CN112941041B - 一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(r)-3-奎宁醇中的应用 - Google Patents

一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(r)-3-奎宁醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)‑3‑奎宁醇中的应用，本发明提供的奎宁酮还原酶作为催化剂在不对称还原3‑奎宁酮制备(R)‑3‑奎宁醇的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ee值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明所述奎宁酮还原酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。

Description

一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用。
背景技术
(R)-3-奎宁醇为白色晶体，分子式为C7H13NO，分子量为127.18，CAS号为25333-42-0，熔点为217-224℃，沸点为120℃，在水中的溶解度为1g/mL。
(R)-3-奎宁醇是合成多种抗胆碱能药物的重要手性砌块。该类药物主要用于治疗慢性阻塞性肺病、老年痴呆症等。(R)-3-奎宁醇的手性合成技术具有广阔的应用前景。(R)-3-奎宁醇的合成有化学法和生物法两种。其中化学合成法一般采用手性拆分或者借助昂贵的金属催化剂来完成(R)-3-奎宁醇的制备，此两种方法都存在反应收率低、产物光学纯度低、生产成本高的缺点，难以工业化生产。与化学法相比，生物法具有反应条件温和、转化率高、立体选择性高等优点。生物法包括动力学拆分和不对称合成。
生物不对称合成法研究较多的是用野生菌或重组工程菌的整细胞或游离酶进行催化。宋水山等从土壤中筛选到粘红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)在100mL反应体系中可将奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇，转化率90％，ee值为88％；Sakayu Shimizu课题组利用从深红酵母(Rhodotorula rubra)中克隆得到的酮还原酶催化3-奎宁酮不对称还原得到(R)-3-奎宁醇，底物浓度最高达到618mM，且对映体过量值ee>99.9％，但此酶的Km值高达145mM，这一高Km值表明该酶对底物的亲和力较弱，底物浓度较低时反应速率较慢，底物浓度为120mM时，反应速率仅为最大速率的46％，导致反应时间大大延长，生产成本提高；朱敦铭等利用传统的土壤筛选法分离到两株微生物：诺卡氏菌(Nocardia sp.)WY 1202和红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)WY 1406，催化3-奎宁酮不对称还原分别生成(R)-3-奎宁醇和(S)-3-奎宁醇，该方法产物收率为93％，产物ee>99％，但是底物最高浓度仅有99mM，严重影响其工业化应用；Nobuya Itoh等人筛选到一株淡黄微杆菌(Microbacteriumluteolum)JCM 9174，该菌能够还原3-奎宁酮生成(R)-3-奎宁醇，并从中挖掘到两个NADH依赖性还原酶QNR和BacC，它们能催化313mM底物的转化，12h转化率分别达到100％和94％，且ee>99％。QNR和BacC经纯化后，测得其比活力分别为8.4U/mg和0.5U/mg，但是底物浓度较低，最高为313mM，不适合工业化生产；许建和团队以不对称还原3-奎宁酮制备(R)-3-奎宁醇为模型反应进行基因挖掘，利用来自放射性土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)CGMCC 7986的奎宁酮还原酶ArQR催化底物3-奎宁酮还原为(R)-3-奎宁醇，通过镍柱亲和层析对该羰基还原酶进行分离纯化，研究发现在40℃，pH 7.0条件下该羰基还原酶的活性最高。此外，还在大肠杆菌中共表达羰基还原酶ArQR和葡萄糖脱氢酶BmGDH，并对葡萄糖脱氢酶和羰基还原酶的串联位置、初始底物加量、生物量和反应时间等因素进行考察，发现0.1g重组工程菌在30℃反应4.5h后可将质量浓度为242g/L的底物完全转化为(R)-3-奎宁醇，ee值>99％，时空产率达916g·L–1·d–1；李伟课题组将来自叶黄素微杆菌(Microbacteriumluteolum)的奎宁酮还原酶MlQR与葡萄糖脱氢酶BmGDH进行融合表达，利用8g/L的冻干重组细胞在0.2mM还原型辅酶加量下，30℃时5.5h将486g/L的3-奎宁酮完全转化为产物(R)-3-奎宁醇，时空产率达1505.5g·L–1·d–1，是目前为止报道最高的底物加载量和时空产率。
然而，以上方法仅限于实验室规模，且存在酶自身活力低，产物浓度不高，需要添加昂贵的辅因子以及酶热稳定性差等缺陷，不适合工业化生产(R)-3-奎宁醇。因此，仍然需要筛选活力高、且能在较短时间内获得较高产物浓度的奎宁酮还原酶，以满足工业化生产(R)-3-奎宁醇的需求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用。
本发明的第一个目的是提供一种奎宁酮还原酶在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用，所述的奎宁酮还原酶是如下(a)或(b)的奎宁酮还原酶：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的奎宁酮还原酶；
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有奎宁酮还原酶活性的由(a)衍生的奎宁酮还原酶。
进一步地，所述的奎宁酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步地，编码所述的奎宁酮还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQID NO.3所示。
进一步地，所述的应用具体是在磷酸盐缓冲液中，在所述的奎宁酮还原酶的催化下，利用3-奎宁酮进行不对称还原反应，形成光学活性(R)-3-奎宁醇。
进一步地，在所述的应用中，3-奎宁酮在反应液中的浓度为1～5000mmol/L，奎宁酮还原酶的用量为0.01～120kU/L。
进一步地，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸-磷酸钠缓冲液或磷酸-磷酸钾缓冲液。
进一步地，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为0.05～0.2mol/L。磷酸盐缓冲液浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。
进一步地，所述的不对称还原反应的条件是：在搅拌条件下，反应温度为20～35℃，反应时间为2～24h。
进一步地，所述奎宁酮还原酶在所述的不对称还原反应中的添加形式较佳地为所述奎宁酮还原酶的冻干细胞。
本发明的第二个目的是提供一种奎宁酮还原酶突变体，所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第三个目的是提供一种编码所述的奎宁酮还原酶突变体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第四个目的是提供一种携带所述基因的表达载体。表达载体可通过本领域常规方法将上述奎宁酮还原酶基因克隆到各种表达载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pET28a质粒。
本发明的第五个目的是提供一种表达所述的奎宁酮还原酶突变体的重组菌。重组菌是通过将上述表达载体转化至宿主细胞中制备得到。宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，并且其所携带的奎宁酮还原酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)或大肠埃希氏菌E.coli DH5α。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供的奎宁酮还原酶作为催化剂在不对称还原3-奎宁酮制备(R)-3-奎宁醇的应用中，底物耐受性好，光学纯度高(ee值达99％以上)，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大。因此，本发明所述奎宁酮还原酶及其基因具有很好的工业应用开发前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。
附图说明
图1为粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
具体实施方式
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20～40℃。
表达质粒pET28a购自上海Novagen公司。
E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DNA Marker，购自北京天根生化科技有限公司。
限制性内切酶NdeI和XhoI购自大连宝生物有限公司
实施例1：奎宁酮还原酶基因的克隆
根据Genbank收录的预测为还原酶的蛋白菌(Kaistia algarum)基因序列(Genebank登录号：PPE80757.1)为依据，设计PCR引物如下：
上游引物：5'-gtgccgcgcggcagccatatgGCAGGGATCTTCGATCTTTCCGGA-3'
下游引物：5'-gtggtggtggtggtgctcgagAGTTAGGTATGCCTGT-3'；
其中，上游引物(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:5所示)下划线部分为NdeI酶切位点，下游引物(核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示)下划线部分为XhoI酶切位点。
以蛋白菌Kaistia algarum的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×TaqPCR MasterMix 10μL，上游引物和下游引物各1μL(0.3μmol/L)，DNA模板1μL(0.1μg)和ddH2O 7μL。PCR扩增程序为：(1)95℃，预变性3min；(2)94℃，变性30s；(3)55℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30个循环；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。获得一条完整的奎宁酮还原酶全长基因序列，经DNA测序，全长792bp，命名为KaQR。所述基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。
实施例2：奎宁酮还原酶重组质粒和重组表达转化体的制备
将实施例1所得的奎宁酮还原酶基因DNA片段及pET28a空质粒在37℃用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切2h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，在4℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28a-KaQR。
将上述重组表达质粒转化到大肠埃希氏菌E.coli DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-KaQR，菌落PCR和基因测序验证阳性克隆。
实施例3：奎宁酮还原酶的表达
将实施例2所得的重组大肠杆菌，接种至含卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振摇培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG作为诱导剂，25℃诱导12h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞，冷冻干燥24h即可得冻干细胞，收集后4℃保存。还可将所得的静息细胞悬浮于pH 7.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组奎宁酮还原酶的粗酶液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析(图1)，重组奎宁酮还原酶以可溶的形式存在。
实施例4：奎宁酮还原酶和甲酸脱氢酶活力的测定
通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用酶标仪测定奎宁酮还原酶的活力。奎宁酮还原酶活力测定方法如下：于200μL反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入1mmol/L 3-奎宁酮，1mmol/L NADH，加入适量实施例3制备的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。甲酸脱氢酶活力测定方法如下：于200反应体系(100mmol/L磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中，加入50mmol/L甲酸，5mmol/L NAD+，加入适量甲酸脱氢酶(制备方法参见:Adv.Synth.Catal.,2020,362,4109-4118)，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。每单位奎宁酮还原酶的活力(U)定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol 3-奎宁酮所需的酶量。每单位甲酸脱氢酶的活力(U)定义为在上述条件下，每分钟催化1μmol甲酸所需的酶量。
实施例5-8：奎宁酮还原酶催化3-奎宁酮的还原反应
在20mL磷酸钾缓冲液(200mmol/L，pH 7.0)中加入实施例3制备的KaQR粗酶液和甲酸脱氢酶粗酶液，使奎宁酮还原酶的含量为30kU/L、20kU/L、15kU/L、10kU/L，甲酸脱氢酶的含量为30kU/L、50kU/L、50kU/L、50kU/L，两酶之间的比例分别为1:1、1:2.5、1:3.3、1:5，加入3-奎宁酮、甲酸至终浓度分别为0.5mol/L、0.75mol/L。反应都在30℃下进行，通过补充碱液2M KOH使反应液pH控制在7.0，直至反应完全，即气相检测转化率>99％。结果见表1。
产物转化率的具体分析条件如下：
使用气相色谱仪进行分析，色谱柱为手性毛细管柱pEG-20M(30m×0.32mm×0.5μm,)，以氮气为载气，进样口温度280℃，检测器温度280℃，柱温220℃，保持12min。
表1 KaQR与RjFDH不同添加比例下还原反应情况
Figure BDA0002943776970000061
实施例9-13：奎宁酮还原酶催化3-奎宁酮的还原反应
在20mL磷酸钾缓冲液(200mmol/L，pH 7.0)中加入实施例3制备的KaQR粗酶液和甲酸脱氢酶，分别加入终浓度为1，2，3，4或5mol/L(162，324，486，648或810g/L)的3-奎宁酮，分别加入终浓度为1.5，3，4.5，6或7.5mol/L的甲酸钠。反应都在30℃下进行，通过补充碱液2M KOH使反应液pH控制在7.0，直至反应完全，即气相检测转化率>99％。结果见表2。反应结束后，将实施例12对应的样品用HCl调节反应液pH至2.0，60℃保温30min后，4000r离心5min，将上清移至新的离心管中，用10M NaOH调节pH至13.0，移入分液漏斗中，加入等体积的正丁醇萃取3次，合并有机相，加入无水Na2SO4过夜干燥后旋蒸至恒重，即可得到(R)-3-奎宁醇。其中，实施例12所得产物为白色晶体，产物摩尔收率为95.9％，光学纯度为99％(R)。
表2 KaQR催化3-奎宁酮不对称还原合成(R)-3-奎宁醇
Figure BDA0002943776970000062
实施例14：奎宁酮还原酶突变体的制备
将实施例1所得的奎宁酮还原酶KaQR全长基因序列(SEQ ID NO:1)进行3个碱基的突变，突变体的突变位置分别是将奎宁酮还原酶基因编码序列的第140位的I突变为L，第155位的A突变为L，第167位的W突变为F。得到的突变基因的序列如SEQ ID NO:3所示。所述奎宁酮还原酶的突变基因通过如实施例2-3所述的方法制备冻干细胞和重组突变奎宁酮还原酶粗酶。经活力测定，KaQR突变酶对3-奎宁酮的比活力约是野生型的5.0倍。
实施例15：奎宁酮还原酶突变体催化3-奎宁酮反应
在20mL磷酸钾缓冲液(200mmol/L，pH 7.0)中加入实施例14制备的KaQR突变酶粗酶液和甲酸脱氢酶，保持与野生型相同的添加量，加入终浓度为4mol/L(648g/L)的3-奎宁酮和终浓度为6.0mol/L的甲酸钠起始反应。反应在30℃下进行，通过补充碱液2M KOH使反应液pH控制在7.0，直至反应完全，即气相检测转化率>99％。反应仅需5.0h即可完全，时空产率为2441g/(L·d)。反应结束后用HCl调节反应液pH至2.0，60℃保温30min后，4000r离心5min，将上清移至新的离心管中，用10M NaOH调节pH至13.0，移入分液漏斗中，加入等体积的正丁醇萃取3次，合并有机相，加入无水Na2SO4过夜干燥后旋蒸至恒重即可得到(R)-3-奎宁醇。所得产物为白色晶体，产物摩尔收率为98％，光学纯度为99％(R)。
不同酶催化不对称还原3-奎宁酮结果的比较。其中酶1制备方法参见参考文献1(Appl.Microbiol.Biotechnol.2009,83,617-626)；酶2、3制备方法参见参考文献2(J.Mol.Catal.B:Enzym.2013,88:14-19)；酶4、5制备方法参见参考文献3(Int.J.Mol.Sci.2012,13,13542-13553)；酶6制备方法参见参考文献4(Organic Letters,2013,15,4917-4919)；酶7制备方法参加参考文献5(Org.Process.Res.Dev.2019,23,1813-1821)；酶8为本发明所述实施例3制备所得，酶9位本发明实施例14制备所得。具体不对称还原结果如表3所示。
表3不同来源的酶不对称还原3-奎宁酮结果比较
Figure BDA0002943776970000071
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种奎宁酮还原酶及其在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 792
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
catatggcag ggatcttcga tctttccgga cgtaaggctc tggtaacggg tggctcgaag 60
gggatcggcg cggccattgt ccgtgccttg gatcgtgcag gcgctacagt tgctatcgct 120
gatttggacg ttatgggggc ccaatccgtc gtcgctgagc ttgaaaacgg gggattcgcc 180
gtggaagttg atgtcaccaa gcgtgaaagc gtacaacatg ccttcgatca agctgtggaa 240
gggcttggcg gaatcgatat cctttgtgca aatgcaggtg tttctaccat gcgtccagca 300
atcgacatca cagacgaaga atgggatttc aattttgatg tgaacgcccg cggagttttt 360
ctggcgaatc aaattgccac gcgctacttc ctggccgaaa agaaagaagc gtgcattatc 420
aatacagcct cgctggcagc gaaagtaggt gctcctctgc tggcacacta ctccgcttca 480
aagtttgcag tatttggctg gacacaagcg ctggcgcgtg agttggcccc caagggtatc 540
cgcgtgaact gcgtctgtcc ggggttcgtc aagacctcga tgcaagaacg cgagatcatc 600
tgggaagcag agctgcgtgg gatgactccg gaagctgttc gcgcggagta tatttcgttg 660
accccgcttg ggcgcatcga ggagcccgaa gatgtggctg acgtagtagt ctttcttgca 720
agcgacgccg ctcgtttcat gacaggacaa ggcatcaaca ttacaggtgg tgtccgtatg 780
gattgactcg ag 792
<210> 2
<211> 261
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
His Met Ala Gly Ile Phe Asp Leu Ser Gly Arg Lys Ala Leu Val Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ser Lys Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Ala Leu Asp Arg
20 25 30
Ala Gly Ala Thr Val Ala Ile Ala Asp Leu Asp Val Met Gly Ala Gln
35 40 45
Ser Val Val Ala Glu Leu Glu Asn Gly Gly Phe Ala Val Glu Val Asp
50 55 60
Val Thr Lys Arg Glu Ser Val Gln His Ala Phe Asp Gln Ala Val Glu
65 70 75 80
Gly Leu Gly Gly Ile Asp Ile Leu Cys Ala Asn Ala Gly Val Ser Thr
85 90 95
Met Arg Pro Ala Ile Asp Ile Thr Asp Glu Glu Trp Asp Phe Asn Phe
100 105 110
Asp Val Asn Ala Arg Gly Val Phe Leu Ala Asn Gln Ile Ala Thr Arg
115 120 125
Tyr Phe Leu Ala Glu Lys Lys Glu Ala Cys Ile Ile Asn Thr Ala Ser
130 135 140
Leu Ala Ala Lys Val Gly Ala Pro Leu Leu Ala His Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Phe Ala Val Phe Gly Trp Thr Gln Ala Leu Ala Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Cys Val Cys Pro Gly Phe Val Lys Thr
180 185 190
Ser Met Gln Glu Arg Glu Ile Ile Trp Glu Ala Glu Leu Arg Gly Met
195 200 205
Thr Pro Glu Ala Val Arg Ala Glu Tyr Ile Ser Leu Thr Pro Leu Gly
210 215 220
Arg Ile Glu Glu Pro Glu Asp Val Ala Asp Val Val Val Phe Leu Ala
225 230 235 240
Ser Asp Ala Ala Arg Phe Met Thr Gly Gln Gly Ile Asn Ile Thr Gly
245 250 255
Gly Val Arg Met Asp
260
<210> 3
<211> 792
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
catatggcag ggatcttcga tctttccgga cgtaaggctc tggtaacggg tggctcgaag 60
gggatcggcg cggccattgt ccgtgccttg gatcgtgcag gcgctacagt tgctatcgct 120
gatttggacg ttatgggggc ccaatccgtc gtcgctgagc ttgaaaacgg gggattcgcc 180
gtggaagttg atgtcaccaa gcgtgaaagc gtacaacatg ccttcgatca agctgtggaa 240
gggcttggcg gaatcgatat cctttgtgca aatgcaggtg tttctaccat gcgtccagca 300
atcgacatca cagacgaaga atgggatttc aattttgatg tgaacgcccg cggagttttt 360
ctggcgaatc aaattgccac gcgctacttc ctggccgaaa agaaagaagc gtgcattctg 420
aatacagcct cgctggcagc gaaagtaggt gctcctctgc tgctgcacta ctccgcttca 480
aagtttgcag tatttggctt tacacaagcg ctggcgcgtg agttggcccc caagggtatc 540
cgcgtgaact gcgtctgtcc ggggttcgtc aagacctcga tgcaagaacg cgagatcatc 600
tgggaagcag agctgcgtgg gatgactccg gaagctgttc gcgcggagta tatttcgttg 660
accccgcttg ggcgcatcga ggagcccgaa gatgtggctg acgtagtagt ctttcttgca 720
agcgacgccg ctcgtttcat gacaggacaa ggcatcaaca ttacaggtgg tgtccgtatg 780
gattgactcg ag 792
<210> 4
<211> 261
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 4
His Met Ala Gly Ile Phe Asp Leu Ser Gly Arg Lys Ala Leu Val Thr
1 5 10 15
Gly Gly Ser Lys Gly Ile Gly Ala Ala Ile Val Arg Ala Leu Asp Arg
20 25 30
Ala Gly Ala Thr Val Ala Ile Ala Asp Leu Asp Val Met Gly Ala Gln
35 40 45
Ser Val Val Ala Glu Leu Glu Asn Gly Gly Phe Ala Val Glu Val Asp
50 55 60
Val Thr Lys Arg Glu Ser Val Gln His Ala Phe Asp Gln Ala Val Glu
65 70 75 80
Gly Leu Gly Gly Ile Asp Ile Leu Cys Ala Asn Ala Gly Val Ser Thr
85 90 95
Met Arg Pro Ala Ile Asp Ile Thr Asp Glu Glu Trp Asp Phe Asn Phe
100 105 110
Asp Val Asn Ala Arg Gly Val Phe Leu Ala Asn Gln Ile Ala Thr Arg
115 120 125
Tyr Phe Leu Ala Glu Lys Lys Glu Ala Cys Ile Leu Asn Thr Ala Ser
130 135 140
Leu Ala Ala Lys Val Gly Ala Pro Leu Leu Leu His Tyr Ser Ala Ser
145 150 155 160
Lys Phe Ala Val Phe Gly Phe Thr Gln Ala Leu Ala Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Cys Val Cys Pro Gly Phe Val Lys Thr
180 185 190
Ser Met Gln Glu Arg Glu Ile Ile Trp Glu Ala Glu Leu Arg Gly Met
195 200 205
Thr Pro Glu Ala Val Arg Ala Glu Tyr Ile Ser Leu Thr Pro Leu Gly
210 215 220
Arg Ile Glu Glu Pro Glu Asp Val Ala Asp Val Val Val Phe Leu Ala
225 230 235 240
Ser Asp Ala Ala Arg Phe Met Thr Gly Gln Gly Ile Asn Ile Thr Gly
245 250 255
Gly Val Arg Met Asp
260
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
gtgccgcgcg gcagccatat ggcagggatc ttcgatcttt ccgga 45
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
gtggtggtgg tggtgctcga gagttaggta tgcctgt 37

Claims (9)

1.一种奎宁酮还原酶在不对称合成(R)-3-奎宁醇中的应用，其特征在于，所述的奎宁酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，编码所述的奎宁酮还原酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是在磷酸盐缓冲液中，在所述的奎宁酮还原酶的催化下，利用3-奎宁酮进行不对称还原反应，形成光学活性(R)-3-奎宁醇。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在所述的应用中，3-奎宁酮在反应液中的浓度为1～5000 mmol/L，奎宁酮还原酶的用量为0.01～120 kU/L。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为磷酸-磷酸钠缓冲液或磷酸-磷酸钾缓冲液。
6.一种奎宁酮还原酶突变体，其特征在于，所述的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
7.一种编码权利要求6所述的奎宁酮还原酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
8.一种携带权利要求7所述基因的表达载体。
9.一种表达权利要求6所述的奎宁酮还原酶突变体的重组菌。
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CN106282134A (zh) * 2015-05-12 2017-01-04 河北省科学院生物研究所 一种奎宁酮还原酶KgQR的制备方法及其在制备(R)-3-奎宁醇中应用
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Title
A novel and robust 3-quinuclidinone reductase from Kaistia algarum for efficient synthesis of (R)-3-quinuclidinol without external cofactor;Luo T et al.;《Molecular Catalysis》;20210910(第514期);全文 *
PPE80757.1 3-ketoacyl-ACP reductase [Kaistia algarum];Lee Y et al.;《GenBank》;20180301;ORIGIN *

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