CN108048425A - 一种对羟基苯甲酰-coa硫酯酶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶及其制备方法。包括以下步骤：1)利用PCR技术扩增得到对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶的克隆，2)构建对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶的表达载体；3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，进一步诱导表达、和纯化蛋白得到对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶。该方法简单，易操作，且发现了新的基因序列的对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶。另外，本发明还提供该对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶的多克隆抗体以及其检测方法，对低温菌Cryobacterium属菌种的鉴定提供新的依据，对于对羟基苯甲酰‑COA硫酯酶的研究提供了新的研究方向。

Description

一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶及其应用。
背景技术
对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶，英文名:4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase。对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶可将对羟基苯甲酰-CoA转化为CoA和对羟基苯甲酸。在4-氯苯甲酸的降解过程中起到重要的作用，在农药及除草剂污染等环境保护领域有极大的应用价值。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种低温适应性好的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶，并相应开发一种更高效、简便的制备对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的方法。
本发明提供一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的氨基酸序列，所述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的核苷酸序列，所述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相应地，本发明提供包含上述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的重组载体、重组菌株以及表达上述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的方法。本发明提供包含上述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的重组载体，优选为pET21a；本发明提供包含上述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因PCR扩增的引物序列，正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4；将本发明的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，作为本发明的一个优选的实施方案，具体的是将本发明的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-HCTE；本发明还提供了一种表达上述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的方法，包括以下步骤：
1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-HCTE；
2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-HCTE；
3)将Ecoli BL21-pET21a-HCTE扩大培养，诱导表达对羟基苯甲酰-COA硫酯酶，收集菌体；
4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶。
相应地，本发明提供上述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶鼠来源的多克隆抗体的制备和检测方法，包括以下步骤：
1)纯化后的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶注射小鼠，采集血清；
2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；
3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；
4)将步骤3)中纯化得到的抗体与对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的原始菌株的破碎液进行Western Blotting检测。
本发明的有益效果在于：1)本发明通过PCR技术在喜冷杆菌属中扩增得到对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因，并且通过NCBI Blast碱基序列比对证明该对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因序列；2)通过基因工程技术得到表达对羟基苯甲酰-COA硫酯酶蛋白的Ecoli BL21-pET21a-DDCP重组菌株，诱导表达重组菌株得到对羟基苯甲酰-COA硫酯酶蛋白；3)利用Ecoli BL21-pET21a-HCTE重组菌株诱导表达对羟基苯甲酰-COA硫酯酶蛋白的方法简单，易操作，而且发现了新的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因序列；4)本发明提供了制备和检测该蛋白的多克隆抗体，为进一步开展对羟基苯甲酰-COA硫酯酶功能分析奠定基础，并为Cryobacterium属的菌种中的鉴定提供证据及低温适应机制的研究提供新的方向。
附图说明
图1为PCR扩增对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNA marker，1号泳道为PCR扩增对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的产物；
图2为表达载体pET21a-HCTE的构建示意图；
图3为重组菌株Ecoli BL21-pET21a-HCTE表达对羟基苯甲酰-COA硫酯酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为protein marker；1号泳道为对羟基苯甲酰-COA硫酯酶蛋白；
图4为细菌对羟基苯甲酰-COA硫酯酶多克隆抗体的Western Blotting分析图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。本具体实施方式仅为最佳例举，并非对本发明技术方案的限制性实施。
实施例1对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的获取
1)获取含有目的基因的菌株
本发明利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如专利号为201710034491.5的中国发明专利，该菌株的命名为：Cryobacteriumbaishanse 02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016604。
2)基因组的提取
利用DNA提取试剂盒(TAKARA Dalian)提取Cryobacterium baishanse 02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。
3)PCR扩增目的基因
设计引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；PCR反应体系如下表1所示：
表1
成分 体积
10×PCR缓冲液 5μl
引物F 1μl
引物R 1μl
模板 80ng
MgSO4 2μl
dNTP 5μl
去离子水 35μl
总计 50μl
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸2min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，PCR扩增产物的大小与预计的510bp接近，将PCR扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断PCR扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。
测序结果如SEQ ID NO.2所示，将SEQ ID NO.2所示的碱基序列在NCBI Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与Cryobacterium arcticum strain PAMC27867的对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶相似性为94％，即可判断SEQ ID NO.2所示的碱基序列属于Cryobacterium属的新的对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶序列。
实施例2构建对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的表达载体
将实施例1中得到的PCR扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶EcoRI和NdeI对PCR扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶EcoRI和NdeI对载体pET21a(+)进行双酶切反应，然后经高效DNA连接酶High Ligation(TOYOBO)催化连接经双酶切反应后的pET21a(+)和PCR扩增产物；构建得到对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的表达载体pET21a-HCTE，表达载体pET21a-HCTE的构建如图2所示。
实施例3表达和纯化细菌对羟基苯甲酰-COA硫酯酶
将实施例2得到的表达载体pET21a-HCTE转化入大肠杆菌BL21的感受态菌体中，大肠杆菌BL21的感受态的制备采用CaCl2法，CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态为实验室常规实验手段，在此不再赘述。将得到的表达载体pET21a-HCTE转化入大肠杆菌BL21后得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-HCTE。将Ecoli BL21-pET21a-HCTE扩大培养至OD600＝0.6后添加1mM IPTG，28℃诱导培养表达对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶蛋白，诱导培养结束后收集菌体，依次经菌体破碎和Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化后的对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶蛋白，如图3所示，得到对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶蛋白的蛋白分子量在14.1-20.1之间，与理论预计值19.1KD一致，表明纯化得到的蛋白即为对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶蛋白。
实施例4对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶鼠来源的多克隆抗体的制备和效价检测
取纯化后的对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶，采用皮下注射免疫约5周龄的小鼠，40-60μg每次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，纯化制备多克隆抗体。
ELISA方法包括以下步骤：
1)将抗原用碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl孵育1小时；
2)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
3)用5％skim milk封闭酶标板1小时，每孔100μl；
4)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
5)稀释的血清(1/5000in PBS-T)孵育抗原1小时；
6)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
7)每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠抗体(1/5000in PBS-T)，孵育1小时；
8)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
9)分光光度计上测420nm下的OD值；
10)通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化的抗体纯度。实施例5对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶鼠来源的多克隆抗体的纯化
抗体纯化是将抗原蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将所得抗血清与PBS按照1:1比例混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化抗体，纯化抗体利用PBS过夜透析，次日进行浓度、效价测定。
上述纯化抗体浓度测定方法，包括如下步骤：
1)CBB染色液配制：根据样品数量，将5×CBB染色液稀释，充分混匀。
2)根据需要取适量BSA标准蛋白，配制终浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml标准样，并混匀。标准样采用PBS为溶剂。
3)标准曲线绘制：取一块酶标板，按下表格加入试剂：
振荡混匀后，室温下静置30min；
用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收为空白对照；
以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
4)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释不同浓度梯度，各取1μl并稀释至10μl，再加入200μl 1×CBB，混匀后室温下静置30min，然后以不含蛋白的溶剂为空白对照，测定样品吸收值。
5)根据测得的吸收值，在标准曲线上计算样品的蛋白含量。
计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量，并根据稀释倍数计算样品的实际浓度。
实施例6对羟基苯甲酰-CoA硫酯酶鼠来源的多克隆抗体的Western Blotting检测
1)细菌Cryobacterium baishanse 02培养至OD至约为2.0，取1.5ml离心收集菌体，300μl Tris-HCl重悬，超声破碎取20μl破碎夜与5μl 5x SDS上样缓冲液混合，其中10μl进行SDS-PAGE电泳。Magic上样量为0.8μl；
2)上样后，电泳仪恒定为18mA，直到电泳结束；
3)电泳后，将凝胶上蛋白样品转移至PVDF膜，恒定电流为0.23A进行转膜，约为35分钟；
4)电泳结束后将PVDF膜干燥，后于5％skim milk中封闭1小时。
5)PBST清洗5次；
6)用PBST稀释纯化的抗体(1:5000)，孵育1小时；
7)PBST清洗5次；
8)用PBST稀释二抗(1:20000，羊抗鼠-HRP)，孵育1小时；
9)PBST清洗5次，ECL显影，暗室成像。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 一种对羟基苯甲酰-COA 硫酯酶及其制备方法
<130> PatentIn version 3.5
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 174
<212> PRT
<213> Cryobacterium baishanse 02
<400> 1
Met Arg Leu His Val Pro Ile Arg Leu Arg Trp Ser Asp Leu Asp Ala
1 5 10 15
Tyr Ala His Val Asn Asn Ala Glu Met Leu Arg Leu Leu Glu Glu Ala
20 25 30
Arg Ile Glu Ala Phe Trp Ser Asn Asp Glu Pro Gly Thr Ala Val Ser
35 40 45
Ala Ser Ala Asp Ala Leu Arg Ala Ser Val Pro Ala Leu Thr Gly Thr
50 55 60
Gly Gln Ser Thr Ala Val Leu Asp Gly Arg Pro Gly Ala Ala Thr Leu
65 70 75 80
Thr Leu Ile Ala Arg Leu Glu Ile Glu Tyr Leu Ala Pro Ile Pro Tyr
85 90 95
Leu Arg Ala Pro Ile Asp Val Gln Leu Trp Ile Gly Lys Leu Gly Gly
100 105 110
Ala Ser Leu Asp Val Cys Tyr Glu Val Arg Gly Pro Val Gly Gln Glu
115 120 125
Pro Gln Arg Leu Tyr Ala Arg Ala Thr Thr Thr Ile Val Leu Val Asp
130 135 140
Ala Ala Thr Glu Arg Pro Arg Lys Ile Asn Ala Val Glu Arg Ala Ala
145 150 155 160
Trp Thr Pro Tyr Leu Glu Ser Pro Val Asp Phe Thr Arg Lys
165 170
<210> 2
<211> 510
<212> DNA
<213> Cryobacterium baishanse 02
<400> 2
atgcggctgc acgttcccat ccgactgcgc tggtcggacc tcgacgcgta cgcccacgtc 60
aacaacgccg agatgctgcg cctcctcgag gaggcgcgca tcgaggcgtt ctggtcgaac 120
gacgagccgg ggaccgaccc ggccgatgcg ctacgcgcat ccgtacccgc cggcaccggc 180
cagagcaccg cggtgctcga cggccgcccc ggtgcggcga cgctcacgct gatcgcccgc 240
ttggaaatcg agtacctggc cccgatccca tacctgcgtg ccccgatcga cgttcagttg 300
tggatcggca agctcggcgg cgcgagcctc gacgtctgtt acgaggtgcg cggcccggtc 360
gggcaggaac cccagcggct ctacgcccgc gccaccacga cgatcgtgct ggtggatgcg 420
gccacggaac gtccccgcaa gatcaacgcg gtggagcggg ccgcctggac cccctacctc 480
gagtccccgg tcgacttcac ccgcaaatag 510
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattccat atgcggctgc acgttcccat c 31
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaattcgct ttgcgggtga agtcga 26

Claims (9)

1.一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶。
3.如权利要求2所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2或3所述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述载体的构建方法为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-HCTE。
6.包含权利要求2或3所述对羟基苯甲酰-COA硫酯酶基因PCR扩增的引物序列。
7.根据权利要求6所述的引物序列，其特征在于：所述引物序列的正向引物如SEQ IDNO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4。
8.一种制备权利要求1所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和NdeI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-HCTE；
2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-HCTE；
3)将Ecoli BL21-pET21a-HCTE扩大培养，诱导表达对羟基苯甲酰-COA硫酯酶，收集菌体；
4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶。
9.一种制备和检测权利要求1所述的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶鼠来源的多克隆抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)纯化后的对羟基苯甲酰-COA硫酯酶注射小鼠，采集血清；
2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；
3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；
4)将步骤3)中纯化得到的抗体与对羟基苯甲酰-COA硫酯酶的原始菌株的破碎液进行Western Blotting检测。
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