CN107988188A - 一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法 - Google Patents

一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107988188A
CN107988188A CN201711376275.5A CN201711376275A CN107988188A CN 107988188 A CN107988188 A CN 107988188A CN 201711376275 A CN201711376275 A CN 201711376275A CN 107988188 A CN107988188 A CN 107988188A
Authority
CN
China
Prior art keywords
alanyls
alanine
alanine carboxypeptidase
ala
carboxypeptidase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201711376275.5A
Other languages
English (en)
Inventor
宫春杰
顾昌祺
薛栋升
胡征
杨波
王毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hubei University of Technology
Original Assignee
Hubei University of Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hubei University of Technology filed Critical Hubei University of Technology
Priority to CN201711376275.5A priority Critical patent/CN107988188A/zh
Publication of CN107988188A publication Critical patent/CN107988188A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶及其制备方法。包括以下步骤：1)利用PCR技术扩增得到D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶的克隆，2)构建D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶的表达载体；3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，进一步诱导表达、和纯化蛋白得到D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶。该方法简单，易操作，且发现了新的基因序列的D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶，该酶在低温条件下依然具备较强的酶学活性。另外，本发明还提供该D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶的多克隆抗体以及其检测方法，对低温菌Cryobacterium属菌种的鉴定提供新的依据，对于D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶的研究提供了新的研究方向。

Description

一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶及其制备方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，主要涉及一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶及其应用。
背景技术
D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，别名：D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，英文名：D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase。D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶存在于大肠杆菌(菌株K12)中，可以水解交联二聚体四肽(D45)和四肽(D44)。从C末端D-Ala-D-Ala二肽中除去末端D-丙氨酸和二肽五肽M5。与肽聚糖(PG)的回收和重塑有关。该酶还参与途径肽聚糖的生物合成，这是植物细胞壁发生的一部分。
D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶具有极大的应用前景，它与肽聚糖(PG)的回收和重塑有关。参与肽聚糖的生物合成，大量制备D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶后，大大加快了交联二聚体四肽(D45)和四肽(D44)的水解，也可以提高肽聚糖(PG)的回收和重塑的效率，以及肽聚糖的合成效率。
目前传统的制备D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的方法是从酵母系统中表达纯化，效率不高且产量较低，操作繁琐。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一种低温适应性好的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，并相应开发一种更高效、简便的制备D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的方法。
本发明提供一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的氨基酸序列，所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的核苷酸序列，所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
相应地，本发明提供包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的重组载体、重组菌株以及表达上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的方法。本发明提供包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的重组载体，优选为pET21a；本发明提供包含上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因PCR扩增的引物序列，正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4；将本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接，作为本发明的一个优选的实施方案，具体的是将本发明的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-DDCP；本发明还提供了一种表达上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的方法，包括以下步骤：
1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-DDCP；
2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-DDCP；
3)将Ecoli BL21-pET21a-DDCP扩大培养，诱导表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，收集菌体；
4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶。
相应地，本发明提供上述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶鼠来源的多克隆抗体的制备和检测方法，包括以下步骤：
1)纯化后的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶注射小鼠，采集血清；
2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；
3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；
4)将步骤3)中纯化得到的抗体与D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的原始菌株的破碎液进行Western Blotting检测。
本发明的有益效果在于：1)本发明通过PCR技术在喜冷杆菌属中扩增得到D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因，并且通过NCBI Blast碱基序列比对证明该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因序列；2)通过基因工程技术得到表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白的Ecoli BL21-pET21a-DDCP重组菌株，诱导表达重组菌株得到D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白；3)利用Ecoli BL21-pET21a-DDCP重组菌株诱导表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白的方法简单，易操作，而且发现了新的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因序列，该D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶在低温条件下依然具备较强的酶学活性；4)本发明提供了制备和检测该蛋白的多克隆抗体，为进一步开展D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶功能分析奠定基础，并为Cryobacterium属的菌种中的鉴定提供证据及低温适应机制的研究提供新的方向。
附图说明
图1为PCR扩增D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNA marker，1号泳道为PCR扩增D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的产物；
图2为表达载体pET21a-DDCP的构建示意图；
图3为重组菌株Ecoli BL21-pET21a-DDCP表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为protein marker；1号泳道为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白；
图4为细菌D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶多克隆抗体的Western Blotting分析图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，但不限制本发明。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。本具体实施方式仅为最佳例举，并非对本发明技术方案的限制性实施。
实施例1 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的获取
1)获取含有目的基因的菌株
本发明利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如专利号为201710034491.5的中国发明专利，该菌株的命名为：Cryobacteriumbaishanse 02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016604。
2)基因组的提取
利用DNA提取试剂盒(TAKARA Dalian)提取Cryobacterium baishanse 02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。
3)PCR扩增目的基因
设计引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ IDNO.4所示；PCR反应体系如下表1所示：
表1
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30s，55℃ 30s，68℃延伸2min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，PCR扩增产物的大小与预计的1278bp接近，将PCR扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断PCR扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。
测序结果如SEQ ID NO.2所示，将SEQ ID NO.2所示的碱基序列在NCBI Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与Cryobacterium arcticum strain PAMC 27867的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶相似性为91％，即可判断SEQ ID NO.2所示的碱基序列属于Cryobacterium属的新的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶序列。
实施例2 构建D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的表达载体
将实施例1中得到的PCR扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶EcoRI和XhoI对PCR扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶EcoRI和XhoI对载体pET21a(+)进行双酶切反应，然后经高效DNA连接酶High Ligation(TOYOBO)催化连接经双酶切反应后的pET21a(+)和PCR扩增产物；构建得到D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的表达载体pET21a-DDCP，表达载体pET21a-DDCP的构建如图2所示。
实施例3 表达和纯化细菌D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶
将实施例2得到的表达载体pET21a-DDCP转化入大肠杆菌BL21的感受态菌体中，大肠杆菌BL21的感受态的制备采用CaCl2法，CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态为实验室常规实验手段，在此不再赘述。将得到的表达载体pET21a-DDCP转化入大肠杆菌BL21后得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-DDCP。将Ecoli BL21-pET21a-DDCP扩大培养至OD600＝0.6后添加1mM IPTG，18℃低温诱导培养表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白，培养至OD约2.5-2.6后，离心收集菌体，依次经菌体破碎和Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化后的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白，如图3所示，得到D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白的蛋白分子量在29.0-44.3之间，与理论预计值43.7KD一致，表明纯化得到的蛋白即为D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶蛋白。
实施例4 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶活性的测定
D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶活性通过荧光偶联反应来检测，分两部分进行：1)D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶发挥作用释放D-丙氨酸，2)D-丙氨酸氧化后转变成荧光终止产物。
底物：五肽(Penta-DAP:L-Ala--D-Gln-DAP-D-Ala-D-Ala)0.5mM，与D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶在37℃条件下共孵育在1×PBS中30min,体系共40ul,使D-丙氨酸分解的反应能在96孔板进行。
释放的D-丙氨酸能在40ul体系中确定，该体系包括：
100mM Tris-HCl pH 8.5,
0.38units ml-1D-amino acid oxidase,D-丙氨酸氧化酶
12.5units ml-1Horseradish peroxidase,辣根过氧化物酶
6.25μg ml-1flavin adenine dinucleotide黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD
50mM Amplex Red荧光试剂
酶活结果可如下表：
由上表可以看出，耐冷细菌Cryobacterium baishanse 02来源的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶能够在低温下发挥活性，并且最适温度约40度，比通常微生物来源的酶的最适温度低很多。因此，在工业催化应用中可节约大量的能源。
实施例5 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶鼠来源的多克隆抗体的制备和效价检测
取纯化后的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，采用皮下注射免疫约5周龄的小鼠，40-60μg每次，2-3周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，纯化制备多克隆抗体。
ELISA方法包括以下步骤：
1)将抗原用碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl孵育1小时；
2)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
3)用5％skim milk封闭酶标板1小时，每孔100μl；
4)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
5)稀释的血清(1/5000in PBS-T)孵育抗原1小时；
6)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
7)每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠抗体(1/5000in PBS-T)，孵育1小时；
8)利用PBS-T将酶标板清洗3次；
9)分光光度计上测420nm下的OD值；
10)通过SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察纯化的抗体纯度。
实施例6 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶鼠来源的多克隆抗体的纯化
抗体纯化是将抗原蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将所得抗血清与PBS按照1:1比例混合后，缓慢经过层析柱，待抗体与抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化抗体，纯化抗体利用PBS过夜透析，次日进行浓度、效价测定。
上述纯化抗体浓度测定方法，包括如下步骤：
1)CBB染色液配制：根据样品数量，将5×CBB染色液稀释，充分混匀。
2)根据需要取适量BSA标准蛋白，配制终浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml标准样，并混匀。标准样采用PBS为溶剂。
3)标准曲线绘制：取一块酶标板，按下表格加入试剂：
孔号 A B C D E F
标准样浓度(mg/ml) 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1
各浓度标准样(μl) 1 1 1 1 1 1
去离子水 9 9 9 9 9 9
CBB染色液 200 200 200 200 200 200
对应蛋白含量(μg) 0 0.125 0.25 0.5 0.75 1
最终体积(μl) 210 210 210 210 210 210
振荡混匀后，室温下静置30min；
用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收为空白对照；
以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。4)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释不同浓度梯度，各取1μl并稀释至10μl，再加入200μl 1×CBB，混匀后室温下静置30min，然后以不含蛋白的溶剂为空白对照，测定样品吸收值。
5)根据测得的吸收值，在标准曲线上计算样品的蛋白含量。
计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量，并根据稀释倍数计算样品的实际浓度。
实施例6 D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶鼠来源的多克隆抗体的Western Blotting检测
1)细菌Cryobacterium baishanse 02培养至OD至约为2.0，取1.5ml离心收集菌体，300μl Tris-HCl重悬，超声破碎取20μl破碎夜与5μl 5x SDS上样缓冲液混合，其中10μl进行SDS-PAGE电泳。Magic上样量为0.8μl；
2)上样后，电泳仪恒定为18mA，直到电泳结束；
3)电泳后，将凝胶上蛋白样品转移至PVDF膜，恒定电流为0.23A进行转膜，约为35分钟；
4)电泳结束后将PVDF膜干燥，后于5％skim milk中封闭1小时。
5)PBST清洗5次；
6)用PBST稀释纯化的抗体(1:5000)，孵育1小时；
7)PBST清洗5次；
8)用PBST稀释二抗(1:20000，羊抗鼠-HRP)，孵育1小时；
9)PBST清洗5次，ECL显影，暗室成像。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶及其制备方法
<130> PatentIn version 3.5
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 434
<212> PRT
<213> Cryobacterium baishanse 02
<400> 1
Met Ser Arg Phe Arg Pro Gly Arg Val Ile Gly Ile Ser Val Gly Thr
1 5 10 15
Leu Val Ile Leu Met Ile Gly Val Tyr Gly Pro Ala Thr Leu Leu Gly
20 25 30
Pro Leu Pro Thr Ala Ala Val Thr Leu Met Thr Pro Asp Ala Pro Val
35 40 45
Ala Ala Ser Thr Pro Ala Leu Pro Ala Ala Gly Thr Ser Gly Ile Leu
50 55 60
Ala Leu Thr Pro Val Ser Glu Ala Ala Asp Ala Ala Asp Thr Asp Thr
65 70 75 80
Ala Ala Ala Thr Asp Gly Ala Ala Ala Leu Gly Ala Ala Pro Ile Ala
85 90 95
Thr Gly Gly Gly Ala Glu Ala Leu Pro Met Ala Ser Ala Ala Lys Ile
100 105 110
Ile Thr Ala Leu Val Val Leu Asp Ala Lys Pro Leu Ala Val Gly Glu
115 120 125
Ala Gly Pro Ala Tyr Ser Leu Val Thr Ala Asp Tyr Gln Asp Tyr Leu
130 135 140
Asp Tyr Thr Ala Glu Asp Ala Arg Thr Val Ile Val Phe Pro Gly Glu
145 150 155 160
Ser Trp Thr Glu Arg Glu Met Leu Gln Ala Met Ile Leu Gly Ser Ser
165 170 175
Asn Asn His Ala Asp Thr Leu Ala Arg Trp Ala Phe Gly Ser Val Asp
180 185 190
Ala Tyr Leu Ala Ala Ala Asn Glu Trp Leu Ala Ala Asn Gly Met Gly
195 200 205
Asp Thr Thr Val Val Asp Ala Asn Gly Leu Ser Asp Gly Ser Ala Gly
210 215 220
Thr Gly Ala Asp Leu Ala Arg Ile Ala Ala Leu Ala Ala Thr Asn Pro
225 230 235 240
Val Ile Ala Asp Ile Ile Ala Lys Pro Ala Ser Ala Leu Val Gly Gln
245 250 255
Arg Gly Val Asn Asn Thr Thr Ala Tyr Leu Pro Asp Glu Gly Ile Thr
260 265 270
Gly Ile Ser Arg Ser Tyr Thr Asp Ala Gly Gly Val Cys Phe Leu Phe
275 280 285
Thr Ala Ala Val Thr Val Asp Thr Glu Thr Phe Thr Phe Ala Gly Ala
290 295 300
Phe Leu Gly Glu Pro Asp Tyr Asp Thr Leu Thr Ala Asp Leu Thr Ala
305 310 315 320
Leu Met Ala Ser Ala Arg Ala Gly Ile Thr Gln Leu Pro Val Leu Thr
325 330 335
Gln Gly Asp Ala Tyr Ala Thr Leu Thr Thr Ala Trp Gly Asp Thr Ala
340 345 350
Asp Ala Val Val Gly Thr Pro Lys Thr Arg Phe Gly Trp Gln Ala Ala
355 360 365
Thr Pro Gly Glu Ala Val Val Asp Leu Asp Ala Val Ala Thr Gly Arg
370 375 380
Ala Gly Ser Ser Val Gly Arg Val Thr Val Asp Ala Phe Gly Glu Ser
385 390 395 400
Val Ser Ser Asn Leu Lys Leu Glu Arg Thr Leu Thr Asp Pro Gly Pro
405 410 415
Gly Trp Arg Leu Leu His Pro Ile Pro Leu Ile Thr Ala Leu Ile Asp
420 425 430
Ser Gln
<210> 2
<211> 1278
<212> DNA
<213> Cryobacterium baishanse 02
<400> 2
gtgatcggtg tttcggtggg aacgctcgtg atcctgatga tcggagtcta cggacccgcc 60
accctgctgg gcccgctgcc caccgccgct gtgacgctca ccgagccggc cgctccggtc 120
gcggcatcca ccccggtact tccggtcgcc gggacgagcg ggatcctggc cctcaccccg 180
gtctcggaag ccgccgcgga cgacgacgcc gacgagtcaa ccgcccccga caccgctgcg 240
ctgggcgcag ccccgatcgc gaccggcggc ggcgctgaag cccttccgat ggcgtccgcc 300
gccaagatca tcaccgcgct cgtggtgctc gacgccaagc ccctcgcggc gggcgaggcc 360
ggcccggcct actcgctcgt caccgcggac taccaggatt acctcgacta cacggccgag 420
gatgcccgga ccgtcatcgt gtttcccggt gagagctgga ccgaacgcga aatgctgcag 480
gccatgatcc tcggctccag caacaaccat gcagacaccc tcgcccgctg ggccttcggt 540
tccgtcgacg cgtatctcgc cgccgcgaac gagtggctgg ccgccaacgg gatggacgac 600
accaccgtcg tcgatgcgaa cggcctggcc gacgggagcg ccggcacggg cgccgatctg 660
gcccgtattg cagctctcgc cgcgaccaac ccggtcatcg cggacatcat cgccaagcct 720
gcctcggcgc tggtcggcca acgtggggtc aacaacacca ccgcctacct tcccgacgag 780
ggcatcaccg gcatctcacg cagctacacg gatgccggcg gcgtctgctt cctcttcacc 840
gcggccgtga ccgtcgagac ggagaccttc accttcgcgg gcgcgttcct cggcgaaccc 900
gattacgaca ctctcaccgc cgatctgacg gccctgatga cctcggcccg cgcgggggtc 960
acgcagctgc cggtgctgac gcagggggac gtctacgcca ccctcacgac cgcgtggggc 1020
gatacggccg atgccgtcgt cggcacgcca aagacccgct tcggctggca ggccgccagc 1080
ccgggcgagg tcgtcgtgga tctggacgcc gtggccaccg gacgtgcggg gaacgctgtc 1140
ggtcgggtca cggtcgacgc gttcggtgag agcgtgtcgt cgaacctcaa gctggagagc 1200
agcctgaccg accccggtcc gggctggcgg ctgatgcacc cggttccact gatcaccgcg 1260
ctcatcgaag cccagtag 1278
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgctcgagg tgatcggtgt ttcggtg 27
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaattcctg ggcttcgatg agcgc 25

Claims (9)

1.一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶。
3.如权利要求2所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.包含权利要求2或3所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述载体的构建方法为：将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于启动子下游并受其调控，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-DDCP。
6.包含权利要求2或3所述D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶基因PCR扩增的引物序列。
7.根据权利要求6所述的引物序列，其特征在于：所述引物序列的正向引物如SEQ IDNO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4。
8.一种制备权利要求1所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的编码基因插入到质粒pET21a上的EcoRI和XhoI限制性酶切位点之间，得到重组大肠杆菌BL21表达质粒pET21a-DDCP；
2)将上述重组载体转化大肠杆菌BL21感受态，得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-DDCP；
3)将Ecoli BL21-pET21a-DDCP扩大培养，诱导表达D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶，收集菌体；
4)菌体破碎后，通过Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶。
9.一种制备和检测权利要求1所述的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶鼠来源的多克隆抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)纯化后的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶注射小鼠，采集血清；
2)用步骤1)中得到的血清通过ELISA进行抗体对抗原的效价；
3)步骤2)中的测得的效价符合条件，即进行抗体纯化；
4)将步骤3)中纯化得到的抗体与D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶的原始菌株的破碎液进行Western Blotting检测。
CN201711376275.5A 2017-12-19 2017-12-19 一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法 Pending CN107988188A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711376275.5A CN107988188A (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711376275.5A CN107988188A (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107988188A true CN107988188A (zh) 2018-05-04

Family

ID=62037979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711376275.5A Pending CN107988188A (zh) 2017-12-19 2017-12-19 一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107988188A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069794A (zh) * 2023-06-20 2023-11-17 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010020654A2 (en) * 2008-08-19 2010-02-25 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof
CN105505897A (zh) * 2015-12-18 2016-04-20 湖北工业大学 细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法
CN105647892A (zh) * 2016-03-04 2016-06-08 江南大学 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA基因及应用
CN107058167A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 湖北工业大学 微生物菌剂的制备方法及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010020654A2 (en) * 2008-08-19 2010-02-25 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield by increasing or generating one or more activities in a plant or a part thereof
CN105505897A (zh) * 2015-12-18 2016-04-20 湖北工业大学 细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法
CN105647892A (zh) * 2016-03-04 2016-06-08 江南大学 一种D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA基因及应用
CN107058167A (zh) * 2017-01-17 2017-08-18 湖北工业大学 微生物菌剂的制备方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAMISH A.I.等: "Purification and properties of the d-alanyl-d-alanine carboxypeptidase of Bacillus coagulans NCIB 9365", 《BIOCHIM BIOPHYS ACTA.》 *
无: "NCBI Reference Sequence: WP_084020967.1，"hypothetical protein [Cryobacterium arcticum]"", 《GENBANK》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069794A (zh) * 2023-06-20 2023-11-17 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用
CN117069794B (zh) * 2023-06-20 2024-02-13 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种糖肽类抗生素荧光探针化合物及其制备方法与应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105505897B (zh) 细菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶抗体制备及检测方法
CN110343689B (zh) 一种链霉菌胰蛋白酶gm2938及其在枯草芽孢杆菌中的异源表达
CN110746499A (zh) 一种血清淀粉样蛋白a突变体及其应用和制备方法
CN107664697B (zh) 表达载体及其制备方法、pedv-s1蛋白及包含该蛋白的间接elisa检测试剂盒
CN109239351B (zh) 一种莲藕潜隐病毒双抗体夹心酶联免疫检测试剂盒及制备与检测方法
CN107988188A (zh) 一种d-丙氨酰-d-丙氨酸羧肽酶及其制备方法
CN107841490A (zh) 双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体
CN114276445A (zh) 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法
CN112661820A (zh) 天山根瘤菌转录调控蛋白MsiR突变蛋白及其在刀豆氨酸生物传感器中的应用
CN107576791A (zh) 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒
CN107988193A (zh) 一种脲基甲酸水解酶及其制备方法
CN105936896A (zh) 细菌烯酰还原酶的多克隆抗体的制备及其应用
CN111454355A (zh) 一种sox6纳米抗体及其应用
CN113583141B (zh) 猪流行性腹泻病毒Nsp9蛋白、含该Nsp9蛋白的融合蛋白及其制备方法和应用
CN107828753A (zh) 组氨醇磷酸氨基转移酶的多克隆抗体及其制备方法
CN108219000A (zh) 一种pedv保护性抗原蛋白及其在乳酸菌中表达的方法
CN110128540B (zh) 一种基于便携式血糖仪的二抗
CN108048425A (zh) 一种对羟基苯甲酰-coa硫酯酶及其制备方法
CN107955807A (zh) 预苯酸脱氢酶及其多克隆抗体
CN114002426A (zh) 猪瘟病毒e0蛋白抗体elisa检测试剂盒
CN107987137B (zh) 一种abc转运蛋白及其制备方法
CN111218438B (zh) 一种链球菌dna酶b抗原及其应用
CN107988180A (zh) 酰基acp合成酶及其多克隆抗体
CN110078832B (zh) 一类基于ZZ domain的二抗及其制备方法和应用
CN114199848B (zh) 一种基于蛋白连接酶的高通量检测蛋白表达的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20180504