로써 수행될 수 있다.
적합하게, 그러므로, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태의 방법은 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 생성하도록 하나 이상의 미생물(들)을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 배양 단계는 발효 배지 (fermentation medium)에서 수행한다.
그러므로, 본 발명의 제9 양태에 따르면, 상기 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태들의 하나 이상의 미생물(들)을 발효 배지에서 배양하여 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 생성시키는 발효 방법이 제공된다.
상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체가 발효 배지에 또는 상기 미생물(들)의 세포 내에 존재할 수 있다.
적합하게, 그러므로, 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태의 방법은 상기 메타크릴산 및/또는 그 형성에서 중간체 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 상기 발효 배지 또는 상기 미생물(들) 세포로부터 수집하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르가 전술한 바와 같이 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 분비하는 미생물(들)에 의해 상기 발효 배지 내에 존재할 수 있다.
상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르가 전술한 바와 같이 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 축적하는 미생물에 의해 상기 미생물(들)의 세포내에 존재할 수 있다.
적합하게 그러므로 상기 세포가 당분야에 알려져 있는 임의의 수단, 가령 여과, 원심분리 등에 의해 상기 발효 배지로부터 제거되고, 메타크릴산 또는 그 염 및/또는 메타크릴산 에스테르가 당분야에 알려져 있는 임의의 수단, 가령 증류, 액체-액체 추출 등에 의해 상기 발효 배지로부터 수집된다. 적합하게 그러므로, 본 발명의 방법은 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 주변 배지 (surrounding medium)로부터 수집하는 단계를 더 포함할 수 있고, 이는 먼저 상기 세포를 여과 또는 원심분리에 의해 상기 배지로부터 제거하고, 그 후 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 상기 청소된 배지로부터 증류 또는 액체-액체 추출에 의해 추출함으로써 수행될 수 있다.
선택적으로, 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 수집하는 단계는 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를, 당분야에 알려져 있는 임의의 수단에 의해 수행될 수 있는 세포, 바람직하게 상기 세포가 용해되어 목적하는 산물을 방출시키는, 가령 초음파처리 (sonication), 균질화 (homogenization), 효소 처리, 비드-밀링 (bead-milling), 삼투 충격 (osmotic shock), 동결-해동 (freeze-thaw), 산/염기 처리, 파지 용해 (phage lysis) 등에 의해 방출시켜서, 전술한 바와 같이 상기 발효 배지로부터 유사한 수집 방법에 의해 수행되는 단계를 더 포함할 수 있다. 적합하게 그러므로, 본 발명의 방법은 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 상기 세포로부터 수집하는 부가의 단계를 포함할 수 있고, 상기는 상기 세포를 용해시키고, 그 후 세포 파편 (cell debris)의 여과 후에, 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 추출함으로써 수행될 수 있다.
적합하게, 미생물의 배양 또는 재배 (cultivation)는 상기 미생물이 에너지 및 성장을 유도할 수 있는 탄소 기반 공급원료를 필요로 한다. 바람직하게, 그러므로, 상기 미생물(들)이 탄소 기반 공급원료에서 배양되고, 본 발명의 제1 또는 제2 양태의 방법은 탄소 기반 공급원료로부터 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 생성할 수 있는 하나 이상의 미생물(들)을 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
바람직하게 상기 배양 또는 재배는 발효 배지, 적합하게 상기 미생물(들)을 둘러싸는 주변 배지에서 수행하고, 바람직하게 상기 탄소 기반 공급원료가 배지 내에 존재하고, 선택적으로 상기 배지에 용해 또는 현탁되고, 상기 배지를 통해 버블되고 (bubbled), 및/또는 상기 배지와 혼합된다. 바람직하게 그러므로 상기 배지는 미생물(들) 및 임의의 버퍼 및 염을 함께 포함하는 탄소 기반 공급원료를 포함한다.
그러므로, 본 발명의 제10 양태에 따르면, 상기 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태들의 하나 이상의 미생물(들)을 포함하는 발효 배지가 제공된다.
바람직하게 상기 발효 배지는 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 더 포함한다.
바람직하게 상기 미생물(들)은 상기에서 설명된 바와 같이 기준 속도보다 높은 증가된 속도로 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르를 생성하고, 이는 바람직하게 직접 분비 또는 상기 세포를 용해시킴으로써 상기 배지내에 존재하는 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르의 농도가 높은 역가 (titre)에 있도록 하였다.
바람직하게 상기 발효 배지에 존재하는 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르의 역가는 적어도 5mg/L이다. 예를 들면, 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105, 115, 125, 135, 145, 155 mg/L, 바람직하게 적어도 130mg/L 초과이다.
바람직하게, 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르가 상기 미생물(들)내에 축적되는 구현예에서, 상기 세포내에 존재하는 메타크릴산 및/또는 그 중간체 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르의 농도는 적어도 0.05mM, 더 바람직하게 적어도 0.1mM, 더 바람직하게 적어도 1mM, 더 바람직하게 적어도 2mM, 더 바람직하게 적어도 5mM, 더 바람직하게 적어도 10mM이다. 바람직하게 상기 세포 내에 메타크릴산 또는 그 중간체 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르의 농도는 10mM 내지 약 300mM, 더 바람직하게 약 20mM 내지 약 200mM, 더욱 바람직하게 약 30mM 내지 약 100mM, 가장 바람직하게 약 40mM 내지 약 70mM의 범위에 있다.
본 발명의 미생물(들)이 배치 (batch), 반복된 배치 (repeated batch), 공급-배치 (fed-batch), 반복된 공급-배치 또는 연속 배양 과정으로 재배 또는 배양될 수 있다.
적합하게, 상기 배양 방법은 달리 상기 주변 배지 또는 발효 배지와 같이 본원에 알려져 있는 배양 배지 (culture medium)에서 수행한다. 바람직하게 공급-배치 또는 반복된 공급-배치 방법이 적용되고, 상기 탄소 공급원 및/또는 질소 공급원 및/또는 부가의 화합물들이 상기 배양 방법에 공급된다. 더 바람직하게, 상기 탄소 및/또는 질소 공급원이 상기 배양 방법으로 공급된다.
본 발명의 미생물(들)이 배양되는 발효 배지는, 상기 생물체에 의해 요구되는 관련 영양분이 제한적이라면, 표제의 생물체의 필요성에 적합한 상업적으로 이용가능한 배지일 수 있다. 상기 배양은 호기성 또는 혐기성일 수 있고, 그러나 상기 옥시다제 효소가 사용되는 본 발명의 문맥에서, 상기 배양은 바람직하게 호기성이다.
상기 발효 배지는 적합하게 전술한 바와 같은 탄소 기반 공급원료 및 질소 공급원, 뿐만 아니라 상기 미생물(들)의 성장 및/또는 메타크릴산 및/또는 메타크릴산 에스테르의 형성을 위해 필요로 하는 부가의 화합물을 포함한다.
당분야에 알려져 있는 적합한 탄소 기반 공급원료의 예는 글루코스, 말토스, 말토덱스트린, 수크로스, 가수분해된 전분, 전분, 리그닌, 방향족화물, 신가스 (syngas) 또는 그 성분들, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄, 몰라시스 (molasses) 및 오일 (oils)을 포함한다. 바람직하게 상기 탄소 기반 공급원료가 바이오매스 (biomass)로부터 유래된다. 혼합물 뿐만 아니라 폐기물 (wastes), 가령 지방 폐기물 (municipal waste), 식품 폐기물 및 식품 가공, 삼림 또는 농업으로부터의 리그노셀룰로스 (lignocellulosic) 폐기물이 또한 사용될 수 있다.
당분야에 알려져 있는 적합한 질소 공급원의 예로는 콩가루 (soy bean meal), 옥수수 침지액 (corn steep liquor), 효모 추출물, 암모니아, 암모늄 염, 니트레이트 염, 우레아, 질소 가스 또는 다른 질소성 공급원을 포함한다.
미생물(들)의 성장을 위해 필요로 하는 부가의 화합물의 예로는 항생제, 항진균제, 항산화제, 버퍼, 포스페이트, 술페이트, 마그네슘 염, 미량 원소 및/또는 비타민을 포함한다.
상기 배지에 첨가되는 탄소 기반 공급원료 및 질소 공급원의 전체 양이 상기 미생물(들)의 필요성 및/또는 상기 배양 공정의 길이에 따라 가변될 수 있다.
상기 배양 배지에서 상기 탄소 기반 공급원료 및 상기 질소 공급원 사이의 비율은 상당하게 가변될 수 있다.
상기 미생물(들)의 성장 및/또는 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르의 생성을 위해 필요로 하는 부가의 화합물로, 가령 포스페이트, 술페이트 또는 미량 원소가 미생물들의 상이한 부류들 사이, 즉 진균, 효모 및 박테리아에서 가변할 수 있는 양으로 첨가될 수 있다. 또한, 첨가되는 부가의 화합물의 양은, 메타크릴산 및/또는 그 유도체 가령 메타크릴산 에스테르가 형성되는지 및 이를 형성하기 위해 어떠한 경로가 사용되는지에 의해서 결정될 수 있다.
통상적으로, 미생물의 성장에 필요한 각 발효 배지 성분의 양은, 상기 영양분에 있어서 성장 수득율을 측정함으로써 결정되고, 및 상기 배양 또는 재배 공정에서 사용된 탄소 기반 공급원료의 양과 관련하여 더 평가되고, 이는 형성된 바이오매스의 양이 사용된 탄소 기반 공급원료의 양 및 임의의 공급 용법 중에 부가된 영양분 제한에 의해 우선적으로 결정될 것이다.
본 발명에 따른 배양 또는 재배 과정이 바람직하게 산업적 규모로 수행된다. 산업적 규모 공정은, ≥ 0.01 m3, 바람직하게 ≥ 0.1 m3, 바람직하게 ≥ 0.5 m3, 바람직하게 ≥ 5 m3, 바람직하게 ≥ 10 m3, 더 바람직하게 ≥ 25 m3, 더 바람직하게 ≥ 50 m3, 더 바람직하게 ≥ 100 m3, 가장 바람직하게 ≥ 200 m3인 용적 규모의 하나 이상의 발효기에서 배양 또는 재배 공정을 포함하는 것으로 이해된다.
바람직하게, 본 발명의 미생물(들)의 배양 또는 재배가 일반적으로 바이오리액터 (bioreactor)에서 수행된다. '바이오리액터'는 일반적으로 미생물들이 산업적으로 배양되는 컨테이너 (container)를 의미하는 것으로 이해된다. 바이오리액터는 임의의 크기, 수 및 형태를 가질 수 있고, 영양분, 성장을 위한 부가의 화합물, 새로운 배지, 탄소 기반 공급원료, 가스, 가령, 이에 한정되는 것은 아니지만, 공기, 질소, 산소 또는 이산화탄소의 첨가제를 제공하는 유입구 (inlets)를 포함할 수 있다. 바이오리액터는 또한 발효 배지 자체로부터 또는 상기 미생물(들)내에서 메타크릴산 및/또는 메타크릴산 에스테르를 수집하기 위해 상기 배양 배지의 부피를 제거하기 위한 출구 (outlets)를 포함할 수 있다. 상기 바이오리액터는 또한 상기 배양의 시료채취를 위한 출구를 갖는다. 상기 바이오리액터는 일반적으로 상기 발효 배지를 혼합하기 위해서, 예를 들면 교반, 락킹 (rocking), 진탕, 인버팅 (inverting), 상기 배지를 통한 기체의 버블링 (bubbling) 등에 의해 혼합되도록 구성될 수 있다. 대안으로서, 일부 연속 배양은, 예를 들면 플러그 플로우 시스템 (plug flow system)을 사용하는 미크로리액터 시스템 (microreactor systems)은 혼합을 필요로 하지 않는다. 바이오리액터는 당분야에서 일반적이고, 잘 알려져 있고, 그 예는 표준 텍스트인, 가령 'Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition' (1989) Authors: Wulf Cruegar and Annelise Crueger, translated by Thomas D. Brock Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA에서 찾을 수 있다.
그러므로, 본 발명의 제11 양태에 따르면, 상기 제4, 제5, 제6, 제7, 제8 또는 부가의 양태들의 하나 이상의 미생물(들) 및/또는 상기 제10 양태의 발효 배지를 포함하는 바이오리액터가 제공된다.
선택적으로, 상기 바이오리액터는 본 발명의 복수의 상이한 미생물(들)을 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 바이오리액터는 본 발명의 방법을 수행할 수 있는 미생물(들) 만을 포함한다.
더 바람직하게 상기 바이오리액터는 동일한 배양 조건이 전체를 통해 사용될 수 있도록 동일한 종의 미생물(들)만을 포함한다.
바이오매스 공급원료
바람직하게 사용된 바이오매스는 다량의 탄수화물을 포함하고, 특별히 바람직한 것은 C5 또는 C6 당 (sugars)의 공급원인 탄수화물, 탄소 기반 기체, 또는 방향족화물, 바람직하게 C5 또는 C6 당, 더 바람직하게 글루코스, 가령, 이에 한정되는 것은 아니지만, 전분, 리그닌, 셀룰로스, 글리코겐, 아라비녹실란, 키틴 또는 펙틴이다.
대안으로, 사용된 바이오매스는 다량의 지방을 포함하고, 특별히 바람직한 것은 글리세롤 및 지방산의 공급원인 지방 또는 오일, 특히 트리글리세리드이다. 적합한 트리글리세리드는 식물 또는 동물 공급원으로부터 용이하게 입수할 수 있는 임의의 오일 또는 지방을 포함한다. 이러한 오일 및 지방의 예는 하기를 포함한다: 팜유, 아마인유, 유채씨유 (rapeseed oil), 돼지기름(lard), 버터, 청어유 (herring oil), 코코넛유, 식물성 오일, 해바라기유, 피마자유, 대두유, 올리브유, 코코아 버터, 지 (ghee), 해양 동물 지방 (blubber) 등.
상기 바이오매스는 하나 이상의 상이한 바이오매스 공급원으로 이루어질 수 있다. 적합한 바이오매스 공급원의 예는 다음과 같다: 천연 목재 (virgin wood), 에너지 작물, 농업 잔류물, 식품 폐기물, 지방 폐기물 및 산업적 폐기물 또는 부산물.
천연 목재 바이오매스 공급원은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 우드 칩; 나무 껍질; 브래쉬 (brash); 통나무; 톱밥; 우드 펠렛 또는 브리케트 (briguette)를 포함할 수 있다.
에너지 작물 바이오매스 공급원은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 짧은 회전 코파이스 (coppice) 또는 포레스트리 (forestry); 비목질 목초 (non-woody grasses), 가령, 억새, 대마 풀 (hemp switchgrass), 갈대 또는 호밀; 설탕, 전분과 같은 농업 작물 또는 오일 작물; 또는 수생식물, 예를 들어, 미세조류 또는 대형 조류 및 수초를 포함할 수 있다.
농업 잔류물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 겉껍질 (husk); 짚; 옥수수 대; 밀가루; 곡물; 가금류 퇴비; 거름; 슬러리; 신가스; 또는 사일리지 (silage)를 포함할 수 있다.
식품 폐기물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 껍질/가죽; 껍데기; 겉껍질; 속 (core); 씨/돌; 동물 또는 어류의 식용 불가능한 부분; 즙 및 오일 추출로부터의 펄프; 양조 (brewing)로부터 곡물 찌꺼기 (spent grain) 또는 호프 (hops); 가정 부엌 폐기물; 돼지기름 또는 오일 또는 지방을 포함할 수 있다.
산업 폐기물은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 펠렛을 포함하는 미처리된 목재, 처리된 목재, MDF/OSD를 포함하는 목재 복합재, 목재 라미네이트, 종이 펄프/파쇄/폐기물; 섬유/실/배출물을 포함하는 직물; 또는 하수 오니 (sewage sludge)를 포함할 수 있다.
부가의 산물
또한 다른 유용한 유기 화합물, 예를 들면 메타크릴산의 유도체 가령 다양한 그 에스테르의 생성이 또한 가정된다. 따라서, 상기 메타크릴산 산물이 에스테르화되어 그 에스테르를 생성할 수 있다. 가능한 에스테르가 C1-C20 알킬 또는 C2-C12 히드록시알킬, 글리시딜, 이소보르닐, 디메틸아미노에틸, 트리프로필렌글리콜 에스테르로부터 선택될 수 있다. 가장 바람직하게 상기 에스테르를 형성하기 위해 사용된 알코올 또는 알켄은 바이오 공급원, 예컨대 바이오메탄올, 바이오에탄올, 바이오부탄올로부터 유도될 수 있다. 바람직한 에스테르는 에틸, n-부틸, i-부틸, 히드록시메틸, 히드록시프로필 또는 메틸 메타크릴레이트, 가장 바람직하게, 메틸 메타크릴레이트 또는 부틸 메타크릴레이트이다.
바람직하게 메타크릴산이 알킬 또는 히드록시알킬 메타크릴레이트로 에스테르화 반응에 의해 전환된다. 이러한 전환을 위한 적합한 반응 조건이 당분야에 잘 알려져 있고, WO/2012/069813에서 메타크릴산의 제조와 관련하여 개시되었다.
본 발명의 제12 양태에 따르면, 메타크릴산 또는 메타크릴산 에스테르의 폴리머 또는 코폴리머를 제조하는 방법이 제공되고, 하기 단계를 포함한다:
(i) 본 발명의 제1, 제2 또는 제3 양태 또는 부가의 양태들에 따른 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 제조 단계;
(ii) 상기 (i)에서 제조된 메타크릴산의 선택적인 에스테르화에 의하여 상기 메타크릴산 에스테르를 생산하는 단계;
(iii) 상기 (i)에서 제조된 메타크릴산 및/또는 그 유도체 및/또는, 존재하는 경우, (ii)에서 제조된 에스테르와, 선택적으로 하나 이상의 코모노머 (comonomers)와의 중합화로 그 폴리머 또는 코폴리머를 제조하는 단계.
단계 (i)는 전술한 제1, 제2 및 제3 양태와 관련하여 개시된 부가의 특성들의 어느것을, 상기 제12 양태의 것과 조합하여 포함할 수 있다.
바람직하게, 상기 (ii)의 메타크릴산 에스테르는 C1-C20 알킬 또는 C2-C12 히드록시알킬, 글리시딜, 이소보르닐, 디메틸아미노에틸, 트리프로필렌글리콜 에스테르, 더 바람직하게, 에틸, n-부틸, i-부틸, 히드록시메틸, 히드록시프로필 또는 메틸 메타크릴레이트, 가장 바람직하게, 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트 또는 부틸 메타크릴레이트로부터 선택된다.
그러므로, 본 발명의 부가의 양태에 따르면, 메타크릴산 에스테르의 폴리머 또는 코폴리머를 제조하는 방법이 제공되고, 하기 단계들을 포함한다:
(i) 본 발명의 제3 양태 또는 부가의 양태들에 따라 메타크릴산 에스테르의 제조 단계;
(ii) (i)에서 제조된 메타크릴산 및/또는 그 유도체와, 선택적으로 하나 이상의 코모노머와의 중합화로 그 폴리머 및 코폴리머를 제조하는 단계.
단계 (i)는 전술한 제3 양태와 관련하여 개시된 부가의 특성들 중 어느 것과, 상기 제12 양태의 것을 조합하여 포함할 수 있다.
유익하게, 이러한 폴리머는 화석 연료 이외의 공급원으로부터 유래된 모노머 잔류물의 전체는 아니더라도 상당한 부분을 가질 것이다.
임의의 경우에, 바람직한 코모노머는 예를 들면, 모노에틸렌성 불포화 카르복실산 및 디카르복실산 및 그 유도체, 가령 에스테르, 아미드 및 무수물을 포함한다.
특별히 바람직한 코모노머는 아크릴산, 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, 프로필 아크릴레이트, n-부틸 아크릴레이트, 이소-부틸 아크릴레이트, t-부틸 아크릴레이트, 2-에틸헥실 아크릴레이트, 히드록시에틸 아크릴레이트, 이소-보르닐 아크릴레이트, 메타크릴산, 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, 프로필 메타크릴레이트, n-부틸 메타크릴레이트, 이소-부틸 메타크릴레이트, t-부틸 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, 히드록시에틸 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 히드록시프로필 메타크릴레이트, 이소-보르닐 메타크릴레이트, 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트, 트리프로필렌글리콜 디아크릴레이트, 스티렌, α-메틸 스티렌, 비닐 아세테이트, 톨루엔 디이소시아네이트 및 p,p'-메틸렌 디페닐 디이소시아네이트를 포함하는 이소시아네이트, 아크릴로니트릴, 부타디엔, 부타디엔 및 스티렌 (MBS) 및 ABS이고, 상기 ABS는 상기 코모노머에 속하지만, (i)에서 상기 산 모노머 또는 에스테르 또는 (ii)에서 상기 에스테르 모노머와 하나 이상의 코모노머와의 임의의 주어진 공중합화에서 상기 (i) 또는 (ii)에서 메타크릴산 또는 메타크릴산 에스테르로부터 선택되는 모노머는 아니다.
물론 상이한 코모노머의 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 코모노머 자체는 상기 (i) 또는 (ii)로부터의 모노머들과 동일한 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 제조되지 않을 수 있다.
본 발명의 제12 양태에 따르면, 본 발명의 제11 양태의 방법으로부터 형성된 폴리메타크릴산, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) 및 폴리부틸메타크릴레이트 호모폴리머 또는 코폴리머가 제공된다.
본 발명은 하기의 비-제한적인 실시예 및 도면을 참조로 설명될 것이다.
도 1은 기질로서 메타크릴릴-CoA와, 아트로박터 종 SU로부터의 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그된 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (75μg.ml- 1)의 키네틱 특성화에 대한 Lineweaver-Burke 플롯을 개시하였다.
도 2는 기질로서 이소부티릴-CoA와, 아트로박터 종 SU로부터의 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그된 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (1mg.ml- 1)의 키네틱 특성화에 대한 Lineweaver-Burke 플롯을 개시하였다.
도 3은 이소부티릴-CoA에서 메타크릴릴-CoA로의 산화를 위해 아라비돕시스 탈리아나로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제 (ACX4)의 인 비트로 활성을 결정하기 위해서 HPLC 방법을 사용하여 표준 이소부티릴-CoA (주 피크 32.2분 및 부 피크 32.9분), 메타크릴릴-CoA (주 피크 30.8분 및 부 피크 31.6분), 메타크릴산 (피크 13.5분) 및 코엔자임 A (주 피크 11분 및 부 피크 12분)의 중첩된 HPLC 트레이스 (traces)를 개시하였다.
도 4는 네가티브 대조군으로서, 기질을 첨가하지 않고, HEPES 분석 버퍼에서 ACX4 무세포 추출물, 정제된 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그된 4HBT 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드를 포함하는 분석 혼합물의 HPLC 트레이스를 개시하였다.
도 5는 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드를 포함하는 HEPES 분석에서 이소부티릴-CoA와 ACX4의 무세포 추출물의 30분 인큐베이션 후에 분석 혼합물의 HPLC 분석을 개시하였다.
도 6은 상기 반응 혼합물이 산성화 (acidification)에 의해 정지된 후에 부가의 이소부티릴-CoA로 스파이크된 (spiked) 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드를 포함하는 HEPES 분석 버퍼에서 이소부티릴-CoA와 ACX4의 무세포 추출물의 30분 인큐베이션 후에 분석 혼합물의 HPLC 분석을 개시하였다.
도 7은 ACX4 무세포 추출물 및 정제된 카르복시-말단 His-태그된 4HBT에 의해 이소부티릴-CoA의 메타크릴산 및 코엔자임 A로의 전환에 대한 효소 결합된 반응의 HPLC 분석을 개시하였다.
도 8은 단일 T7 프로모터의 조절 하에 4HBT 유전자, ACX4 유전자 및 AcsA 유전자를 포함하는 pET20b(+) 플라스미드인, pET20b(+)::4HBT-ACX-AcsA 플라스미드를 개시하였다.
도 9는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA에 의한 4HBT, ACX4 및 AcsA 동시-발현의 SDS-PAGE 분석을 개시하였다.
도 10은 유도 후 20.5시간에서 이소부티르산의 메타크릴산으로의 생물전환 (biotransformation) 및 모든 관련 대조군의 분석에 대해 수행된 HPLC 트레이스를 개시하였고, 여기서 도 10 (A)는 이소부티르산이 첨가되지 않은 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA의 배양에 대해 수행된 트레이스를 개시하였고; 도 10 (B)는 이소부티르산이 첨가되지 않은 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)의 배양을 개시하였고; 도 10 (C)는 이소부티르산의 5mM 표준의 HPLC 트레이스를 개시하였고; 도 10 (D)는 재조합 단백질 발현을 유도하고 1시간 후에 이소부티르산 (5mM)이 보충된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)의 배양의 HPLC 트레이스를 개시하였고; 도 10 (E)는 이소부티르산 (5mM) 및 메타크릴산 (200μM) 표준의 칵테일의 HPLC 트레이스를 개시하였고, 및 도 10 (F)는 이소부티르산 (5mM)이 재조합 단백질 발현을 유도하고 1시간 후에 첨가된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 배양의 HPLC 트레이스를 개시하였다.
도 11은, 이소부티르산이 상기 배양에 첨가된 이후로, 이소부티르산이 보충된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 배양에서 시간에 대한 메타크릴산의 농도에서의 변화 (하단선) 뿐만 아니라 시간에 대한 배양의 ln(OD600)에서의 변화 (상단선)를 개시하였다.
도 12는 모두 단일 T7 프로모터의 조절 하에, 아트로박터 종 균주 SU로부터 4HBT, 아라비돕시스 탈리아나로부터 ACX4, 뿐만 아니라 슈도모나스 푸티다 KT2440으로부터 bkdA1, bkdA2, bkdB 및 lpdV 유전자를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 갖는 pET20b(+) 플라스미드인, pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 플라스미드를 개시하였다.
도 13은 2-케토이소발레르산 (5mM), 이소부티르산 (5mM) 및 메타크릴산 (200μM) 표준의 칵테일의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리 (isocratic elution)에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되었다.
도 14는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+) 네가티브 대조군 균주의 배양의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되었다.
도 15는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD의 배양의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되어, 글루코스로부터 메타크릴산의 생성을 입증하였다.
도 16은 부가의 0.24mM 인증된 (authentic) 메타크릴산으로 스파이크된, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD의 배양의 시료의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되었다.
도 17은 2-케토이소발레르산이 보충된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+) 네가티브 대조군 균주의 배양의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되었다.
도 18은 2-케토이소발레르산 (5mM)이 보충된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD의 배양의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되었고, 상기 배양액에 2-케토이소발레르산을 보충하면 상기 균주에 의해서 메타크릴산 생성이 증대되는 것을 입증하였다.
도 19는 2-케토이소발레르산 (5mM)이 보충되고, 부가의 0.24mM 인증된 메타크릴산으로 스파이크된, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD의 배양액의 시료의 HPLC 분석을 개시하였고, 여기서 상기 성분들이 등용매 용리에 의해서, HCl로 pH 2.5로 산성화된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴을 사용하여, 1ml.min-1의 유속으로 분리되었다.
도 20은 이.콜리에서 아라비돕시스 탈리아나 ACX4 단백질의 발현을 위한 플라스미드 pMMA121의 구조를 개시하였다.
도 21은 실시예 5의 재조합 이.콜리로부터 생성된 아라비돕시스 탈리아나 ACX4 단백질을 사용하여 이소부티릴-CoA로부터 메타크릴릴-CoA의 생성을 개시하였다.
도 22는 아라비돕시스 탈리아나 ACX4 단백질을 포함하는 실시예 5의 재조합 이.콜리의 분획물의 SDS-PAGE 분석을 개시하였다.
도 23은 재조합 이.콜리에서 사과 AAT (MpAAT1), 아라비돕시스로부터의 ACX4, 및 슈도모나스 에루기노사 PA01 균주로부터의 bkdA1, bkdA2, bkdB 및 lpdV:BCKAD 복합체 유전자의 발현을 위한 플라스미드 pWA008, pMMA133 및 pMMA134의 구조를 개시하였다.
도 24는 플라스미드 pMMA134를 발현시키는 재조합 이.콜리 생성의 배양액의 시료의 HPLC 분석에 의해서 2-케토이소발레레이트 및 부탄올로부터 부틸 메타크릴레이트의 생성을 개시하였다.
실시예 1: 메타크릴릴-CoA의 선택적 가수분해.
실시예 2: 효소 결합된 반응에서 이소부티릴-CoA의 메타크릴릴-CoA로의 산화 및 이소부티릴-CoA의 메타크릴산 및 코엔자임 A의 인 비트로 전환.
실시예 3: 이소부티르산의 메타크릴산으로의 전체 세포 생물전환.
실시예 4: 2-케토이소발레레이트 중간체를 통해 글루코스로부터 메타크릴산의 전체 세포 생성.
실시예 5: 재조합 에스케리치아 콜리에 의해 2-케토이소발레레이트로부터 부틸 메타크릴레이트의 전체 세포 생성.
1.1 실시예 1 내지 4의 물질
실시예 1 내지 4를 통해 사용된 박테리아 균주 뿐만 아니라 실험을 통해 사용된 성장 배지 및 아가 플레이트가 열거되었다. 프라이머의 표에 본 연구에 사용된 모든 프라이머가 열거되었고, 플라스미드의 표에 본 연구 동안 사용 및 제작된 모든 플라스미드가 열거되었다.
1.1. 1 박테리아 균주
이. 콜리 JM107이 플라스미드 클로닝 숙주로 사용되었고, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS가 유전자 발현 숙주로 사용되었다.
1.1. 2 박테리아 성장 배지 및 영양 아가 플레이트
1.1. 2.1 루리아 베르타니 브로스 (Luria Bertani broth: LB 배지)
루리아 베르타니 고염 배지 (Melford) (25g.L- 1)는 LB 배지로 지칭될 때마다 사용되었고, 1 리터에서 25g의 LB 고염 배지는 카제인 분해물 (casein digest)로부터의 펩톤 (10g.L-1), 효모 추출물 (5g.L-1) 및 염화나트륨 (10g.L-1)으로 구성된다. LB 배지에 종종 카르베니실린 (50μg.ml-1), 클로람페니콜 (34μg.ml-1) 및/또는 글루코스 (1% w/v)가 보충되었다. LB 배지가 오토클레이브로 멸균되었고, 수 중 글루코스 (20% w/v), 수 중 카르베니실린 (100mg.ml-1) 및 에탄올 중 클로람페니콜 (34mg.ml-1)의 원료 용액이 멸균 여과되었고, 각각 첨가되었다.
1.1. 2.2 MSX 최소 배지
MSX 배지가 실온에서 MSA 배지 (760ml.L-1), MSB 배지 (200ml.L-1) 및 12.5% (w/v) 글루코스 원료 용액 (40ml.L- 1)을 배합시킴으로써 제조되었다. MSB 배지가 NH4Cl (15g.L-1) 및 MgSO4.7H2O　(2.0g.L- 1)로 이루어졌고, 오토클레이브로 멸균되었다. MSA 배지가 KH2PO4 (7.89g.L-1), 비쉬니아크 (vishniac) 미량 원소 (2.63ml.L- 1)로 이루어졌고, MSA가 오토클레이브로 멸균되기 전에 pH가 7.0에 도달할 때까지 KOH 용액이 첨가되었다. 비쉬니아크 미량 원소가 이전에 개시된 바와 같이 제조되었지만 (Vishniac W, Santer M. THE THIOBACILLI, Bacteriological Reviews1957;21(3):195-213.), 3.9g.L-1의 ZnSO4.7H2O 만을 사용하였다. 상기 글루코스가 0.22μm 멸균 필터를 사용하여 멸균 여과되었다. MSX 배지에 때로 리보플라빈 (1mg.L- 1)이 보충되었고, 이는 리보플라빈을 MSB 배지로 먼저 (5mg.L-1) 용해시킴으로써 달성되었다. 상기 용액이 그 후 멸균 여과되었고, 상기 MSB+리보플라빈 용액이 그 후 MSX 배지 단독인 경우와 동일한 부피의 MSA 및 글루코스와 혼합되어서 리보플라빈이 보충된 MSX를 형성하였다. MSX 및 리보플라빈이 보충된 MSX 둘 다에, LB 배지에 대해 이전에 개시된 바와 같이 제조되는, 카르베니실린 (50μg.ml-1) 및 클로람페니콜 (34μg.ml- 1)이 항상 보충되었다.
1.1. 2.3 루리아 베르타니 아가 플레이트
루리아 베르타니 아가 플레이트가 루리아 베르타니 고염 배지 (Melford) (25g.L-1) 및 아가 (20g.L-1)를 사용하여 제조되었다. 상기 LB 및 아가 혼합물이 오토클레이브로 멸균되었고, 붓기 (pouring) 전에 50℃ 수조에서 1시간 동안 냉각시켰다. 상기 LB 아가 플레이트에 카르베니실린 (50μg.ml-1), 클로람페니콜 (34μg.ml-1) 및/또는 글루코스 (1% w/v)가 종종 보충되었다. 상기 카르벤실린, 클로람페니콜 및 글루코스 원료 용액이 루리아 베르타니 액체 브로스에 대해 이전에 개시된 바와 같이 제조되었고, 붓기 직전에 상기 LB 아가 용액에 첨가되었다. 상기 글루코스 원료 용액이 이를 상기 LB 아가에 첨가하기 전에 1시간 동안 50 ℃ 수조에서 사전-가온시켰다.
1.1. 3 프라이머 및 서열 목록의 표
Figure pct00001
서열번호: 1 - 에스케리치아 콜리에서 발현을 위해 아토박터 종 (Arthobacter sp .) 균주 SU로부터의 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT)에 대한 코돈 최적화된 유전자 서열.
서열번호: 4 - PCR 산물을 pET20b(+) 플라스미드로 서브-클로닝하여 pET20b(+)::CtHis-4HBT 플라스미드를 형성하도록 4HBT 유전자를 변형시키도록 수행된 폴리머라제 연쇄 반응의 산물.
서열번호: 5 - pET20b(+)::CtHis-4HBT 플라스미드에서 카르복시-말단 히스티딘 태그된 4HBT 효소를 코딩하는 유전자.
서열번호: 6 - 에스케리치아 콜리에서 발현을 위해 아라비돕시스 탈리아나로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제 (ACX4)를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자.
서열번호: 11 - 4HBT 및 ACX4를 하나의 폴리뉴클레오티드로 연결시키기 위해서 중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응의 산물.
서열번호: 12 - 에스케리치아 콜리에서 발현을 위해 슈도모나스 클로로라피 스 B23으로부터의 아실-CoA 신테타제 (AcsA)를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자.
서열번호: 13 - pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA에서 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이 또는 이를 포함하는 서열.
서열번호: 14 - pBSK::ppBCKD 플라스미드에 전달된, 슈도모나스 푸티다 KT2440 분지쇄 케토산 데히드로게나제의 서브유닛을 코딩하는 4개의 유전자를 포함하는 Biomatik에 의해 합성된 'ppBCKD' 폴리뉴클레오티드.
서열번호: 15 - pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 플라스미드에서 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이 및 이를 포함하는 서열.
서열번호: 22 - 변형된 Sse8387I 제한 부위를 포함하는 pET16b (Sse) 발현 벡터의 서열.
서열번호: 23 - pET16b (Sse) 발현 벡터에서 발현을 위해 아라비돕시스 탈리아나로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제 (ACX4)를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자.
서열번호: 24 - pET16b (Sse) 발현 벡터에서 발현을 위해 사과로부터 알코올 아실 트란스퍼라제 (AAT)를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자.
1.1. 4 플라스미드의 표
플라스미드 참조 공급원 설명
pBMH::4HBT Biomatik Corporation NdeI 및 NotI 제한 부위에 의해 플랭크된 4HBT를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 암피실린에 대한 내성을 부여하는 클로닝 벡터.
pBMH::AcsA Biomatik Corporation 3' XhoI 제한 부위 및 NheI 제한 부위, 리보좀 결합 부위, 스페이서 서열 및 NdeI 제한 부위를 포함하는 5' 서열에 의해 플랭크된 AcsA를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 암피실린에 대한 내성을 부여하는 클로닝 벡터.
pBSK::ppBCKD Biomatik Corporation 3' XhoI 제한 부위 및 XbaI 제한 부위, 스페이서 서열, NheI 제한 부위, 리보좀 결합 부위 및 제2 스페이서 서열로 이루어진 5' 서열에 의해 플랭크된, 슈도모나스 푸티다 KT2440의 분지쇄 케토 산 데히드로게나제 복합체를 코딩하는 4개의 유전자를 갖는 클로닝 벡터.
pMA-RQ::ACX4 Life Technologies 5' NdeI 및 3' XhoI 제한 부위에 의해 플랭크된, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 포함하고, 및 암피실린에 대한 내성을 부여하는 클로닝 플라스미드.
pJET1.2 Thermo Scientific Thermo Scientific에 의해 pJET1.2 선형화된 블런트 말단 (linearised blunt end) 클로닝 벡터.
pJET1.2::CtHIS-4HBT 본 연구 4HBT의 정지 코돈을 5'-GGA-3' 서열로 대체시키고, 그 후 XhoI 부위를 대체시켜서, 상기 삽입물을 pET20b(+)로 서브-클로닝할 때, 형성된 유전자가 상기 말단에 부착된 C-말단 His-tag를 갖는 4HBT를 코딩하고, 그 사이에 트리펩티드 링커를 갖도록, 폴리머라제 연쇄 반응의 산물을 포함하는 pJET1.2 클로닝 벡터.
pJET1.2::4HBT-ACX4 본 연구 4HBT 및 ACX4 유전자를, 상기 2개의 유전자들 사이에 새로운 리보좀 결합 부위를 갖는 단일 폴리뉴클레오티드로 연결된 중첩 확장 폴리머라제 연쇄 반응의 산물을 포함하는 pJET1.2 클로닝 벡터.
pET20b(+) Novagen Novagen에 의한 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::4HBT 본 연구 NdeI 및 NotI 제한 부위 사이에 아트로박터 종 균주 SU로부터의 4HBT를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::CtHIS-4HBT 본 연구 각 서브유닛의 카르복시-말단에 부착된 Gly-Leu-Glu-His-His-His-His-His-His 펩티드를 갖는 4HBT의 발현을 위해, NdeI 와 XhoI 제한 부위 사이에서 서브클로닝된 pJET1.2::CtHIS-4HBT로부터의 삽입물을 갖는 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::ACX4 본 연구 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 클로닝된, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::AcsA 본 연구 NdeI 및 XhoI 제한 부위사이에서 클로닝된, AcsA를 코딩하는 코돈 최적화된 유전자를 포함하는 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::4HBT-ACX4 본 연구 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 pET20b(+) 플라스미드로 pJET1.2::4HBT-ACX4 플라스미드로부터 단일 폴리뉴클레오티드로서 서브클로닝되어서, 발현 유닛이 4HBT
및 ACX4 둘다에 대해 동시-발현시키기 위해 형성되고, 새롭게 도입된 NheI 부위 및 XhoI 부위 사이에 제2 삽입물을 수용할 수 있도록, 4HBT 및 ACX4 유전자를 포함하는 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 본 연구 그 NheI 및 XhoI 부위 사이에서 pBMH::AcsA 플라스미드로부터 서브클로닝된 AcsA 유전자를 포함하는 pET20b(+)::4HBT-ACX4 발현 벡터.
pET20b(+)::ppBCKD 본 연구 XbaI 및 XhoI 제한 부위 사이에서pBSK::ppBCKD 플라스미드로부터 서브클로닝된, ppBCKD 복합체를 코딩하는 4개의 유전자를 포함하는 pET20b(+) 발현 벡터.
pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 본 연구 그 NheI 및 XhoI 제한 부위사이에 pBSK::ppBCKD 플라스미드로부터 서브클로닝된, ppBCKD 복합체를 코딩하는 4개의 유전자를 포함하는 pET20b(+)::4HBT-ACX4 발현 벡터.
pET16b (Sse) 본 연구 변형된 Sse8387I 제한 부위를 갖는 pET16b 발현 벡터.
pMMA121 본 연구 그 XbaI 및 Sse8387I 제한 부위 사이에서 pET16b (Sse)에서 발현하기 위해 최적화된 에이. 탈리아나로부터의 ACX4 유전자를 포함하는 pET16b (Sse) 발현 벡터.
pWA008 본 연구 그 NcoI 및 Sse8387I 제한 부위 사이에 삽입된 피. 에루기노사 PA01 균주로부터의 BCKAD 복합체를 코딩하는 오페론을 포함하는 pET16b(Sse) 발현 벡터.
pAAT212 본 연구 그 NcoI 및 Sse8387I 제한 부위 사이에 삽입된 pET16b (Sse)에서 발현하기 위해 최적화된 사과로부터 AAT 유전자를 포함하는 pET(Sse) 발현 벡터.
pMMA133 본 연구 SpeI 제한 부위 및 AAT 유전자 사이에 삽입된 pET16b (Sse) 벡터에서 발현하기 위해 최적화된 에이. 탈리아나로부터의 ACX4 유전자를 더 포함하는 pAAT212 플라스미드.
pMMA134 본 연구 pET16b (Sse) 벡터에서 발현하기 위해 최적화된 에이. 탈리아나로부터의 ACX4 유전자, pET16b (Sse) 벡터에서 발현하기 위해 최적화된 사과로부터의 AAT 유전자, 및 XbaI 및 Sse8387I 제한 부위 사이에 삽입된 피. 에루기노사 PA01 균주로부터의 BCKAD 복합체를 포함하고, 함께 결찰된 pMMA133 및 pWA008 플라스미드.
1.2 실시예 1 내지 4에 대한 일반적인 방법
1.2. 1 이 . 콜리 JM107 클로닝 숙주로 플라스미드의 형질전환
플라스미드 (1ng)가 Fermentas TransformAid™ 박테리아 형질전환 키트를 사용하여 수용력이 있는 이. 콜리 JM107 (50μl)로 형질전환되었다. 새롭게 형질전환된 세포가 빙 (ice) 상에서 5분 동안 인큐베이트되었고, 그 후 카르베니실린 (50ng.μl- 1)이 보충된 사전가온된 LB 아가 플레이트 상에 플레이트되었다. 상기 플레이트가 37℃에서 16시간 동안 인큐베이트되었다.
1.2. 2 플라스미드의 제한 분해물
플라스미드로부터 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 삽입물을 단리시키기 위해, 플라스미드의 제한 분해물이, 제공된 지침에 따라, 제한 엔도뉴클레아제의 Fermentas FastDigest® 시리즈를 사용하여 수행되었다. 모든 제한 분해 반응이 37℃ 수조에서 3시간 동안 수행되었다.
1.2. 3 선형 발현 벡터의 제조
전술한 바와 같이, 플라스미드 DNA (100ng.μl-1), Fermentas FastDigest® Green 버퍼 (1X) 및 Fermentas FastDigest® 제한 엔도뉴클레아제를 포함하는 제한 분해 반응 (100μl)에서 플라스미드가 선형화되었다. 선형화된 벡터가, 상기 제한 엔도뉴클레아제를 제1 가열-불활성화 없이, 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출에 의해 정제되었다. 상기 선형화된 벡터의 5' 포스페이트가 그 후 제공된 지침에 따라 남극 (Antarctic) 포스파타제 (New England Biolabs)에 의해 가수분해되었다. 상기 데포스포릴화 (dephosphorylated) 벡터가 에탄올 침전에 의해 농축되었고, 3M 소듐 아세테이트, pH 5.2를 상기 시료에 첨가 (첨가된 부피: 원시료 부피의 1/10), 그 후 순수 에탄올의 첨가 (첨가된 부피: 새로운 시료 부피의 2X)를 필요로 하였다. 상기 침전 혼합물이 밤새 -20℃에서 인큐베이트되었다. 상기 침전된 DNA가 그 후 Eppendorf miniSpin F-45-12-11 로터에서 13400rpm으로 30분 동안 원심분리되었다. 상층액을 버리고, 세포 펠렛을 70% (v/v) 에탄올로 세척하였다. 상기 DNA 펠렛이 그 후 이전과 동일한 로터 및 동일한 속도로 추가 10분 동안 원심분리되었다. 상층액이 제거되었고, DNA 펠렛이 뉴클레아제 프리 워터 (nuclease free water) (50μl)에 재현탁시키기 전에 20분 동안 흄 후드 (fume hood)에서 공기 건조되었다. 상기 선형화된 벡터의 농도가 분석 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었다.
1.2. 4 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출
플라스미드 분해 또는 PCR 증폭으로부터 선형 DNA 단편이 아가로스 겔 전기영동에 의해 정제되었다. 분해물 또는 PCR 산물이 아가로스 (1% (w/v)), 에티듐 브로미드 (1.78μM), 트리스　아세테이트 (4mM) 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA) (1mM)으로 구성된 아가로스 겔 상에 로딩되었다. 겔 길이의 센티미터 당 7V의 전위 차이가 상기 겔을 통해 적용되어서 폴리뉴클레오티드를 분해시켰다. DNA가 트란스루미네이터 (transluminator)에 의해 겔에서 시각화되었고, 관심 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 겔 슬라이스가 스캘펠 (scalpel)로 절개되었다. 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 겔 슬라이스로부터 QIAquick® Gel 추출 키트에 의해 정제되었다. 상기 폴리뉴클레오티드의 농도가 분석 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었다.
1.2. 5 선형 플라스미드로 삽입물의 결찰
유전자 삽입물이 결찰 반응 (20μl)에서 선형화된 플라스미드로 결찰되었다. 결찰 반응은, 유전자 삽입물 및 선형 벡터 (50ng)을, 길이 3kb 미만의 유전자 삽입물에 대해 3:1의 몰비 또는 길이 3kb 초과의 유전자 삽입물에 대해 1:1 몰비로 이루어지고, T4 DNA 리가제 (1유닛) 및 T4 DNA 리가제에 대한 Fermentas 버퍼 (1X)를 포함한다. 결찰이 실온에서 20분 동안 수행되었고, 결찰 혼합물 (2.5μl)이 이 . 콜리　JM107로의 형질전환을 위한 플라스미드의 공급원으로 사용되었고, 상기는 이전과 같이 Fermentas TransformAid 박테리아 형질전환 키트를 사용하여 수행되었다. 형질전환된 세포가 카르베니실린이 보충된 사전가온된 LB 아가 플레이트에 플레이트되었고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이트되었다.
1.2. 6 발현 벡터로 폴리뉴클레오티드의 서브클로닝
새로운 벡터로 폴리뉴클레오티드를 서브-클로닝하기 위해서, 상기 소스 (source) 벡터를 Fermentas TransformAid™ 박테리아 형질전환 키트를 사용하여 이. 콜리 JM107로 형질전환시킴으로써 먼저 증폭시키고, 그 후 아가 플레이트 상에 5개의 독특한 콜로니 각각에 대해 카르베니실린이 보충된 LB 배양액 (5ml)을 준비하였다. 5x5ml LB+카르베니실린 배양액이 250rpm에서 16시간 동안 진탕하면서 37℃로 인큐베이트되었고, 매뉴얼에 개시된 바와 같이 QIAGEN QIAprep® Spin miniprep 키트를 사용하여 플라스미드가 상기 배양액으로부터 정제되었다. 원하는 5' 및 3' 클로닝 부위의 각각에 대해 필요로 하는 제한 엔도뉴클레아제의 1μl를 사용하여 제한 분해 반응 (20μl)에서 각 플라스미드 제조로부터 관심있는 폴리뉴클레오티드가 분해되었다. 상기 제한 분해물이 함께 풀링되었고, 새로운 벡터로 서브클로닝되는 폴리뉴클레오티드가 나머지 소스 벡터로부터 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출에 의해 정제되었다. 상기 삽입물에 대한 상보적 응집 말단을 가지고 이전에 제조된 선형화된 발현 벡터에 폴리뉴클레오티드 삽입물을 결찰하기 위한 결찰 반응이 확립되었다. 상기 결찰 반응 (2.5μl)이 이전에 개시된 바와 같이 이. 콜리 JM107로의 형질전환을 위한 플라스미드의 공급원으로 사용되었다. 상기 발현 플라스미드가, 형질전환체의 플레이트로부터 단일 콜로니로 LB+카르베니실린 배양액 (100ml)을 접종시키고, 상기 배양액을 37℃에서, 200rpm에서 16시간 동안 진탕시키면서 인큐베이트되었고, QIAGEN Plasmid MidiPrep 키트를 사용하여 상기 배양액으로부터 플라스미드를 정제시킴으로써 증폭되었다.
1.2. 7 발현 벡터에 의한 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS의 형질전환
발현 벡터 (1ng)가 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS 발현 숙주로 형질전환되었다. 수용성 세포가 Novagen으로부터 구입되었고, 빙냉 (ice cold) 원형 플라스미드 (1ng)가 빙냉 수용성 세포 (20μl)로 첨가되었다. 상기 형질전환 혼합물이 42℃에서 30초 열 충격 이전에 5분 동안 빙 상에서 인큐베이트되었다. 상기 열 충격 후에, 세포가 빙 상에서 추가 2분 동안 인큐베이트되었다. SOC 배지 (Novagen) (80μl)가 상기 형질전환된 세포로 첨가되었고, 상기 세포가, 카르베니실린 (50μg.ml-1), 클로람페니콜 (34μg.ml-1) 및 글루코스 (1%, w/v)가 보충된 LB 아가 플레이트 상에 플레이트하기 전에 37℃에서 250rpm에서 60분 동안 진탕시키면서 인큐베이트되었다. 플레이트가 37℃에서 16시간 동안 인큐베이트되었다.
1.2. 8 분석 아가로스 겔 전기영동
선형 DNA 상동성 및 농도가 분석 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었다. 아가로스 겔은 아가로스 (1% (w/v)), 에티듐 브로미드　(1.78μM), 트리스 아세테이트 (4mM) 및 EDTA (1mM)로 구성되었다. 고정된 부피 (5μl)의 DNA 시료가 GeneRuler™ 1kb 플러스 DNA 래더 (ladder) (Thermo Scientific) (5μl)를 갖는 겔 상에 로딩되었다. 상기 시료의 농도를 예측하기 위해서, 상기 시료 밴드의 세기가, GeneRuler™ 1kb 플러스 DNA 래더에 대해 매뉴얼에서 개시된 바와 같이, 상기 래더에서 알려져 있는 물질 및 유사한 크기의 밴드의 세기와 비교하여 시각화되었다.
1.2. 9 소듐 - 도데실 - 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동
시료 (1.5ml)가 세포 배양액으로부터 채취되었고, 세포가 5000g에서 10분동안 원심분리에 의해 펠렛화되었다. 상기 시료가 채취될 때 상기 세포 배양액의 각 OD600 유닛에 대해 100μl를 사용하여, 세포 펠렛이 세포 용해 버퍼에 재현탁되었다. 세포 용해 버퍼는 포타슘 포스페이트 버퍼 (100mM, pH 7.5), BugBuster 세포 용해 세제 (Merck-Millipore) (1X), 벤조나제 뉴클레아제 (Benzonase nuclease) (Sigma Aldrich) (0.01%, v/v) 및 프로테아제 저해제 칵테일 (Roche)을 포함하였다. 재현탁된 세포가 20분 동안 250rpm에서 진탕하면서 인큐베이트되었고, 18,000g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리되었다. 상기 세포 펠렛을 재현탁시키기 위해 사용된 것과 동일한 부피를 사용하여 불용성 분획물이 포타슘 포스페이트 버퍼 (100mM, pH 7.5)에 재현탁되었다. 가용성 및 불용성 분획물이, β-메르캅토에탄올 (5%, v/v)을 포함하는 2X Laemmli 시료 버퍼 (Bio-Rad)와 1:1 비율로 혼합되었다. 시료가 100℃에서 5분 동안 비등되었고, Bio-Rad AnyKD TGX precast 겔 상에 로딩되었다. 전기영동이 200V에서 트리스/글리신/SDS 러닝 버퍼 (running buffer) (Bio-Rad)에서 수행되었다. 5분 동안 온화하게 교반 (50rpm)하면서 실온에서 이중 증류수에 겔을 침지시킴으로써 겔이 세척되었다. 물이 제거되었고, 세척 절차가 추가로 4회 반복되었다. 그 후 16시간 동안 온화하게 교반하면서 실온에서 EZBlueTM 겔 염색 시약 (Sigma-Aldrich)에서 밤새 (16시간) 침지시킴으로써 겔이 염색되었다.
1.3 실시예 1 - 메타크릴릴 - CoA로부터 메타크릴산의 제조:
아트로박터 종 균주 SU로부터 효소 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT) (Genbank 기탁번호 AAC80224.1, Uniprot 기탁번호 Q04416, EC 넘버 3.1.2.23)가, 메타크릴릴-CoA와 구조적으로 관련이 있는 기질에서 알려져 있는 활성을 갖는 티오에스테라제에 대한 데이터베이스 및 문헌 조사 후에, 메타크릴릴-CoA의 가수분해에 대한 후보체 티오에스테라제로 확인되었다.
4HBT에 대한 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 이. 콜리에서 발현을 위해 최적화된 코돈이었고, 5' 말단에 통합된 NdeI 제한 부위 및 3' 말단에 부착된 NotI 제한 부위를 갖는 것이 Biomatik Corporation에 의해 합성되었다.
합성된 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 1)가 pBMH::4HBT 클로닝 벡터에 전달되었고, 4HBT 유전자 삽입물이 이전에 선형화된 pET20b(+) 발현 벡터로, NdeI 및 NotI 제한 부위에서 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::4HBT를 형성하였다. 새롭게 제작된 pET20b(+)::4HBT 플라스미드가 그 후 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환되어서, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT를 형성하였다.
4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 효소를 발현시키기 위해서, 글루코스, 카르벤실린 및 클로람페니콜이 보충된 LB 배지의 스타터 배양액 (20ml)에, 글루코스, 클로람페니콜 및 카르베니실린이 보충된 LB 아가 플레이트로부터 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT의 단일 콜로니로 먼저 접종되었다. 상기 스타터 배양액이 OD600 1.0에 도달할 때까지, 37℃에서 200rpm으로 진탕시키면서 인큐베이트되었다. 상기 세포가 그 후 5000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리에 의해서 수확되었고, 글루코스, 카르베니실린 및 클로람페니콜이 또한 보충된, LB 배지의 중간 배양액을 접종시키는데 사용되었다. 상기 중간 배양액이 OD600 1.0이 될 때까지, 37℃에서 200rpm으로 진탕시키면서 인큐베이트되었다. 2.5L 배플된 (baffled) 진탕 플라스크에서, 글루코스, 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 새로운 LB 배지 (1L)로 재현탁되기 전에, 상기 중간체 배양액 중 세포가 5000g으로 15분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수확되었다. 상기 배양액이 OD600 1.0이 될 때까지 37℃에서, 200rpm으로 진탕시키면서 인큐베이트되었고, 4HBT의 발현이 그 후 0.4mM의 최종 농도로 이소프로필-β-D-티오갈락토피란노시드 (IPTG)의 첨가에 의해 유도되었다. 상기 배양액이 추가의 5.5시간 동안 동일한 조건하에서 인큐베이트되었다. 상기 배양액을 3개의 원심분리 튜브로 균일하게 나뉘고, 세포가 그 후 5000g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수확되었다. 상기 세포가 수확되기 전에 채취된 배양액의 시료가 SDS-PAGE로 분석되었고, 이는 상기 단백질이 높은 가용성을 나타내고 잘 발현되는 것을 보였다. 각 원심분리 튜브에서 세포 펠렛이 분석 버퍼 (50ml)로 3회 세척되었고, 상기는 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일])에탄술폰산 (HEPES) (50mM)을 포함하고, 이는 pH 7.5로 포타슘 히드록시드로 조정되었다. 상기 세포 펠렛이 용해될 때까지 -80℃로 동결되었다. 상기 과정이 무 (empty) pET20b(+) 벡터 네가티브 대조군 균주인 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)에 대해 반복되었다.
4HBT 효소의 무세포 추출물을 제조하기 위해서, 이전에 제조된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT의 세포 펠렛들 중 하나가 HEPES (50mM, pH 7.5) 분석 버퍼에 재현탁되었고, Constant Systems One Shot cell disrupter에서 용해되었다. 상기 세포 용해물이 18,000g에서 15분 동안 4℃에서 원심분리되었고, 상기의 상층액이 57,750g에서 추가의 60분 동안 4℃에서 원심분리되었다. 상기 상층액이 VivaSpin Viva6 10,000 Molecular Weight Cut-Off 원심분리 농축기를 사용하여 세척되었고, 10,000g, 18℃에서 6배로 부피가 감소될 때까지 원심분리되었고, 그 후 HEPES 분석 버퍼에서 6배로 재-희석시키고, 원심분리 농축기에서 부피를 추가로 6배 감소시켰다. 이 . 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT 과발현 배양액으로부터 무세포 추출물의 전체 단백질 농축이 BioRad DC 분석 키트를 사용하여, 단백질 표준으로 우혈청 알부민을 사용하여 수행되었다. 네가티브 대조군 균주인, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)의 세포 펠렛으로부터 무세포 추출물을 제조하기 위해 동일한 과정이 수행되었다.
메타크릴릴-CoA에서 활성에 대해 4HBT 효소를 분석하기 위해서, 메타크릴릴-CoA가 먼저 제조되었다. 메타크릴릴-CoA의 합성이 메타크릴산 무수물과 코엔자임 A의 반응에 의해서 수행되었다. 상기 반응은 소듐 포스페이트 버퍼 (100mM, pH 8.5) 중 코엔자임 A (20mM) 및 메타크릴산 무수물 (40mM)로 구성되었다. 상기 반응이 빙 상에서 인큐베이트되었고, 30분 동안 2분 마다 와동시켰고, 최종 반응 믹스가 pH 3.5로 염산에 의해 산성화되었다. 메타크릴산 부산물 및 반응하지 않은 메타크릴산 무수물이 4x10ml 물 포화된 디에틸에테르에 의한 추출로 제거되었다. 메타크릴릴-CoA가 분석 스케일 컬럼 (Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 컬럼, 4.6mm x 150mm) 상에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reverse phase high performance liquid chromatography: RP-HPLC)에 의해 정제되었다. 시료 (75μl)가 C18 컬럼 상에 주입되었고, 40분에 걸쳐 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)에서 선형 아세토니트릴 구배 (1.8% - 13.5%)에 의해, 1ml.min-1의 유속으로, 용출되었다. 주 피크는 메타크릴릴-CoA 포함 피크이고, 상기 메타크릴릴-CoA 함유 분획물이 수집되었고, 풀링되었다. 아세토니트릴이 회전 증발 (21℃, 3kPa)에 의해 제거되어서, 메타크릴릴-CoA 및 트리플루오로아세트산의 수용액이 남았다. 메타크릴릴-CoA 및 트리플루오로아세트산의 용액을 pH 7로 소듐 히드록시드로 올리고, 동결건조 전에 액체 질소로 순간 동결시켰다. TFA가 뉴클레아제 프리 워터 (10ml)에 상기 동결 건조된 시료를 재용해시키고, 상기 동결-건조-재용해 사이클을 2회 이상, 한 번은 5ml에서, 및 마직막은 1ml의 뉴클레아제 프리 워터에서 반복시킴으로써 제거되었다. 메타크릴릴-CoA의 농도가 16800M- 1.cm-1.의 몰 소멸 계수 (molar extinction coefficient)로, 260nm에서 흡광도에 의해 결정되었다.
4HBT의 조질 효소 분석 (crude enzymatic assays)이, 무세포 단백질 추출물 (1mg.ml-1), 메타크릴릴-CoA (대략 100μM), 5'5-디티오비스-(2-니트로벤조) 산 (DTNB) (500μM)을 포함하는 큐벳 (1ml)에서 수행되었다. 반응은 기질의 첨가에 의해 개시되었고, 412nm에서 모니터되었다. 이 . 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)의 무세포 추출물에 대해 효소 분석이 반복되었다. 4HBT 과발현 균주 및 무 벡터 대조군 균주 둘 다의 무세포 추출물에 대한 효소 분석이 또한 기질로서 이소부티릴-CoA에 대해 반복되었다.
4HBT의 조질 효소 분석으로 4HBT가 메타크릴릴-CoA의 가수분해를 촉매화하고, 기질로서 이소부티릴-CoA보다 메타크릴릴-CoA에 대한 선택성을 나타내는 것이 입증되었다.
4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제를 더 잘 특성화하기 위해서, 상기 효소가 His-태그되어서, 이는 무 세포 추출물의 일부와 반대되는 순수한 효소로서 분석될 수 있다. 상기 효소를 His-태그하기 위해, 폴리머라제 연쇄 반응이 확립되었다. 4HBT His-tagging에 대한 포워드 및 리버스 프라이머인, HHT.F (서열번호: 2) 및 HHT.R (서열번호: 3)이, 4HBT를 코딩하는 유전자로부터 (5'-TAA-3') 정지 코돈을 (5'-GGA-3') 서열로 대체시키고, 및 직후 3' XhoI 제한 부위를 도입시키도록 디자인되었다. 그러므로, NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 pET20b(+)로 상기 PCR 산물을 클로닝할 때, 글리신-루신-글루타메이트 스페이서 서열 및 카르복시-말단 헥사히스티딘 (His) 태그를 갖는 4HBT를 코딩하는 오픈 리딩 프레임이 형성되었다.
폴리머라제 연쇄 반응 혼합물은 주형 DNA로서 pET20b(+)::4HBT 플라스미드 (50pg.μl-1), KOD DNA 폴리머라제 (1유닛), 프라이머 HHT.F (0.4μM), 프라이머 HHT.R　(0.4μM), 데옥시아데노신트리포스페이트 (dATP) (0.2mM), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) (0.2mM), 데옥시시티딘트리포스페이트 (dCTP) (0.2mM), 데옥시구아노신트리포스페이트 (dGTP) (0.2mM), MgCl2 (1mM) 및 KOD DNA 폴리머라제에 대한 Novagen 버퍼 #1 (1X)을 포함하였다. PCR 혼합물이 94℃에서 3분, 그 후 94℃에서 30초 용융, 55℃에서 30초 어닐링, 72℃에서 80초 연신의 30회 반복시키고, 72℃에서 5분으로 종료시키도록 프로그램된 서모사이클러로 로딩되었다.
PCR 산물 (서열번호: 4)이 아가로스 겔 전기영동하고, 그 후 겔 추출에 의해 정제되었고, pJET1.2 클로닝 벡터로 블런트 엔드 결찰되어서 pJET1.2::CtHis-4HBT를 형성하였다. 상기 삽입물이 그 후 pJET1.2::CtHis-4HBT로부터 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이의 pET20b(+)로 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::CtHis-4HBT를 형성하였다. 상기 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS 발현 숙주가 그 후에 pET20b(+)::CtHis-4HBT로 형질전환되어서 C-말단 헥사히스티딘 태그된 4HBT 발현 숙주인, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::CtHis-4HBT를 형성하였다.
순수한 카르복시-말단 His-태그된 4HBT 효소가 그 후 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::CtHis-4HBT의 배양액을 먼저 성장시키고, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT에 대해 수행된 것과 정확하게 동일한 방식으로 발현을 유도시킴으로써 제조되었다. 발현 후 5.5시간에서 채취된 배양액으로부터의 시료는 상기 카르복시-말단 His-태그된 4HBT 효소가 매우 가용성이고, 높은 수준으로 발현되는 것을 보였다. 상기 세포 배양액을 3개의 원심분리 튜브로 분할하고, 5000g에서 20분동안 4℃에서 원심분리함으로써 세포가 수확되었다. 세포 펠렛이 세척되지 않았고, 대신에 -80℃에서 보관되었다. 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그된 4HBT의 무세포 추출물이, 니켈-세파로스 FPLC 컬럼에 대해 결합 버퍼 (binding buffer) (6ml)에 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::CtHis- 4HBT 세포 펠렛 중 하나를 재현탁시킴으로써 제조되었다. 결합 버퍼는 NaH2PO4 (10mM), Na2HPO4 (10mM), NaCl (500mM), 이미다졸 (30mM)로 구성되었고, pH 7.4로 HCl에 의해 조정되었다. Benzonase® 뉴클레아제 (0.6μl)가 Constant Systems One Shot cell disrupter에서 용해되기 전에 재현탁된 세포로 첨가되었다. 상기 세포 용해물이 그 후 18,000g에서 15분 동안 4℃로 원심분리에 의해 정제되었고, 상기 상층액을 57,750g으로 60분 동안 4℃에서 원심분리되었다. 상층액이 그 후 결합 버퍼로 평형화시킨 GE Healthcare HisTrapTM FF 조질 컬럼 (1ml)에 로딩되었다. 결합되지 않은 단백질은 상기 컬럼에서 5배 컬럼 부피의 결합 버퍼로 씻어내고, His-태그된 단백질이 선형 이미다졸 농도 구배, 30mM에서 500mM까지 20배의 컬럼 부피에 대해 용출되었다. 단백질 용출이 280nm에서 모니터되었고, 분획물이 카르복시-말단 His-태그된 4HBT의 존재 및 순도에 대해 SDS-PAGE에 의해 확인되었다. 순수한 CtHis-4HBT 단백질을 포함하는 분획물이 풀링되었고, 상기 용출 버퍼를 포타슘 포스페이트 분석 버퍼 (100mM, pH 7.5)로 대체시키기 위한 버퍼 교환이 VivaSpin Viva6 10,000 Molecular Weight Cut-Off 원심분리 농축기에서 수행되었다. 상기 버퍼 교환을 수행하기 위해서, 상기 풀링된 분획물의 부피가 1ml로 감소될 때까지 10,000g으로 18℃에서 원심분리 농축기의 한외여과 막을 통해 상기 풀링된 분획물이 원심분리되었다. 남아있는 단백질 분획물이 포타슘 포스페이트 분석 버퍼에서 6배로 희석되었고, 상기 시료가 6배의 부피 감소가 달성될 때까지 동일한 조건 하에 한외여과막을 통한 추가의 원심분리에 의해 시료가 농축되었다. 포타슘 포스페이트 분석 버퍼에서 후자의 희석 및 재-농축이 1회 이상 수행되었고, CtHIS-4HBT 단백질의 농도가, 카르복시-말단 His-태그된 4HBT 효소에 대해 20970M- 1.cm-1의 몰 소멸 계수 및 17516.5mg.mmol-1 의 분자량을 사용하여, NanoDrop ND1000 분광기에서 UV280 흡광도에 의해 결정되었다. 상기 몰 소멸 계수 및 분자량에 대한 값이, pET20b(+)::CtHis-4HBT 플라스미드에서 카르복시-말단 his 태그된 4HBT 효소 (서열번호: 5)를 코딩하는 유전자 서열의 아미노산 번역을 사용하는, Expasy ProtParam 툴을 사용하여 결정되었다.
정제된 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그된 4HBT 효소의 키네틱 특성화가 이전에 제조된 메타크릴릴-CoA 및 이소부티릴-CoA (이소부티릴-CoA 리튬 염으로 Sigma Aldrich로부터 구입)에 대해 수행되었다.
메타크릴릴-CoA 가수분해 반응 (200μl)이, 반응을 모니터하기 위해서, 정제된 CtHis-4HBT 단백질 (0.075mg.ml-1) 및 DTNB (0.5mM)를 사용하여 Nunc 96 웰 플레이트에서 수행되었다. 초기 속도가 0.375mM, 0.3mM, 0.225mM, 0.15mM 및 0.075mM의 메타크릴릴-CoA 개시 농도에 대해 결정되었다. 상기 반응이 효소의 첨가에 의해 개시되었다.
이소부티릴-CoA 가수분해 반응 (200μl)이 또한, 하기 반응을 모니터하기 위해, Nunc 96 웰 플레이트에서, 정제된 CtHIS-4HBT 단백질 (1mg.ml-1) 및 DTNB (0.5mM)를 사용하여 수행되었다. 초기 속도가 0.5mM, 0.4mM, 0.3mM, 0.2mM 및 0.1mM의 이소부티릴-CoA 개시 농도에 대해 결정되었다. 상기 반응이 효소의 첨가에 의해 다시 개시되었다.
Lineweaver-Burke 플롯이, 메타크릴릴-CoA (도 1) 및 이소부티릴-CoA (도 2) 둘 다의 키네틱 특성화에 대해 플로팅되었다. 메타크릴릴-CoA에 있어서 카르복시-말단 헥사히스티딘 태그된 4HBT에 대한 키네틱 상수는 1.6mM의 KM 및 470nmols.mg- 1.min-1의 Vmax이었고, 반면에 이소부티릴-CoA에 있어서, 3mM의 Km 및 16.7nmols.mg- 1.min-1의 Vmax이었다.
그러므로, 4HBT가 메타크릴릴 CoA의 가수분해를 촉매화하고, 메타크릴산을 제조하기 위해 사용될 수 있다는 것이 입증되었다. 4HBT는, 이소부티릴-CoA에 있어서 보다, 더 낮은 KM 값 및 더 높은 Vmax 값으로 메타크릴릴-CoA를 가수분해하기 때문에, 4HBT에 의한 메타크릴릴-CoA의 가수분해는 유익하게 높은 선택성이 있다.
1.4 실시예 2 - 이소부티릴 - CoA로부터 메타크릴릴 - CoA 및 메타크릴산의 형성
아라비돕시스 탈리아나로부터의 효소 단쇄 아실-CoA 옥시다제 (ACX4) (Genbank 기탁 번호 AB017643.1, Uniprot 기탁 번호 Q96329, EC 넘버 1.3.3.6)가, 곤충 세포주에서 발현될 때, 기질로서 이소부티릴-CoA에서 검출가능한 활성을 갖는 아실-CoA 옥시다제 효소로서 문헌 조사를 통해 확인되었다.
상기 옥시다제가 대사 경로로 그 통합을 위해 기질로서 이소부티릴-CoA에서 유용한 활성 수준으로 에스케리치아 콜리에서 기능적으로 발현될 수 있는지를 결정하기 위해, ACX4에 대해 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는, 5' 말단에 통합된 NdeI 제한 부위 및 3' 말단에서 XhoI 제한 부위를 갖는, Life Technologies에 의해 이. 콜리에서 발현하기에 최적화된 코돈이었다.
합성된 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 6)가 pMA-RQ::ACX4 플라스미드에 전달되었고, 상기 유전자 삽입물이 이전에 선형화된 pET20b(+) 벡터로, NdeI 및 XhoI 제한 부위에서 서브클로닝되어서, pET20b(+)::ACX4를 형성하였다. 새롭게 제작된 pET20b(+)::ACX4 플라스미드가 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환되어서, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::ACX4를 형성하였다.
ACX4의 발현을 테스트하기 위해서, 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 MSX 스타터 배양액에 글루코스, 클로람페니콜 및 카르베니실린이 보충된 LB 아가 플레이트로부터 이.콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::ACX4의 단일 콜로니가 접종되었다. 상기 스타터 배양액 (20ml)이 37℃에서 200rpm으로 16시간 동안 진탕하면서 인큐베이트되었다. 5000g으로 15분 동안 4℃에서 원심분리에 의해서 상기 스타터 배양액으로부터 세포가 수확되었고, 클로람페니콜 및 카르베니실린이 또한 보충된 새로운 MSX 배지 중간 배양액 (100ml)으로 재현탁되었다. 상기 중간 배양액이 37℃에서 200rpm으로 진탕하면서 OD600이 1.0이 될 때까지 인큐베이트되었다. 5000g으로 15분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 상기 중간 배양액으로부터 세포가 수확되었고, 클로람페니콜, 카르베니실린 및 또한 리보플라빈이 보충된, 2.5L의 배플된 진탕 플라스크에서, 새로운 MSX 배양액 (1L)으로 재현탁되었다. 상기 배양액이 37℃에서 200rpm으로 진탕하면서 OD600이 0.7이 될 때까지 인큐베이트되었고, 그 후 0.4mM의 최종 농도로 IPTG의 첨가에 의해 발현이 유도되었다. 상기 배양액이 추가로 7시간 동안 동일한 조건하에 인큐베이트된 후에, 세포를 3개의 원심분리 튜브로 분할시키고, 5000g으로 20분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수확되었다. 세포가 수확되기 전에 배양액의 시료가 채취되고, SDS-PAGE에 의해 분석되었고, 이는 상기 ACX4 단백질이 잘 발현되는 것으로 보였고, 약 1/3의 ACX4 단백질이 가용성 분획물에 있었고, 2/3는 불용성 분획물에 있었다. 상기 세포 펠렛이 pH 7.5로 KOH에 의해 조정된 HEPES 버퍼 (50mM)로 3회 세척되었다. 세포 펠렛이 용해될 때까지 -80℃로 동결되었다. 상기 과정이 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+) 네가티브 대조군 균주에 대해 반복되었다.
상기 ACX4 효소의 무세포 추출물을 제조하기 위해서, 이전에 제조된 세포 펠렛 중 하나가 10μM의 최종 농도로 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD)가 보충된 HEPES (50mM, pH 7.5) 버퍼 (6ml)에 재현탁되었다. 상기 재-현탁된 세포가 그 후 Constant Systems One Shot cell disrupter에서 용해되었다. 상기 용해물이 18,000g으로 15분 동안 4℃에서 원심분리되었고, 이의 상층액이 57,750rpm으로 60분 동안 4℃에서 추가로 원심분리되었다. 상기 상층액이 VivaSpin Viva6 10,000 Molecular Weight Cut-Off 원심분리 농축기에서, 10,000g으로 18℃에서, 보유물의 부피가 6배로 감소될 때까지 원심분리시킴으로써 농축되었다. 상기 보유물이, FAD (10μM)가 다시 보충된 HEPES 버퍼 (50mM, pH 7.5)에서 6배 재-희석으로 한번 세척되었고, 그 후 상기 원심분리 농축기에서 부피를 6배 감소시키는 제2 농축 단계를 수행하였다. 상기 보유물 중 전체 단백질 농도가, 단백질 표준으로 우 혈청 알부민을 사용하여, BioRad DC 단백질 분석 키트를 사용하여 결정되었다.
분석 HPLC 방법이 실시되어, 이소부티릴-CoA (IB-CoA), 메타크릴릴-CoA (MAA-CoA), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD), 메타크릴산 (MAA) 및 코엔자임 A (CoA-SH)로 분해되었다. 코엔자임 A, 메타크릴릴-CoA 및 이소부티릴-CoA가 각각 11.0분, 30.8분 및 32.2분에서 용출되었다. 코엔자임 A, 메타크릴릴-CoA 및 이소부티릴-CoA는 각각 12분, 31.6분 및 32.9분에서 주 피크와 관련된 작은 테일링 (부) 피크를 갖는다 (도 3). 메타크릴산이 13.5분에 용출되었고, ACX4의 조질 분석에서 및 이소부티릴-CoA 및 메타크릴릴-Coa 표준에 대한 내부 표준으로서 사용되는 FAD가 27.8분에서 용출되었다.
코엔자임 A, 메타크릴산, 이소부티릴-CoA 및 메타크릴릴-CoA가 무세포 추출물로부터의 피크와 혼동되지 않기 위해서, 기질이 없는 대조군이, HEPES 버퍼에서 ACX4 무세포 추출물 (0.8mg.ml-1) 정제된 CtHis-4HBT (0.6mg.ml-1) 및 FAD (10μM)를 사용하여, 수행되었다. 코엔자임 A, 메타크릴산, 메타크릴릴-CoA 또는 이소부티릴-CoA 용출 시간에서 용출되는 피크가 관찰되지 않았다 (도　4).
ACX4의 활성 테스트가 1.5ml의 미세-원심분리 튜브에서 수행되었다. 조질 효소 반응은 HEPES 버퍼 (50mM, pH 7.5)에서 무세포 ACX4 단백질 추출물 (0.8mg.ml-1), 이소부티릴-CoA (500μM) 및 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (10μM)로 구성되었다. 상기 반응이 30℃에서 1.5ml의 미세-원심분리 튜브에서, 250rpm에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이트되었고, 최종 반응 산물이 분석 HPLC에 의해 분석되었다 (도 5). 메타크릴릴-CoA는 30.7분에서 피크를 갖는 주요 산물이었다. 조질 효소 분석 동안 형성된 메타크릴산의 농도는 74μM이었다.
상기 메타크릴릴-CoA 피크의 진위 및 전이된 용출 시간을 갖는 이소부티릴-CoA 피크가 아니라는 것을 확인하기 위해서, 상기 시료가 이소부티릴-CoA로 스파이크되었고, HPLC로 다시 분석되었다. 상기 시료가 산성화되었을 때 ACX4가 불활성화되었고, 이는 임의의 부가의 이소부티릴-CoA가 메타크릴릴-CoA로 전환되지 않는다는 것을 확인하였다. 실제로, 상기 이소부티릴-CoA로 스파이크된 시료는 원래의 메타크릴릴-CoA 피크뿐만 아니라 32분에서 부가의 피크를 나타내었고, 이는 이소부티릴-CoA의 특징적인 테일 피크를 갖는다 (도 6).
메타크릴산이 효소 결합 반응에서 이소부티르산으로부터 생성될 수 있는지를 결정하기 위해서, 조질 ACX4가 정제된 CtHis-4HBT 효소와 인큐베이트하는 실험으로 확립되었다. ACX4의 동일한 무세포 추출물이 상기 ACX4에 대한 단백질 공급원으로 사용되었고, 순수한 CtHis-4HBT가 실시예 1에서 그 키네틱 특성화에서와 동일한 방식으로 다시 제조되었지만, 이전에 사용된 포스페이트 버퍼 대신에, 마지막에 HEPES 버퍼 (50mM, pH 7.5)로 버퍼 교환을 수행하였다. 그러므로, 조질 ACX4 (0.8mg.ml-1)가 HEPES 버퍼에서 FAD (10μM) 및 이소부티릴-CoA (500μM)와 함께 순수한 CtHis-4HBT (0.6mg.ml- 1)와 동시-인큐베이트되었다. 상기 시료가 30℃에서 250rpm에서 30분 동안 진탕하면서, 인큐베이트되었고, HPLC로 분석되었다. 메타크릴산 및 코엔자임 A는 주요 산물이었다. 상기 메타크릴산 피크가 13.45분에서 관찰되었고, 상기 코엔자임　A 주 및 부 피크가 각각 11.1분 및 12.1분에서 관찰되었다. 상기 결합된 효소 반응 (도 7) 동안 생성된 메타크릴산의 농도는 345μM이었고, 조질 ACX4 분석 단독에서보다 4.7배 더 높았다.
ACX4가 이소부티릴-CoA를 산화시키는 것으로 확인되었다. ACX4와 4HBT의 조합은 이소부티릴-CoA를 산업적으로 적용가능한 수준의 메타크릴산으로 인 비트로에서 전환시킬 수 있다는 것이 입증되었다.
1.5 실시예 3 - 이소부티르산의 메타크릴산으로의 전체 세포 생물전환
코엔자임 A로 이소부티르산을 활성화하여 이소부티릴-CoA를 형성시키는 아실-CoA 신테타제를 사용하여 이소부티르산을 메타크릴산으로의 부가의 생물전환이 본 실시예에 개시되었고, 또한 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 산화시키기 위한 아라비돕시스 탈리아나로부터의 아실-CoA 옥시다제 ACX4 뿐만 아니라 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 및 코엔자임　A로 가수분해시키기 위한 아트로박터 종 균주 SU로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT가 또한 개시되었다.
슈도모나스 클로로라피스 B23으로부터 아실-CoA 신테타제 AcsA (Genbank 기탁 번호: BAD90933.1, uniprot 기탁 번호: Q5CD72)가, 이소부티르산을 이소부티릴-CoA로 활성화할 수 있는 AMP-형성 아실-CoA 신테타제로서 데이터베이스 및 문헌 조사로부터 확인되었고, 공개된 마이켈리스 상수 (Michaelis constant) (Km)는 0.14mM이고, 전환수 (turnover number) (kcat)는 10.6s-1이다.
본 실시예에서, 본 발명자들은 pET20b(+)의 T7 프로모터의 조절 하에 단일 오페론으로부터 4HBT, ACX4 및 AcsA를 코딩하는 유전자의 동시-발현을 위해서, pET20b(+) 기반된 벡터인, pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA의 제작 및 이소부티르산을 메타크릴산으로의 전체 세포 생물전환을 위한 대사 경로를 코딩하기 위해 그 용도를 입증하였다.
상기 오페론의 제작이 2 단계로 수행되었다. 제1 단계는 4HBT 및 ACX4를 코딩하는 유전자의 동시-발현을 위해서 pET20b(+) 기반 벡터인, pET20b(+)::4HBT-ACX4의 제작을 포함하고, 제2 단계는 AcsA를 코딩하는 유전자를, 그 자체의 리보좀 결합 부위를 갖는, pET20b(+)::4HBT-ACX4 벡터로 서브-클로닝하여 최종 pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 플라스미드를 제작하는 것에 관여한다.
pET20b(+)::4HBT-ACX4 벡터를 제작하기 위해서, 4HBT 및 ACX4를 코딩하는 유전자가 먼저, 4HBT를 코딩하는 유전자와 ACX4를 코딩하는 유전자 사이의 새로운 리보좀 결합 부위를 갖는, 단일 폴리뉴클레오티드로 결합되어서, 후자의 효율적인 번역을 보장하였다. 2개의 유전자들을 함께 결합시키기 위해서, 중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응이 수행되었다. 중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응이 2 단계로 수행되었다. 먼저, 4HBT 및 ACX4를 코딩하는 유전자가, 2개의 개별 폴리머라제 연쇄 반응인, 반응들 'A' 및 'B'에서, 그 개별의 발현 벡터인, pET20b(+)::4HBT 및 pET20b(+)::ACX4로부터 증폭되었다.
중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응을 위해 사용된 프라이머는 프라이머 OE.A.F (서열번호:　7), 중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응 A에 대한 포워드 프라이머; 프라이머 OE.A.R (서열번호:　8), 폴리머라제 연쇄 반응 A에 대한 리버스 프라이머; 프라이머 OE.B.F (서열번호:　9), 중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응 B에 대한 포워드 프라이머 및 마지막으로 OE.B.R (서열번호:　10), 중첩된 연장 폴리머라제 연쇄 반응 B에 대한 리버스 프라이머이었다. 프라이머 OE.A.F의 오버행 (overhang)이 새로운 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에서 NdeI 제한 부위를 유지하도록 디자인되었다. 프라이머 OE.A.R 및 OE.B.F의 오버행은 반응 A 및 B로부터 2개의 PCR 산물을 연결시키기 위해서 서로에 대해 상보적인 서열을 포함하도록 디자인되었다. 상기 2개의 PCR 산물의 연결에서, 4HBT 유전자와 ACX4 유전자 사이에 유전자간 (intergenic) 서열이 도입되고, 이는 후자 유전자의 새로운 리보좀 결합 부위를 포함하도록 상보적 서열로 디자인되었다. 마지막으로, 프라이머 OE.B.R의 오버행이 2개의 제한 부위인, NheI 제한 부위 및 XhoI 제한 부위를 포함하도록 디자인되었다. 상기는 4HBT 및 ACX4 유전자를 포함하는 연결된 폴리뉴클레오티드가 그 NdeI 및 XhoI 제한 부위에서 pET20b(+) 플라스미드로 클로닝되게 하여 pET20b(+)::4HBT-ACX4를 형성할 수 있고, 또한 상기 AcsA 유전자를 NheI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 pET20b(+)::4HBT-ACX4 플라스미드로 클로닝되게 하여 pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 플라스미드를 형성할 수 있다. 아데닌 및 티민이 풍부한 스페이서 서열이 프라이머 OE.B.R에서 NheI 및 XhoI 제한 부위 사이에 포함되어서, 다른 프라이머의 것에 더 가깝게 매치되도록 하여, 상기 프라이머의 어닐링 온도를 더 낮추고, 인접한 NheI 및 XhoI 제한 부위에서 효과적으로 이중 분해를 할 수 있다.
폴리머라제 연쇄 반응 A (50μl)는 주형 DNA로서 pET20b(+)::4HBT (10pg.μl-1), KOD DNA 폴리머라제 (1유닛), 프라이머 OE.A.F (0.4μM), 프라이머 OE.A.R　(0.4μM), 데옥시아데노신트리포스페이트 (dATP) (0.2mM), 데옥시티미딘 트리포스페이트 (dTTP) (0.2mM), 데옥시시티딘트리포스페이트 (dCTP) (0.2mM), 데옥시구아노신트리포스페이트 (dGTP) (0.2mM), MgCl2 (1mM) 및 KOD DNA 폴리머라제를 위한 Novagen 버퍼 (1X)를 포함했다.
폴리머라제 연쇄 반응 B (50μl)는 주형 DNA로서 pET20b(+)::ACX4 (20pg.μl-1), KOD DNA 폴리머라제 (1 유닛) 프라이머 OE.B.F (0.4μM), 프라이머 OE.B.R (0.4μM), dATP (0.2mM), dTTP (0.2mM), dCTP (0.2mM), dGTP (0.2mM), MgCl2 (1mM) 및 KOD DNA 폴리머라제를 위한 Novagen 버퍼 (1X)로 이루어졌다.
두 PCR 반응이 병렬로 동일한 조건 하에 수행되었고, 이는 95℃에서 3분 동안 초기 변성 단계로 시작하여, 98℃에서 15초의 변성 단계, 50℃에서 2초 어닐링 단계 및 72℃에서 20초 연장 단계로 구성된 25 사이클이 수행되었다. 상기 25 사이클 후에 72 ℃에서 추가 5분 연장 단계가 이어진다. 상기 2개의 이중가닥 PCR 산물인, 산물 A 및 산물 B가 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출에 의해 정제되었고, 그 농도가 분석 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정되었다.
PCR 산물 A 및 B가 그 후, PCR 산물 A (15nM), PCR 산물 B (15nM), dATP　(0.2mM), dTTP (0.2mM), dCTP (0.2mM), dGTP (0.2mM), MgCl2 (1mM), KOD DNA 폴리머라제를 위한 Novagen 버퍼 #1 (1X), 디메틸술폭시드 (5% (v/v)) 및 KOD DNA 폴리머라제 (8nl/μl)로 구성된 제2 폴리머라제 연쇄 반응에서 연결되었다. 상기 반응이, 95℃에서 3분 동안으로 시작하여, 98℃에서 15초 변성 단계, 50℃에서 2초 어닐링 단계, 및 72℃에서 20초 연장 단계의 15 사이클을 진행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 지속하는 추가의 연장 단계로 종료되도록 프로그램된 서모사이클러 (thermocycler)에서 수행되었다.
상기 PCR 프로그램 후에, A 및 B 각각의 증폭에 사용된 외부 포워드 프라이머 및 외부 리버스 프라이머를 농축된 원료 (50μM)로부터 최종 농도 0.5μM으로 첨가되었다. 상기 변형된 PCR 반응 혼합물이 그 후, 95℃에서 초기 3분간의 용융 단계로 시작하여, 98℃에서 15초 지속하는 용융 단계, 55℃에서 2초 지속하는 어닐링 단계, 및 72℃에서 20초 지속하는 연장단계로 구성된 15 사이클을 진행하고, 마지막으로 72℃에서 5분 지속하는 추가의 연장 단계로 종료되도록 프로그램된 서모사이클러에서 또다른 PCR 라운드로 처리되었다.
상기 연결 단계의 산물 (서열번호: 11)이 아가로스 겔 전기영동 및 겔 추출에 의해 정제되었고, pJET1.2 클로닝 벡터로 블런트 말단 결찰되어서 pJET1.2::4HBT-ACX4를 형성하였다. 연결된 4HBT 및 ACX4 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 그 후에 pET20b(+)에 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::4HBT-ACX4를 형성하였다. 상기 pET20b(+)::4HBT-ACX4 플라스미드가 그 후 NheI 및 XhoI 제한 부위에서 제한효소 분해 (restriction digestion)에 의해 선형화되었다.
상기 pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 플라스미드의 제작에서 다음 단계에 있어서, AcsA의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 이. 콜리에서 발현하기에 최적화된 코돈이고, 3' 말단에 부착된 XhoI 제한 부위 및 5' 말단에 부착된 짧은 서열을 갖는 것이 Biomatik corporation에 의해 합성되었다. 상기 서열은 NheI 제한 부위, 리보좀 결합 부위, 및 시토신-아데닌-티민 트리뉴클레오티드로 끝나는 스페이서 서열을 포함하였고, AcsA의 개시 코돈과 함께 NdeI 제한 부위를 코딩하였다.
상기 합성된 코돈 최적화된 AcsA 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 12)가 상기 pBMH::AcsA 클로닝 플라스미드에 전달되었고, 상기 AcsA 유전자가, NheI 및 XhoI 제한 부위 사이에서, 그 5' 리보좀 결합 부위와 함께 상기 선형화된 pET20b(+)::4HBT-ACX4 벡터로 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 플라스미드 (도　8)를 형성하였다. 상기 플라스미드가 그 후에 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환되어서, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA를 형성하였다. 상기 pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 플라스미드에서 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이 및 이를 포함하는 서열이 서열번호: 13에 개시되었다.
상기 AcsA 유전자만을 발현시키기 위한 균주를 제작하기 위해서, 상기 AcsA 유전자 만이 pBMH::AcsA 클로닝 벡터로부터 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 pET20b(+) 플라스미드로 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::AcsA를 형성하였다. 상기 pET20b(+)::AcsA 플라스미드가 그 후 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환되어서, 이 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::AcsA를 형성하였다.
4HBT, ACX4 및 AcsA를 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA에 의한 동시-발현이, 2개의 다른 시험 온도인 37℃ 및 28℃에서 리보플라빈 (1mg.L-1)이 보충된 MSX 배지에서 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA의 배양액 (100ml)을 인큐베이트함으로써 확인되었다. 배양액이 OD600 0.5로 성장시켰고, IPTG (0.4mM)의 첨가에 의해 발현이 유도되었다. 발현 유도 직전뿐만 아니라 유도 후 1시간, 3시간, 5시간 및 20시간에서 시료가 채취되었다. 실시예 2에서 제조된 바와 같은 대조군 균주 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::ACX4 및 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::AcsA가 또한 동일한 조건 하에 배양되었다. 이 . 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA에서 4HBT, ACX4 및 AcsA의 동시-발현 동안 채취된 시료뿐만 아니라 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::ACX4에서 ACX4 및 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::AcsA에서 AcsA의 발현 중에 채취된 시료가 소듐 도데실술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 의해 분석되었다.
SDS-PAGE에 의한 분석 (도 9)은 발현이 37℃에서 수행되었을 때, 유도 후 5시간에서, 높은 수준의 가용성 4HBT (좌측 하단 밴드) 및 양호한 수준의 ACX4 (좌측 상단 밴드)와 매우 적은 불용성 단백질이 검출되었고, 높은 수준의 불용성 AcsA (우측 상단 밴드)가 가용성 분획물에서 검출되었지만 AcsA 단백질은 보이지 않았다. 레인 1) 무 (Empty) pET20b(+) 벡터 네가티브 대조군. 2) Spectra BR 단백질 래더. 3) pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA 발현 0h 가용성. 3) 3h 가용성. 4) 5h 가용성. 5) 0h 불용성. 6) pET20b(+)::AcsA 발현 5h 가용성. 7) pET20b(+)::ACX4 가용성. 8) pET20b(+)::4HBT 가용성. 9) pET20b(+):4HBT-ACX4-AcsA 0h 불용성. 10) pET20b(+):4HBT-ACX4-AcsA 3h 불용성. 11) pET20b(+):4HBT-ACX4-AcsA 5h 불용성. 12) pET20b(+)::AcsA 5h 불용성.
이소부티르산을 메타크릴산으로 전환시키는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA의 능력을 테스트하기 위해서, 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된, MSX 사전-배양액 (20ml)에, 글루코스 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA의 단일 콜로니가 접종되었고, 200rpm에서 16시간 동안 진탕시키면서 37℃로 인큐베이트되었다. 상기 세포가 5000g으로 15분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 수확되었고, 상기 세포가, 250ml의 진탕 플라스크에서, 카르베니실린, 클로람페니콜 및 리보플라빈이 보충된 MSX 배지 (100ml)에 재-현탁시켰고, 상기 배양액이 200rpm으로 진탕시키면서, 37℃로 인큐베이트되었다. OD600 0.5에서 IPTG (0.4mM)를 첨가하여 유전자들의 동시-발현이 유도되었다. 상기 배양 배지에서 500mM의 농축된 원료 농도로부터 5mM의 최종 농도로 포타슘 이소부티레이트 (pH 7.0)의 첨가 전에 추가로 1시간 동안 상기 배양액이 인큐베이트되었다. 이소부티르산의 첨가 직후 (0h 시료) 및 그 후 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간 및 19.5시간에서 시료가 채취되었다.
이소부티르산에서 메크릴산으로의 생물변환을 통해 채취된 시료들이 에펜르프 miniSpin F-45-12-11 로터에서 5분 동안 6000rpm으로 원심분리되었다. 상층액이 0.2μm Sartorius RC 4mm 필터를 통해 여과되었고, 그 후 5M HCl로 pH2.5로 산성화되었다. 산성화된 상층액이 Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 컬럼 (4.6mm x 150mm)으로 주입되었다. HPLC가 0.4ml.min-1로 수행되었고, 메타크릴산이 이소부티르산으로부터, HCl로 pH 2.5로 조정된 KH2PO4 중 14% 아세토니트릴로 등용매 용리에 의해서 분해되었다. 상기 컬럼이, 실행들 사이에서 유속을 1ml.min-1로 증가시키고 상기 아세토니트릴 농도를 75%로 15분 동안 증가시킴으로써 세척되었고, 그 후 상기 조건들을 유속 0.4ml.min-1 및 14% 아세토니트릴로 다음 시료를 위해 되돌렸다. 상기 컬럼은 다음 시료를 주입하기 전에 20분 동안 평형화시켰다.
3개의 네가티브 대조군이 또한 수행되고, 분석되었다. 상기 제1 대조군은, 4HBT-ACX4-AcsA 동시-발현 오페론을 포함하지 않는, 네가티브 대조군 균주, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)이었고, IPTG가 배양 배지에 첨가된 후에 상기 배지에 이소부티르산이 첨가되지 않고 배양되었다. 제2 대조군은 제1 대조군에서 사용된 것과 동일한 균주가 사용되었지만, IPTG가 상기 배양 배지에 첨가되고 1시간 후에 이소부티르산 (5mM)이 첨가되었다. 제3 대조군은 주요 생물변환 배양에서 사용된 것과 동일한 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA가 사용되었지만, 4HBT, ACX4 및 AcsA의 동시-발현이 유도된 후에 상기 배양 배지로 이소부티르산이 첨가되지 않았다.
상기 HPLC 트레이스의 요약을 도 10에서 관찰하였고, 이는 테스트된 모두 4개의 배양액으로부터, 유도후 20.5시간 (19.5시간의 생물변환 시간)에서 채취된 시료들의 트레이스이다. 도 10 (C)는 이소부티르산의 표준(5mM)이고, 도 10 (E)는 메타크릴산 (200μM)의 표준과 혼합된 이소부티르산의 표준 (5mM)이다. 도 10 (A), 10 (B) 및 10 (D)는 상기 대조군에서 메타크릴산이 형성되지 않았음을 보여주었고, 도 10 (F)는 상기 생물전환 동안 메타크릴산이 실제로 형성된 것을 보여주었다.
도 11은 메타크릴산의 원하는 산물의 최종 농도가 약 0.25mM인 생물전환 동안 시간에 따른 메타크릴산의 생성 뿐만 아니라 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-AcsA의 성장을 요약하였다.
본 실시예에서, 산업적으로 이용가능한 수준으로 이소부티르산 공급원료를 메타크릴산으로 전환하기 위한 전체 세포 공정이, 재조합 이 . 콜리에서 4HBT, ACX4 및 AcsA를 인 비트로에서 동시-발현시킴으로써 입증되었다.
1.6 실시예 4 - 글루코스로부터 메타크릴산의 형성
슈도모나스 푸티다 KT2440으로부터 분지쇄 케토산 데히드로게나제 복합체가 이. 콜리에서 이소부티르산의 생성을 위한 재조합 대사경로에서 2-케토이소발레르산을 이소부티릴-CoA로의 산화적 데카르복실화를 촉매화하는 것이 이전에 개시되었다 (Zhang, K., Xiong, M. and Woodruff, A. P. 2012, Cells and methods for producing isobutyric acid, 국제특허번호 WO 2012/109534 A2). 분지쇄 케토산 데히드로게나제 알파 서브유닛 (bkdA1), 분지쇄 케토산 데히드로게나제 베타 서브유닛 (bkdA2), 리포아미드 아실트란스퍼라제 성분 (bkdB) 및 상기 분지쇄 케토산 데히드로게나제 복합체의 리포아미드 데히드로게나제 성분 (lpdV)을 코딩하는 유전자가 서로 인접하게 그룹화되었고, 슈도모나스 푸티다 KT2440 게놈 DNA (genbank 기탁번호 AE015451.1)에서 단일 프로모터의 조절하에 모두 발견되었다.
bkdA1, bkdA2, bkdV 및 lpdV 유전자들을 코딩하는 전체 야생형 서열은, 뉴클레오티드 4992042 내지 4996988 사이의 슈도모나스 푸티다 KT2440 게놈 DNA에서 나타나는 바와 같이, 단일, ppBCKD, 폴리뉴클레오티드 (서열번호: 14)로서 Biomatik corporation에 의해 합성되었다. 상기 ppBCKD 폴리뉴클레오티드는 3' 말단에 XhoI 제한 부위, 및 bkdA1 유전자의 개시 코돈 직전에 5' 말단에 짧은 서열을 포함하였다. 상기 5' 부착된 서열은 XbaI 제한 부위, 스페이서 서열, NheI 제한 부위, 리보좀 결합 부위, 및 제2 스페이서 서열을 포함하였다. 슈도모나스 푸티다 KT2550 분지쇄 케토산 데히드로게나제의 4개의 유전자 만을 발현시킬 수 있는, pET20b(+)::ppBCKD의 제작을 위해 pET20b(+) 플라스미드로 ppBCKD 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있도록 상기 XbaI 부위가 포함되었다. pET20b(+)::ppBCKD 플라스미드에서 T7 프로모터와 리보좀 결합 부위 사이의 동일한 수의 염기쌍을 pET20b(+) 플라스미드에 존재하는 것과 동일하게 유지하기 위해 제1 스페이서 서열이 포함되었고, 예외적으로 상기 리보좀 결합 부위 바로 앞에 있는 NheI 부위를 코딩하는 6개의 뉴클레오티드인 스페이서 서열은 pET20b(+) 플라스미드에서 XbaI 부위 및 리보좀 결합 부위 사이의 것과 동일하다. pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 플라스미드를 제작하기 위해 pET20b(+)::4HBT-ACX4 플라스미드로 ppBCKD 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있도록 NheI 제한 부위가 포함되었다. 상기 리보좀 결합 부위 및 상기 스페이서 서열은, 이전에 보고되었던 이소부티르산의 생성을 위해 BCKD 유전자가 발현되는 경우 bkdA1 유전자 바로 앞에 사용되는 것과 동일하였다 (Zhang, K., Xiong, M. and Woodruff, A. P. 2012, Cells and methods for producing isobutyric acid, 국제특허번호 WO 2012/109534 A2).
슈도모나스 푸티다 KT2440 분지쇄 케토산 데히드로게나제의 4개의 유전자를 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드가 pBSK 플라스미드 (pBSK::ppBCKD)에 전달되었다. 상기 4개의 유전자가 pBSK::ppBCKD 플라스미드로부터 NheI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 실시예 2의 pET20b(+)::4HBT-ACX4 플라스미드로 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD를 형성하였다　(도　12). 서열번호: 15는 pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 플라스미드에서 NdeI 및 XhoI 제한 부위 사이의 서열을 나타내었다. 상기 pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 플라스미드가 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환되어서 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD를 형성하였다. 유사하게 상기 4개의 유전자들이 또한 NheI 및 XhoI 제한 부위 사이에서 pET20b(+) 플라스미드로 서브-클로닝되어서, pET20b(+)::ppBCKD를 형성하였고, 상기 플라스미드가 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS로 형질전환되어서 이. 콜 리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::ppBCKD를 형성하였다. 상기 후자의 균주는 발현 연구 동안 SDS-PAGE 겔에서 bkdA1, bkdA2, bkdB 및 lpdV 유전자에 해당하는 밴드를 확인하는데 돕기 위해 사용되었다 (개시되지 않음).
카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 MSX 사전-배양액 (10ml)에 글루코스, 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 LB 아가 플레이트 상에 단일 콜로니로부터 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD로 접종되었다. 배양액이 250rpm으로 16시간 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이트되었다. 5000g으로 15분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 세포가 수확되었고, 그 후 500ml 진탕 플라스크에 리보플라빈 뿐만 아니라 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 새로운 MSX 배지 (100ml)에 재-현탁되었다. 상기 새로운 배양액이 250rpm에서 진탕하면서 37℃에서 인큐베이트되었고, 각 배양액에서 OD600 0.5에서 IPTG (0.4mM)의 첨가에 의해 발현이 유도되었다. 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의한 분석을 위해 시료가 채취되기 전에 상기 배양액이 추가 17시간 동안 인큐베이트되었다. 이 . 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+) 네가티브 대조군 배양을 위해 반복한 배양이 수행되었다.
시료가 에펜도르프 miniSpin F-45-12-11 로터에서 5분 동안 6000rpm으로 원심분리되었다. 상층액이 0.2 미크론 Sartorius RC 4mm 필터를 통해 여과되었고, 그 후 5M HCl로 pH 2.5로 산성화되었다. 산성화된 상층액이 Agilent Zorbax Eclipse XDB C18 컬럼 (4.6mm x 250mm)에 주입되었다. HPLC가 1ml.min-1로 수행되었고, HCl로 pH 2.5로 조정된 50mM KH2PO4 중 14% 아세토니트릴로 등용매 용리에 의해 분석물이 용출되었다. 상기 컬럼은 실행들 사이에 15분 동안 상기 아세토니트릴의 농도를 75%로 증가시킴으로써 세척되었고, 그 후 20분 동안 재-평형화 단계를 위해 14%의 아세토니트릴로 되돌렸다.
메타크릴산 (0.2mM), 이소부티르산 (5mM) 및 2-케토이소발레르산 (5mM)의 표준이 3.6분, 8.3분 및 8.6분에서 용출되었고, 피크 면적은 각각 5980mAU.min, 330mAU.min 및 1580mAU.min이었다. 2-케토이소발레르산 (5mM), 이소부티르산 (5mM) 및 메타크릴산 (200μM)의 칵테일의 HPLC 분석이 도 13에 개시되었다.
도 14에 개시된 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+) 네가티브 대조군 배양액으로부터 채취된 시료의 HPLC 분석에서, 메타크릴산에 대해 기대된 영역에서 피크가 없었고, 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 배양액으로부터 채취된 시료의 분석에서는, 0.11mM의 메타크릴산 농도에 해당하는 8.6분에서 피크 및 0.88AU.min의 피크 면적을 보였다.
상기 피크가 실제로 메타크릴산을 나타내는지를 확인하기 위해서, 상기 시료가 10mM의 원료 용액으로부터 추가의 0.24mM의 메타크릴산으로 스파이크되었고, 상기 스파이크된 시료가 또한 HPLC에 의해 분석되었고, 도 16에서 볼 수 있다. 0.34mM의 메타크릴산 농도에 해당하는 2.7AU.min의 면적을 갖는 단일 피크가 8.5분에서 관찰되었고, 이는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 균주가 글루코스로부터 직접 메타크릴산을 생성한다는 것을 뒷받침한다.
상기 배양액에 2-케토이소발레르산을 보충하는 것이 메타크릴산 생성을 촉진할 수 있는지를 결정하기 위해서, 카르베니실린 및 클로람페니콜이 보충된 2개의 MSX 사전-배양액 (10ml)이 다시 준비되었고, 하나는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD로 접종되었고, 다른 하나는 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)로 전과 같이 접종되었다. 상기 사전-배양액이 250rpm으로 16시간 동안 진탕하면서 37℃에서 인큐베이트되었고, 그 후 세포가 펠렛되었고, 500ml의 진탕 플라스크에서 리보플라빈, 클로람페니콜 및 카르베니실린이 보충된 새로운 MSX 배지 (100ml)에 재-현탁되었다. 각 배양액에서 OD600 0.5에서 IPTG (0.4mM)의 첨가에 의해서 발현이 유도되었고, 배양액이 추가 3시간 동안 인큐베이트된 후에, 각 배양액에서 5mM의 최종 농도로 2-케토이소발레레이트 (pH 7.0)가 첨가되었다. 상기 배양액이 추가의 14시간 동안 인큐베이트되었다. 배양 시료가 채취되었고, 2-케토이소발레르산이 보충되지 않은 배양액에 대해 개시된 바와 같이, 등용매 용리에 의해 고성능 액체 크로마토그래피로 분석되었다.
도 17에 개시된 바와 같이, 무 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+) 네가티브 대조군 배양액에 2-케토이소발레레이트가 첨가되고 14시간 후에 채취된 시료의 HPLC 분석에서 메타크릴산이 기대되는 바와 통상적으로 관찰되는 영역에서 피크가 관찰되지 않았다. 그러나 2-케토이소발레르산의 일부 배경 소비를 보였고 (도 6), 상기 배양액에서 2-케토이소발레르산의 피크 면적은 3353mAU.min이고, 이는 원래 5mM과는 대조적으로 상기 배양액에 남아있는 2-케토이소발레르산 2.8mM에 해당한다.
2-케토시발레르산을 메타크릴산으로 전환하기 위한 유전자를 발현시키는 배양액인 이. 콜리 BL21 (DE3) pLysS pET20b(+)::4HBT-ACX4-ppBCKD 배양액에 2-케토이소발레레이트가 첨가되고 14시간 후에 시료가 채취되었을 때, 피크가 8.4분에 있고, 피크 면적은 HPLC 트레이스에서 나타나는 바와 같이 1890mAU.min이었고 (도 18), 이는 메타크릴산이 0.24mM의 농도로 생성되었음을 나타내었다. 상기 시료에서 2-케토이소발레르산이 검출되지 않았고, 이는 2-케토이소발레르산이 메타크릴산으로 전환하는 동안 완전히 소비된 것을 나타내었다.
상기 시료가 부가의 0.24mM 메타크릴산으로 스파이크되었고, 상기 스파이크된 시료의 분석 (도 19)은 피크 면적 3.4AU.min의 피크를 나타내고, 이는 0.44mM의 메타크릴산 농도에 해당하므로, 상기 원래의 메타크릴산 피크는 진짜였다.
본 실시예에서, 슈도모나스 푸티다 KT2440으로부터의 분지쇄 케토산 데히드로게나제, 즉 BCKD가 세포 시스템에서 아실-CoA 옥시다제, 즉 아라비돕시스 탈리아 나로부터의 ACX4, 및 티오에스테라제 효소, 즉 아트로박터 종 균주 SU로부터의 4HBT와 동시-발현되었다. 재조합 이 . 콜리를 사용하여 바이오매스로부터 용이하게 이용할 수 있는 글루코스와 같은 주요 공급원료로부터 메타크릴산을 생성할 수 있고, 또한 2-케토이소발레르산을 성장 배지에 보충함으로써 상기 메타크릴산의 생성을 증가시킬 수 있음이 증명되었다.
1.7 실시예 5: 재조합 에스케리치아 콜리 에 의해 2- 케토이소발레레이트로 부터 부틸 메타크릴레이트의 전체 세포 생성
에이. 탈리아나로부터의 ACX4 유전자는 이. 콜리에 대해 최적화된 코돈이고, 합성되었고, pET16b (Sse) 벡터로 클로닝되었다. 상기 유전자가 NheI/Sse8387I로 분해되었고, XbaI/Sse8387I로 분해된 pET16b (Sse)로 결찰되었다. 결과의 플라스미드, pMMA121 (도 20 참조)이 이. 콜리 BL21(DE3)로 도입되었고, 재조합 이 . 콜리 (BL21(DE3)/pMMA121)가 하기와 같이 배양되었다; BL21(DE3)/pET16b (벡터 대조군) 또는 BL21(DE3)/pMMA121이 암피실린 (0.1 mg/ml)이 보충된 LB 배지에 접종되었고, 37℃에서 테스트 튜브에서 밤새 성장시켰다. 밤새 배양액의 알리코트 (aliquot)를 플라스크내 동일한 배지 100ml로 옮기고, 37℃에서 2-3시간 동안 진탕시켰다. IPTG (최종 1mM)가 상기 플라스크로 첨가되었고, 상기 배양액이 20℃에서 밤새 진탕하며 인큐베이트되었다.
원심분리에 의해 세포가 수확되었고, 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼 (pH7.0)에 현탁시키고, 그 후 초음파로 분쇄시켰다. 상기 분쇄된 이.콜리 세포가 상층액과 펠렛 분획물로 원심분리되었고, 벡터 대조군 및 pMMA121을 포함하는 세포 둘 다가 ACO (아실-CoA 옥시다제) 활성에 대해 분석되었고 (도 21 참조), SDS-PAGE에 의해서 ACX4 단백질 발현이 분석되었다 (도 22 참조). 도 21은 상기 버퍼 중 IBA-CoA 단독의 존재, 변경되지 않은 플라스미드 pET16b 만을 포함하는 세포를 포함하는 시료내 IBA-CoA 및 소량의 CoA의 존재, 및 플라스미드 pMMA121을 포함하는 세포를 포함하는 시료에서 MAA-CoA, 약간의 IBA-CoA 및 미지의 화합물의 존재를 나타내었다. 그러므로, 높은 ACO 활성이 메타크릴릴 CoA의 생성을 나타내는 BL21/pMMA121의 상층액 분획에서 검출되었고, 이는 도 22의 SDS-PAGE에 의해 검출된 40 kDa 단백질이 ACX4 단백질임을 개시하였다. 상기 SDS-PAGE는 레인 1 - BL21/pET16b (벡터) SF (가용성 분획물); 레인 2 - BL21/pMMA121 SF; 레인 3 - BL21/pET16b IF (불용성 분획물); 레인 4 - BL21/pMMA121 IF; 및 레인 5 - 분자량 마커를 나타내었다. 약 40 kDa, 밴드 (검정 박스로 강조함)가 BL21/pMMA121 레인에서만 관찰되었고, BL21/pET16b (벡터) 레인에서는 관찰되지 않았다.
BCKAD 복합체 유전자가 하기와 같이 슈도모나스 에루기노사 PA01 균주로부터 클로닝되었다. 주형으로서 게놈 DNA를 사용하여 프라이머 BCKAD.F 및 BCKAD.R (1.1.3에서 표)에 의한 PCR 방법에 의해서 BCKAD 복합체 유전자를 코딩하는 전체 유전자 오페론을 포함하는 DNA 단편이 수득되었다. 상기 수득된 단편이 제한 효소 BspHI 및 Sse8387I에 의해 분해되었고, NcoI/Sse8387I (pET16b의 BamH 부위가 Sse8387I 부위로 전환됨) 사이의 벡터 pET16b(Sse)로 삽입되었다. 결과의 플라스미드를 pWA008이라 한다 (도 23 참조).
사과의 AAT 및 에이. 탈리아나 ACX4를 발현시키기 위한 플라스미드가 하기와 같이 제작되었다. AAT 또는 ACX4 유전자를 포함하는 DNA 단편이, 주형으로서 코돈-최적화된 AAT 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 pMMA121을 각각 사용하여, 프라이머 AAT.F 및 AAT.R 또는 ACX4.F 및 ACX4.R (1.1.3에서 표)에 의해서 PCR 방법에 의해 증폭되었다. pET(Sse) 벡터가 제한 효소 NcoI 및 Sse8387I에 의해 분해되었고, In-Fusion HD 클로닝 키트 (Takara Bio)를 사용하여 AAT 유전자를 포함하는 DNA 단편과 결합되었다. 결과의 플라스미드인, pAAT212가 제한 효소 SpeI로 분해되었고, In-Fusion HD 클로닝 키트를 사용하여 ACX4 유전자를 포함하는 DNA 단편과 결합하였다. 결과의 플라스미드인, pMMA133은 T7 프로모터 조절과 AAT 및 ACX4 유전자를 포함하였다 (도 23 참조).
BCKAD, AAT 및 ACX4를 발현시키기 위한 플라스미드가 하기와 같이 제작되었다. 플라스미드 pMMA133이 제한 효소 SpeI 및 Sse8387I로 분해되었고, 선형화된 DNA 단편이 수득되었다. 플라스미드 pWA008이 제한 효소 XbaI 및 Sse8387I로 분해되었고, BCKAD 복합체 유전자를 포함하는 5.0 kb 단편이 단리되었다. 두 단편들이 DNA 결찰 키트 'Mighty Mix' (Takara Bio Inc. 제조)를 사용하여 결찰되었다. 결과의 플라스미드 pMMA134 (도 23 참조)가 부틸 메타크릴레이트 생성 실험을 위해 이. 콜리 BL21(DE3)로 도입되었다.
이. 콜리 BL21(DE3)/ pMMA134가 ACX4의 발현과 관련하여 상기에 개시된 바와 기본적으로 동일한 방식으로 배양되었다. 세포가 원심분리에 의해 수확되었고, 0.1M 소듐 포스페이트 버퍼 (pH7.0)로 세척되었고, 동일한 버퍼에 현탁되어서 세포 현탁액이 수득되었다. 세포 현탁액을 사용하여, 약 1 ml의 남아 있는 세포 반응 용액이 각 바이알에서 제조되었고, 이는 40mM 2-케토이소발레레이트 (2-옥소이소발레레이트), 60mM 부탄올, 0.05 M 소듐 포스페이트 버퍼 (pH7.0) 및 세포 (OD650=12.5)를 포함하였다. 상기 반응이 30℃에서, 180 rpm으로 3 내지 44시간 동안 수행되었고, 1 ml의 아세토니트릴이 상기 바이알로 첨가되었고, 잘 혼합하여 반응을 정지시켰다. 시린지 필터 (syringe filter) DISMIC/hole 직경 0.45 미크론 (ADVANTEC에 의해 제조)을 사용하여 여과한 후에, ODS 컬럼에서 HPLC에 의해 분석이 실시되었다. 상기 HPLC 조건은 하기와 같다: 장치: Waters 2695, 컬럼: CAPCELL PAK C18 UG120, 2.0 mmI.D. x 250 mm, 이동상: 0.1% 인산 / 65% 메탄올, 유량: 0.25 ml/min, 실행 시간: 12분, 컬럼 온도: 35C 및 검출: UV 210 nm. 도 24는 발효 시간에 대한 하기 화학물질의 농도를 나타내었다: ■, 2-케토이소발레레이트 (2-OIV); ▲, 이소부티르산(IBA); ◆, 부틸 메타크릴레이트 (BMA): 및 ×, 메타크릴산(MAA). 2-케토이소발레레이트 (2-옥소이소발레레이트)의 공급원료의 농도가 떨어지면, 이소부티르산 경로에서 중간체의 생성이 증가하여, 최종 에스테르 생성물인 부틸 메타크릴레이트의 생성도 증가될 것이다.
본 실시예는 글루코스로부터 직접 생성되는 생화학적 중간체인 2-케토이소 발레레이트 (2-옥소이소발레레이트) 및 통상적인 산업적 공급원료인 시약 부탄올로부터 메타크릴산 유도체인, 메타크릴레이트 에스테르 부틸 메타크릴레이트의 실행가능한 인 비보 생성을 입증하였다. 2-케토이소발레레이트를 이소부티릴 CoA로 전환시키는 BCKAD 오페론, 이소부티릴 CoA를 메타크릴릴 CoA로 전환시키는 ACX4 옥시다제, 및 메타크릴릴 CoA를 부틸 메타크릴레이트로 부탄올과 반응에 의해 전환시키는 AAT를 발현시키는 재조합 이 . 콜리 세포의 배양으로부터 산업적으로 적용가능한 수준으로 부틸 메타크릴레이트의 생성이 입증되었다.
본 출원과 관련된 본 명세서와 동시에 또는 그 이전에 출원되고, 본 명세서와 함께 공중에 공개된 모든 논문 및 문헌들에 주목하며, 이러한 모든 논문 및 문헌들의 내용은 참조로 본 명세서에 통합된다.
본 명세서 (수반하는 청구범위, 요약서 및 도면을 모두 포함)에 개시된 모든 특징들 및/또는 본 명세서에 개시된 방법 또는 공정의 모든 단계는 임의의 조합으로 조합될 수 있으나, 단 이러한 특징들 및/또는 단계들 중 적어도 일부가 상호 배타적인 조합은 제외된다.
본 명세서 (수반하는 청구범위, 요약서 및 도면을 모두 포함)에 개시된 각각의 특징은, 달리 명백히 언급하지 않는 한, 동일하거나, 균등하거나 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백히 언급하지 않는 한, 개시된 각각의 특징은 단지 균등한 또는 유사한 특징들의 일반적인 시리즈 중 일 예이다.
본 발명은 상기한 구현예(들)의 상세한 설명에 제한되지 않는다. 본 발명은 본 명세서 (수반하는 특허청구범위, 요약 및 도면 모두를 포함함)에 개시된 신규 특징들, 또는 특징들의 신규 조합, 또는 본 명세서에 개시된 방법 또는 공정의 신규 단계, 또는 단계들의 신규 조합까지 확장된다.
SEQUENCE LISTING <110> Lucite International UK Limited <120> Process for the Biological Production of Methacrylic Acid <130> P31059WO <150> GB1508582.2 <151> 2015-05-19 <150> GB1517545.8 <151> 2015-10-05 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 471 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimised 4-hydroxybenzoyl-coA thioesterase (4HBT) from Arthrobacter sp. strain SU <400> 1 tatacatatg caccgtacct ctaacggttc tcacgcgacc ggtggtaacc tgccggatgt 60 tgcttctcat tacccggttg cgtacgaaca gaccctggac ggcaccgtgg gtttcgttat 120 cgacgaaatg accccggaac gtgcgaccgc gtctgttgaa gttaccgaca ccctgcgtca 180 gcgttggggt ctggttcacg gtggtgctta ctgcgcactg gcggagatgc tggcgaccga 240 agcgaccgtt gcggttgtgc acgaaaaggg tatgatggcg gttggccagt ctaaccacac 300 ctctttcttc cgtccggtta aagaaggtca cgttcgcgcg gaagctgttc gcatccacgc 360 gggttctacc acctggttct gggacgtttc cctgcgcgat gatgcgggtc gcctgtgtgc 420 ggtgtcttct atgtctatcg cggtgcgtcc gcgtcgtgac taagcggccg c 471 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HHT.F forward primer for cloning of 4-HBT <400> 2 tatacatatg caccgtacct ctaacggttc tcacgc 36 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HHT.R reverse primer for cloning of 4HBT <400> 3 ctcgagtccg tcacgacgcg gacg 24 <210> 4 <211> 469 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Product of the PCR performed to modify the 4HBT gene for sub cloning into the pET20b(+) plasmid to form the pET20b(+)::CtHis 4HBT plasmid. <400> 4 tatacatatg caccgtacct ctaacggttc tcacgcgacc ggtggtaacc tgccggatgt 60 tgcttctcat tacccggttg cgtacgaaca gaccctggac ggcaccgtgg gtttcgttat 120 cgacgaaatg accccggaac gtgcgaccgc gtctgttgaa gttaccgaca ccctgcgtca 180 gcgttggggt ctggttcacg gtggtgctta ctgcgcactg gcggagatgc tggcgaccga 240 agcgaccgtt gcggttgtgc acgaaaaggg tatgatggcg gttggccagt ctaaccacac 300 ctctttcttc cgtccggtta aagaaggtca cgttcgcgcg gaagctgttc gcatccacgc 360 gggttctacc acctggttct gggacgtttc cctgcgcgat gatgcgggtc gcctgtgtgc 420 ggtgtcttct atgtctatcg cggtgcgtcc gcgtcgtgac ggactcgag 469 <210> 5 <211> 483 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> carboxy-terminal hexahistidine tagged 4HBT in the pET20b(+)::CtHis-4HBT plasmid <400> 5 atgcaccgta cctctaacgg ttctcacgcg accggtggta acctgccgga tgttgcttct 60 cattacccgg ttgcgtacga acagaccctg gacggcaccg tgggtttcgt tatcgacgaa 120 atgaccccgg aacgtgcgac cgcgtctgtt gaagttaccg acaccctgcg tcagcgttgg 180 ggtctggttc acggtggtgc ttactgcgca ctggcggaga tgctggcgac cgaagcgacc 240 gttgcggttg tgcacgaaaa gggtatgatg gcggttggcc agtctaacca cacctctttc 300 ttccgtccgg ttaaagaagg tcacgttcgc gcggaagctg ttcgcatcca cgcgggttct 360 accacctggt tctgggacgt ttccctgcgc gatgatgcgg gtcgcctgtg tgcggtgtct 420 tctatgtcta tcgcggtgcg tccgcgtcgt gacggactcg agcaccacca ccaccaccac 480 tga 483 <210> 6 <211> 1320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimised acyl-coA oxidase 4 (ACX4) from Arabidopsis thaliana <400> 6 catatggcag ttctgagcag cgcagatcgt gcaagcaatg aaaaaaaagt gaaaagcagc 60 tatttcgacc tgcctccgat ggaaatgagc gttgcatttc cgcaggcaac accggcaagc 120 acctttccgc cttgtaccag cgattattat cattttaatg atctgctgac ccctgaagaa 180 caggccattc gtaaaaaagt tcgtgagtgc atggaaaaag aagtggcacc gattatgacc 240 gaatattggg aaaaagcaga attcccgttt catattaccc cgaaactggg tgcaatgggt 300 gttgccggtg gtagcattaa aggttatggt tgtccgggtc tgagcattac cgcaaatgca 360 attgcaaccg cagaaattgc acgtgttgat gcaagctgta gcacctttat tctggttcat 420 agcagcctgg gtatgctgac cattgcactg tgtggtagcg aagcacagaa agaaaaatat 480 ctgccgagcc tggcacagct gaataccgtt gcatgttggg cactgaccga accggataat 540 ggtagtgatg caagcggtct gggcaccacc gcaaccaaag ttgaaggtgg ttggaaaatt 600 aacggtcaga aacgttggat tggcaatagc acctttgcag atctgctgat tatctttgca 660 cgtaatacca ccaccaatca gattaacggc ttcatcgtta aaaaagatgc accgggtctg 720 aaagcaacca aaattccgaa caaaattggt ctgcgtatgg tgcagaatgg tgatattctg 780 ctgcagaatg tttttgtgcc ggatgaagat cgtctgcctg gtgttaatag ctttcaggat 840 accagcaaag ttctggcagt tagccgtgtt atggttgcat ggcagccgat tggtattagc 900 atgggtattt atgatatgtg ccaccgctat ctgaaagaac gtaaacagtt tggtgcaccg 960 ctggcagcat ttcagctgaa tcagcagaaa ctggttcaga tgctgggtaa tgttcaggca 1020 atgtttctga tgggttggcg tctgtgtaaa ctgtatgaaa ccggtcagat gacaccgggt 1080 caggcaagcc tgggtaaagc atggattagc agcaaagcac gtgaaaccgc cagcctgggt 1140 cgtgaactgc tgggtggtaa tggtattctg gcagattttc tggttgcaaa agcattttgt 1200 gatctggaac cgatctatac ctatgaaggc acctatgata tcaataccct ggttaccggt 1260 cgtgaagtta ccggtattgc aagctttaaa ccggcaaccc gtagccgtct gtaactcgag 1320 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OE.A.F forward primer for overlap extension polymerase chain reaction A <400> 7 acatatgcac cgtacctcta acggttc 27 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OE.A.R reverse primer for overlap extension polymerisation chain reaction B <400> 8 ctgccatatc tatatctcct gttagtcacg acgcggacg 39 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OE.B.F forward primer for overlap extension polymerase chain reaction B <400> 9 gtgactaaca ggagatatag atatggcagt tctgagcagc 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OE.B.R reverse primer for overlap polymerase chain reaction B <400> 10 ctcgagatat tatagctagc ttacagacgg ctacgggttg 40 <210> 11 <211> 1805 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> product of the overlap polymerase chain reaction to concatenate 4HBT and ACX4 into one polynucleotide <400> 11 acatatgcac cgtacctcta acggttctca cgcgaccggt ggtaacctgc cggatgttgc 60 ttctcattac ccggttgcgt acgaacagac cctggacggc accgtgggtt tcgttatcga 120 cgaaatgacc ccggaacgtg cgaccgcgtc tgttgaagtt accgacaccc tgcgtcagcg 180 ttggggtctg gttcacggtg gtgcttactg cgcactggcg gagatgctgg cgaccgaagc 240 gaccgttgcg gttgtgcacg aaaagggtat gatggcggtt ggccagtcta accacacctc 300 tttcttccgt ccggttaaag aaggtcacgt tcgcgcggaa gctgttcgca tccacgcggg 360 ttctaccacc tggttctggg acgtttccct gcgcgatgat gcgggtcgcc tgtgtgcggt 420 gtcttctatg tctatcgcgg tgcgtccgcg tcgtgactaa caggagatat agatatggca 480 gttctgagca gcgcagatcg tgcaagcaat gaaaaaaaag tgaaaagcag ctatttcgac 540 ctgcctccga tggaaatgag cgttgcattt ccgcaggcaa caccggcaag cacctttccg 600 ccttgtacca gcgattatta tcattttaat gatctgctga cccctgaaga acaggccatt 660 cgtaaaaaag ttcgtgagtg catggaaaaa gaagtggcac cgattatgac cgaatattgg 720 gaaaaagcag aattcccgtt tcatattacc ccgaaactgg gtgcaatggg tgttgccggt 780 ggtagcatta aaggttatgg ttgtccgggt ctgagcatta ccgcaaatgc aattgcaacc 840 gcagaaattg cacgtgttga tgcaagctgt agcaccttta ttctggttca tagcagcctg 900 ggtatgctga ccattgcact gtgtggtagc gaagcacaga aagaaaaata tctgccgagc 960 ctggcacagc tgaataccgt tgcatgttgg gcactgaccg aaccggataa tggtagtgat 1020 gcaagcggtc tgggcaccac cgcaaccaaa gttgaaggtg gttggaaaat taacggtcag 1080 aaacgttgga ttggcaatag cacctttgca gatctgctga ttatctttgc acgtaatacc 1140 accaccaatc agattaacgg cttcatcgtt aaaaaagatg caccgggtct gaaagcaacc 1200 aaaattccga acaaaattgg tctgcgtatg gtgcagaatg gtgatattct gctgcagaat 1260 gtttttgtgc cggatgaaga tcgtctgcct ggtgttaata gctttcagga taccagcaaa 1320 gttctggcag ttagccgtgt tatggttgca tggcagccga ttggtattag catgggtatt 1380 tatgatatgt gccaccgcta tctgaaagaa cgtaaacagt ttggtgcacc gctggcagca 1440 tttcagctga atcagcagaa actggttcag atgctgggta atgttcaggc aatgtttctg 1500 atgggttggc gtctgtgtaa actgtatgaa accggtcaga tgacaccggg tcaggcaagc 1560 ctgggtaaag catggattag cagcaaagca cgtgaaaccg ccagcctggg tcgtgaactg 1620 ctgggtggta atggtattct ggcagatttt ctggttgcaa aagcattttg tgatctggaa 1680 ccgatctata cctatgaagg cacctatgat atcaataccc tggttaccgg tcgtgaagtt 1740 accggtattg caagctttaa accggcaacc cgtagccgtc tgtaagctag ctataatatc 1800 tcgag 1805 <210> 12 <211> 1663 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimised acyl-CoA synthetase (acsA) from Pseudomonas chlororaphis B23 <400> 12 gctagcagga gatatacata tgcgcgacta cgaacacgtt gtggaatctt tcgactacct 60 gcagagcgca acccaggacc tgcatggcga actgactgct ctgaacgcgt gtgtggagtg 120 ctgtgatcgt cacgcgcacg gcgaggctgt tgctctgtat tgcgaagcgc aggatggcca 180 cgcggaacgc taccgtttcc gcgatctgca gcgccaggct gcacgttttg gcaacttcct 240 gcgtgagcag ggcgtgaaac cgggcgaccg tgttgcgggc ctgatgccgc gtaccgtgga 300 actgctgatc gcaatcctgg gcacttggcg catcggtgcg gtttatcagc cgctgtttac 360 tgcgttcggt ccgaaagcaa ttgagcagcg tctgaactgt tctaacgcac gctggattgt 420 gaccgatccg cacaaccgcc cgaaactgga cgacgttacc gactgcccgt ctattgtggt 480 taccggtggc gcaccgcaga acccggcaga ccatcacttt tggtccgcac tgaaccgtca 540 ggcggatgac tgtgcgccgg tgctgctgga cgcatctgca ccgttcctgc tgatgtgcac 600 ctccggcacc actggtccgg caaagccgct ggaagttccg ctgtctgcga ttctggcatt 660 taaaggttac atgcgtgatg caatcgacct gcgcgctgat gatcgcttct ggaacctggc 720 agatccgggt tgggcatacg gtctgtacta cgcggtgact ggcccgctgg cgtgtggcta 780 cgcgaccctg ttttacgacg gtccgttcac tgttgaatcc acccgtcaca tcatcgcgaa 840 atacgcgatt aacaacctgg cgggtagccc gaccgcttac cgctttctga ttgctgcagg 900 cgcggaattt gcggacgctg ttcgtggtcg tctgcgtgca gttagcagcg cgggtgaacc 960 gctgaacccg caggtggttc gttggtttgc tgaacagctg ggtgttgtta tccatgacca 1020 ctatggtcag accgaaattg gtatggttct gtgcaaccac cacggcctgc gtcacccggt 1080 tcgcgagggt agcgctggct atgcagtgcc gggctatcgt atcgtggtgc tggataaagc 1140 acaccgtgag ctgccggctg gtcagccggg tgttctggcg gtggaccgtg aacgctcccc 1200 gctgtgctgg tttgacggct acctgggtat gccgactcag gcgttcgcgg gtcgttatta 1260 cctgtctggt gatatcgttg aactgaacga cgatggcagc atctctttcg tgggtcgcaa 1320 cgatgatctg atcaccacct ctggttatcg tgtgggcccg ttcgacgttg agtctgcact 1380 gattgaacat ccggcagttg ttgaagctgc tgttatcggt aaaccggacc cgcagcgtac 1440 tgagctgatt aaagcgtttg ttgttctgaa cactccgtac ctgccgagcc cggaactggc 1500 ggaagaactg cgtctgcatg ttcgtcagcg cctggctgcg cacgcatatc cgcgcgagat 1560 ggagtttgtg gaccatctgc cgaaaacccc gtctggcaaa ctgcagcgtt tcattctgcg 1620 taaccaggaa atcgctaagc agcaggctct gggttaactc gag 1663 <210> 13 <211> 3447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The sequence between, and inclusive of, the NdeI and XhoI restriction sites in pET20b(+)::4HBT ACX4 AcsA. <400> 13 catatgcacc gtacctctaa cggttctcac gcgaccggtg gtaacctgcc ggatgttgct 60 tctcattacc cggttgcgta cgaacagacc ctggacggca ccgtgggttt cgttatcgac 120 gaaatgaccc cggaacgtgc gaccgcgtct gttgaagtta ccgacaccct gcgtcagcgt 180 tggggtctgg ttcacggtgg tgcttactgc gcactggcgg agatgctggc gaccgaagcg 240 accgttgcgg ttgtgcacga aaagggtatg atggcggttg gccagtctaa ccacacctct 300 ttcttccgtc cggttaaaga aggtcacgtt cgcgcggaag ctgttcgcat ccacgcgggt 360 tctaccacct ggttctggga cgtttccctg cgcgatgatg cgggtcgcct gtgtgcggtg 420 tcttctatgt ctatcgcggt gcgtccgcgt cgtgactaac aggagatata gatatggcag 480 ttctgagcag cgcagatcgt gcaagcaatg aaaaaaaagt gaaaagcagc tatttcgacc 540 tgcctccgat ggaaatgagc gttgcatttc cgcaggcaac accggcaagc acctttccgc 600 cttgtaccag cgattattat cattttaatg atctgctgac ccctgaagaa caggccattc 660 gtaaaaaagt tcgtgagtgc atggaaaaag aagtggcacc gattatgacc gaatattggg 720 aaaaagcaga attcccgttt catattaccc cgaaactggg tgcaatgggt gttgccggtg 780 gtagcattaa aggttatggt tgtccgggtc tgagcattac cgcaaatgca attgcaaccg 840 cagaaattgc acgtgttgat gcaagctgta gcacctttat tctggttcat agcagcctgg 900 gtatgctgac cattgcactg tgtggtagcg aagcacagaa agaaaaatat ctgccgagcc 960 tggcacagct gaataccgtt gcatgttggg cactgaccga accggataat ggtagtgatg 1020 caagcggtct gggcaccacc gcaaccaaag ttgaaggtgg ttggaaaatt aacggtcaga 1080 aacgttggat tggcaatagc acctttgcag atctgctgat tatctttgca cgtaatacca 1140 ccaccaatca gattaacggc ttcatcgtta aaaaagatgc accgggtctg aaagcaacca 1200 aaattccgaa caaaattggt ctgcgtatgg tgcagaatgg tgatattctg ctgcagaatg 1260 tttttgtgcc ggatgaagat cgtctgcctg gtgttaatag ctttcaggat accagcaaag 1320 ttctggcagt tagccgtgtt atggttgcat ggcagccgat tggtattagc atgggtattt 1380 atgatatgtg ccaccgctat ctgaaagaac gtaaacagtt tggtgcaccg ctggcagcat 1440 ttcagctgaa tcagcagaaa ctggttcaga tgctgggtaa tgttcaggca atgtttctga 1500 tgggttggcg tctgtgtaaa ctgtatgaaa ccggtcagat gacaccgggt caggcaagcc 1560 tgggtaaagc atggattagc agcaaagcac gtgaaaccgc cagcctgggt cgtgaactgc 1620 tgggtggtaa tggtattctg gcagattttc tggttgcaaa agcattttgt gatctggaac 1680 cgatctatac ctatgaaggc acctatgata tcaataccct ggttaccggt cgtgaagtta 1740 ccggtattgc aagctttaaa ccggcaaccc gtagccgtct gtaagctagc aggagatata 1800 catatgcgcg actacgaaca cgttgtggaa tctttcgact acctgcagag cgcaacccag 1860 gacctgcatg gcgaactgac tgctctgaac gcgtgtgtgg agtgctgtga tcgtcacgcg 1920 cacggcgagg ctgttgctct gtattgcgaa gcgcaggatg gccacgcgga acgctaccgt 1980 ttccgcgatc tgcagcgcca ggctgcacgt tttggcaact tcctgcgtga gcagggcgtg 2040 aaaccgggcg accgtgttgc gggcctgatg ccgcgtaccg tggaactgct gatcgcaatc 2100 ctgggcactt ggcgcatcgg tgcggtttat cagccgctgt ttactgcgtt cggtccgaaa 2160 gcaattgagc agcgtctgaa ctgttctaac gcacgctgga ttgtgaccga tccgcacaac 2220 cgcccgaaac tggacgacgt taccgactgc ccgtctattg tggttaccgg tggcgcaccg 2280 cagaacccgg cagaccatca cttttggtcc gcactgaacc gtcaggcgga tgactgtgcg 2340 ccggtgctgc tggacgcatc tgcaccgttc ctgctgatgt gcacctccgg caccactggt 2400 ccggcaaagc cgctggaagt tccgctgtct gcgattctgg catttaaagg ttacatgcgt 2460 gatgcaatcg acctgcgcgc tgatgatcgc ttctggaacc tggcagatcc gggttgggca 2520 tacggtctgt actacgcggt gactggcccg ctggcgtgtg gctacgcgac cctgttttac 2580 gacggtccgt tcactgttga atccacccgt cacatcatcg cgaaatacgc gattaacaac 2640 ctggcgggta gcccgaccgc ttaccgcttt ctgattgctg caggcgcgga atttgcggac 2700 gctgttcgtg gtcgtctgcg tgcagttagc agcgcgggtg aaccgctgaa cccgcaggtg 2760 gttcgttggt ttgctgaaca gctgggtgtt gttatccatg accactatgg tcagaccgaa 2820 attggtatgg ttctgtgcaa ccaccacggc ctgcgtcacc cggttcgcga gggtagcgct 2880 ggctatgcag tgccgggcta tcgtatcgtg gtgctggata aagcacaccg tgagctgccg 2940 gctggtcagc cgggtgttct ggcggtggac cgtgaacgct ccccgctgtg ctggtttgac 3000 ggctacctgg gtatgccgac tcaggcgttc gcgggtcgtt attacctgtc tggtgatatc 3060 gttgaactga acgacgatgg cagcatctct ttcgtgggtc gcaacgatga tctgatcacc 3120 acctctggtt atcgtgtggg cccgttcgac gttgagtctg cactgattga acatccggca 3180 gttgttgaag ctgctgttat cggtaaaccg gacccgcagc gtactgagct gattaaagcg 3240 tttgttgttc tgaacactcc gtacctgccg agcccggaac tggcggaaga actgcgtctg 3300 catgttcgtc agcgcctggc tgcgcacgca tatccgcgcg agatggagtt tgtggaccat 3360 ctgccgaaaa ccccgtctgg caaactgcag cgtttcattc tgcgtaacca ggaaatcgct 3420 aagcagcagg ctctgggtta actcgag 3447 <210> 14 <211> 4996 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ppBCKD polynucleotide containing the four genes encoding the subunits of the Pseudomonas putida KT2440 branched chain keto acid dehydrogenase delivered in the pBSK::ppBCKD plasmid <400> 14 tctagaaata attttgttta actgctagca ggagaaatta actatgaacg agtacgcccc 60 cctgcgtttg catgtgcccg agcccaccgg ccggccaggc tgccagaccg atttttccta 120 cctgcgcctc aacgatgcag gtcaagcccg taaacccgcg atcgatgtcg atgctgccga 180 cactgccgac ctgtcctaca gcctggtccg cgtgctcgac gagcaaggcg atgcgcaagg 240 cccctgggcc gaagacatcg acccgcagat cctccgtcaa ggcatgcgcg ccatgctcaa 300 gacgcggatc ttcgacagcc gcatggtggt tgcccagcgc cagaagaaga tgtccttcta 360 catgcaaagc ctgggcgaag aagccatcgg cagcggccag gcgctggcgc tgaaccgcac 420 cgacatgtgc ttcccgacct accgccagca aagcatcctg atggcccgcg acgtgtcgct 480 ggtcgagatg atctgccaac tgctgtccaa cgagcgcgac cccctcaagg gccgccagtt 540 gccgatcatg tattcggtgc gcgaagccgg cttcttcacc atcagcggca acctggcgac 600 ccagttcgtg caggcggtcg gctgggccat ggcatcggcg atcaagggcg ataccaagat 660 cgcctcggca tggatcggtg acggcgctac tgccgagtcg gacttccaca ccgcccttac 720 ctttgcccac gtataccgcg ccccggtcat cctcaacgtg gtcaacaacc aatgggccat 780 ttccaccttc caggccatcg ccggtggcga gtcgaccacc tttgccggcc gtggcgtggg 840 ttgcggtatt gcttcgctgc gggttgacgg caacgacttc gtcgccgtgt acgctgcctc 900 gcgctgggcg gccgagcgcg cccgccgcgg cctgggccca agcctgatcg agtgggtcac 960 ctaccgtgcc ggcccgcact cgacgtcgga cgacccctcc aagtaccgcc ctgccgacga 1020 ctggagccac ttcccgctgg gtgacccgat cgcccgcctg aagcagcacc tgatcaagat 1080 cggccactgg tccgaggaag aacaccaggc cgtcacggcc gagctcgaag ctgcggtgat 1140 tgccgcacag aaagaagccg agcagtacgg caccctggcc aacgggcaca tcccgagcgc 1200 cgcctcgatg ttcgaggatg tgtacaagga aatgcccgac cacctgcgcc gtcaacgcca 1260 ggaactgggg gtttgagatg aacgaccaca acaacagcat caacccggaa accgccatgg 1320 ccaccactac catgaccatg atccaggccc tgcgctcggc catggatgtc atgcttgagc 1380 gcgacgacaa tgtggtggtg tacggccagg acgtcggtta cttcggcggc gtgttccgct 1440 gcaccgaagg cctgcagaac aagtacggca aatcgcgcgt gttcgacgcg cccatctccg 1500 agagcggcat cgtcggtacc gccgtgggca tgggtgccta tggcctgcgc ccggtggtgg 1560 agatccagtt cgccgactac ttctacccgg cctccgacca gatcgtctcc gagctggccc 1620 gcctgcgtta ccgttcggcc ggcgagttca ttgccccgct gaccctgcgc atgccttgcg 1680 gcggcggcat ctatggcggc cagactcaca gccagagccc ggaagcgatg ttcacccagg 1740 tgtgcggcct gcgcaccgtg atgccgtcca acccttatga cgccaaaggc ctgttgattg 1800 cctcgatcga atgcgacgac ccggtaatct tcctggagcc caaacgcctg tacaacggcc 1860 cgttcgatgg ccaccacgac cgccctgtaa ccccgtggtc gaagcacccg cacagcgccg 1920 tgcccgacgg ttattacacc gtaccgctgg acaaggccgc cattacccgc cctggcaatg 1980 acgtgaccgt gctgacctac ggcaccacgg tgtacgtggc ccaggtggcc gccgaagaaa 2040 gcggcgtcga tgccgaagtg atcgacctgc gcagcctgtg gccgctggac ctggacacta 2100 tcgtcgagtc ggtgaaaaag accggccgtt gcgtggtggt gcacgaggcc acccgcacct 2160 gcggcttcgg tgccgagctg gtgtcgctgg tgcaggagca ctgcttccac cacctggagg 2220 cgccgatcga acgcgtcacc ggctgggaca ccccctaccc tcacgcacag gaatgggctt 2280 acttcccagg cccttcgcgg gtaggtgcgg cactgaaaaa ggtcatggag gtctgaatgg 2340 gcacgcacgt catcaagatg ccggacattg gcgaaggcat cgcgcaggtc gagttggtgg 2400 aatggttcgt caaggtcggc gacatcatcg ccgaggacca ggtggtggcc gacgtcatga 2460 ccgacaaggc caccgtggaa atcccctcgc cggtcagcgg caaggtgttg gccctgggtg 2520 gccagcccgg ggaagtgatg gcggtcggta gcgaactgat ccgcatcgaa gtggaaggca 2580 gcggcaacca tgtggatgtg cctcagccaa aaccggtaga ggccccggct gcccccattg 2640 cagccaagcc ggaaccgcag aaagacgtaa aacccgccgt gtaccaggcg cccgccaacc 2700 acgaagctgc gcccatcgtg ccgcgccagc cgggcgacaa gccgctggcc tcgcctgccg 2760 tgcgcaaacg cgccctggac gccggtatcg aactgcgtta tgtgcatggt agcggcccgg 2820 ccgggcgtat tctgcacgaa gacctcgatg ccttcatgag caagccgcaa agcaatgccg 2880 ggcaagcacc tgatggttat gccaagcgca ccgacagcga gcaggtgcca gtgatcggcc 2940 tgcgccgcaa gattgcccag cgcatgcagg acgccaaacg ccgggtcgcg cacttcagtt 3000 atgtcgagga aatcgacgtc accgccctgg aggccctgcg ccagcaactc aacagcaagc 3060 acggcgacag ccggggcaag ctgaccttgc tgccattcct ggtacgcgcc ctggtcgtgg 3120 cgctgcgtga cttcccgcag atcaacgcga cctacgatga cgaagcgcag atcatcaccc 3180 gccatggcgc ggtgcatgtg ggcattgcca cccaaggtga caacggcctg atggtgcccg 3240 tgctgcgcca cgccgaagcg ggcagcctgt gggccaatgc cggcgagatt tcgcgcctgg 3300 ccaacgctgc acgtaacaac aaggccagcc gtgaagagct gtccggctcg accatcaccc 3360 tgaccagcct tggcgccctg ggtggcattg tcagcacgcc ggtggtcaac accccggaag 3420 tggcaatcgt cggggtcaac cgcatggtcg aacggccagt ggtgatcgac ggccagatcg 3480 tcgtgcgcaa gatgatgaac ctgtccagct cgttcgacca ccgcgtggtc gatggcatgg 3540 atgccgccct gttcatccag gccgtacgtg gcctgctcga acaacccgcc tgcctgttcg 3600 tggagtgagc atgcaacaga ttatccagac taccctgttg atcatcggcg gcggccctgg 3660 cggctatgta gcagccatcc gcgccgggca actgggcatt cctaccgtac tggtggaagg 3720 ccaggcactg ggcggcacct gcctgaacat cggctgcatc ccgtccaagg cgctgatcca 3780 cgtggccgag cagtttcacc aggcctcgcg ctttaccgaa ccctcgccgc tgggcatcag 3840 cgtggcttcg ccgcgcctgg acatcggcca gagcgtcacc tggaaggacg gcattgtcga 3900 ccgcctgacc acaggtgttg ccgccctgct gaaaaagcac ggggtgaaag tggtgcatgg 3960 ttgggccaag gtactggacg gcaagcaggt cgaggtcgat ggccagcgta tccagtgcga 4020 gcatctgttg ctggcgaccg gttccagcag tgtcgaactg cctatgctgc cgctgggtgg 4080 cccggtgatt tcctcgaccg aagccctggc gccgaaaacc ctgccgcaac acctggtggt 4140 ggtcggcggt ggctatatcg gcctggagct gggcattgcc tatcgcaagc tgggtgcaca 4200 ggtgagtgtg gtggaagcgc gggagcgcat cctgccgacc tacgacagcg aattgaccgc 4260 cccggtggcc gagtcgctga agaaactggg catagcgttg cacctgggcc acagcgtcga 4320 gggctacgaa aatggctgcc tgctggccag cgacggcaag ggtgggcaac tgcgccttga 4380 ggccgaccag gtactggtgg ccgtgggacg ccggccacgc accaagggct tcaacctgga 4440 atgcctggac ctgaagatga acggcgccgc cattgccatc gacgagcgct gtcacaccag 4500 catgcacaac gtctgggcca tcggcgacgt cgctggcgaa ccgatgctgg cgcaccgggc 4560 catggcccag ggcgagatgg tcgccgaaat catcgccggc aaggcccgac gctttgaacc 4620 gacagcgatt gccgccgtgt gctttaccga cccggaagtg gtggtggtcg gcaagacccc 4680 ggaacaagcc agccagcagg gcctggactg catcgtcgcg cagttcccgt ttgccgccaa 4740 tggccgggcc atgagcctgg aatcgaaaag cggtttcgtg cgggtggtgg cgcgccgtga 4800 caaccacctg atcgtgggtt ggcaggcggt tggcgtggcg gtctccgagc tatccaccgc 4860 gtttgcccaa tcgctggaga tgggcgcgtg cctggaagat gtggccggta ccattcatgc 4920 ccacccaacg ctcggtgaag cggtacagga agccgcactg cgcgccctgg gccacgcctt 4980 gcatatctga ctcgag 4996 <210> 15 <211> 6758 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The sequence between, and inclusive of, the NdeI and XhoI restriction sites in the pET20b(+)::4HBT ACX4 ppBCKD plasmid <400> 15 acatatgcac cgtacctcta acggttctca cgcgaccggt ggtaacctgc cggatgttgc 60 ttctcattac ccggttgcgt acgaacagac cctggacggc accgtgggtt tcgttatcga 120 cgaaatgacc ccggaacgtg cgaccgcgtc tgttgaagtt accgacaccc tgcgtcagcg 180 ttggggtctg gttcacggtg gtgcttactg cgcactggcg gagatgctgg cgaccgaagc 240 gaccgttgcg gttgtgcacg aaaagggtat gatggcggtt ggccagtcta accacacctc 300 tttcttccgt ccggttaaag aaggtcacgt tcgcgcggaa gctgttcgca tccacgcggg 360 ttctaccacc tggttctggg acgtttccct gcgcgatgat gcgggtcgcc tgtgtgcggt 420 gtcttctatg tctatcgcgg tgcgtccgcg tcgtgactaa caggagatat agatatggca 480 gttctgagca gcgcagatcg tgcaagcaat gaaaaaaaag tgaaaagcag ctatttcgac 540 ctgcctccga tggaaatgag cgttgcattt ccgcaggcaa caccggcaag cacctttccg 600 ccttgtacca gcgattatta tcattttaat gatctgctga cccctgaaga acaggccatt 660 cgtaaaaaag ttcgtgagtg catggaaaaa gaagtggcac cgattatgac cgaatattgg 720 gaaaaagcag aattcccgtt tcatattacc ccgaaactgg gtgcaatggg tgttgccggt 780 ggtagcatta aaggttatgg ttgtccgggt ctgagcatta ccgcaaatgc aattgcaacc 840 gcagaaattg cacgtgttga tgcaagctgt agcaccttta ttctggttca tagcagcctg 900 ggtatgctga ccattgcact gtgtggtagc gaagcacaga aagaaaaata tctgccgagc 960 ctggcacagc tgaataccgt tgcatgttgg gcactgaccg aaccggataa tggtagtgat 1020 gcaagcggtc tgggcaccac cgcaaccaaa gttgaaggtg gttggaaaat taacggtcag 1080 aaacgttgga ttggcaatag cacctttgca gatctgctga ttatctttgc acgtaatacc 1140 accaccaatc agattaacgg cttcatcgtt aaaaaagatg caccgggtct gaaagcaacc 1200 aaaattccga acaaaattgg tctgcgtatg gtgcagaatg gtgatattct gctgcagaat 1260 gtttttgtgc cggatgaaga tcgtctgcct ggtgttaata gctttcagga taccagcaaa 1320 gttctggcag ttagccgtgt tatggttgca tggcagccga ttggtattag catgggtatt 1380 tatgatatgt gccaccgcta tctgaaagaa cgtaaacagt ttggtgcacc gctggcagca 1440 tttcagctga atcagcagaa actggttcag atgctgggta atgttcaggc 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ggcttcttca 2340 ccatcagcgg caacctggcg acccagttcg tgcaggcggt cggctgggcc atggcatcgg 2400 cgatcaaggg cgataccaag atcgcctcgg catggatcgg tgacggcgct actgccgagt 2460 cggacttcca caccgccctt acctttgccc acgtataccg cgccccggtc atcctcaacg 2520 tggtcaacaa ccaatgggcc atttccacct tccaggccat cgccggtggc gagtcgacca 2580 cctttgccgg ccgtggcgtg ggttgcggta ttgcttcgct gcgggttgac ggcaacgact 2640 tcgtcgccgt gtacgctgcc tcgcgctggg cggccgagcg cgcccgccgc ggcctgggcc 2700 caagcctgat cgagtgggtc acctaccgtg ccggcccgca ctcgacgtcg gacgacccct 2760 ccaagtaccg ccctgccgac gactggagcc acttcccgct gggtgacccg atcgcccgcc 2820 tgaagcagca cctgatcaag atcggccact ggtccgagga agaacaccag gccgtcacgg 2880 ccgagctcga agctgcggtg attgccgcac agaaagaagc cgagcagtac ggcaccctgg 2940 ccaacgggca catcccgagc gccgcctcga tgttcgagga tgtgtacaag gaaatgcccg 3000 accacctgcg ccgtcaacgc caggaactgg gggtttgaga tgaacgacca caacaacagc 3060 atcaacccgg aaaccgccat ggccaccact accatgacca tgatccaggc cctgcgctcg 3120 gccatggatg tcatgcttga gcgcgacgac aatgtggtgg tgtacggcca ggacgtcggt 3180 tacttcggcg gcgtgttccg ctgcaccgaa ggcctgcaga acaagtacgg caaatcgcgc 3240 gtgttcgacg cgcccatctc cgagagcggc atcgtcggta ccgccgtggg catgggtgcc 3300 tatggcctgc gcccggtggt ggagatccag ttcgccgact acttctaccc ggcctccgac 3360 cagatcgtct ccgagctggc ccgcctgcgt taccgttcgg ccggcgagtt cattgccccg 3420 ctgaccctgc gcatgccttg cggcggcggc atctatggcg gccagactca cagccagagc 3480 ccggaagcga tgttcaccca ggtgtgcggc ctgcgcaccg tgatgccgtc caacccttat 3540 gacgccaaag gcctgttgat tgcctcgatc gaatgcgacg acccggtaat cttcctggag 3600 cccaaacgcc tgtacaacgg cccgttcgat ggccaccacg accgccctgt aaccccgtgg 3660 tcgaagcacc cgcacagcgc cgtgcccgac ggttattaca ccgtaccgct ggacaaggcc 3720 gccattaccc gccctggcaa tgacgtgacc gtgctgacct acggcaccac ggtgtacgtg 3780 gcccaggtgg ccgccgaaga aagcggcgtc gatgccgaag tgatcgacct gcgcagcctg 3840 tggccgctgg acctggacac tatcgtcgag tcggtgaaaa agaccggccg ttgcgtggtg 3900 gtgcacgagg ccacccgcac ctgcggcttc ggtgccgagc tggtgtcgct ggtgcaggag 3960 cactgcttcc accacctgga ggcgccgatc gaacgcgtca ccggctggga caccccctac 4020 cctcacgcac aggaatgggc ttacttccca ggcccttcgc gggtaggtgc ggcactgaaa 4080 aaggtcatgg aggtctgaat gggcacgcac gtcatcaaga tgccggacat tggcgaaggc 4140 atcgcgcagg tcgagttggt ggaatggttc gtcaaggtcg gcgacatcat cgccgaggac 4200 caggtggtgg ccgacgtcat gaccgacaag gccaccgtgg aaatcccctc gccggtcagc 4260 ggcaaggtgt tggccctggg tggccagccc ggggaagtga tggcggtcgg tagcgaactg 4320 atccgcatcg aagtggaagg cagcggcaac catgtggatg tgcctcagcc aaaaccggta 4380 gaggccccgg ctgcccccat tgcagccaag ccggaaccgc agaaagacgt aaaacccgcc 4440 gtgtaccagg cgcccgccaa ccacgaagct gcgcccatcg tgccgcgcca gccgggcgac 4500 aagccgctgg cctcgcctgc cgtgcgcaaa cgcgccctgg acgccggtat cgaactgcgt 4560 tatgtgcatg gtagcggccc ggccgggcgt attctgcacg aagacctcga tgccttcatg 4620 agcaagccgc aaagcaatgc cgggcaagca cctgatggtt atgccaagcg caccgacagc 4680 gagcaggtgc cagtgatcgg cctgcgccgc aagattgccc agcgcatgca ggacgccaaa 4740 cgccgggtcg cgcacttcag ttatgtcgag gaaatcgacg tcaccgccct ggaggccctg 4800 cgccagcaac tcaacagcaa gcacggcgac agccggggca agctgacctt gctgccattc 4860 ctggtacgcg ccctggtcgt ggcgctgcgt gacttcccgc agatcaacgc gacctacgat 4920 gacgaagcgc agatcatcac ccgccatggc gcggtgcatg tgggcattgc cacccaaggt 4980 gacaacggcc tgatggtgcc cgtgctgcgc cacgccgaag cgggcagcct gtgggccaat 5040 gccggcgaga tttcgcgcct ggccaacgct gcacgtaaca acaaggccag ccgtgaagag 5100 ctgtccggct cgaccatcac cctgaccagc cttggcgccc tgggtggcat tgtcagcacg 5160 ccggtggtca acaccccgga agtggcaatc gtcggggtca accgcatggt cgaacggcca 5220 gtggtgatcg acggccagat cgtcgtgcgc aagatgatga acctgtccag ctcgttcgac 5280 caccgcgtgg tcgatggcat ggatgccgcc ctgttcatcc aggccgtacg tggcctgctc 5340 gaacaacccg cctgcctgtt cgtggagtga gcatgcaaca gattatccag actaccctgt 5400 tgatcatcgg cggcggccct ggcggctatg tagcagccat ccgcgccggg caactgggca 5460 ttcctaccgt actggtggaa ggccaggcac tgggcggcac ctgcctgaac atcggctgca 5520 tcccgtccaa ggcgctgatc cacgtggccg agcagtttca ccaggcctcg cgctttaccg 5580 aaccctcgcc gctgggcatc agcgtggctt cgccgcgcct ggacatcggc cagagcgtca 5640 cctggaagga cggcattgtc gaccgcctga ccacaggtgt tgccgccctg ctgaaaaagc 5700 acggggtgaa agtggtgcat ggttgggcca aggtactgga cggcaagcag gtcgaggtcg 5760 atggccagcg tatccagtgc gagcatctgt tgctggcgac cggttccagc agtgtcgaac 5820 tgcctatgct gccgctgggt ggcccggtga tttcctcgac cgaagccctg gcgccgaaaa 5880 ccctgccgca acacctggtg gtggtcggcg gtggctatat cggcctggag ctgggcattg 5940 cctatcgcaa gctgggtgca caggtgagtg tggtggaagc gcgggagcgc atcctgccga 6000 cctacgacag cgaattgacc gccccggtgg ccgagtcgct gaagaaactg ggcatagcgt 6060 tgcacctggg ccacagcgtc gagggctacg aaaatggctg cctgctggcc agcgacggca 6120 agggtgggca actgcgcctt gaggccgacc aggtactggt ggccgtggga cgccggccac 6180 gcaccaaggg cttcaacctg gaatgcctgg acctgaagat gaacggcgcc gccattgcca 6240 tcgacgagcg ctgtcacacc agcatgcaca acgtctgggc catcggcgac gtcgctggcg 6300 aaccgatgct ggcgcaccgg gccatggccc agggcgagat ggtcgccgaa atcatcgccg 6360 gcaaggcccg acgctttgaa ccgacagcga ttgccgccgt gtgctttacc gacccggaag 6420 tggtggtggt cggcaagacc ccggaacaag ccagccagca gggcctggac tgcatcgtcg 6480 cgcagttccc gtttgccgcc aatggccggg ccatgagcct ggaatcgaaa agcggtttcg 6540 tgcgggtggt ggcgcgccgt gacaaccacc tgatcgtggg ttggcaggcg gttggcgtgg 6600 cggtctccga gctatccacc gcgtttgccc aatcgctgga gatgggcgcg tgcctggaag 6660 atgtggccgg taccattcat gcccacccaa cgctcggtga agcggtacag gaagccgcac 6720 tgcgcgccct gggccacgcc ttgcatatct gactcgag 6758 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCKAD.F forward primer for cloning of BCKAD operon <400> 16 ggcctgtcat gagtgattac gagccg 26 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BCKAD.R reverse primer for cloning of BCKAD operon <400> 17 cggccctgca ggttcgcggg aatcagatgt gc 32 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT.F forward primer for cloning of AAT <400> 18 aggagatata ccatgaaaag cttttctgta ctc 33 <210> 19 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAT.R reverse primer for cloning of AAT <400> 19 agcagccgga tcccctgcag gactagttta ctggctggtg ctac 44 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACX4.F forward primer for cloning of ACX4 <400> 20 caccagccag taagctagca aggagatata ccatggctg 39 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ACX4.R reverse primer for cloning of ACX4 <400> 21 tcccctgcag gactagttta caggcgagaa cgggtag 37 <210> 22 <211> 5652 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pET16b(Sse) expression vector <400> 22 ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 60 aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 120 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 180 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 240 tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 300 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 360 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 420 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 480 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 540 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 600 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 660 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 720 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 780 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 840 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 900 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 960 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 1020 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 1080 agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 1140 ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 1200 ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 1260 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 1320 tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 1380 tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 1440 tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 1500 tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 1560 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 1620 acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 1680 ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 1740 gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 1800 ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 1860 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 1920 taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 1980 cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca 2040 tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc 2100 gcatagttaa gccagtatac actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc 2160 gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt 2220 acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac 2280 cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga 2340 tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc 2400 ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg 2460 tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca 2520 cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac 2580 tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg 2640 ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga 2700 acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga 2760 agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc 2820 gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg 2880 tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga 2940 tgcgccgcgt gcggctgctg gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg 3000 tttgcgcatt cacagttctc cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc 3060 cgttagcgag gtgccgccgg cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg 3120 acgcaacgcg gggaggcaga caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt 3180 ccatgtgctc gccgaggcgg cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt 3240 taggctggta agagccgcga gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg 3300 cctggacagc atggcctgca acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat 3360 aatggggaag gccatccagc ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc 3420 ggccgccatg ccggcgataa tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt 3480 gacgaaggct tgagcgaggg cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat 3540 cgtcgcgctc cagcgaaagc ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg 3600 tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg 3660 cgcccaccgg aaggagctga ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gagatcccgg 3720 tgcctaatga gtgagctaac ttacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3780 gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3840 gcgtattggg cgccagggtg gtttttcttt tcaccagtga gacgggcaac agctgattgc 3900 ccttcaccgc ctggccctga gagagttgca gcaagcggtc cacgctggtt tgccccagca 3960 ggcgaaaatc ctgtttgatg gtggttaacg gcgggatata acatgagctg tcttcggtat 4020 cgtcgtatcc cactaccgag atatccgcac caacgcgcag cccggactcg gtaatggcgc 4080 gcattgcgcc cagcgccatc tgatcgttgg caaccagcat cgcagtggga acgatgccct 4140 cattcagcat ttgcatggtt tgttgaaaac cggacatggc actccagtcg ccttcccgtt 4200 ccgctatcgg ctgaatttga ttgcgagtga gatatttatg ccagccagcc agacgcagac 4260 gcgccgagac agaacttaat gggcccgcta acagcgcgat ttgctggtga cccaatgcga 4320 ccagatgctc cacgcccagt cgcgtaccgt cttcatggga gaaaataata ctgttgatgg 4380 gtgtctggtc agagacatca agaaataacg ccggaacatt agtgcaggca gcttccacag 4440 caatggcatc ctggtcatcc agcggatagt taatgatcag cccactgacg cgttgcgcga 4500 gaagattgtg caccgccgct ttacaggctt cgacgccgct tcgttctacc atcgacacca 4560 ccacgctggc acccagttga tcggcgcgag atttaatcgc cgcgacaatt tgcgacggcg 4620 cgtgcagggc cagactggag gtggcaacgc caatcagcaa cgactgtttg cccgccagtt 4680 gttgtgccac gcggttggga atgtaattca gctccgccat cgccgcttcc actttttccc 4740 gcgttttcgc agaaacgtgg ctggcctggt tcaccacgcg ggaaacggtc tgataagaga 4800 caccggcata ctctgcgaca tcgtataacg ttactggttt cacattcacc accctgaatt 4860 gactctcttc cgggcgctat catgccatac cgcgaaaggt tttgcgccat tcgatggtgt 4920 ccgggatctc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta ggaagcagcc cagtagtagg 4980 ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat gcaaggagat ggcgcccaac 5040 agtcccccgg ccacggggcc tgccaccata cccacgccga aacaagcgct catgagcccg 5100 aagtggcgag cccgatcttc cccatcggtg atgtcggcga tataggcgcc agcaaccgca 5160 cctgtggcgc cggtgatgcc ggccacgatg cgtccggcgt agaggatcga gatctcgatc 5220 ccgcgaaatt aatacgactc actatagggg aattgtgagc ggataacaat tcccctctag 5280 aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatgg cctgcagggg atccggctgc 5340 taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata 5400 accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc 5460 cggatatccc gcaagaggcc cggcagtacc ggcataacca agcctatgcc tacagcatcc 5520 agggtgacgg tgccgaggat gacgatgagc gcattgttag atttcataca cggtgcctga 5580 ctgcgttagc aatttaactg tgataaacta ccgcattaaa gcttatcgat gataagctgt 5640 caaacatgag aa 5652 <210> 23 <211> 1311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimised acyl-coA oxidase 4 (ACX4) from Arabidopsis thaliana for expression in pET16b (Sse) <400> 23 atggctgtcc tgtcaagcgc tgaccgtgcg agcaatgaaa aaaaagtgaa atcttcttac 60 ttcgatctgc cgccgatgga aatgtctgtt gcatttccgc aggcaacgcc ggcatcaacc 120 ttcccgccgt gcacgtcgga ttattaccat tttaacgacc tgctgacccc ggaagaacag 180 gccattcgta aaaaagttcg cgaatgtatg gaaaaagaag tcgcaccgat tatgaccgaa 240 tattgggaaa aagcggaatt tccgttccac attaccccga aactgggtgc gatgggtgtg 300 gccggcggta gtatcaaagg ctacggttgc ccgggtctgt ccattacggc aaatgctatc 360 gcgaccgccg aaattgcacg tgtggatgct tcatgctcga cgttcatcct ggttcatagc 420 tctctgggta tgctgaccat tgcgctgtgt ggctcagaag cccagaaaga aaaatatctg 480 ccgtcgctgg cgcaactgaa cacggtcgca tgttgggctc tgaccgaacc ggataatggc 540 agcgacgcat ctggcctggg taccacggct accaaagtgg aaggcggttg gaaaatcaac 600 ggtcagaaac gttggattgg caatagtacc tttgcggatc tgctgattat cttcgcccgc 660 aacaccacga ccaaccagat caacggtttc atcgtcaaaa aagacgcacc gggcctgaaa 720 gctaccaaaa ttccgaataa aatcggtctg cgcatggtgc agaacggcga tattctgctg 780 caaaatgtgt ttgttccgga tgaagaccgt ctgccgggtg ttaacagttt ccaggacacc 840 agcaaagttc tggcagtcag ccgcgtcatg gtggcttggc aaccgattgg catctctatg 900 ggtatctatg atatgtgcca ccgttacctg aaagaacgta aacagtttgg tgcaccgctg 960 gcagcattcc aactgaacca gcaaaaactg gtccagatgc tgggtaatgt gcaagcaatg 1020 tttctgatgg gctggcgtct gtgtaaactg tatgaaacgg gtcagatgac cccgggtcaa 1080 gcaagcctgg gcaaagcctg gattagttcc aaagcgcgtg aaaccgcaag cctgggtcgt 1140 gaactgctgg gcggtaacgg catcctggcc gattttctgg ttgcaaaagc tttctgcgac 1200 ctggaaccga tctatacgta cgaaggtacc tacgatatta atacgctggt gaccggtcgc 1260 gaagttacgg gcattgcaag cttcaaaccg gctacccgtt ctcgcctgta a 1311 <210> 24 <211> 1368 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> optimised alcohol acyl transferase (AAT) from Apple for expression in pET16b(Sse) <400> 24 atgaaaagct tttctgtact ccaagtcaaa cgcctgcaac cagaactgat tacgccagcg 60 aaatcgaccc cgcaggaaac caaattcctg tctgacatcg atgaccaaga gagcttgcgt 120 gtgcagattc cgatcatcat gtgctataaa gacaacccga gcctgaataa gaatcgcaat 180 ccggttaagg ccattcgtga ggccctgtcc cgtgcgctgg tttactatta cccgctggcg 240 ggtcgtctgc gtgagggtcc gaatcgcaaa ctggtggtgg actgcaatgg tgagggtatt 300 ctgtttgttg aggcgagcgc ggacgtcacc ctggaacagc tgggcgacaa gatcctgccg 360 ccgtgtccgc tgttggaaga gtttctgtac aacttcccgg gcagcgatgg tatcatcgat 420 tgcccgctgc tgctgattca agtcacttgt ctgacgtgtg gtggctttat tctggctctg 480 cgcctgaacc acaccatgtg tgatgcagcg ggtttgttgc tgttcctgac cgccatcgca 540 gagatggccc gtggtgccca cgcaccgagc attctgccgg tgtgggaacg tgaactgctg 600 ttcgcacgtg acccgcctcg tattacttgc gcgcaccatg aatacgagga cgttatcggc 660 catagcgacg gcagctacgc gagcagcaac caaagcaata tggtgcagcg tagcttttac 720 ttcggcgcga aagaaatgcg tgttctgcgc aagcagatcc cgcctcacct gatcagcacg 780 tgcagcacct ttgatttgat taccgcatgc ctgtggaagt gccgtacgct ggcgctgaac 840 atcaacccga aagaagccgt ccgtgtgagc tgtatcgtta acgcgcgtgg taaacacaac 900 aatgttcgcc tgccgctggg ctattacggc aatgcgttcg cattcccggc tgctatctct 960 aaggcagagc cgctgtgtaa gaaccctctg ggttacgccc tggagttggt gaagaaggcg 1020 aaagcgacca tgaatgaaga gtatctgcgc agcgtggcgg atctgctggt tttgcgcggt 1080 cgtccgcaat actccagcac gggttcctat ctgattgtga gcgacaatac ccgcgtgggt 1140 tttggtgatg tcaacttcgg ttggggccag ccagtctttg ctggcccggt caaagcattg 1200 gacctgatta gcttctatgt tcaacataag aacaacacgg aagatggtat cttggttccg 1260 atgtgcctgc cgtcctcggc gatggagcgt ttccaacagg agctggagcg cattacccag 1320 gaaccgaaag aggatatttg caacaatctg cgtagcacca gccagtaa 1368

Claims (54)

  1. 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 제조하는 방법으로서,
    (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 및/또는 그 유도체로 전환시키는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 단계 (b)가 생물학적 또는 화학적으로 수행될 수 있는 것인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게, C1 내지 C20 알킬 에스테르, 가장 바람직하게 C1 내지 C12 알킬 에스테르, 특히 C1 내지 C4 알킬 에스테르 또는 C4 내지 C12 알킬 에스테르인 것인 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 상기 메타크릴산 에스테르는 부틸 메타크릴레이트, 예를 들면 n-부틸메타크릴레이트인 것인 방법.
  5. 청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 메타크릴산 에스테르가 트란스퍼라제의 작용에 의해 생물학적으로 형성되는 것인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 트란스퍼라제는 알코올 아실트란스퍼라제, 적합하게 EC 그룹 넘버 2.3.1.84에 속하는 것인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 알코올 아실트란스퍼라제가 과일 기원 (fruit origin), 가령 사과, 멜론 또는 토마토 기원으로부터 유래되는 것인 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 상기 알코올 아실트란스퍼라제는 알코올, 예를 들면 C1 내지 C12 알코올, 가령 C1 내지 C4 알코올 또는 C4 내지 C12 알코올의 존재하에 작용하여 해당하는 알킬 에스테르를 형성하는 것인 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 알코올은 부탄올인 것인 방법.
  10. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)에서 형성된 메타크릴산을 메타크릴산 에스테르로 전환시키는 단계 (c)를 더 포함하는 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 단계 (c)가 생물학적 또는 화학적으로 수행될 수 있는 것인 방법.
  12. 청구항 10 또는 11에 있어서, 단계 (c)가 에스테라제 (esterase) 또는 히드롤라제 (hydrolase)의 작용에 의해 생물학적으로 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 항에 있어서, 상기 옥시다제는 아실-CoA 옥시다제, 적합하게 EC 그룹 넘버 1.3.3.6에 속하는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 아실-CoA 옥시다제가 하기 효소들의 어느 것으로부터 선택되는 것인 방법: 아라비돕시스 탈리아나 ( Arabidopsis thaliana )로부터의 ACX4, 아트로박터 니코티아네 ( Arthrobacter Nicotianae )로부터의 단쇄 아실-CoA 옥시다제, 비그나 라디아테 ( Vigna radiate)로부터의 퍼옥시솜 (peroxisomal) 아실-CoA 옥시다제, 칸디다 종 ( Candida sp .)으로부터의 아실-CoA 옥시다제 및 칸디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis )로부터의 아실-CoA 옥시다제 4.
  15. 청구항 13 또는 14에 있어서, 상기 아실-CoA 옥시다제는 아라비돕시스 탈리 아나로부터의 ACX4인 것인 방법.
  16. 청구항 1, 2 또는 10 내지 15 중 어느 항에 있어서, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로, 티오에스테라제, 트란스퍼라제, 신테타제, 및/또는 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제의 작용에 의해 전환되는 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 티오에스테라제의 작용에 의해 전환되는 것인 방법.
  18. 청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 티오에스테라제는 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제, 적합하게 EC 그룹 3.1.2.23에 속하는 것인 방법.
  19. 청구항 16 또는 17에 있어서, 상기 티오에스테라제는 EC 그룹 넘버 3.1.2.X에 속하고, 상기 트란스퍼라제는 EC 그룹 넘버 2.8.3.X에 속하는 CoA 트란스퍼라제이고, 상기 신테타제는 EC 그룹 넘버 6.2.1.X에 속하는 산-티올 신테타제이고, 상기 포스포트란스아실라제는 EC 그룹 넘버 2.3.1.X에 속하고, 및 상기 단쇄 지방산 키나제는 EC 그룹 넘버 2.7.2.X에 속하는 것인 방법.
  20. 청구항 16 내지 19 중 어느 항에 있어서, 상기 티오에스테라제가 아트로박터 종 ( Arthrobacter sp.)으로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT, 아트로박터 글로 비포르미스 ( Arthrobacter globiformis )로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT, 슈도모나스 종 (Pseudomonas sp .) 균주 CBS-3으로부터의 4HBT, 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli )로부터의 EntH, 에스케리치아 콜리 또는 헤모필루스 인플루엔제 ( Haemophilus influenzae )로부터의 YciA, 에스케리치아 콜리로부터의 TesA 또는 TesB 및 미코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로부터의 FcoT로부터 선택되고; 상기 CoA 트란스퍼라제가 클로스트리디움 종 (Clostridium sp .) SB4로부터의 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 클로스트리디움 스티클란디이 (Clostridium sticklandii )로부터의 부티릴-CoA:아세토아세테이트 CoA 트란스퍼라제, 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetobutylicum ) ATCC824로부터의 부티레이트:아세토아세테이트 CoA-트란스퍼라제, 및 에스케리치아 콜리로부터의 아세테이트 코엔자임 A 트란스퍼라제 ydiF로부터 선택되고; 상기 포스포트란스아실라제가 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC824로부터의 포스포트란스부티릴라제로부터 선택되고; 및 상기 단쇄 지방산 키나제가 스피로헤테 (Spirochete) MA-2로부터의 분지쇄 지방산 키나제, 터모토가 마리티마 ( Thermotoga maritima )로부터의 부티레이트 키나제 및 클로스트리디움 부티리쿰 (Clostridium butyricum)으로부터의 부티레이트 키나제로부터 선택되는 것인 방법.
  21. 청구항 16 내지 20 중 어느 항에 있어서, 메타크릴릴-CoA가 메타크릴산으로 티오에스테라제의 작용에 의해 전환되고, 상기 티오에스테라제는 아트로박터 종 균주 SU로부터의 아실-CoA 티오에스테라제 4HBT인 것인 방법.
  22. 청구항 1 내지 21 중 어느 항에 있어서, 상기 방법의 생물학적 전환이 하나 이상의 숙주 미생물(들)에서 효소에 의해 수행되는 것인 방법.
  23. 청구항 1 내지 22 중 어느 항의 방법에 따라 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 생산하는데 사용하기 위한 미생물.
  24. (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 생물학적으로 전환시키는 단계를 수행하도록 된 (adapted) 재조합 미생물로서, 상기 재조합 미생물은 에스케리치아 콜리인 것인 재조합 미생물.
  25. (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 생물학적으로 전환시키는 단계를 수행하도록 하나 이상의 이종 핵산에 의해 변형된 미생물.
  26. (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산 및/또는 그 유도체로 생물학적으로 전환시키는 단계를 수행하도록 된 미생물.
  27. 청구항 23 또는 26에 있어서, 상기 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게 C1 내지 C20 알킬 에스테르, 가장 바람직하게, C1 내지 C12 알킬 에스테르, 특히 C1 내지 C4 알킬 에스테르 또는 C4 내지 C12 알킬 에스테르인 것인 미생물.
  28. 청구항 23 내지 27 중 어느 항에 따른 미생물을 사용하여 메타크릴산을 생산하는 방법.
  29. 청구항 23 내지 27에 있어서, 상기 미생물은 하기 효소들을 발현시키는 것인 미생물:
    (a) (i) 아실-CoA 옥시다제; 및 하기의 하나 이상:
    (b) (i) 아실-CoA 티오에스테라제;
    (ii) CoA 트란스퍼라제;
    (iii) 산-티올 신테타제;
    (iv) 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제;
    (v) 알코올 아실트란스퍼라제.
  30. 청구항 23 내지 27 또는 29 중 어느 항에 있어서, 상기 미생물은 하기 효소들을 발현시키는 것인 미생물:
    (a) 아실-CoA 옥시다제, 가령 ACX4; 및
    (b) 아실-CoA 티오에스테라제, 가령 4HBT.
  31. 청구항 23 내지 27, 29 또는 30 중 어느 항에 있어서, 상기 미생물은 하기 효소들을 발현시키는 것인 미생물:
    (a) ACX4, 적합하게 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4; 및
    (b) 4HBT, 적합하게 아트로박터 종으로부터의 4HBT.
  32. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 31 중 어느 항에 있어서, 상기 미생물은 상기 하나 이상의 효소를 내인성으로 (endogenously) 발현시키거나 또는 상기 미생물은 상기 하나 이상의 효소를 이종성으로 (heterologously) 발현시키거나, 또는 상기 미생물은 내인성 및 이종성 효소들의 조합을 발현시키는 것인 미생물.
  33. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 32 중 어느 항에 있어서, 상기 미생물이 야생형 또는 재조합 미생물(들), 예를 들면, 박테리아, 고세균 (archeae), 효모 (yeast), 진균 (fungus), 조류 (algae) 또는 발효 공정에 적용가능한 다양한 다른 미생물(들)의 변종(variety) 중 어느 하나로부터 선택될 수 있는 것인 미생물.
  34. 청구항 33에 있어서, 상기 미생물은 하기로부터 선택되는 박테리아인 것인 미생물: 속 에스케리치아 (Escherichia), 엔테로박터 ( Enterobacter ), 판토에 (Pantoea), 클레브시엘라 ( Klebsiella ), 세라티아 ( Serratia ), 어위니아 ( Erwinia ), 살모넬라 (Salmonella), 모르가넬라 ( Morganella ) 등의 프로테오박테리아 (proteobacteria)에 속하는 엔테로박테리아 (enterobacteria), 속 브레비박테리 움 ( Brevibacterium ), 코리네박테리움 ( Corynebacterium ) 또는 미크로박테리움 (Microbacterium)에 속하는 소위 코리네형 (coryneform) 박테리아 및 속 알리시클로바실루스 (Alicyclobacillus), 바실루스 (Bacillus), 히드로게노박터 ( Hydrogenobacter ), 메 타노코쿠스 ( Methanococcus ), 아세토박터 ( Acetobacter ), 아 시네토박터 ( Acinetobacter ), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 악소르히조비움 (Axorhizobium), 아조토박터 ( Azotobacter ), 아나플라스마 ( Anaplasma ), 박테로이데스 (Bacteroides), 바르토넬라 ( Bartonella ), 보르데텔라 ( Bordetella ), 보렐리아 (Borrelia), 브루셀라 ( Brucella ), 부르크홀데리아 ( Burkholderia ), 칼림마토박테리움 ( Calymmatobacterium ), 캄필로박터 ( Campylobacter ), 클라미디아 (Chlamydia), 클라미도필라 (Chlamydophila), 클로스트리디움 (Clostridium), 콕시엘라 ( Coxiella ), 에를리치아 ( Ehrlichia ), 엔테로코쿠스 ( Enterococcus ), 프란시셀라 (Francisella), 푸소박테리움 (Fusobacterium), 가르드네렐라 ( Gardnerella ), 헤모필루스 ( Haemophilus ), 헬리코박터 (Helicobacter), 켈브시엘라 ( Kelbsiella ), 메타노박테리움 ( Methanobacterium ), 미크로코쿠스 ( Micrococcus ), 모락셀라 (Moraxella), 미코박테리움 (Mycobacterium), 미코플라스마 (Mycoplasma), 네이세리아 ( Neisseria ), 파스 테우렐라 ( Pasteurella ), 펩토스트렙토코쿠스 ( Peptostreptococcus ), 포르피로모나스 (Porphyromonas), 프레보텔라 (Prevotella), 슈도모나스 ( Pseudomonas ), 리조비움 ( Rhizobium ), 리케치아 (Rickettsia), 로칼리마에 (Rochalimaea), 로티아 ( Rothia ), 시겔라 ( Shigella ), 스타필로코쿠스 (Staphylococcus), 스테노트로포모나스 (Stenotrophomonas), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 트레포네마 ( Treponema ), 비브리오 ( Vibrio ), 볼바치 아 (Wolbachia), 여시니아 ( Yersinia )에 속하는 박테리아.
  35. (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 아실-CoA 옥시다제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 C1 내지 C20 메타크릴산 에스테르, 적합하게 C1 내지 C12 메타크릴산 에스테르, 가령 C1 내지 C4 또는 C4 내지 C12 메타크릴산 에스테르로 알코올 아실 트란스퍼라제의 발현에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계를 수행하도록 된 미생물.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 미생물은 에스케리치아 콜리인 것인 미생물.
  37. 청구항 35 또는 36에 있어서, 상기 아실-CoA 옥시다제는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 ACX4인 것인 미생물.
  38. 청구항 35 내지 37 중 어느 항에 있어서, 상기 알코올 아실 트란스퍼라제가 과일 기원, 가령 사과, 멜론 또는 토마토 기원으로부터 유래되는 것인 미생물.
  39. 청구항 35 내지 38 중 어느 항에 있어서, 상기 미생물은 재조합 미생물인 것인 미생물.
  40. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 39 중 어느 항에 있어서, 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생산을 향상시키도록 상기 미생물이 유전적으로 변형되는 것인 미생물.
  41. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 40 중 어느 항에 있어서, 동일한 기질 및/또는 중간체와 경쟁함으로써 메타크릴산 및/또는 그 유도체 이외의 화합물의 합성을 촉매화하는 효소의 활성을 감소 또는 제거하는 변형, 메타크릴산을 대사작용하거나 또는 메타크릴산의 생산에서 중간체를 대사작용하는 효소의 활성을 감소 또는 제거시키는 변형, 및/또는 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 생산에서 중간체를 제거하는 다른 세포 기능에 관여하는 단백질의 활성을 감소 또는 제거하는 변형에 의해서 상기 미생물이 유전적으로 변형될 수 있는 것인 미생물.
  42. 청구항 40 또는 41에 있어서, 상기 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게, C1 내지 C20 알킬 에스테르, 가장 바람직하게, C1 내지 C12 알킬 에스테르, 특히 C1 내지 C4 알킬 에스테르 또는 C4 내지 C12 알킬 에스테르인 것인 미생물.
  43. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 42 중 어느 항의 하나 이상의 미생물(들)을 발효 배지에서 배양하여 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 생산시키는 단계를 포함하는 발효 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게, C1 내지 C20 알킬 에스테르, 가장 바람직하게, C1 내지 C12 알킬 에스테르, 특히 C1 내지 C4 알킬 에스테르 또는 C4 내지 C12 알킬 에스테르인 것인 방법.
  45. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 42 중 어느 항의 하나 이상의 미생물(들)을 포함하는 발효 배지.
  46. 청구항 45에 있어서, 상기 배지는 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 더 포함하는 것인 발효 배지.
  47. 청구항 46에 있어서, 상기 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게, C1 내지 C20 알킬 에스테르, 가장 바람직하게, C1 내지 C12 알킬 에스테르, 특히 C1 내지 C4 알킬 에스테르 또는 C4 내지 C12 알킬 에스테르인 것인 발효 배지.
  48. 청구항 23 내지 27 또는 29 내지 42 중 어느 항의 하나 이상의 미생물(들) 및/또는 청구항 45 내지 47 중 어느 항의 발효 배지를 포함하는 바이오리액터 (bioreactor).
  49. 메타크릴산 또는 메타크릴산 에스테르의 폴리머 또는 코폴리머를 제조하는 방법으로서,
    (i) 청구항 1 내지 22 또는 28의 어느 항에 따른 메타크릴산 및/또는 그 유도체의 제조 단계;
    (ii) 상기 (i)에서 제조된 상기 메타크릴산의 선택적 에스테르화에 의하여 상기 메타크릴산 에스테르를 생산하는 단계;
    (iii) 상기 (i)에서 제조된 상기 메타크릴산 및/또는 그 유도체 및/또는, 존재하는 경우, (ii)에서 제조된 에스테르와, 선택적으로 하나 이상의 코모노머 (comonomers)와의 중합화로 그 폴리머 또는 코폴리머를 제조하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 메타크릴산의 그 유도체는 메타크릴산 에스테르, 더 바람직하게, C1 내지 C20 알킬 에스테르, 가장 바람직하게, C1 내지 C12 알킬 에스테르, 특히 C1 내지 C4 알킬 에스테르 또는 C4 내지 C12 알킬 에스테르인 것인 방법.
  51. 청구항 49 또는 50의 방법으로부터 형성된 폴리메타크릴산, 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) 및 폴리부틸메타크릴레이트 호모폴리머 또는 코폴리머.
  52. 메타크릴산을 제조하는 방법으로서,
    (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT), 트란스퍼라제, 신테타제, 및/또는 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  53. 청구항 52의 방법에 따라 메타크릴산 및/또는 그 유도체를 제조하는데 사용하기 위한 미생물.
  54. (a) 이소부티릴-CoA를 메타크릴릴-CoA로 생물학적으로 전환시키는 단계; 및
    (b) 메타크릴릴-CoA를 메타크릴산으로 티오에스테라제, 적합하게 4-히드록시벤조일-CoA 티오에스테라제 (4HBT), 트란스퍼라제, 신테타제, 및/또는 포스포트란스아실라제 및 단쇄 지방산 키나제의 작용에 의해 생물학적으로 전환시키는 단계를 수행하도록 된 미생물.
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