CN109306342B

CN109306342B - 一种17β-羟基甾体脱氢酶、其基因及应用

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Publication number: CN109306342B
Application number: CN201710617905.7A
Authority: CN
Inventors: 王玉; 陈曦; 刘媛媛; 冯进辉; 吴洽庆; 朱敦明; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-07-26
Filing date: 2017-07-26
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2037-07-26
Also published as: CN109306342A

Abstract

本发明公开了一种来源于白色念珠菌Candida albicans 7103的17β‑羟基甾体脱氢酶(17β‑HSDcab)及其编码基因，并利用该酶作为生物催化剂催化底物17‑羰基甾体化合物合成17β‑羟基甾体化合物。该酶具有宽广的底物谱，尤其对雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮，雄甾‑4,9(11)‑二烯‑3,17‑二酮的活力很高。采用重组菌静息细胞作为生物催化剂，雄甾‑4‑烯‑3,17‑二酮为底物，能以较高底物投料浓度，获得高收率的目标产物睾酮，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平。

Description

一种17β-羟基甾体脱氢酶、其基因及应用

技术领域

本发明涉及一种基因及其蛋白质产物，具体涉及一种来源于白色念珠菌(Candidaalbicans 7103)的17β-羟基甾体脱氢酶及其基因，并利用其生物催化合成17β-羟基甾体化合物，属于应用微生物与酶工程领域。

背景技术

甾体药物具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克等药理作用。随着时代的不断发展，甾体药物已经成为仅次于抗生素的第二大类药物。甾体激素类药物分类：肾上腺皮质激素，包括氢化可的松，强的松等，可治疗阿狄森氏症，抗炎，抗过敏，抗休克的等；蛋白同化激素，其主要生理功能是抑制蛋白异化和促进蛋白合成，主要用于治疗蛋白质增加和合成不足引起的疾病；性激素，包括雌性激素、雄性激素和孕激素。

17β-羟基甾体化合物作为药物及药物中间体具有重要的药用价值和工业应用潜力。如睾酮(TS)是一类重要的甾体激素药物，临床上作为性激素药物治疗原发性和继发性男性性腺功能减退，维持男性第二特征、性功能等。其庚酸酯、丙酸酯及其半合成产物甲基睾丸素、苯丙酸诺龙等也是临床药物，它具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提神及提升体能等作用。传统工业上17β-羟基甾体化合物的合成是通过一系列化学方法从甾醇或者17-羰基甾体化合物制得，虽最终能获得产物，但产品纯度低，副产物的生成增加了纯化难度，而且存在环境污染问题。采用生物催化技术，可以一步将17-羰基甾体化合物转化为17β-羟基甾体化合物，副产物少，立体选择性和区域选择性高，反应条件温和，其中的关键就是采用17β-羟基甾体脱氢酶。

自二十世纪30年代以来，人们已证实在不同微生物中存在组成型或诱导型的17β-羟基甾体脱氢酶，但对该类酶的深入研究还较少，目前研究较多的17β-羟基甾体脱氢酶为来源于Cochliobolus lunatus的17β-HSDcl(

M B,Stojan J,

T L.Journal ofSteroid Biochemistry and Molecular Biology,2012(129):92-98,Kristan K,StojanJ,

G,et al.Molecular and Cellular Endocrinology,2005(241):80-87)，然而利用该酶作为生物催化剂在转化底物17-羰基甾体化合物合成17β-羟基甾体化合物中的应用未见有报道。挖掘新的微生物来源的17β-羟基甾体脱氢酶，开发活力更高的生物催化剂，并应用于一步将17-羰基甾体化合物转化为17β-羟基甾体化合物，仍是今后研究的热点。

发明内容

本发明的目的是公开一种17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)及其基因，以及利用该酶还原底物17-羰基甾体化合物合成17β-羟基甾体化合物的方法。

本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

一种来源于白色念珠菌Candida albicans 7103的17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)，其基因核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供了制备17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的方法。

该制备方法包括以下步骤：(1)通过PCR扩增技术获得编码17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的基因片段。正向引物5′-GGAATTCCATATGTCAGAACGTCAAAAGGTTA-3′(NdeⅠ)，反向引物5′-CCGCTCGAGCTAATTAACTTTCTCTTTCAGATAC-3′(XhoⅠ)，模板为白色念珠菌Candida albicans 7103基因组DNA。(2)将基因片段构建到pET21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(3)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌C43(DE3))，获得相应的工程菌株。(4)将工程菌株接种至LB培养基中，培养至A₆₀₀ 0.6-1.0，并用0.25mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)于37℃诱导表达10～12h。(5)离心收集菌体，破菌留取上清液，采用金属亲和层析法(镍柱)纯化回收目的蛋白，并透析除去咪唑即得17β-HSDcab纯酶液。SDS-PAGE电泳图谱显示纯化所得蛋白条带单一，达到了电泳纯(见附图2)。

本发明还提供了17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的底物谱。

本发明的17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)具有宽广的底物谱，对一系列17-羰基甾体化合物均有活性，尤其对雄甾-4-烯-3,17-二酮(4-AD)，雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮的活力很高。

本发明还提供了利用17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)重组菌静息细胞作为生物催化剂转化底物雄甾-4-烯-3,17-二酮生成睾酮的方法。具体地，将诱导表达后的发酵液离心，获取湿菌体，用一定量的pH 7.0的缓冲液重悬菌体，菌体浓度为80～120g/L，加入底物雄烯二酮母液(用吐温80配置成混悬液)至终浓度为3～5g/L，辅助底物葡萄糖15-30g/L，30～35℃，转化8～12h可完成反应。

根据本领域公共知识，任何基因通过DNA突变技术可以改变其序列，产生各种不同的突变体，这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。因此，凡是经等位基因突变或者具有一个或多个氨基酸添加、插入、缺失或取代且具有催化17-羰基甾体化合物生成17β-羟基甾体化合物功能的酶均属于本发明的保护范围。

本发明的有益效果：本发明选择一株从自然界筛选得到的白色念珠菌Candidaalbicans 7103(本实验室自主保存)作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了一种17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的编码基因，利用大肠杆菌作为宿主，成功高效表达了该17β-羟基甾体脱氢酶。该17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)具有宽广的底物谱，对一系列17-羰基甾体化合物均有活性。利用17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)重组菌静息细胞作为生物催化剂，4-AD为底物，能以较高底物投料浓度，获得高收率的目标产物睾酮，副产物少，产率不低于95％，而且转化时间短，所用生物催化剂用量少，时空产率远高于目前报道水平，制备方法简单方便、条件温和、环境友好。

附图说明

附图1为重组质粒pET-cab构建示意图。

附图2为17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)蛋白纯化后SDS-PAGE图。其中，M-标准蛋白；1-诱导表达后破菌上清；2-镍柱纯化所得17β-HSDcab。

附图3为购买的睾酮标样的液相谱图。

附图4为实施例4中转化产物的液相谱图。其中保留时间为9.797min的峰为剩余的底物雄烯二酮，保留时间为12.199min的峰为产物睾酮。

具体实施方式

下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。

实施例1：17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)基因的克隆和基因工程菌的构建

1.1PCR扩增17β-羟基甾体脱氢酶基因

以Candida albicans为限定菌株，在NCBI数据库中以17β-hydroxysteroiddehydrogenase为检索词，搜索得到假设性的17β-hydroxysteroid dehydrogenase基因序列，根据序列设计下列两条引物：

正向引物：5′-GGAATTCCATATGTCAGAACGTCAAAAGGTTA-3′(下划线处为NdeⅠ酶切位点)

反向引物：5′-CCGCTCGAGCTAATTAACTTTCTCTTTCAGATAC-3′(下划线处为XhoⅠ酶切位点)

以Candida albicans 7103的基因组DNA为模板，扩增目的基因片段。

PCR条件为：94℃预变性2min；94℃变性15s，50℃退火30s，68℃延伸1min，循环30次；最后68℃延伸10min。

0.8％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物，得出结论：与预期分子量(882bp)大小相符。

利用pET21a质粒构建表达载体，流程图见附图1。

1.2限制性酶切反应，纯化及连接反应

对实施例1.1获得的PCR产物用对应的酶进行双酶切反应。本实验中，所用的限制性内切酶是NdeⅠ和XhoⅠ，同样的用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ对pET21a质粒进行酶切，分别将酶切后的PCR产物和质粒用DNA纯化试剂盒进行纯化回收。将纯化后的PCR产物和pET21a线性化质粒用T4连接酶进行连接，获得重组质粒pET-cab。

1.3重组质粒pET-cab的转化

氯化钙法制备感受态大肠杆菌细胞。

(1)取10μL重组质粒pET-cab于50μL大肠杆菌C43(DE3)感受态细胞中，冰浴30min。

(2)42℃水浴热激45s，快速置于冰上1～2min。

(3)加入新鲜LB液体培养基600μL，于37℃振荡培养45～60min。

(4)取200μL菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基表面，37℃培养12～16h至单菌落出现。

1.4重组子的鉴定

将单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，提取质粒，分别用NdeⅠ和XhoⅠ对重组质粒pET-cab进行双酶切，酶切产物用0.8％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。根据电泳结果判断含有与cab基因相同大小DNA片段的质粒为重组质粒pET-cab，具有该重组质粒的菌落为阳性克隆，即为目的基因工程菌。

实施例2：17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的诱导表达及纯化

配置种子液50mL，培养基为LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(LB培养基)，37℃，200rpm培养至A₆₀₀ 0.6-1.0左右，加入0.25mM的IPTG，并置于37℃，200rpm诱导10～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(50mM，pH 7.5)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法纯化回收目的蛋白，目的蛋白经透析除去咪唑后即得17β-HSDcab纯酶液。SDS-PAGE电泳图谱显示纯化所得蛋白条带单一，达到了电泳纯(见附图2)。

实施例3：17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的底物谱

酶活测定体系：总反应体积0.2mL，pH 7.0-7.5，浓度为100mM的磷酸钠缓冲液，0.5mM的NADPH和0.8mM的不同底物，加入适量纯酶液后30℃开始检测，测定340nm处吸光度的变化。

结果如表1所示，17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)对一系列的17-羰基甾体化合物均有活性，其中对底物雄甾-4-烯-3,17-二酮和雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮的活力最高。

表1 17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)的底物谱

表注：①将酶对雄甾-4-烯-3,17-二酮的活力定为100％(4.4U/mg)。②酶活定义：每分钟催化氧化1μmol NADPH所需要的酶量为1个酶活单位(U)。

实施例4：17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)重组菌静息细胞转化雄甾-4-烯-3,17-二酮为睾酮的方法

按照实施例2的方法诱导表达17β-羟基甾体脱氢酶(17β-HSDcab)，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。

产物测定方法：Aglient高效液相色谱仪，色谱柱：Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×150mm)，流动相：甲醇-水(V/V＝65:35)，检测波长：254nm，柱温：30℃，流速：0.6mL/min。

(1)取菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为80g/L，加入底物雄甾-4-烯-3,17-二酮母液(用吐温80配置成混悬液)至终浓度为3g/L，吐温80终浓度为1％(w/v)，辅助底物葡萄糖15g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，8h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率为95％，时空产率为0.359g/(L.h)。

(2)取菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(pH 7.0，100mM)，菌体浓度为120g/L，加入底物雄甾-4-烯-3,17-二酮母液(用吐温80配置成混悬液)至终浓度为5g/L，吐温80终浓度为1％(w/v)，辅助底物葡萄糖25g/L，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产率为95％，时空产率为0.397g/(L.h)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种新的17β-羟基甾体脱氢酶、其基因及应用

<130> Svegelj M B, Stojan J, Rizner T L. Journal of Steroid

Biochemistry and Molecular Biology, 2012(129): 92-98

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 293

<212> PRT

<213> Candida albicans

<400> 1

Met Ser Glu Arg Gln Lys Val Thr Leu Val Thr Gly Ala Ser Ser Gly

1 5 10 15

Ile Gly Tyr Ala Thr Ala Ile Glu Phe Ala Lys Arg Gly Tyr Lys Val

20 25 30

Phe Ala Gly Ala Arg Arg Leu Glu Pro Met Gln Lys Leu Lys Asp Asp

35 40 45

His Gly Val Ile Ile Phe Lys Leu Asp Val Ser Asp Leu Glu Ser Val

50 55 60

Lys Asn Ala Lys Lys Phe Ile Glu Ser Glu Thr Gly Ala Asp Tyr Leu

65 70 75 80

Asp Phe Leu Tyr Asn Asn Ala Gly Gln Ser Cys Thr Phe Pro Ala Thr

85 90 95

Asp Val Thr Asp Ala Gln Met Lys Gln Cys Phe Glu Val Asn Val Phe

100 105 110

Gly Ala Ile Arg Thr Val Arg Glu Leu Val Pro Leu Ile Ile Asn Ala

115 120 125

Gln Gly Val Ile Gly Phe Thr Gly Ser Val Ser Gly Ile Ile Pro Phe

130 135 140

Pro Phe Ser Cys Ile Tyr Ser Ala Ser Lys Ala Ala Ile His Gln Tyr

145 150 155 160

Ala Ala Thr Leu Arg Leu Glu Met Lys Pro Phe Gly Val Lys Val Ile

165 170 175

Asn Ile Val Thr Gly Gly Val Lys Thr Asp Ile Glu Asp Lys Arg Asp

180 185 190

Leu Pro Glu Ser Ser Ile Tyr Asn Val Pro Gly Ile Lys Glu Ala Phe

195 200 205

Asn Glu Arg Arg Gln Met Ala Ala Arg Asn Lys Pro Met Pro Ala Glu

210 215 220

Val Tyr Ala Lys Lys Val Val Thr Asp Phe Glu Ser Ala Asn Leu Gly

225 230 235 240

Gly Ala Leu Asn Ile Tyr Arg Gly Thr Met Ser Thr Phe Leu Ser Phe

245 250 255

Val Leu Thr Phe Val Pro Arg Phe Ile Val Glu Ala Ala Leu Val Ser

260 265 270

Lys Phe Lys Leu Asn Ser Val Phe Gln Tyr Leu His Glu Lys Tyr Leu

275 280 285

Lys Glu Lys Val Asn

290

<210> 2

<211> 882

<212> DNA

<213> Candida albicans 7103

<400> 2

atgtcagaac gtcaaaaggt tacattagtt actggtgctt catcaggtat tggttatgcc 60

accgcaattg agtttgctaa aagaggatac aaagtttttg ctggggcaag aagattggaa 120

ccaatgcaaa aattaaaaga cgaccatggt gtgatcatct tcaagttaga tgtcagtgac 180

ttggagagtg ttaagaacgc caaaaaattc attgaatcag aaactggcgc agattatttg 240

gacttcttat acaacaatgc tggtcaatcg tgtactttcc ctgccacaga tgttactgat 300

gcacaaatga aacaatgttt tgaagttaac gtctttggtg ctattagaac tgttcgtgaa 360

ttggtcccat tgataataaa cgctcaaggt gtcattgggt ttacagggtc tgttagtgga 420

ataatcccat tcccattttc ttgtatatat tctgcctcca aagcggccat tcatcaatat 480

gctgcaactt tgagattaga aatgaaaccg tttggtgtta aagtcatcaa cattgtgaca 540

ggtggtgtca aaactgacat tgaagataag agagatttac cagagtcttc tatttacaat 600

gtgccaggta tcaaggaagc tttcaatgaa agaagacaga tggcagctcg aaacaaacca 660

atgccggcag aggtttatgc caaaaaagtt gttactgatt ttgaaagtgc taacttgggt 720

ggtgctttga acatttatcg tggcacaatg agtacatttt tgagtttcgt attaactttt 780

gttcctagat ttatagtaga ggcagcttta gtctccaagt ttaagttgaa cagtgtgttc 840

cagtacttgc atgaaaagta tctgaaagag aaagttaatt ag 882

Claims

1.一种17β-羟基甾体脱氢酶，所述酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。

2.一种编码17β-羟基甾体脱氢酶的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No .2所示。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所述基因。

4.根据权利要求1所述的17β-羟基甾体脱氢酶在还原底物17-羰基甾体化合物合成17β-羟基甾体化合物过程中的用途。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述17-羰基甾体化合物包括雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-4,9(11)-二烯-3,17-二酮，3β-羟基-5-雄烯-17-酮，19-去甲雄甾-4-烯-3,17-二酮，雌甾-4,9-二烯-3,17-二酮，9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，19-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮，雌酚酮。