CN111454919B

CN111454919B - 17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌

Info

Publication number: CN111454919B
Application number: CN202010246547.5A
Authority: CN
Inventors: 齐崴; 尤生萍; 张伟; 丁娟娟; 钱建武; 苏荣欣
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2020-03-31
Filing date: 2020-03-31
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2040-03-31
Also published as: CN111454919A

Abstract

本发明公开了17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌，17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶简写为17β‑HSD3^G186R/Y195W，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明采用理性设计技术对17β‑羟基类固醇羟化酶3进行分子改造，经多同源建模、分子对接、结合能计算等方法而获得与底物亲和力提高的17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶，酶活提高为原来的1.66倍，利用此策略可以显著提高17β‑羟基类固醇羟化酶3的催化活力。本发明的编码17β‑羟基类固醇羟化酶3突变酶使睾酮产量高达3.95g/L，为规模化的生物法制备睾酮这种雄性激素类药物提供技术支撑和数据参考。

Description

17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌

技术领域

本发明属于酶工程和生物工程技术领域，具体涉及一种17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及含有编码基因的质粒及工程菌。

技术背景

类固醇类药物被广泛用作抗炎、利尿、合成代谢、避孕药、雄激素、孕激素和抗癌药物，因此它们是制药行业的一种非常宝贵的资源，每年全球市场超过1000亿美元，睾酮(TS)就是其中一种十分重要的雄性激素。睾酮作为一类调节男性生育力、肌肉质量和脂肪分布的关键性激素，临床上用于治疗男性性腺功能减退，维持男性第二性征以及性功能等；同时睾酮也是一种非常有用的类固醇前体，通常用于合成高性能类固醇药物，如5α-二氢睾酮，其对男性生殖器官的正常发育至关重要。医药行业对睾酮日益增长的需求，导致睾酮市场一直处于供不应求的状态。为了从甾醇中获得睾酮，研究人员已经提出多种方法：(1)通过多步化学合成；(2)酶法催化4-雄烯-3,17-二酮(4-AD)制备睾酮；但是，这两种睾酮生产技术都面临着瓶颈问题：

传统化学合成工艺中，睾酮主要是以4-雄烯-3,17-二酮(4-AD)、1,4-雄二烯-3,17-二酮(ADD)或甾醇为原料，通过多步化学法进行合成的，但是由于前体物质甾核上不饱和化学键较多，因而造成化学合成过程副产物多、转化率低等现象，且化学合成方法成本高、污染大，随着环保意识的不断提高和绿色技术的进一步发展，无毒无污染的生物技术必然成为睾酮工业化生产的主要方向。

微生物合成工艺中，睾酮合成的前体物是4-AD，微生物胞内的17β-羟基类固醇羟化酶(17β-HSDs)可以将4-AD的C17-酮基催化还原成羟基，用于睾酮的合成。但是微生物来源的17β-羟基类固醇羟化酶存在以下问题：①该来源17β-羟基类固醇羟化酶是一类可逆的氧化还原酶，催化甾核上C17-酮基和C17-醇基之间进行可逆性还原/氧化反应，不适于睾酮高效率制备；②在催化4-AD转化为睾酮的过程中，会伴随着一些C19类固醇的副产物产生，如ADD和1(2)-脱氢睾酮(1(2)-DT)，从而导致睾酮的积累量极低，无法满足工业生产要求。

人体中17β-羟基类固醇羟化酶3(17β-HSD3，NADPH依赖型的17-氧化还原酶)是人体诸多17β-HSDs亚型中的一种，主要存在于男性睾丸间质细胞的微粒体中，作为睾酮合成的关键酶，能够特异性识别4-AD上C17的酮基，并在辅因子NADPH的作用下，专一、不可逆地催化4-AD合成睾酮。Baillie等检测出睾丸中睾酮的含量是4-AD的10倍左右。

有人选择人源的17β-羟基类固醇羟化酶3(17β-HSD3)酶法催化4-AD合成睾酮，如图1所示，然而该酶活性低、表达量少、反应需酶量大，导致睾酮酶法催化成本高昂，不利于规模化制备。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种酶活性提高，使睾酮酶法催化成本下降，利于规模化生产的17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述基因的重组质粒。

本发明的第四个目的是提供一种含有上述质粒的工程菌。

本发明技术方案概述如下：

17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶，所述突变酶简写为17β-HSD3^G186R/Y195W，所述17β-HSD3^G186R/Y195W的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

含有编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因的重组质粒。

含有上述质粒的工程菌。

本发明的优点：

1.本发明首次采用理性设计技术对17β-羟基类固醇羟化酶3进行分子改造，经过同源建模、分子对接、结合能计算等方法而获得与底物亲和力提高的17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶，酶活提高为原来的1.66倍，利用此策略可以显著提高17β-羟基类固醇羟化酶3的催化活力。

2.本发明的编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶使睾酮产量高达3.95g/L，为规模化的生物法制备睾酮这种雄性激素类药物提供技术支撑和数据参考。

附图说明

图1NADPH循环辅助系统下的睾酮合成过程。

图2睾酮生产过程中NADPH的供电子作用。

图317β-羟基类固醇羟化酶3空间结构及其与4-AD和NADPH相互作用的示意图。

图4重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3结构示意图。

图5重组质粒pPICZαA-G6PDH结构示意图。

图6重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3^G186R/Y195W结构示意图。

图7对照菌与工程菌睾酮产量以及酶活性测定结果。

具体实施方式

下面通过附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详述，以下实施例只是描述性的，本发明所保护范围不限于此。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1

17β-羟基类固醇羟化酶3突变位点的理性设计

(1)17β-羟基类固醇羟化酶3空间结构的模拟：以同族酶17β-羟基类固醇羟化酶1(PDB：1FDT)为模型，发现其结构具有一组典型特征：①由8个α螺旋和8个β折叠构成桶形结构；②NADPH的烟酰胺环和附近的17个残基在C-末端形成椭圆形口袋；③从晶体结构中发现两个通道用于底物进入和产物释放；④关键氨基酸Phe306和Trp227在底物识别中起重要作用。结合上述信息，运用SWISS-MODEL在线服务器模拟17β-羟基类固醇羟化酶3(SEQ IDNO.3)的空间结构；运用Verify_3D对同源建模的结构模型进行评估和优化，获得准确性更高的模拟结构。由此整理出17β-羟基类固醇羟化酶3突变位点的理性设计思路：酶本身不参与电子传输，由NADPH提供电子，反应完成后4-AD转化成睾酮，NADPH转化成NADP⁺，如图2所示；考虑到酶本身不参与电子传输，只是为NADPH和4-AD的反应提供了结合位点，因此，从酶与底物相互作用入手，提升酶与底物的亲和力，进而提升催化效率。

(2)分子对接模拟17β-羟基类固醇羟化酶3与4-雄烯-3,17-二酮之间的相互作用力：通过CDOCKER软件将17β-羟基类固醇羟化酶3与4-雄烯-3,17-二酮进行分子对接，分析酶和底物之间的相互作用类型包括范德华力、π-π相互作用和静电相互作用；如图3所示，为模拟出的17β-羟基类固醇羟化酶3空间结构及与4-AD和NADPH相互作用的示意图。

(3)虚拟突变提升酶与底物亲和力：通过虚拟突变得到能提升酶与底物亲和力的关键残基，包括直接接触底物的残基、不与底物直接接触的第二壳层残基，进行虚拟突变，得到了酶与底物的亲和力提升最显著的17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶，其氨基酸序列中186位甘氨酸和195位酪氨酸分别突变为精氨酸和色氨酸，简写为17β-HSD3^G186R/Y195W，所述17β-HSD3^G186R/Y195W的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。17β-HSD3^G186R/Y195W与4-AD的结合能降低了-1.42kcal/mol。

实施例2

重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3和pPICZαA-G6PDH的制备

一种重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3，将密码子优化后的17β-羟基类固醇脱氢酶基因(SEQ ID NO.4)连接在pPIC3.5K质粒上获得。

一种重组质粒pPICZαA-G6PDH，将能够催化NADP⁺合成NADPH的酶如酿酒酵母来源的6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(SEQ ID NO.18)连接在pPICZαA质粒上获得。

其中，17β-羟基类固醇脱氢酶基因的来源：智人Homo sapiens(GI:21706851)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；将人源17β-羟基类固醇羟化酶3基因进行密码子优化后获得适用于毕赤酵母宿主表达的密码子优化后的17β-羟基类固醇脱氢酶基因(SEQID NO.4)；

所述pPIC3.5K质粒和pPICZαA质粒分别购置于赛默飞世尔科技公司；

所述重组质粒的制备方法，具体步骤如下：

按照北京全式金生物生物技术有限公司无缝重组试剂盒的要求，分别以密码子优化后的17β-羟基类固醇脱氢酶基因和6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(G6PDH基因)作为模板，设计引物如下(注：下划线标注的部分是基因片段与载体片段连接的公共序列)：

17HSD3-F：5`-ATTATTCGAAGATGGGTGACGTTTTGGAACAATTTT-3`(SEQ ID NO.5)

17HSD3-R：5`-CATCCTCTTGATCATCTAACTTTGGTGTTCAATTTC-3`(SEQ ID NO.6)

3.5K-F：5`-AAGTTAGATGATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCT-3`(SEQ ID NO.7)

3.5K-R：5`-ACGTCACCCATCTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTGATCTTC-3`(SEQ ID NO.8)

G6PDH-F：5`-TATTCGAAACGATGAGTGAAGGCCCCGTCAAATTCG-3`(SEQ ID NO.9)

G6PDH-R：5`-TGATGATGATGATTATCCTTCGTATCTTCTGGCTTA-3`(SEQ ID NO.10)

ZαA-F：5`-CGAAGGATAATCATCATCATCATCATCATTGAGTTT-3`(SEQ ID NO.11)

ZαA-R：5`-CCTTCACTCATCGTTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTG-3`(SEQ ID NO.12)

通过PCR扩增后分别得到0.9kb的密码子优化后的17β-羟基类固醇脱氢酶基因片段和1.5kb的G6PDH基因片段；同时以质粒pPIC3.5K和pPICZαA为模板，通过PCR扩增分后别得到9.0kb和3.5kb的载体片段；将基因片段与载体片段按照无缝重组试剂盒要求的比例混合，在连接酶的作用下形成环状重组质粒；将连接体系转化入DH5α感受态细胞，通过卡那霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得如图4和图5所示的重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3和pPICZαA-G6PDH。

其中，所述卡那霉素平板培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，卡那霉素50mg/L；

所述PCR反应体系以及PCR程序参照北京全式金生物技术有限公司

FastPfu Fly DNA Polymerase试剂盒的要求进行，如下表所示：

实施例3

含有编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶(17β-HSD3^G186R/Y195W)的基因的重组质粒(简称：含突变基因的重组质粒)的制备

基于实施例1理性设计的突变位点，设计并合成定点突变的引物如下：

G186R-F：

(引入186位点的突变)(SEQ ID NO.13)

G186R-R：

(引入186位点的突变)(SEQ ID NO.14)

Y195W-F：

(引入186和195位点的突变)(SEQ ID NO.15)

Y195W-R：

(引入186和195位点的突变)(SEQ ID NO.16)

按照无缝重组试剂盒的要求采用无缝连接和反向PCR技术构建含突变基因的重组质粒，主要分为两步：(1)以重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3为模板，G186R-F和G186R-R作为引物进行第一轮PCR扩增(95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃5min，30个循环；72℃10min)，对其PCR产物进行DpnI酶消化、核酸电泳和切胶回收后得到纯化的基因片段，在无缝重组连接酶作用下连接片段后，将其转化入DH5α感受态细胞，通过卡那霉素平板培养基筛选、质粒提取和测序验证，获得编码17β-HSD3^G186R突变酶的重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3^G186R；(2)以pPIC3.5K-17β-HSD3^G186R作为模板，Y195W-F和Y195W-R作为引物进行第二轮PCR扩增(95℃2min；95℃30s，55℃30s，72℃5min，30个循环；72℃10min)，将获得的PCR产物按照同样的步骤进行纯化，在无缝重组连接酶作用下连接片段后，转化入DH5α感受态细胞，经过质粒提取和测序验证获得编码17β-HSD3^G186R/195W突变酶的重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3^G186R/Y195W，其结构如图6所示；

其中，所述卡那霉素平板培养基的配方为：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，卡那霉素50mg/L。

实施例4

P.pastoris GS115/17β-HSD3^G186R/Y195W-G6PDH工程菌的构建

以Pichia pastorisGS115作为表达宿主，用SacI酶对重组质粒pPIC3.5K-17β-HSD3^G186R/Y195W和pPICZαA-G6PDH进行酶切线性化后，按照毕赤酵母表达手册依次进行电转，先后涂布于MD和YPD/Zeo平板培养基上进行筛选，将YPD/Zeo平板培养基上生长的单克隆点接在YPD/G418压力平板培养基上，挑取在YPD/G418平板上长出的菌落，摇瓶培养，提取染色体进行PCR验证后得到高拷贝的毕赤酵母阳性重组子P.pastoris GS115/17β-HSD3^G186R ^/Y195W-G6PDH，即成功构建了含17β-HSD3^G186R/Y195W突变酶和G6PDH的表达工程菌；

其中，所述Pichia pastoris GS115菌株购置于赛默飞世尔科技公司；

所述MD平板培养基的配方为：不含氨基酸的酵母基础氮源(YNB)13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉15g/L；

所述的YPD/Zeo平板培养基的配方为：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂粉15g/L，硫酸博莱霉素(Zeo)100mg/L；

所述YPD/G418压力平板培养基的配方为：蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，琼脂粉15g/L，遗传霉素(G418)1g/L；

按照上述方法构建对照菌P.pastoris GS115/17β-HSD3-G6PDH。

实施例5

P.pastoris GS115/17β-HSD3^G186R/Y195W-G6PDH工程菌(简称工程菌)的诱导表达

将工程菌接种于YPD液体培养基，30℃，160r/min培养过夜；将过夜培养菌液按1％的接种量接入BMG培养基中，30℃，250r/min培养至OD₆₀₀约为5时，按照初始OD₆₀₀＝1的接种量转接于BMM培养基中，30℃，250r/min条件下培养，每24h添加0.5％(W/V)的甲醇诱导96h。离心收集工程菌湿细胞，再用磷酸钾缓冲液清洗两次，离心收集工程菌湿细胞。

其中，所述YPD液体培养基的配方为：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；

所述Buffered Minimal Glycerol Medium(BMG)培养基的配方为：YNB 13.4g/L，甘油10g/L，生物素4×10^-4g/L，定容采用0.1mol/L磷酸钾缓冲液，pH＝6.0；

所述Buffered Minimal Methanol Medium(BMM)培养基的配方为：YNB 13.4g/L，甲醇20g/L，生物素4×10^-4g/L，定容采用0.1mol/L磷酸钾缓冲液，pH＝6.0；

所述磷酸钾缓冲液的配方为：0.05mol/L磷酸钾缓冲液，pH＝7.5；

所述离心条件为：离心力3500～5000×g，离心5～15min。

按照上述方法对对照菌P.pastoris GS115/17β-HSD3-G6PDH进行诱导表达后，在同样的离心条件下收集对照菌湿细胞。

实施例6

工程菌催化性能与酶活性检测

将实施例5获得的对照菌湿细胞和工程菌湿细胞，分别用pH＝7.5、50mM磷酸钾缓冲液复溶，在转化体系中添加4-AD进行睾酮的催化合成过程；

工程菌转化体系的组成为：4-AD 5g/L，葡萄糖50g/L，工程菌湿细胞生物量200g/L，甲基化-β-环糊精23.2g/L，定容采用0.05mol/L磷酸钾缓冲液，pH＝7.5。

对照菌转化体系的组成为：4-AD 5g/L，葡萄糖50g/L，对照菌湿细胞生物量200g/L，甲基化-β-环糊精23.2g/L，定容采用0.05mol/L磷酸钾缓冲液，pH＝7.5。

(1)酶活性的测定：分别取10mL对照菌转化体系和工程菌转化体系于50mL锥形瓶中，在37℃、160rpm/min条件下转化6h，HPLC检测两种体系中睾酮的产量，按照酶活的定义分别计算得到对照菌和工程菌的酶活性分别为1.31U/g和2.17U/g，实验结果如图7所示；

所述的酶活性定义为：37℃、160rpm/min条件下，静息细胞1h转化1mmolAD生成睾酮的湿细胞重量定义为1个酶活单位(U)。

(2)菌株发酵性能的测定：分别取50mL对照菌转化体系和工程菌转化体系于250mL锥形瓶中，在37℃、160rpm/min条件下转化96h，HPLC测得对照菌和工程菌的睾酮产量分别为1.38g/L和3.94g/L，工程菌的睾酮产量为对照菌产量的2.86倍，实验结果如图7所示；

所示述HPLC的检测条件为：紫外检测器，245nm的特征吸收峰，ZORBAX EclipsePlus C18反相色谱柱(5μl，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(V/V＝70:30)，柱温40℃，进样量10μL，流速1.0ml/min。

序列表

<110> 天津大学

<120> 17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶及编码基因及工程菌

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Asp Val Leu Glu Gln Phe Phe Ile Leu Thr Gly Leu Leu Val

1 5 10 15

Cys Leu Ala Cys Leu Ala Lys Cys Val Arg Phe Ser Arg Cys Val Leu

20 25 30

Leu Asn Tyr Trp Lys Val Leu Pro Lys Ser Phe Leu Arg Ser Met Gly

35 40 45

Gln Trp Ala Val Ile Thr Gly Ala Gly Asp Gly Ile Gly Lys Ala Tyr

50 55 60

Ser Phe Glu Leu Ala Lys Arg Gly Leu Asn Val Val Leu Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Leu Glu Lys Leu Glu Ala Ile Ala Thr Glu Ile Glu Arg Thr Thr

85 90 95

Gly Arg Ser Val Lys Ile Ile Gln Ala Asp Phe Thr Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Tyr Glu His Ile Lys Glu Lys Leu Ala Gly Leu Glu Ile Gly Ile Leu

115 120 125

Val Asn Asn Val Gly Met Leu Pro Asn Leu Leu Pro Ser His Phe Leu

130 135 140

Asn Ala Pro Asp Glu Ile Gln Ser Leu Ile His Cys Asn Ile Thr Ser

145 150 155 160

Val Val Lys Met Thr Gln Leu Ile Leu Lys His Met Glu Ser Arg Gln

165 170 175

Lys Gly Leu Ile Leu Asn Ile Ser Ser Arg Ile Ala Leu Phe Pro Trp

180 185 190

Pro Leu Trp Ser Met Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Phe Val Cys Ala Phe

195 200 205

Ser Lys Ala Leu Gln Glu Glu Tyr Lys Ala Lys Glu Val Ile Ile Gln

210 215 220

Val Leu Thr Pro Tyr Ala Val Ser Thr Ala Met Thr Lys Tyr Leu Asn

225 230 235 240

Thr Asn Val Ile Thr Lys Thr Ala Asp Glu Phe Val Lys Glu Ser Leu

245 250 255

Asn Tyr Val Thr Ile Gly Gly Glu Thr Cys Gly Cys Leu Ala His Glu

260 265 270

Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ser Leu Ile Pro Ala Trp Ala Phe Tyr Ser

275 280 285

Gly Ala Phe Gln Arg Leu Leu Leu Thr His Tyr Val Ala Tyr Leu Lys

290 295 300

Leu Asn Thr Lys Val Arg

305 310

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtgacg ttttggaaca atttttcatt cttaccggac ttttggtctg ccttgcttgt 60

ttggccaagt gcgttagatt ctctagatgc gttttgttga attattggaa agttcttcca 120

aagtctttct tgaggagtat gggacagtgg gctgttatca ccggagccgg agacggaatc 180

ggtaaggcct actctttcga attggccaag aggggattga acgttgtcct tatctctagg 240

actttggaga agttggaggc catcgccacc gagatcgaga ggaccactgg taggagtgtc 300

aaaatcatcc aagctgattt tactaaagat gatatttacg agcacatcaa ggagaagttg 360

gccggacttg agatcggaat cttggtcaac aacgtcggaa tgttgcctaa cttgttgcca 420

agtcacttcc ttaacgcccc agacgagatc cagagtctta ttcactgtaa catcacctct 480

gttgttaaga tgacccaatt gatccttaag catatggaat ctaggcaaaa aggtcttatt 540

cttaacatct cttctaggat cgccttgttc ccatggccac tttggtctat gtattctgct 600

agtaaggcct tcgtctgcgc cttcagtaaa gccttgcaag aagagtacaa ggccaaggag 660

gtcatcatcc aagttttgac cccttacgcc gtttctaccg ccatgactaa gtaccttaat 720

accaacgtca tcaccaagac cgccgatgag ttcgtcaagg agagtcttaa ctacgtcacc 780

atcggaggag agacttgcgg ttgtttggcc catgagatcc ttgccggatt cttgagtttg 840

atcccagctt gggcctttta ctctggtgcc ttccagaggt tgttgttgac ccactatgtc 900

gcctacttga aattgaacac caaagttaga tga 933

<210> 3

<211> 310

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Asp Val Leu Glu Gln Phe Phe Ile Leu Thr Gly Leu Leu Val

1 5 10 15

Cys Leu Ala Cys Leu Ala Lys Cys Val Arg Phe Ser Arg Cys Val Leu

20 25 30

Leu Asn Tyr Trp Lys Val Leu Pro Lys Ser Phe Leu Arg Ser Met Gly

35 40 45

Gln Trp Ala Val Ile Thr Gly Ala Gly Asp Gly Ile Gly Lys Ala Tyr

50 55 60

Ser Phe Glu Leu Ala Lys Arg Gly Leu Asn Val Val Leu Ile Ser Arg

65 70 75 80

Thr Leu Glu Lys Leu Glu Ala Ile Ala Thr Glu Ile Glu Arg Thr Thr

85 90 95

Gly Arg Ser Val Lys Ile Ile Gln Ala Asp Phe Thr Lys Asp Asp Ile

100 105 110

Tyr Glu His Ile Lys Glu Lys Leu Ala Gly Leu Glu Ile Gly Ile Leu

115 120 125

Val Asn Asn Val Gly Met Leu Pro Asn Leu Leu Pro Ser His Phe Leu

130 135 140

Asn Ala Pro Asp Glu Ile Gln Ser Leu Ile His Cys Asn Ile Thr Ser

145 150 155 160

Val Val Lys Met Thr Gln Leu Ile Leu Lys His Met Glu Ser Arg Gln

165 170 175

Lys Gly Leu Ile Leu Asn Ile Ser Ser Gly Ile Ala Leu Phe Pro Trp

180 185 190

Pro Leu Tyr Ser Met Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Phe Val Cys Ala Phe

195 200 205

Ser Lys Ala Leu Gln Glu Glu Tyr Lys Ala Lys Glu Val Ile Ile Gln

210 215 220

Val Leu Thr Pro Tyr Ala Val Ser Thr Ala Met Thr Lys Tyr Leu Asn

225 230 235 240

Thr Asn Val Ile Thr Lys Thr Ala Asp Glu Phe Val Lys Glu Ser Leu

245 250 255

Asn Tyr Val Thr Ile Gly Gly Glu Thr Cys Gly Cys Leu Ala His Glu

260 265 270

Ile Leu Ala Gly Phe Leu Ser Leu Ile Pro Ala Trp Ala Phe Tyr Ser

275 280 285

Gly Ala Phe Gln Arg Leu Leu Leu Thr His Tyr Val Ala Tyr Leu Lys

290 295 300

Leu Asn Thr Lys Val Arg

305 310

<210> 4

<211> 933

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggtgacg ttttggaaca atttttcatt cttaccggac ttttggtctg ccttgcttgt 60

ttggccaagt gcgttagatt ctctagatgc gttttgttga attattggaa agttcttcca 120

aagtctttct tgaggagtat gggacagtgg gctgttatca ccggagccgg agacggaatc 180

ggtaaggcct actctttcga attggccaag aggggattga acgttgtcct tatctctagg 240

actttggaga agttggaggc catcgccacc gagatcgaga ggaccactgg taggagtgtc 300

aaaatcatcc aagctgattt tactaaagat gatatttacg agcacatcaa ggagaagttg 360

gccggacttg agatcggaat cttggtcaac aacgtcggaa tgttgcctaa cttgttgcca 420

agtcacttcc ttaacgcccc agacgagatc cagagtctta ttcactgtaa catcacctct 480

gttgttaaga tgacccaatt gatccttaag catatggaat ctaggcaaaa aggtcttatt 540

cttaacatct cttctggaat cgccttgttc ccatggccac tttactctat gtattctgct 600

agtaaggcct tcgtctgcgc cttcagtaaa gccttgcaag aagagtacaa ggccaaggag 660

gtcatcatcc aagttttgac cccttacgcc gtttctaccg ccatgactaa gtaccttaat 720

accaacgtca tcaccaagac cgccgatgag ttcgtcaagg agagtcttaa ctacgtcacc 780

atcggaggag agacttgcgg ttgtttggcc catgagatcc ttgccggatt cttgagtttg 840

atcccagctt gggcctttta ctctggtgcc ttccagaggt tgttgttgac ccactatgtc 900

gcctacttga aattgaacac caaagttaga tga 933

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

attattcgaa gatgggtgac gttttggaac aatttt 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

catcctcttg atcatctaac tttggtgttc aatttc 36

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagttagatg atcaagagga tgtcagaatg ccatttgcct 40

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgtcaccca tcttcgaata attagttgtt ttttgatctt c 41

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tattcgaaac gatgagtgaa ggccccgtca aattcg 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgatgatgat gattatcctt cgtatcttct ggctta 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgaaggataa tcatcatcat catcatcatt gagttt 36

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccttcactca tcgtttcgaa taattagttg ttttttg 37

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catctcttct aggatcgcct tgttcccatg gccactttac tctatg 46

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaacaaggcg atcctagaag agatgttaag aataagacct ttttgcc 47

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

catggccact ttggtctatg tattctgcta gtaaggcctt cgtctg 46

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaatacatag accaaagtgg ccatgggaac aaggcgatcc tagaag 46

<210> 17

<211> 933

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens human)

<400> 17

atgggggacg tcctggaaca gttcttcatc ctcacagggc tgctggtgtg cctggcctgc 60

ctggcgaagt gcgtgagatt ctccagatgt gttttactga actactggaa agttttgcca 120

aagtctttct tgcggtcaat gggacagtgg gcagtgatca ctggagcagg cgatggaatt 180

gggaaagcgt actcgttcga gctagcaaaa cgtggactca atgttgtcct tattagccgg 240

acgctggaaa aactagaggc cattgccaca gagatcgagc ggactacagg gaggagtgtg 300

aagattatac aagcagattt tacaaaagat gacatctacg agcatattaa agaaaaactt 360

gcaggcttag aaattggaat tttagtcaac aatgtcggaa tgcttccaaa ccttctccca 420

agccatttcc tgaacgcacc ggatgaaatc cagagcctca tccattgtaa catcacctcc 480

gtagtcaaga tgacacagct aattctgaaa catatggaat caaggcagaa aggtctcatc 540

ctgaacattt cttctgggat agccctgttt ccttggcctc tctactccat gtactcagct 600

tccaaggcgt ttgtgtgcgc attttccaag gccctgcaag aggaatataa agcaaaagaa 660

gtcatcatcc aggtgctgac cccatatgct gtctcgactg caatgacaaa gtatctaaat 720

acaaatgtga taaccaagac tgctgatgag tttgtcaaag agtcattgaa ttatgtcaca 780

attggaggtg aaacctgtgg ctgccttgcc catgaaatct tggcgggctt tctgagcctg 840

atcccggcct gggccttcta cagcggtgcc ttccaaaggc tgctcctgac acactatgtg 900

gcatacctga agctcaacac caaggtcagg tag 933

<210> 18

<211> 1518

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<400> 18

atgagtgaag gccccgtcaa attcgaaaaa aataccgtca tatctgtctt tggtgcgtca 60

ggtgatctgg caaagaagaa gacttttccc gccttatttg ggcttttcag agaaggttac 120

cttgatccat ctaccaagat cttcggttat gcccggtcca aattgtccat ggaggaggac 180

ctgaagtccc gtgtcctacc ccacttgaaa aaacctcacg gtgaagccga tgactctaag 240

gtcgaacagt tcttcaagat ggtcagctac atttcgggaa attacgacac agatgaaggc 300

ttcgacgaat taagaacgca gatcgagaaa ttcgagaaaa gtgccaacgt cgatgtccca 360

caccgtctct tctatctggc cttgccgcca agcgtttttt tgacggtggc caagcagatc 420

aagagtcgtg tgtacgcaga gaatggcatc acccgtgtaa tcgtagagaa acctttcggc 480

cacgacctgg cctctgccag ggagctgcaa aaaaacctgg ggcccctctt taaagaagaa 540

gagttgtaca gaattgacca ttacttgggt aaagagttgg tcaagaatct tttagtcttg 600

aggttcggta accagttttt gaatgcctcg tggaatagag acaacattca aagcgttcag 660

atttcgttta aagagaggtt cggcaccgaa ggccgtggcg gctatttcga ctctataggc 720

ataatcagag acgtgatgca gaaccatctg ttacaaatca tgactctctt gactatggaa 780

agaccggtgt cttttgaccc ggaatctatt cgtgacgaaa aggttaaggt tctaaaggcc 840

gtggccccca tcgacacgga cgacgtcctc ttgggccagt acggtaaatc tgaggacggg 900

tctaagcccg cctacgtgga tgatgacact gtagacaagg actctaaatg tgtcactttt 960

gcagcaatga ctttcaacat cgaaaacgag cgttgggagg gcgtccccat catgatgcgt 1020

gccggtaagg ctttgaatga gtccaaggtg gagatcagac tgcagtacaa agcggtcgca 1080

tcgggtgtct tcaaagacat tccaaataac gaactggtca tcagagtgca gcccgatgcc 1140

gctgtgtacc taaagtttaa tgctaagacc cctggtctgt caaatgctac ccaagtcaca 1200

gatctgaatc taacttacgc aagcaggtac caagactttt ggattccaga ggcttacgag 1260

gtgttgataa gagacgccct actgggtgac cattccaact ttgtcagaga tgacgaattg 1320

gatatcagtt ggggcatatt caccccatta ctgaagcaca tagagcgtcc ggacggtcca 1380

acaccggaaa tttaccccta cggatcaaga ggtccaaagg gattgaagga atatatgcaa 1440

aaacacaagt atgttatgcc cgaaaagcac ccttacgctt ggcccgtgac taagccagaa 1500

gatacgaagg ataattag 1518

Claims

1.17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶，所述突变酶简写为17β-HSD3^G186R/Y195W，其特征在于所述17β-HSD3^G186R/Y195W的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因，其特征是所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述编码17β-羟基类固醇羟化酶3突变酶的基因的重组质粒。

4.含有权利要求3所述重组质粒的工程菌。