CN107841490A - 双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体 - Google Patents
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体。双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，包括步骤：1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；2)纯化抗血清得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。本发明利用PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因，并通过基因工程技术得到Ecoli BL21‑pET21a‑BMTHC重组菌株，诱导表达重组菌株得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白，该蛋白具有较好的低温耐受，而且以双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原成功得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体。
背景技术
5,10-亚甲基四氢叶酸和10-甲基四氢叶酸参与蛋氨酸,丝氨酸,胸腺嘧啶核苷酸和嘌呤的合成。5,10-亚甲基四氢叶酸和10-甲基四氢叶酸结构相互转换是合成反应的重要中枢环节，而这种结构的相互转换是由双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶催化完成的。
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶，英文名:Bifunctional-methylene-tetrahydrofolate/cyclohydrolase。双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶兼有5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶和5,10-亚甲基四氢叶酸环化酶的活性，这种酶最初在埃列希腹水肿瘤细胞中发现，随后在癌变的哺乳动物细胞和胚胎以及未分化组织中检测到。近年来，为了进一步了解双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶，有关对双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的研究广泛展开，来自不同生物体的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶被克隆，其基因从原核生物，酵母，动植物中克隆，包括大肠杆菌，豌豆，酵母，果蝇，人，兔，猪，大鼠和小鼠，这些基因表达得到的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的大小在30kDa至100kDa不等。但是目前对于双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的研究仅限于一些常规生物中，对于一些极端微生物比如耐冷，耐热，耐酸，耐碱等微生物中对于双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的研究几乎没有，对于耐冷微生物中酶的研究尤其具有重要的意义。因此亟需得到来源于耐冷微生物中的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶；而且为了检测双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶制备其多克隆抗体是前提，目前尚无双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的相关报道。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体，得到来源于耐冷微生物中的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶以及制备其多克隆抗体。
本发明的目的之一是提供一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的氨基酸序列；所述双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的目的之二是提供一种编码双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的氨基酸基因的碱基序列；所述双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的氨基酸基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的目的之三是提供一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法。
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的方法，包括以下步骤：
1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；
2)纯化抗血清得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。
进一步地，所述双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的制备方法为：
1.1)利用PCR技术扩增SEQ ID NO.2所示的碱基序列；
1.2)将SEQ ID NO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的表达载体；
1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白。
进一步地，所述纯化抗血清的方法为：将双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，再将待纯化的抗血清与PBS按照1:1比例混合后经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白结合完全后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。
更进一步地，所述步骤1.1)中，PCR技术扩增所用的引物为：正向引物如SEQ IDNO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
更进一步地，所述步骤1.2)中载体质粒为pET21a(+)。
更进一步地，所述步骤1.3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。
更进一步地，所述步骤1.3)中，所述纯化蛋白过程中利用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。
本发明的优点在于：
1，本发明通过PCR技术在喜冷杆菌属Cryobacterium中扩增得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因，并且通过NCBI Blast碱基序列比对证明该双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因碱基序列属于喜冷杆菌属的新的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因序列。通过基因工程技术得到表达双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白的Ecoli BL21-pET21a-BMTHCT重组菌株，诱导表达重组菌株得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白，双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为低温酶，即在低温条件下发挥活性，具有较好低温的耐受力。
2，本发明以双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体，该多克隆抗体可以准确地检测双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白。
附图说明
图1为PCR扩增双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定图；其中M泳道为DNA marker，1号泳道为PCR扩增双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因的产物；
图2为表达载体pET21a-BMTHC的构建示意图；
图3为重组菌株Ecoli BL21-pET21a-BMTHC表达双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定图；其中Marker泳道为protein marker；1泳道为双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白；
图4为双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶多克隆抗体的Western Blotting分析图，其中Magic泳道为蛋白质分子量标准，C.b 02泳道为细菌Cryobacterium baishanse02超声破碎离心后的上清液样品。
具体实施方式
为更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对发明进行详细的说明。
实施例1
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因的获取
1)获取含有目的基因的菌株
本发明利用喜冷杆菌属菌株，喜冷杆菌属菌株筛选自长白山土壤，具体的筛选过程如申请号为201710034491.5的中国发明专利，该菌株的命名为：Cryobacteriumbaishanse 02，保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016604。保藏日期为2016年10月31日，保藏地址为，中国武汉，武汉大学。喜冷杆菌属菌株Cryobacteriumbaishanse 02为耐冷菌株，在4℃的环境中仍保持较高的代谢活性。
2)基因组的提取
利用DNA提取试剂盒(TAKARA Dalian)提取Cryobacterium baishanse 02菌株的基因组作为模板，提取的基因组样品于-20℃保存待用。
3)PCR扩增目的基因
设计引物：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示；PCR反应体系如下表1所示：
表1
| 成分 | 体积 |
| 10×PCR缓冲液 | 5μl |
| 引物F | 1μl |
| 引物R | 1μl |
| 模板 | 80ng |
| MgSO4 | 2μl |
| dNTP | 5μl |
| 去离子水 | 35μl |
| 总计 | 50μl |
PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃30s，55℃30s，68℃延伸1.30min，共计30个循环；68℃延伸10min；15℃保持10min。
将PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，如图1所示，PCR扩增产物的大小与预计的885bp接近，将PCR扩增产物切胶回收，送生物公司测序以准确判断PCR扩增产物的碱基序列，测序委托铂尚生物技术有限公司完成。
测序结果如SEQ ID NO.2所示，将SEQ ID NO.2所示的碱基序列在NCBI Blast网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行碱基序列比对，比对结果与Cryobacterium arcticum strain PAMC 27867的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶相似性为95％，即可判断SEQ ID NO.2所示的碱基序列属于Cryobacterium属的新的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶序列。
实施例2
构建双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的表达载体
将实施例1中得到的PCR扩增产物进行胶回收，用限制性内切酶EcoRI和NdeI对PCR扩增产物进行双酶切反应；同时用限制性内切酶EcoRI和NdeI对载体pET21a(+)进行双酶切反应，然后经高效DNA连接酶High Ligation(TOYOBO)催化连接经双酶切反应后的pET21a(+)和PCR扩增产物；构建得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的表达载体pET21a-BMTHC，表达载体pET21a-BMTHC的构建如图2所示。
实施例3
表达和纯化双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白
将实施例2得到的表达载体pET21a-BMTHC转化入大肠杆菌BL21的感受态菌体中，大肠杆菌BL21的感受态的制备采用CaCl2法，CaCl2法制备大肠杆菌BL21的感受态为实验室常规实验手段，在此不再赘述。将得到的表达载体pET21a-BMTHC转化入大肠杆菌BL21后得到重组菌株Ecoli BL21-pET21a-BMTHCT。将Ecoli BL21-pET21a-BMTHCT扩大培养至OD600＝0.6后添加1mM IPTG，28℃诱导培养表达双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白，诱导培养结束后收集菌体，依次经菌体破碎和Ni-NTA亲和层析色谱柱纯化后得到纯化后的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白，如图3所示，得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白的蛋白分子量在29.0～44.3之间，与理论预计值30.7KD一致，表明纯化得到的蛋白即为双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白。
实施例4
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白的活力影响试验
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白的酶活测定，原理为：由于双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶具有5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性，利用5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶活性的检测方法即可得出双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白的酶活。5,10-亚甲基四氢叶酸脱氢酶可将5,10-亚甲基四氢叶酸氧化为5,10-甲炔基四氢叶酸。
具体方法为：以5,10-亚甲基四氢叶酸作为底物，分别加入辅酶因子，与实施例3得到的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白一起进行孵育，生成5,10-甲炔基四氢叶酸的量用酶标仪在350nm的吸光值根据摩尔吸光系数计算得到。
底物的配制：配制反应体系：25mmol/L磷酸钾缓冲液，36mmol/L巯基乙醇，100umol/LNADP,0.5mmol/L5,10-亚甲基四氢叶酸。
测定酶活方法为，向底物液中加入1umol/L的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白，总体积为50ul。分别在4℃、18℃、28℃、37℃、50℃、60℃、70℃、80℃下测定酶活。结果见表2。
酶活力单位定义：双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶在一定的温度和PH条件下，每秒钟催化转换1mol5,10-亚甲基四氢叶酸生成5,10-甲炔基四氢叶酸定义为一个活力单位。
表2
| 温度℃ | 相对酶活％ |
| 4 | 26％ |
| 18 | 59％ |
| 28 | 75％ |
| 37 | 86％ |
| 50 | 59％ |
| 60 | 43％ |
| 70 | 11％ |
| 80 | 0％ |
由表2可以看出，本发明得到的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白最适温度为37℃，而且双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶在4℃具有26％的相对酶活，与现有的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶相比，本发明得到的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶具有较好的低温耐受，这是因为编码双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的碱基序列来自于Cryobacterium baishanse 02，Cryobacterium baishanse 02为低温菌，使得到的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶具有低温耐受特性，利用本发明的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶能够在低温条件下能催化5，10-亚甲基四氢叶酸和10-甲基四氢叶酸结构转换，能为工业生产节约能耗，具有较好的应用前景。而且双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的低温特性也进一步验证实施例3得到的重组蛋白的基因来源于耐冷微生物。
实施例5
双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备：
取实施例3纯化后的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白作为抗原，采用皮下注射免疫约5周龄的小鼠，50μg每次，2周免疫一次，共免疫4次；采血检测，通过ELISA方法确定抗体针对抗原的效价，效价大于1:50000进行最终采血制备抗血清，然后纯化抗血清制备多克隆抗体。
一)ELISA方法确定抗体针对抗原的效价的方法为：
1)将抗原用碳酸钠缓冲液(pH 9.6)稀释到10μg/ml，将抗原置于酶标96孔板，每孔100μl孵育1h。
2)用PBS-T将酶标96孔板清洗3次。
3)用5％skim milk封闭酶标板1小时，每孔100μl。
4)用PBS-T将酶标板清洗3次。
5)用PBS-T稀释血清5000倍，孵育抗原1h。
6)用PBS-T将酶标板清洗3次。
7)每孔加入100μl HRP标记的羊抗鼠抗体，用PBS-T稀释羊抗鼠抗体5000倍，孵育1h。
8)利用PBS-T将酶标板清洗3次。
9)清洗完毕后每孔加入100μl显色液ABST，反应20min后每孔加入50μl过氧化氢；
10)最后分光光度计上测420nm上述步骤9)中样品的OD值，并得出效价为1：16，大于1:50000然后进行最终采血得到抗血清。
二)纯化抗血清：
纯化抗血清的方法是：将抗原蛋白(双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白)与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，将上述采血所得的抗血清与PBS按照1:1比例混合后，缓慢经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与抗原蛋白结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的多克隆抗体，纯化后的多克隆抗体利用PBS过夜透析，次日进行浓度测定。
上述纯化的多克隆抗体浓度的测定方法，包括以下步骤：
1)CBB染色液配制：根据样品数量，将5×CBB染色液稀释，充分混匀。
2)根据需要取适量BSA标准蛋白，配制终浓度分别为1mg/ml、0.75mg/ml、0.5mg/ml、0.25mg/ml和0.125mg/ml标准样，并混匀。标准样采用PBS为溶剂。
3)标准曲线绘制：取一块酶标板，按下表格加入试剂：
| 孔号 | A | B | C | D | E | F |
| 标准样浓度(mg/ml) | 0 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 0.75 | 1 |
| 各浓度标准样(μl) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 去离子水 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 | 9 |
| CBB染色液 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| 对应蛋白含量(μg) | 0 | 0.125 | 0.25 | 0.5 | 0.75 | 1 |
| 最终体积(μl) | 210 | 210 | 210 | 210 | 210 | 210 |
4)振荡混匀后，室温下静置30min。
5)用酶标仪测定562nm处的吸光值，以不含BSA的光吸收为空白对照。以蛋白含量(μg)为横坐标，吸收值为纵坐标，绘出标准曲线。
6)样品测定：将待测蛋白样品用去离子水稀释不同浓度梯度，各取1μl并稀释至10μl，再加入200μl 1×CBB，混匀后室温下静置30min，然后以不含蛋白的溶剂为空白对照，测定样品吸收值。
7)根据测得的吸收值，在标准曲线上计算样品的蛋白含量。
8)计算蛋白浓度：以查得的蛋白含量，并根据稀释倍数计算样品的实际浓度。
三)利用Western Blotting检测双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的方法为：
1)细菌Cryobacterium baishanse 02(保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2016604)培养至OD至约为2.0，取1.5ml离心收集菌体，300μl Tris-HCl重悬，超声破碎取20μl破碎夜与5μl 5×SDS上样缓冲液混合，其中10μl进行SDS-PAGE电泳。蛋白质分子量标准上样量为0.8μl。
2)上样后，电泳仪恒定为18mA，直到电泳结束。
3)电泳后，将凝胶上蛋白样品转移至PVDF膜，恒定电流为0.23A进行转膜，时间为35分钟。
4)电泳结束后将PVDF膜干燥后于5％skim milk中封闭1小时。
5)PBST清洗PVDF膜5次。
6)用PBST稀释上述纯化的抗体(1:5000)，孵育PVDF膜1小时。
7)PBST清洗PVDF膜5次。
8)用PBST稀释二抗(1:20000，羊抗鼠-HRP)，孵育PVDF膜1小时。
9)PBST清洗5次，ECL显影，暗室成像。
结果如图4所示，结果表明制备得到的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体可以检测到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 湖北工业大学
<120> 双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶及其多克隆抗体
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 294
<212> PRT
<213> Cryobacterium
<400> 1
Met Thr Ala Leu Thr Leu Asp Gly Val Ala Thr Ala Thr Gln Val Lys
1 5 10 15
Leu Glu Leu Ala Glu Arg Val Arg Ala Leu Ala Ala His Gly Ile Val
20 25 30
Pro Gly Leu Gly Thr Leu Leu Val Gly Asp Asp Pro Gly Ser Arg Ser
35 40 45
Tyr Val Ala Gly Lys His Arg Asp Cys Ala Glu Val Gly Ile Glu Ser
50 55 60
Ile Arg Ile Asp Leu Pro Gly Ser Ala Thr Ser Ala Asp Val Arg Ala
65 70 75 80
Ala Ile Thr Asp Leu Asn Ala Ala Arg Glu Val Thr Gly Tyr Ile Ile
85 90 95
Gln Leu Pro Leu Pro Val Gly His Asn Glu Asn Ala Met Leu Glu Leu
100 105 110
Met Asp Pro Ala Lys Asp Ala Asp Gly Leu His Pro Thr Asn Leu Gly
115 120 125
Arg Leu Val Leu Gly Ile Glu Gly Glu Leu Asp Ser Pro Leu Pro Cys
130 135 140
Thr Pro Ala Gly Ile Val Glu Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Val Pro Ile
145 150 155 160
Ala Gly Lys Asn Val Val Val Ile Gly Arg Gly Leu Thr Val Gly Arg
165 170 175
Pro Leu Gly Leu Leu Phe Thr Arg Lys Gly Leu Asp Ala Thr Val Thr
180 185 190
Leu Thr His Ser Arg Thr Val Asp Leu Ala Gly Glu Val Arg Arg Ala
195 200 205
Asp Ile Val Val Ala Ala Val Gly Val Pro His Leu Val Gln Ala Asp
210 215 220
Trp Ile Lys Pro Gly Ala Ala Val Leu Asp Val Gly Ile Thr Arg Val
225 230 235 240
Glu Asp Pro Glu Thr Gly Lys Gly Val Leu Thr Gly Asp Val His Pro
245 250 255
Asp Val Ala Ser Val Ala Gly His Leu Ser Pro Asn Pro Arg Gly Val
260 265 270
Gly Pro Met Thr Arg Ala Met Leu Leu Ala Asn Val Val Lys Ala Ser
275 280 285
Glu Arg Leu Leu Lys Pro
290
<210> 2
<211> 885
<212> DNA
<213> Cryobacterium
<400> 2
atgaccgcac tcaccctcga cggcgtcgcc accgcgaccc aggtcaagct cgaactcgcc 60
gagcgcgtgc gcgcgctggc cgcgcacggc atcgtgccgg gcctcggcac cctgctcgtc 120
ggcgacgatc cgggcagccg ctcctacgtg gccggcaagc accgcgactg cgccgaggtg 180
ggtatcgagt ccatccgcat cgacctgccc ggctccgcca cctcggcgga tgtgcgcgcc 240
gcgatcacgg acctcaacgc cgcccgcgag gtcaccggtt acatcatcca gctgccgttg 300
cccgtgggcc acaacgagaa cgccatgctc gagctgatgg acccggccaa ggacgccgac 360
ggcctgcacc ccaccaacct gggccgcctg gtgctgggca tcgagggcga gctcgactcg 420
ccgctgccgt gcacccccgc cggcatcgtg gaactgctgc gccgctacga ggtgcccatc 480
gccggcaaga acgtggtcgt catcggccgc ggcctcaccg tgggccgccc gctgggcctg 540
ctcttcaccc gcaagggcct ggacgccacc gtcaccctca cccactcccg cacggtcgac 600
ctggccggcg aggtgcgccg cgccgacatc gtcgtggccg ctgtgggcgt gccgcacctc 660
gtgcaggccg actggatcaa gcccggcgcc gccgtgctcg acgtgggcat cacccgcgtg 720
gaggacccgg agaccggcaa gggcgtgctt accggagacg tgcaccccga cgtcgcctcg 780
gtggccggac acctctcgcc gaacccccgc ggagtgggcc cgatgacccg cgccatgctc 840
ctcgccaacg tggtcaaggc ctccgagcgc ctcctcaagc cctag 885
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggaattccat atgaccgcac tcaccctcga c 31
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggaattcggc cttgaggagg cgctc 25
Claims (10)
1.一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶，其特征在于：所述双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种编码权利要求1所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的基因，其特征在于：所述双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体，其特征在于：所述多克隆抗体的抗原为SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的多肽。
4.一种制备权利要求3所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)以氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶为抗原，免疫小鼠制备抗血清；
2)纯化抗血清得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的制备方法为：
1.1)利用PCR技术扩增SEQ ID NO.2所示的碱基序列；
1.2)将SEQ ID NO.2所示的碱基序列克隆入载体质粒中，构建双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的表达载体；
1.3)将表达载体转化入大肠杆菌感受态菌体中得到重组菌体，依次经扩大培养、诱导表达、收集菌体、破碎菌体和纯化蛋白过程得到双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白。
6.根据权利要求4所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述纯化抗血清的方法为：将双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白与Ni-NTA偶联制备成抗体纯化层析柱，再将待纯化的抗血清与PBS按照1:1比例混合后经过抗体纯化层析柱，待抗血清中的抗体与双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶蛋白结合完全后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，获得纯化的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体。
7.根据权利要求5所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.1)中，PCR技术扩增所用的引物为：正向引物如SEQ ID NO.3所示，反向引物如SEQ ID NO.4所示。
8.根据权利要求5所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.2)中载体质粒为pET21a(+)。
9.根据权利要求5所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中，大肠杆菌感受态菌体为大肠杆菌BL21感受态菌体。
10.根据权利要求5所述的双功能亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化酶的多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤1.3)中，所述纯化蛋白过程中利用Ni-NTA亲和层析色谱柱进行蛋白纯化。
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