CN102604905A - 睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途 - Google Patents

Abstract

一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途，属于应用环境微生物技术领域，其特征是：通过分子生物学技术从睾丸酮丛毛单胞菌（C.testosteroni，ATCC11996）中克隆到一个新的基因，其编码的产物是3，17β-羟基类固醇脱氢酶，本发明对其进行了克隆、表达及功能研究发现3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用，在降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物有极大的应用价值。有益效果是：3，17β-HSD基因是首次从C.testosteroni中克隆得到的，在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用，是一种可作用于多种类固醇的酶，该酶在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。

Description

睾丸酮丛毛单胞菌3,17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途

技术领域

本发明属于应用环境微生物技术领域，涉及一种利用分子生物学技术，从睾丸酮丛毛单胞菌中克隆到一个新的基因，在降解环境污染物睾丸酮、胆固醇上的应用。

背景技术

，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）是睾丸酮丛毛单胞菌（C.testosteroni）中降解类固醇等物质的系列酶中的关键酶，阿根廷科学家利用Northern的分子生物学手段研究发现，此酶受部分类固醇激素诱导（Identification of a novel steroid inducible gene associated with The  βhsd locus of Comamonas testosteroni，José Luis Pruneda-Paz and so on，Argentina），然而对于其基因结构及功能未进行研究，国内未见报道。尤其是在C.testosteroni以及假单胞杆菌中未见报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途，3，17β-HSD基因是首次从C.testosteroni中克隆得到的，并对它进行了序列测定与分析。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29.5KD。研究发现3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用（降解率达90%以上），是一种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。

本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）是：

 Xho I 起始密码子

GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT

                                  终止密码子 BamH I

本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）制取方法是：

1.以C.testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11.5.1对所测定序列进行开放阅读框分析，为一个完整的开放阅读框，基因全长765bp(如下所示)，通过所测定序列做BLAST分析，确定该基因为3，17β-HSD。

通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17β-HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体pET-15b的Xho I和BamH I 酶切位点上构建重组质粒p3/17β-HSD，转化表达宿主菌BL21（DE3）（Studier F W,et al.J.Mol.Biol.1986,189:113）,进行IPTG诱导表达。研究发现此酶是由254个氨基酸残基组成的（如下所示），SDS-PAGE显示分子量为29.5KD。

对大肠杆菌中3，17β-HSD的表达产物进行了western blotting验证。确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17β-HSD。

对大肠杆菌中3，17β-HSD的表达产物做生物活性测定。以睾丸酮和胆固醇为底物，以高效液相色谱法（HPLC）进行残留量测定，研究发现该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强。

采用Ni-柱亲和层析，对3，17β-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度（99.5%）的3，17β-HSD。同时它保持了很高的生物活性。

本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）用途是：

利用本发明构建的工程菌及其产生的酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物，改善环境，它与其他的降解方法相比更高效、经济、安全。

本发明的有益效果是：3，17β-HSD基因是首次从C.testosteroni中克隆得到的，并对它进行了序列测定与分析。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。研究发现此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29.5KD。研究发现3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用（降解率达90%以上），是一种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。

附图说明

图 1 质粒p3/17β-HSD的构建过程示意图；

图 2 SDS-PAGE检测3,17β-HSD基因在大肠杆菌中的表达，

     Line 1、line 10：蛋白质低分子量标准，

     Line 2：BL21（DE3）/pET-15b菌体蛋白提取物，

     Line 3-9：BL21（DE3）/p3/17β-HSD菌体蛋白提取物；

图 3 western blotting检测3，17β-HSD基因在大肠杆菌中的表达，

     Line 1:蛋白质低分子量标准，

     Line 2：DAB显色3，17β-HSD；

图 4：3，17β-HSD降解睾丸酮的HPLC图谱，

     4.1：1mM 睾丸酮标准品色谱图，

     4.2：3，17β-HSD降解睾丸酮色谱图；

图 5：3，17β-HSD降解胆固醇的HPLC图谱，

5.1：1mM 胆固醇标准品色谱图，

     5.2：3，17β-HSD降解胆固醇色谱图。

具体实施方式

实施例1．睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的获得及其用于对睾丸酮的降解

1.1 睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的获得

1.1.1 C.testosteroni基因组的提取

1）按照1：50的比例接种C.testosteroni于10mlLB培养基中，27℃，180rpm培养过夜；

2）取过夜培养的菌液1ml于1.5ml Eppendorf管中，13000rpm，4℃离心30s，倒掉上清，收集沉淀；

3）向管中加入500ul经过高压灭菌的双蒸水，彻底悬浮菌体；

4）加入500ul酚：氯仿（1：1）混合均匀，室温下放置5min；13000rpm，室温离心5min；小心吸取上层于新的1.5mlEppendorf管中；

5）重复步骤4）一次；

6）小心吸取上层于新的1.5mlEppendorf管中，加入1/20V 5M NaCl和2V无水乙醇，震荡混匀，放置-20℃，30min；13000rpm，4℃，离心10min；

7）将上清倒掉，加入1ml70%乙醇彻底悬浮沉淀；

8）倒掉上清，将离心管放置数分钟，晾干；

9）加入20-50ul高压灭菌的双蒸水溶解沉淀，进行后续实验或者-20℃保存。

，17β-HSD基因片段的PCR扩增

以5’-GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAG-3’和5’-ATAAGGATCCCTATAGCCCCATGCC-3’为引物，以1.1提取的C.testosteroni基因组为模板，在以下条件下进行PCR扩增：

反应体系：

模板3ul，引物1 2ul，引物2 2ul，10X PCR buffer 5ul，聚合酶（Taq+pfu）1ul，dNTP 2ul，双蒸水35ul。

扩增条件：

a．   95℃变性5min；

b．   95℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；

c．   72℃延伸10min；

d．   4℃保存，放置至室温，1%琼脂糖凝胶电泳检测

1.1.3 目的基因的序列测定及分析

将1%琼脂糖凝胶电泳检测得到的大小合适的片段，采用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行目的片段的回收，经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的浓度及纯度，之后在T4 DNA连接酶的作用下，与购自上海生工生物技术有限公司的pUCm-T载体，22℃连接16h，构建重组质粒T-3/17βHSD。采用CaCl2转化感受态大肠杆菌DH5α（TaKaBa），进行氨苄青霉素抗性筛选，挑取平板上的单菌落进行PCR及双酶切鉴定，挑出测序所用的亚克隆，送往测序公司进行DNA测序。

测序结果出来后，利用Vector nti 11.5.1软件对所测定序列进行分析，发现所克隆的DNA片段为一完整的开放阅读框，其基因全长765bp，编码254个氨基酸残基。

重组质粒p3/17β-HSD的构建（如图1）

质粒T-3/17βHSD以Xho I和BamH I酶切，回收765bp的小片段，连接到经Xho I和BamH I酶切的质粒pET-15b上（Novagen），得到了正确的重组质粒，将此质粒转入宿主菌BL21（DE3）。

，17β-HSD基因在大肠杆菌中的诱导表达

将含有质粒p3/17β-HSD的BL21（DE3）菌株按照1：50的比例接种在LB液体培养基中（含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素），37℃恒温震荡摇床培养过夜（180rpm），作为种子液使用。

将种子液按照1：20的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中（含有终浓度为100ug/ml氨苄青霉素），37摄氏度，180rpm摇床培养2-3h。

加入IPTG（终浓度 1mM），继续摇床培养5h。于10000rpm下离心10min，取沉淀（菌体）。用于SDS-PAGE、western blotting检测目的蛋白带的表达。SDS-PAGE检测结果（图2）和western blotting检测结果（图3）均表明在29.5KD附近有一条目的蛋白带，与预期大小一致。

，17β-HSD的分离纯化

采用1.5的方法诱导表达工程菌，在4℃条件下，10000rpm，10min离心收集菌体；菌体沉淀用0.2M pH7.0磷酸缓冲液悬浮，加入溶菌酶（100ug/ml）进行细胞超声波破碎（200w，20min），10000rpm，离心15min，取上清，得到酶储备液。

酶储备液进行Ni-柱亲和层析。分别以10倍柱体积的1mM和20mM的咪唑进行洗涤，最后用50mM的咪唑洗脱，以SDS-PAGE检测纯度。结果表明，经过以上纯化过程，获得了纯度高（99.5%）的3，17β-HSD目的蛋白。

，17β-HSD用于降解睾丸酮

1.2.1 所需培养基及睾丸酮标准样

无机盐培养基：MgSO4.7H20 0.2g/L;KH2PO4 0.5g/L;(NH4)2SO4 0.5g/L;K2HPO4.3H2O 1.96g/L:121℃湿热灭菌20min；加1%微量元素溶液；加底物S.

微量元素：Na2EDTA.2H2O 12g/L;FeSO4.7H2O 2g/L;CaCl2 1g/L;ZnSO4.7H2O 0.4g/L;MnSO4.H2O 0.4g/L;CuSO4.5H2O 0.1 g/L;Na2MoO4.2H2O 0.1g/L:pH 7.0,115℃湿热灭菌15min，冷却后4℃保存备用。

睾丸酮标准样：按照2010版《中国药典》配制。

上述培养基中无机盐均为分析纯，睾丸酮标准品购自sigma公司。

实验方法

将0.5mg酶液加入到50ml无机盐培养基（睾丸酮浓度为1uM）中，27℃，180rpm震荡2h，采用10000rpm离心10min，收集无机盐培养基，采用HPLC色谱（色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为水：甲醇=45：55；流速为1.0ml/mim;检测波长为250nm；进样量为50ul；柱温为40℃）分析睾丸酮的残留量。结果（图4）表明，本发明构建的3，17β-HSD表达工程菌表达的酶对降解睾丸酮（降解率达到90%以上）活性高。

实施例2．睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的获得及其用于对胆固醇的降解

2.1 睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的获得及其分离纯化参照实施例1.1

2.2 3，17β-HSD用于降解胆固醇

2.2.1 所需培养基及胆固醇标准样

无机盐培养基：MgSO4.7H20 0.2g/L;KH2PO4 0.5g/L;(NH4)2SO4 0.5g/L;K2HPO4.3H2O 1.96g/L:121℃湿热灭菌20min；加1%微量元素溶液；加底物S.

微量元素：Na2EDTA.2H2O 12g/L;FeSO4.7H2O 2g/L;CaCl2 1g/L;ZnSO4.7H2O 0.4g/L;MnSO4.H2O 0.4g/L;CuSO4.5H2O 0.1 g/L;Na2MoO4.2H2O 0.1g/L:pH 7.0,115℃湿热灭菌15min，冷却后4℃保存备用。

胆固醇标准样：按照2010版《中国药典》配制。

上述培养基中无机盐均为分析纯，胆固醇标准品购自sigma公司。

实验方法

 将0.5mg酶液加入到50ml无机盐培养基（胆固醇浓度为1uM）中，27℃，180rpm震荡2h，采用10000rpm离心10min，收集无机盐培养基，采用HPLC色谱（色谱柱为C18反相色谱柱；流动相为100%乙腈；流速为0.7ml/mim;检测波长为205nm；进样量为50ul；柱温为35℃）分析睾丸酮的残留量。结果（图5）表明，本发明构建的3，17β-HSD表达工程菌表达的酶对降解胆固醇（降解率达到90%以上）活性高。

<110>长春理工大学

<120>睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途

<160>2

<210>1

<211>782

<212>DNA

<213>睾丸酮丛毛单胞菌（C.testosteroni）

<220>

<221>CDS

<222>(8) ...(772)

<223>该DNA序列共有782bp，其中第770-772位为终止密码子TAG、第8-769位编码成熟，该成熟3，17β-羟基类固醇脱氢酶含有254个氨基酸。

<400>1

gctcgag atg aca aat cgt ttg cag ggt aag gtg gcg ctg gtc act ggt ggt gcc 55

        Met Thr Asn Arg Leu Gln Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly Ala

        1               5                   10                  15

agc ggt gtg ggt ctt gag gtg gtg aag ctg ctt ctt ggc gaa ggc gcc aag 106

Ser Gly Val Gly Leu Glu Val Val Lys Leu Leu Leu Gly Glu Gly Ala Lys

            20                  25                  30

gtc gca ttc agc gat atc aat gaa gcg gcg ggg cag caa ctg gcg gct 154

Val Ala Phe Ser Asp Ile Asn Glu Ala Ala Gly Gln Gln Leu Ala Ala

    35                  40                  45

gaa ctg ggc gaa cgc tcc atg ttt gtc cgc cat gac gtg agc agc gag 202

Glu Leu Gly Glu Arg Ser Met Phe Val Arg His Asp Val Ser Ser Glu

50                  55                  60                  65

gcg gac tgg acg ctt gtg atg gcg gcg gtg cag cgg cgt ctg ggc acg 250

Ala Asp Trp Thr Leu Val Met Ala Ala Val Gln Arg Arg Leu Gly Thr

                70                  75                  80

ctc aat gtg ctg gtc aac aat gcc ggc atc ctg ctg cct ggt gac atg 298

Leu Asn Val Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Leu Leu Pro Gly Asp Met

            85                  90                  95

gaa aca ggg cgt ctg gag gat ttc agc cgc ctg ctc aag atc aac acc 346

Glu Thr Gly Arg Leu Glu Asp Phe Ser Arg Leu Leu Lys Ile Asn Thr

        100                 105                 110

gag tca gtc ttc att ggt tgc cag cag ggc att gcg gcg atg aag gag 394

Glu Ser Val Phe Ile Gly Cys Gln Gln Gly Ile Ala Ala Met Lys Glu

    115                 120                 125

aca gga ggc tcc atc atc aat atg gcc tcg gta tcg agc tgg ctg ccc 442

Thr Gly Gly Ser Ile Ile Asn Met Ala Ser Val Ser Ser Trp Leu Pro

130                 135                 140                 145

ata gag caa tac gcc ggc tat agc gcc agc aag gcc gcc gtg tcg gca 490

Ile Glu Gln Tyr Ala Gly Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Ala Val Ser Ala

                150                 155                 160

ctg acc cgc gcc gct gca ctg agc tgt cga aag caa ggc tat gcg att 538

Leu Thr Arg Ala Ala Ala Leu Ser Cys Arg Lys Gln Gly Thr Ala Ile

            165                 170                 175

cgc gtc aat tcc att cat ccc gat ggc atc tat acg ccc atg atg cag 586

Arg Val Asn Ser Ile His Pro Asp Gly Ile Tyr Thr Pro Met Met Gln

        180                 185                 190

gct tcg ctg cca aag ggc gtg agc aag gaa atg gtc ttg cat gac ccc 634

Ala Ser Leu Pro Lys Gly Val Ser Lys Glu Met Val Leu His Asp Pro

    195                 200                 205

aag ctc aac cgt gcc ggc cgc gcc tat atg ccc gag cgt atc gcg cag 682

Lys Leu Asn Arg Ala Gly Arg Ala Tyr Met Pro Glu Arg Ile Ala Gln

210                 215                 220                 225

ctg gtg ttg ttc ctg gcc agc gac gag tcc agt gtc atg agc ggt agc 730

Leu Val Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Ser Val Met Ser Gly Ser

                230                 235                 240

gag ctg cat gca gat aac tcg att ctg ggc atg ggg cta tag ggatccttat 782

Glu Leu His Ala Asp Asn Ser Ile Leu Gly Met Gly Leu ＊

            245                 250

<210>2

<211>254

<212>PRT

<213>睾丸酮丛毛单胞菌（C.testosteroni）

<220>

<222>（1）...（254）

<400>2

Met Thr Asn Arg Leu Gln Gly Lys Val Ala Leu Val Thr Gly Gly

1               5                   10                  15

Ala Ser Gly Val Gly Leu Glu Val Val Lys Leu Leu Leu Gly Glu

                20                  25                  30

Gly Ala Lys Val Ala Phe Ser Asp Ile Asn Glu Ala Ala Gly Gln

                35                  40                  45

Gln Leu Ala Ala Glu Leu Gly Glu Arg Ser Met Phe Val Arg His

                50                  55                  60

Asp Val Ser Ser Glu Ala Asp Trp Thr Leu Val Met Ala Ala Val

                65                  70                  75

Gln Arg Arg Leu Gly Thr Leu Asn Val Leu Val Asn Asn Ala Gly

                80                  85                  90

Ile Leu Leu Pro Gly Asp Met Glu Thr Gly Arg Leu Glu Asp Phe

                95                  100                 105

Ser Arg Leu Leu Lys Ile Asn Thr Glu Ser Val Phe Ile Gly Cys

                110                 115                 120

Gln Gln Gly Ile Ala Ala Met Lys Glu Thr Gly Gly Ser Ile Ile

                125                 130                 135

Asn Met Ala Ser Val Ser Ser Trp Leu Pro Ile Glu Gln Tyr Ala

                140                 145                 150

Gly Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Ala Val Ser Ala Leu Thr Arg Ala

                155                 160                 165

Ala Ala Leu Ser Cys Arg Lys Gln Gly Thr Ala Ile Arg Val Asn

                170                 175                 180

Ser Ile His Pro Asp Gly Ile Tyr Thr Pro Met Met Gln Ala Ser

                185                 190                 195

Leu Pro Lys Gly Val Ser Lys Glu Met Val Leu His Asp Pro Lys

                200                 205                 210

Leu Asn Arg Ala Gly Arg Ala Tyr Met Pro Glu Arg Ile Ala Gln

                215                 220                 225

Leu Val Leu Phe Leu Ala Ser Asp Glu Ser Ser Val Met Ser Gly

                230                 235                 240

Ser Glu Leu His Ala Asp Asn Ser Ile Leu Gly Met Gly Leu

                245                 250              

 

Claims (3)

1.一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶，其特征是：

Xho I 起始密码子

GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT

                                  终止密码子 BamH I。

2.一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的用途是：

利用睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物。

3.如权利要求1所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的制取方法是：

a.以C.testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11.5.1对所测定序列进行开放阅读框分析，为一个完整的开放阅读框，基因全长765bp，通过所测定序列做BLAST分析，确定该基因为3，17β-HSD；

b.通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17β-HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体pET-15b的Xho I和BamH I 酶切位点上构建重组质粒p3/17β-HSD，转化表达宿主菌BL21,进行IPTG诱导表达；此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29.5KD；

MTNRLQGKVALVTGGASGVGLEVVKLLLGEGAKVAFSDINEAAGQQLAAELGERSMFVRHDVSSEADWTLVMAAVQRRLGTLNVLVNNAGILLPGDMETGRLEDFSRLLKINTESVFIGCQQGIAAMKETGGSIINMASVSSWLPIEQYAGYSASKAAVSALTRAAALSCRKQGYAIRVNSIHPDGIYTPMMQASLPKGVSKEMVLHDPKLNRAGRAYMPERIAQLVLFLASDESSVMSGSELHADNSILGMGL；

c.对大肠杆菌中3，17β-HSD的表达产物进行了western blotting验证；确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17β-HSD；

d.对大肠杆菌中3，17β-HSD的表达产物做生物活性测定；以睾丸酮和胆固醇为底物，以高效液相色谱法进行残留量测定，该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强；

e.采用Ni-柱亲和层析，对3，17β-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度的3，17β-HSD。

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