CN110643585B - 一种利用氨基酸脱氨酶生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法 - Google Patents

一种利用氨基酸脱氨酶生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用氨基酸脱氨酶生产α‑酮‑β‑甲基正戊酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明是在氨基酸脱氨酶突变体Pm‑LAAD*的基础上，利用构象动力学的方法进行蛋白质工程改造，获得新的突变体Pm‑LAAD*(V411A/T414A)，其稳定性显著提高，50℃下半衰期从8h增加至10h，4℃冷藏保存的半衰期从150h上升至240h。该酶经过改造后，转化体系中不添加任何缓冲剂，转化通气量仅为0.2vvm，转化体系中添加湿细胞添加量15g/L，转化12h，L‑异亮氨酸摩尔转化率达到95％以上，产量达到98.0g/L，下游纯化简易，极大地降低了生产成本，能够满足工业化需求。

Description

一种利用氨基酸脱氨酶生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用氨基酸脱氨酶生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
α-酮-β-甲基正戊酸(α-keto-β-methylvaleric acid,α-KMV)是α-酮酸的一种，别名酮异亮氨酸。分子式为C6H10O3，相对分子质量为130.14，结构式如图1所示。α-KMV的盐比较稳定，常温容易保存，因此α-KMV多以其钠盐或者钙盐形式保存。α-KMV是化学合成和药物合成中重要的中间体，在保健品、药物、化妆品、化工等领域有着广泛的研究和应用。同时，α-KMV的钙盐也是复方α-酮酸片中四种酮氨基酸钙的主要成分之一，在临床上可以用来作为肾功能不全患者改善蛋白质代谢紊乱而造成的对身体的伤害。
α-KMV主要通过化学法生产，化学法主要有海因法、羰基还原法等。海因法是以海因和甲乙酮为原料，制备生成1-甲基亚丙基海因中间体，然后再经碱水解后生成α-KMV。该合成反应相对来说比较温和，水解过程中使用氢氧化钠进行水解，水解产物除了α-酮酸外，没有其他副产物。但是该过程路径较长，且需要特殊结构的化合物作为起始底物，有毒废物也会对环境和工作人员造成不利。生物酶法因操作简单、条件温和、副产物少、高效绿色环保等特点而广受关注。α-KMV可以通过氨基酸氧化酶、转氨酶、脱氢酶、脱氨酶催化异亮氨酸生成。转氨酶需要另外一种酮酸作为氨基受体，脱氢酶有NADH/NADPH辅酶依赖性，因此这两种酶不具有好的经济效益。L-氨基酸脱氨酶(LAAD,EC 1.4.3.2)，是一种FAD依赖性的黄素蛋白，能够催化L-氨基酸脱氨生成相应的酮酸、水和氨，同时还原辅因子的电子转移到细胞色素而不产生过氧化氢。郭濛檬等人已经成功在大肠杆菌中异源表达了来源于奇异变形杆菌Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶，进行定向进化后突变株E209Q可以催化L-异亮氨酸脱氨氧化合成104g/Lα-KMV，底物转化率89％，底物转化率偏低，影响产品的下游分离纯化。Yuxiang Yuan等对奇异变形杆菌Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶通过蛋白质工程改造获得突变株pmLAADT436A/W438A，催化L-异亮氨酸生产α-KMV产量达到98.9g/L，转化率达到99.7％(ChemCatChem,2019,11(10):2464-2472)，但该酶蛋白稳定性欠佳，方法转化操作较复杂，不能很好地满足工业生产的需求。
发明内容
本发明旨在通过蛋白质工程手段改造奇异变形杆菌Proteus mirabilis来源的氨基酸脱氨酶，提高α-KMV稳定性，缩短转化周期，减少湿细胞的添加量，进一步降低α-KMV的生产成本。本发明应用构象动力学工程改造得到稳定性更强的氨基酸脱氨酶，并应用基因工程菌株全细胞转化异亮氨酸生产α-KMV的方法，该方法湿菌体用量少、转化体系简单、酶稳定性强，适用于工业化生产α-KMV。
本发明的第一个目的是提供一种氨基酸脱氨酶突变体，所述突变体含有如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
本发明的第二个目的是提供编码上述氨基酸脱氨酶突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。
本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达上述的氨基酸脱氨酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pET系列的质粒为载体构建得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pET28a为载体，将SEQ ID NO:2所示基因与载体连接，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中重组表达SEQ ID NO:4所示的氨基酸脱氨酶。
本发明的第五个目的是提供应用本发明的基因工程菌生产氨基酸脱氨酶的方法。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是将所述基因工程菌按照5～20％接种量接种于发酵培养基，通气量1.0～3.0vvm，温度30～37℃，搅拌速率300～600rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至OD600在8.0～16.0，将温度下降至16～25℃，加入5～15g/L乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，当溶氧突然上升至60％以上，此时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在25～50％，发酵培养20～24h结束发酵。
本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分为：甘油4～10g/L，酵母粉10～15g/L，K2HPO4·12H2O 45～80mmol/L，KH2PO4 10～30mmol/L。
本发明的一种实施方式中，所述补料培养基的成分为：甘油300～600g/L，MgSO4·7H2O 5～10g/L。
本发明的第六个目的是提供应用所述基因工程菌生产α-KMV的方法，所述方法是以L-异亮氨酸为底物，应用所述基因工程菌转化底物生产α-KMV。
在本发明的一种实施方式中，转化体系中不添加任何缓冲剂，L-异亮氨酸的浓度为80～100g/L，湿细胞添加量为10～20g/L，转化过程中转化液pH出现下降，通过补加4mol/L NaOH控制pH在7.2～8.5，转化温度为28～32℃，通气量0.2～1.0vvm，搅拌转速300～450rpm，转化12～16h。
本发明还提供所述氨基酸脱氨酶的突变体在食品、制药或化工领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明是使用来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的氨基酸脱氨酶生产α-KMV，在前期突变体Pm-LAAD*的基础上，利用构象动力学的方法进行蛋白质工程改造，获得新的突变体Pm-LAAD*(V411A/T414A)的稳定性显著提高，50℃下半衰期从8h增加至10h，4℃冷藏保存的半衰期从150h上升至240h。
(2)该酶经过改造后，转化体系中不添加任何缓冲剂，转化通气量仅为0.2vvm，转化体系中添加湿细胞添加量为15g/L，转化12h，L-异亮氨酸摩尔转化率达到95％以上，产量达到98.0g/L，下游纯化简易，极大地降低了生产成本，能够满足工业化需求。
附图说明
图1：α-酮-β-甲基正戊酸结构式。
图2：单点突变体酶活稳定性检测。
图3：双点组合突变体酶活稳定性评价。
图4：突变体转化生产α-KMV过程曲线。
具体实施方式
下述实验都是采用常规实验方法，实施材料均从商业途径可得。
样品预处理：取转化液12000rpm离心10min收集上清液，并以α-KMV作为标准品，配制标准溶液。将适度稀释后的上清液和标准溶液分别经0.22μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法检测。
α-KMV含量的测定：高效液相色谱法，流动相成分：5mmol/L稀硫酸，流速0.6mL/min；进样体积：10μL；色谱柱：Aminex HPX-87H Ion Exclusion Column，300×7.8mm；检测器：紫外检测器，波长为210nm。
氨基酸脱氨酶的酶活检测：称取0.5g湿菌体于250mL锥形瓶中，加入30mL预热的L-异亮氨酸溶液，30℃、200rpm的摇床中反应15min。反应完成后，取适量反应液快速离心稀释进行液相检测。酶活单位定义为1min内转化生成1μmolα-KMV所需的酶量。残留酶活力＝转化结束酶活力/初始酶活力×100％。
种子培养基的成分为：LB培养基，酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L。
发酵培养基的成分为：甘油5g/L，酵母粉12g/L，K2HPO4·12H2O 45mmol/L，KH2PO412mmol/L。
补料培养基的成分为：甘油600g/L，MgSO4·7H2O 5g/L。
实施例1：奇异变形杆菌氨基酸脱氨酶蛋白质工程改造
(1)在发明人团队前期构建的氨基酸脱氨酶PmLAADT436A/W438A(以下简写为Pm-LAAD*，编码突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；突变体的氨基酸序列如SEQID NO:3所示)基础上，为了进一步提高催化性能，应用构象动力学思想，从产物周围的loop结构入手，调节对结构影响较小的loop上的氨基酸，在不影响催化活性的前提下，增强蛋白质分子的刚性。通过对酶结构的分子设计，共选择了8个氨基酸位点(S106/D144/E145/I316/F317/V411/T414/T434)进行突变，依次突变为丙氨酸。以发明人团队前期构建的质粒pET-28a-pmLAADT436A/W438A为模板，利用表1中引物进行全质粒PCR，将PCR产物42℃热击转化于E.coli JM109感受态细胞中，后培养2h，涂布于含Kan的LB平板，筛选阳性克隆并进行测序，构建上述8个单突变体库，转化于宿主E.coli BL21(DE3)。
表1引物
引物名称 引物序列
S106A-F TAGTTACCAAACAGCGCCAGAAATCTTCC
S106A-R GGAAGATTTCTGGCGCTGTTTGGTAACTA
D144A-F AGAAGCGCTGGCAGCGGAAAAAGCATTAG
D144A-R CTAATGCTTTTTCCGCTGCCAGCGCTTCT
E145A-F AGCGCTGGCAGATGCGAAAGCATTAGATA
E145A-R TATCTAATGCTTTCGCATCTGCCAGCGCT
I316A-F CGTTGCACCACGTGCGTTTACGAGTTCAA
I316A-R TTGAACTCGTAAACGCACGTGGTGCAACG
F317A-F TGCACCACGTATCGCGACGAGTTCAATAG
F317A-R CTATTGAACTCGTCGCGATACGTGGTGCA
V411A-F TTGGGGTGCCGTTGCGAGTCCAACATTTG
V411A-R CAAATGTTGGACTCGCAACGGCACCCCAA
T414A-F CGTTGTGAGTCCAGCGTTTGATGAATTAC
T414A-R GTAATTCATCAAACGCTGGACTCACAACG
T434A-F CTTAGTGATTAACGCGGCAGCGGTGGCGG
T434A-R CCGCCACCGCTGCCGCGTTAATCACTAAG
V411A/T414A-F CGTTGCGAGTCCAGCGTTTGATGAATTAC
V411A/T414A-R GTAATTCATCAAACGCTGGACTCGCAACG
转化于宿主E.coli BL21(DE3)后，获得基因工程菌株。挑取基因工程菌株于LB种子培养基中，培养8～12h，OD600为4～6，按照15％接种量接种于发酵培养基，通气量1.0vvm，温度37℃，搅拌速率400rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至OD600在14.0左右，将温度下降至20℃，加入8g/L乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，当溶氧突然上升至60％以上，此时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在25～50％，发酵培养20h结束发酵。将发酵液收集后6000rpm离心10min，收集湿菌体。
检测亲本酶Pm-LAAD*和突变酶在50℃下保温12h残留酶活力，结果见图2，突变体Pm-LAAD*(V411A)和Pm-LAAD*(T414A)的酶活力分别残留35.6％和38.9％，显著高于亲本酶(30.5％)，而其余突变体与亲本酶相比，残余酶活力降低或无显著性提高。
(2)为了让2个突变点起着协同调控作用，直接构建了双点突变体，即把上述2个有益突变进行组合。以质粒pET-28a-pmLAADT436A/W438A/V411A为模板，利用表1中引物V411A/T414A–F和V411A/T414A-R进行全质粒PCR，将PCR产物42℃热击转化于E.coli JM109感受态细胞中，后培养2h，涂布于含Kan的LB平板，筛选阳性克隆并进行测序，将测序正确质粒转化于宿主E.coli BL21(DE3)，得到表达突变体Pm-LAAD*(V411A/T414A)的基因工程菌(编码突变体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)。
实施例2：氨基酸脱氨酶突变体的评价
(1)挑取实施例1表达Pm-LAAD*(V411A/T414A)的基因工程菌于LB种子培养基中，培养8～12h，OD600为4～6，将培养液按照15％接种量接种于发酵培养基，通气量1.0vvm，温度37℃，搅拌速率400rpm，此时设定溶氧为100％，当培养至OD600在14.0左右，将温度下降至20℃，加入8g/L乳糖诱导氨基酸脱氨酶的表达，当溶氧突然上升至60％以上，此时开始添加补料培养基，通过溶氧与补料相关联，控制溶氧在25～50％，发酵培养20h结束发酵。将发酵液收集后6000rpm离心10min，收集湿菌体。结果显示，初始酶活与亲本酶活一致，双点组合突变体的酶活稳定性更佳，50℃保温12h仍然残留43.6％的酶活力(图3)，而亲本酶的残余酶活仅为30％左右。
(2)收集湿菌体转化L-异亮氨酸生产α-KMV，使用2mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液溶解L-异亮氨酸90g/L，转化温度30℃，当温度稳定后添加湿细胞20g/L，转化过程中转化液pH出现下降，通过补加4mol/L NaOH控制pH在7.2～8.5，通气量为0.8vvm，搅拌转速为400rpm，转化12～16h，直到α-KMV产量不再增加，Pm-LAAD*和Pm-LAAD*(V411A/T414A)的产量分别为88.0g/L和87.8g/L；转化结束离心收集菌体，使用2mmol/L Tris-HCl缓冲液洗涤两遍后，检测转化后菌体的酶活力，Pm-LAAD*与Pm-LAAD*(V411A/T414A)残留酶活分别为初始的20.4％和45.9％，说明突变体具有更好的稳定性。
表1野生型和突变体的生产性能评价
Figure BDA0002266029470000061
(3)工业应用酶需要具备高效的催化性能同时需要较强的稳定性，易于保藏的运输。为了进一步检测突变体Pm-LAAD*(V411A/T414A)的稳定性，在4℃冰箱中进行全细胞保藏，并检测其过程中酶活变化，Pm-LAAD*冷藏保存的半衰期为150h，突变体半衰期上升至240h。
实施例3：全细胞催化L-异亮氨酸生产α-KMV
取用实施例2(1)中获得的湿菌体作为细胞催化剂用于转化L-异亮氨酸生产α-KMV。在发酵罐1L转化体系，菌体添加量为20g/L，L-异亮氨酸浓度为100g/L，溶解于0.02mol/L pH8.0的Tris-HCl溶液，转化温度30℃，通过补加4mol/L NaOH控制pH在7.5，通气量降低至0.2vvm，搅拌转速400rpm。转化过程曲线如图4，氨基酸脱氨酶催化过程中需要充足的氧气，由于突变体Pm-LAAD*(V411A/T414A)具有更好的稳定性，在较低的溶氧水平下催化12h，可以积累98.8g/Lα-KMV，摩尔转化率达到99.6％，相较于Pm-LAAD*缩短了4h。
实施例4：异亮氨酸生产α-KMV的规模化制备
取用实施例2(1)中获得的湿菌体，作为细胞催化剂用于转化异亮氨酸生产α-KMV。在20L转化体系中，菌体添加量为15g/L，L-异亮氨酸浓度为100g/L，体系中不添加任何缓冲剂，通过补加4mol/L NaOH控制pH在7.5，转化温度30℃，通气量降低至0.2vvm，搅拌转速350rpm。转化12h时，α-KMV产量最高达到98.0g/L，转化率为98.7％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
无锡宸明生物技术有限公司
<120> 一种利用氨基酸脱氨酶生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法
<160> 22
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1422
<212> DNA
<213> Proteus mirabilis
<400> 1
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cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840
caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900
catttccgcg agcaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960
atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020
ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080
tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140
acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200
tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gcgagtccag cgtttgatga attacctatc 1260
atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcagcggt ggcgggtatg 1320
accgaaggcc cagcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380
attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422
<210> 3
<211> 473
<212> PRT
<213> Proteus mirabilis
<400> 3
Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly
20 25 30
Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln
35 40 45
Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile
50 55 60
Gln Gly Ile Met Thr Ala Ile Asn Leu Ala Glu Arg Gly Met Ser Val
65 70 75 80
Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala
85 90 95
Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu
100 105 110
His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly
115 120 125
Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp
130 135 140
Glu Lys Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ala Trp Ile Lys Thr Ala Lys Glu
145 150 155 160
Ala Ala Gly Phe Asp Thr Pro Leu Asn Thr Arg Ile Ile Lys Gly Glu
165 170 175
Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala
180 185 190
Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro
195 200 205
Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn
210 215 220
Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val
225 230 235 240
Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly
245 250 255
Gly Ile Trp Ser Arg Leu Phe Met Gly Asn Met Gly Ile Asp Ile Pro
260 265 270
Thr Leu Asn Val Tyr Leu Ser Gln Gln Arg Val Ser Gly Val Pro Gly
275 280 285
Ala Pro Arg Gly Asn Val His Leu Pro Asn Gly Ile His Phe Arg Glu
290 295 300
Gln Ala Asp Gly Thr Tyr Ala Val Ala Pro Arg Ile Phe Thr Ser Ser
305 310 315 320
Ile Val Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gly Pro Lys Phe Met His Leu Leu
325 330 335
Gly Gly Gly Glu Leu Pro Leu Glu Phe Ser Ile Gly Glu Asp Leu Phe
340 345 350
Asn Ser Phe Lys Met Pro Thr Ser Trp Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro
355 360 365
Phe Glu Gln Phe Arg Val Ala Thr Ala Thr Gln Asn Thr Gln His Leu
370 375 380
Asp Ala Val Phe Gln Arg Met Lys Thr Glu Phe Pro Val Phe Glu Lys
385 390 395 400
Ser Glu Val Val Glu Arg Trp Gly Ala Val Val Ser Pro Thr Phe Asp
405 410 415
Glu Leu Pro Ile Ile Ser Glu Val Lys Glu Tyr Pro Gly Leu Val Ile
420 425 430
Asn Thr Ala Ala Val Ala Gly Met Thr Glu Gly Pro Ala Ala Gly Glu
435 440 445
Val Thr Ala Asp Ile Val Met Gly Lys Lys Pro Val Ile Asp Pro Thr
450 455 460
Pro Phe Ser Leu Asp Arg Phe Lys Lys
465 470
<210> 4
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Met Asn Ile Ser Arg Arg Lys Leu Leu Leu Gly Val Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Gly Gly Ala Ala Leu Val Pro Met Val Arg Arg Asp Gly
20 25 30
Lys Phe Val Glu Ala Lys Ser Arg Ala Ser Phe Val Glu Gly Thr Gln
35 40 45
Gly Ala Leu Pro Lys Glu Ala Asp Val Val Ile Ile Gly Ala Gly Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Thr Ile Leu Glu Lys Gly Gln Ile Ala Gly Glu Gln Ser Gly Arg Ala
85 90 95
Tyr Ser Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Thr Ser Pro Glu Ile Phe Pro Leu
100 105 110
His His Tyr Gly Lys Ile Leu Trp Arg Gly Met Asn Glu Lys Ile Gly
115 120 125
Ala Asp Thr Ser Tyr Arg Thr Gln Gly Arg Val Glu Ala Leu Ala Asp
130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Glu Leu Ser Asn Arg Leu Val Gly Ala Gln Thr Pro Trp Thr Val Ala
180 185 190
Ala Phe Glu Glu Asp Ser Gly Ser Val Asp Pro Glu Thr Gly Thr Pro
195 200 205
Ala Leu Ala Arg Tyr Ala Lys Gln Ile Gly Val Lys Ile Tyr Thr Asn
210 215 220
Cys Ala Val Arg Gly Ile Glu Thr Ala Gly Gly Lys Ile Ser Asp Val
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Val Ser Glu Lys Gly Ala Ile Lys Thr Ser Gln Val Val Leu Ala Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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450 455 460
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465 470
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
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<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
ggaagatttc tggcgctgtt tggtaacta 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
agaagcgctg gcagcggaaa aagcattag 29
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ctaatgcttt ttccgctgcc agcgcttct 29
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
agcgctggca gatgcgaaag cattagata 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
tatctaatgc tttcgcatct gccagcgct 29
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
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<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
ttgaactcgt aaacgcacgt ggtgcaacg 29
<210> 13
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
tgcaccacgt atcgcgacga gttcaatag 29
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<212> DNA
<213> 人工合成
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ctattgaact cgtcgcgata cgtggtgca 29
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
caaatgttgg actcgcaacg gcaccccaa 29
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<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
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<210> 18
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
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<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
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cttagtgatt aacgcggcag cggtggcgg 29
<210> 20
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
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ccgccaccgc tgccgcgtta atcactaag 29
<210> 21
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 21
cgttgcgagt ccagcgtttg atgaattac 29
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
gtaattcatc aaacgctgga ctcgcaacg 29

Claims (10)

1.一种氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.编码权利要求1所述氨基酸脱氨酶突变体的基因。
3.含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.如权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列载体。
5.表达权利要求1所述氨基酸脱氨酶突变体的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的宿主细胞为大肠杆菌。
7.一种生产α-酮-β-甲基正戊酸的方法，其特征在于，所述方法是以L-异亮氨酸为底物，以权利要求5或6所述基因工程菌作为全细胞催化剂，进行转化反应。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，L-异亮氨酸的浓度为80~100 g/L，所述全细胞催化剂的添加量为10~20 g/L，pH为7.2~8.5，转化温度为28~32℃，通气量为0.2~1.0vvm，转速为300~450 rpm，转化12~16 h。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述转化的体系中不添加任何缓冲剂。
10.权利要求1所述氨基酸脱氨酶突变体在食品、制药或化工领域的应用。
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