CN107058167A - 微生物菌剂的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种微生物菌剂的制备方法，1)取长白山原始森林的土壤；2)将土壤用灭菌水稀释10倍后混匀，采用梯度稀释分离法制备土壤悬浮液后分别涂布于5块固体培养基平板上培养，挑选一块单菌落较多的平板作为统计平板；3)对统计平板上的菌落进行归类并统计数量；4)根据步骤3)的结果确定3株优势菌株；5)将3株优势菌株采用革兰氏染色法判断细菌的类别，然后利用PCR技术扩增16SrDNA鉴定菌株的种属；6)将优势菌株保存；7)将3株优势菌株培养，并按适宜的体积比混合后离心悬浮于灭菌盐水中，即制得微生物菌剂。制得的微生物菌剂可用于在促进花卉生长方面的应用。该方法简单易操作，制得的微生物菌剂能显著促进植物生长。

Description

微生物菌剂的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料领域，尤其涉及一种微生物菌剂的制备方法及其应用。
背景技术
花卉栽培肥料是花卉养料的来源，施肥的合理与否直接影响待花卉的生成，关系到花卉的产量和质量。植物在生长发育需要的元素比较多，主要成分为氮，磷，钾，氮，磷，钾单纯靠培养土供给是不够的，因此，需要通过施肥来补充。
现有的肥料分为有机肥料，无机肥料与微生物肥料，有机肥料又脏又臭，对于花卉的养殖者来说难以接受，无机肥料虽然清洁卫生，但是长期使用容易造成土壤板结。微生物肥料提供的是能固氮、解磷、解钾等有益微生物，这些活的微生物不仅能固氮、解磷、解钾，而且分泌有利于植物生长的多种激素，多糖等物质，改良土壤结构，改善花卉产品品质和提高花卉的防病、抗病能力，从而实现花卉植株最佳的观赏价值。
现市售的微生物肥料的类型多种多样，价格也参差不齐，微生物肥料通过多种微生物菌株混合而成，如中国发明专利(申请公布号CN 105567604A申请公布日2016.05.11)公开了一种复合微生物菌剂及其制备方法，其中微生物菌剂是由经过发酵的真菌菌剂和经过发酵的细菌菌剂按照菌数比35～85:15～65的比例混合后形成。该发明的微生物菌剂采用细菌与真菌的混合菌剂，可用于污水处理系统以及石油污染突然生物修复中，但是该发明中的微生物菌剂不适用于花卉作物的养植。如中国发明专利(授权公告号CN 103332989B，授权公告日2015.07.22)公开了一种利用微生物有益菌种制备温室花卉专用肥料 的方法，其中采用的微生物有益菌种均为购买的固氮菌，解磷菌以及蜡状芽孢杆菌以及自制的固体微生物，其中固体微生物的制备方法是:将熟化以后的植物淀粉放在山上的阴凉处，并用植物的干叶将其盖住，进而采取各种微生物生命体的组合，放置10天后将其取回。采用这种方法采集到的微生物的种类非常复杂，无法进行鉴别微生物的具体种属，而且这种方式得到的微生物中非常容易感染有害微生物，一旦将这种感染有害微生物的菌剂使用在花卉或作物中时，会造成死苗的严重后果。
发明内容
本发明的目的就是针对以上技术的不足，提供一种微生物菌剂的制备方法及其应用。该方法制得的微生物菌剂中菌株种属可鉴定、菌株的品种较为单一、制备微生物菌剂的操作简单且能显著促进植物生长。
为实现上述目的，本发明所设计的一种微生物菌剂的制备方法包括以下步骤：
1)材料的选择：取自长白山原始森林的土壤；
2)稀释涂布：取土壤m克，将m克的土壤用灭菌水稀释10倍后混匀，采用梯度稀释分离法制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液各取0.2ml分别涂布于5块固体培养基平板上，将涂有不同浓度土壤悬浮液的5块固体培养基平板置于18℃的恒温箱中培养2～3天，培养后从5块固体培养基平板中挑选出一块单菌落较多的平板作为统计平板；
所述固体培养基的配方为：10g/L胰蛋白粉、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、15g/L琼脂、5g/L葡萄糖；
3)统计：根据统计平板中菌落的形态特征对统计平板中的菌落进行归类并统计数量；
4)优势菌株的确定：根据步骤3)的结果确定3株优势菌株，采用平板划线法进一步纯化3株优势菌株；
5)优势菌株的鉴定：将纯化后的3株优势菌株分别接种到LB固 体培养基上，18℃培养，观察菌落的形态特征并采用革兰氏染色法对细菌的类别进行的判断，然后利用PCR技术扩增16SrDNA鉴定菌株的种属，具体的过程为：挑取单菌落溶于100ul超纯水中，在沸水中煮10min裂解菌体，吸取1ul裂解后的菌液作为PCR反应的模板，扩增16SrDNA基因，将扩增的16SrDNA基因序列与GeneBank中16SrDNA的数据库进行同源性比对，确定3株优势菌株的种属；
PCR技术扩增中的引物采用通用引物对27F-1492R；引物对27F-1492R的序列为：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’与5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR的反应体系为：10×PCR buffer 5μl、dNTP 5μl、Mg2+2μl、10μM引物对27F-1492R各1μl、KOD DNA polymease1μl、模板1ul，用超纯水定容至50μl；
其中，KOD DNA polymease(高保真性PCR酶)购自东洋纺生物科技有限公司，10×PCR buffer、dNTP、Mg2+、引物对27F-1492R均购自TaKaRa公司。
PCR反应程序为95℃5min；95℃1min、52℃30s、68℃2min，30个循环；68℃10min，15℃10min；(PCR仪购自Bio-Bad公司)
6)优势菌株的保存：将3株优势菌株分别接种于5ml LB液体培养基中培养，待OD600达到1.8～2.2时，取0.5ml菌液与0.5ml质量百分比为40％的灭菌甘油混合均匀，液氮预冻，-80℃保存待用；
7)微生物菌剂的制备：从液氮中取出3株优势菌株，分别接种在3瓶50ml LB液体培养基中培养，控制3瓶菌液的OD600为0.5～0.7时，将3瓶菌液按适宜的体积比混合，将混合的菌液离心悬浮于质量百分比为0.9％的灭菌盐水中，即制得微生物菌剂。
进一步地，所述步骤1)中m为10，将10克的土壤投入装有90ml灭菌水的锥形瓶中放入摇床中摇动1小时混匀，摇床的转速为100rpm；采用梯度稀释分离法制备10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液。采用这种混合方式，可以将土壤更好的混匀，使其中土壤中的菌株在土壤液中分布均一，优选制备10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液，因为10-2、10-3土 壤悬浮液浓度较高，后期涂平板会产生较多的菌苔，不利于判断优势菌株。
进一步地，步骤5)中鉴定3株优势菌株分别为假单胞菌、柠檬酸杆菌和喜冷杆菌；所述步骤7)中3瓶菌液混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:2～4:4～6。假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:2～4:4～6是根据原始森林土壤中的菌株的比例，制备的微生物菌剂中菌株的比例与原始森林土壤中的菌株的比例尽可能保持一致，这样才能达到促进植物生长的效果。
更进一步地，所述喜冷杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期为2016.10.31，保藏号为CCTCC M 2016604，命名为Cryobacteriumbaishanse 02；所述3瓶菌液混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:3:5；采用该混合体积比更能促进植物生长。
一种微生物菌剂的应用，所述微生物菌剂在促进花卉生长的应用。
进一步地，所述花卉为芦荟，仙人掌，虎尾兰；由于芦荟，仙人掌，虎尾兰这三种花卉生长速度较慢，将微生物菌剂应用在这三种花卉中可使其生长的速度明显加快。
本发明的优点在于：
1、从长白山原始森林是最接近原始生态的环境，在森林内有丰富的微生物，原始森林土壤没有经过人为破坏，因此微生物在该环境中经过长期的进化，与长期生活的绿色植物共同生长会对植物生长具有促进作用。通过筛选长白山原始森林土壤中的主要优势菌群来制备微生物菌剂应用在花卉植株中，促进花卉植株的生长。
2、采用梯度稀释分离法涂布平板，通过分类法统计菌落的类型与数量确定优势菌株，通过革兰氏染色法与16SrDNA共同鉴定优势菌株的种属，得到的优势菌株的种属结果准确，并将得到的优势菌株进行保存，便于再次使用该菌株。
3、将保存的优势菌株培养至相同的OD600值，以一定的体积比混合得到微生物菌剂，通过试验得出3瓶菌液混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:2～4:4～6，这种体积比的微生物菌剂应 用在花卉植株中，花卉植株的生长速度较快。
附图说明
图1为1号喜冷杆菌属菌株培养于LB平板上的形态；
图2为3号假单胞菌属菌株培养于LB平板上的形态；
图3为5号柠檬酸杆菌属菌株培养于LB平板上的形态；
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种微生物菌剂的制备方法，具体地说，通过在长白山原始森林土壤中筛选得到优势菌株，将此优势菌株鉴定其种属后制成微生物菌剂应用于花卉植株上，促进花卉植株的生长。下将通过具体的实施例来对本发明的一种微生物菌剂的制备方法及其应用的优选方式进行详细地说明。
1)材料的选择：取自长白山原始森林的土壤；
2)稀释涂布：取土壤10克，将10克的土壤投入装有90ml灭菌水的锥形瓶中放入摇床中摇动1小时混匀，摇床的转速为100rpm；采用梯度稀释分离法制备10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液，将10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液各取0.2ml分别涂布于5块固体培养基平板上，将涂有不同浓度土壤悬浮液的5块固体培养基平板置于18℃的恒温箱中培养2～3天，培养后从5块固体培养基平板中挑选出一块单菌落较多的平板作为统计平板；
固体培养基的配方为：10g/L胰蛋白粉、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、15g/L琼脂、5g/L葡萄糖；
3)统计：根据统计平板中菌落的形态特征对统计平板中的菌落进行归类并统计数量；见表1
表1菌落形态与数量统计
4)优势菌株的确定：根据步骤3)的结果确定3株优势菌株，采用平板划线法进一步纯化3株优势菌株；
本发明所述的优势菌株定义为：在最高稀释度上，菌落数占总菌落数的比例为10％以上的菌株称之为优势菌株。每个样品中最多菌落达不到10％的，取菌落数最多的3种作为优势菌株。根据该定义，得出1号，3号，5号菌株为优势菌株。如图1为1号菌株培养于LB平板上的形态；如图2为3号菌株培养于LB平板上的形态；如图3为5号菌株培养于LB平板上的形态。
5)优势菌株的鉴定：将纯化后的3株优势菌株分别接种到LB固体培养基上，18℃培养，观察菌落的形态特征并采用革兰氏染色法对细菌的类别进行的判断，然后利用PCR技术扩增16SrDNA鉴定菌株的种属，具体的过程为：挑取单菌落溶于100ul超纯水中，在沸水中煮10min裂解菌体，吸取1ul裂解后的菌液作为PCR反应的模板，扩增16SrDNA基因，将扩增的16SrDNA基因序列与GeneBank中16SrDNA的数据库进行同源性比对，确定3株优势菌株的种属；
PCR技术扩增中的引物采用通用引物对27F-1492R；
PCR的反应体系为：10×PCR buffer 5μl、dNTP 5μl、Mg2+2μl、10μM引物对27F-1492R各1μl、KOD DNA polymease 1μl、模板1ul，用超纯水定容至50μl；
PCR反应程序为95℃5min；95℃1min、52℃30s、68℃2min，30个循环；68℃10min，15℃10min；
将3株优势菌株的菌落形态，染色结果对比《伯杰氏细菌鉴定手册》及16S rDNA分析其相应的菌属。结果如下：菌株1与Cryobacterium psychrotolerans相似度为97％，菌株3与Pseudomonas fluorescens相似度为99％，菌株5与Citrobacter murliniae相似度为98％。综合以上，鉴定3株优势菌株分别为喜冷杆菌、假单胞菌、柠檬酸杆菌；见表2
表2优势菌株的菌属鉴定
编号 相关属 相关种 拉丁名 相似度 革兰氏染色
1 喜冷杆菌属 psychrotolerans Cryobacterium psychrotolerans 97％ 阴性
3 假单胞菌属 fluorescens Pseudomonas fluorescens 99％ 阴性
5 柠檬酸杆菌属 murliniae Citrobacter murliniae 98％ 阴性
6)优势菌株的保存：将3株优势菌株分别接种于5ml LB液体培养基中培养，待OD600达到2.0时，取0.5ml菌液与0.5ml质量百分比为40％的灭菌甘油混合均匀，液氮预冻，-80℃保存待用；
7)微生物菌剂的制备：从液氮中取出3株优势菌株，分别接种在3瓶50ml LB液体培养基中培养，控制3瓶菌液的OD600为0.6时，将3瓶菌液混合，混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:2:4，将混合的菌液离心悬浮于质量百分比为0.9％的灭菌盐水中，即制得微生物菌剂A，取10ml微生物菌剂A，10ml无菌水分别将它倒入相同大小的芦荟的培养土中，三个月后，记录芦荟的长势，具体见表3，其中高度差为三个月后的芦荟与三个月前同一株芦荟的高度差；湿重差为三个月后的芦荟与三个月前同一株芦荟的湿重差；干重差为三个月后的芦荟与三个月前同一株芦荟的干重差。
表3
高度差(cm) 湿重差(g) 干重差(g)
对比例 5.1 105.3 12.4
微生物菌剂A 12.6 292.1 26.4
将3瓶菌液混合，混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:3:5，将混合的菌液离心悬浮于质量百分比为0.9％的灭菌盐水中，即制得微生物菌剂B；取10ml微生物菌剂B，10ml无菌水 分别将它倒入相同大小的仙人掌的培养土中，三个月后，记录仙人掌的长势，具体见表4，其中高度差为三个月后的芦荟与三个月前同一株仙人掌的高度差；湿重差为三个月后的芦荟与三个月前同一株仙人掌的湿重差；干重差为三个月后的芦荟与三个月前同一株仙人掌的干重差。
表4
高度差(cm) 湿重差(g) 干重差(g)
对比例 0.5 4.6 1.2
微生物菌剂B 2.5 15.6 4.5
将3瓶菌液混合，混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:4:6，将混合的菌液离心悬浮于质量百分比为0.9％的灭菌盐水中，即制得微生物菌剂C；取10ml微生物菌剂C，10ml无菌水分别将它倒入相同大小的仙人掌的培养土中，三个月后，记录虎尾兰的长势，具体见表5，其中高度差为三个月后的芦荟与三个月前同一株虎尾兰的高度差；湿重差为三个月后的芦荟与三个月前同一株虎尾兰的湿重差；干重差为三个月后的芦荟与三个月前同一株虎尾兰的干重差。
表5
高度差(cm) 湿重差(g) 干重差(g)
对比例 5.8 90.3 24.3
微生物菌剂C 14.3 200.8 45.3
上述喜冷杆菌属菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏日期为2016.10.31，保藏号为CCTCC M2016604。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)材料的选择：取自长白山原始森林的土壤；
2)稀释涂布：取土壤m克，将m克的土壤用灭菌水稀释10倍后混匀，采用梯度稀释分离法制备10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液各取0.2ml分别涂布于5块固体培养基平板上，将涂有不同浓度土壤悬浮液的5块固体培养基平板置于18℃的恒温箱中培养2～3天，培养后从5块固体培养基平板中挑选出一块单菌落较多的平板作为统计平板；
所述固体培养基的配方为：10g/L胰蛋白粉、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、15g/L琼脂、5g/L葡萄糖；
3)统计：根据统计平板中菌落的形态特征对统计平板中的菌落进行归类并统计数量；
4)优势菌株的确定：根据步骤3)的结果确定3株优势菌株，采用平板划线法进一步纯化3株优势菌株；
5)优势菌株的鉴定：将纯化后的3株优势菌株分别接种到LB固体培养基上，18℃培养，观察菌落的形态特征并采用革兰氏染色法对细菌的类别进行的判断，然后利用PCR技术扩增16SrDNA鉴定菌株的种属，具体的过程为：挑取单菌落溶于100ul超纯水中，在沸水中煮10min裂解菌体，吸取1ul裂解后的菌液作为PCR反应的模板，扩增16SrDNA基因，将扩增的16SrDNA基因序列与GeneBank中16SrDNA的数据库进行同源性比对，确定3株优势菌株的种属；
所述PCR技术扩增中的引物采用通用引物对27F-1492R；
所述PCR的反应体系为：10×PCR buffer 5μl、dNTP 5μl、Mg2+2μl、10μM引物对27F-1492R各1μl、KOD DNA polymease 1μl、模板1ul，用超纯水定容至50μl；
所述PCR反应程序为95℃5min；95℃1min、52℃30s、68℃2min，30个循环；68℃10min，15℃10min；
6)优势菌株的保存：将3株优势菌株分别接种于5ml LB液体培养基中培养，待OD600达到1.8～2.2时，取0.5ml菌液与0.5ml质量百分比为40％的灭菌甘油混合均匀，液氮预冻，-80℃保存待用；
7)微生物菌剂的制备：从液氮中取出3株优势菌株，分别接种在3瓶50ml LB液体培养基中培养，控制3瓶菌液的OD600为0.5～0.7时，将3瓶菌液按适宜的体积比混合，将混合的菌液离心悬浮于质量百分比为0.9％的灭菌盐水中，即制得微生物菌剂。
2.根据权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述m为10，将10克的土壤投入装有90ml灭菌水的锥形瓶中放入摇床中摇动1小时混匀，摇床的转速为100rpm；采用梯度稀释分离法制备10-4、10-5、10-6的土壤悬浮液。
3.根据权利要求1所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：步骤5)中鉴定3株优势菌株分别为假单胞菌、柠檬酸杆菌和喜冷杆菌；所述步骤7)中3瓶菌液混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:2～4:4～6。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述喜冷杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉，武汉大学，保藏日期为2016.10.31，保藏号为CCTCC M 2016604；命名为Cryobacterium baishanse 02。
5.根据权利要求3所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于：所述3瓶菌液混合的体积比为，假单胞菌：柠檬酸杆菌：喜冷杆菌为1:3:5。
6.一种微生物菌剂的应用，其特征在于：所述微生物菌剂在促进花卉生长的应用。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂的应用，其特征在于：所述花卉为芦荟，仙人掌，虎尾兰。
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