CN104774828B

CN104774828B - 重组卤醇脱卤酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

Info

Publication number: CN104774828B
Application number: CN201510136155.2A
Authority: CN
Inventors: 柳志强; 郑裕国; 薛锋; 朱杭芹; 王亚军; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-03-26
Filing date: 2015-03-26
Publication date: 2019-02-01
Anticipated expiration: 2035-03-26
Also published as: CN104774828A

Abstract

本发明公开了一种重组卤醇脱卤酶、编码基因，含有该基因的重组表达载体和重组菌，以及该重组卤醇脱卤酶在催化(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯脱卤合成(R)‑4‑氰基‑3‑羟基丁酸乙酯中的应用；与其它卤醇脱卤酶相比，本方法获得的卤醇脱卤酶，催化活性高，能够耐受高浓度底物和产物，具有工业应用前景。

Description

重组卤醇脱卤酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种重组卤醇脱卤酶、编码基因、载体，重组基因工程菌，以及该重组卤醇脱卤酶制备阿托伐他汀关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯应用。

(二)背景技术

卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应，也可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N₃ ^-、NO₂ ^-、CN^-等所介导的环氧化物开环反应。卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低酪氨酸的pKa值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶介导的生物催化反应，优势主要体现在：1.酶催化反应条件温和；2.酶催化手性选择高。3.酶催化转化率高

(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯(HN)是合成降血脂药物阿托伐他汀(Atorvastatin)的关键中间体。根据文献报道，其合成方法可分为化学法和生物酶法两大类。化学法合成主要包括以下途径：以(S)-环氧氯丙烷为原料，经氰化钠开环、乙醇醇解、三甲硅烷基保护、氰化钠氰化、脱保护等步骤，得到(R)-HN总收率约57％。另外，有研究人员以L-苹果酸为起始原料，经酯化、还原、溴代和氰化四步反应得到(R)-HN，合成总收率为56.7％。由此可见，化学法不仅反应过程较繁琐，而且反应总收率较低。较之化学合成法，生物酶法合成HN则具有反应步骤短，条件相对温和等优点。目前，可用于催化合成HN的生物催化剂包括：卤醇脱卤酶、腈水解酶、脂肪酶等。其中，腈水解酶途径的底物3-羟基戊二腈合成较为困难，而且在水解之后还需进一步酯化；脂肪酶途径中第二步反应所用催化剂1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺价格也非常昂贵，因此，这两条途径并不适合于大规模生产。卤醇脱卤酶途径的底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)可以由廉价的4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)经羰基还原制得，而且脱卤过程和加氰基的过程是一起完成，并不需要额外的操作(图1)，因此，它具有较好的工业化生产潜质。

近年来，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌。目前文献报道中，仅有来源于Agrobacterium radiobacter AD1的HheC和Parvibaculum avamentivorans DS-1的HHDH-PL适于催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。野生型的HheC催化效率较低，而且热稳定性及对底物的耐受能力较差，Codexis公司利用蛋白质序列-活性相关性(ProSAR)驱动的蛋白质定向进化策略对HheC进行了改造，经过18轮的突变，得到了一株活力非常高的突变株，其催化(S)-CHBE的活力是野生型酶的约4000倍。最优突变体在催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯反应过程中，底物浓度为140g/L，酶冻干粉用量为1.2g/L，反应5h，产率为92％，e.e.值大于99.5％。而野生型的HHDH-PL，活力较高，底物浓度为200g/L，重组工程菌的用量为40g/L时(干重)，反应14h，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的产率为85％，e.e.值大于99。随着DNA测序技术的进步，急剧增加的生物信息为新酶的开发带来了前所未有的机遇，近年来基因数据挖掘技术已成为快速开发新酶的有力手段。利用已获得的卤醇脱卤酶序列作为探针，在整个基因数据库中挖掘同源序列，从而获得新型且对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯催化活性更高的卤醇脱卤酶。

(三)发明内容

本发明提供一种卤醇脱卤酶及其编码基因，含有该基因的重组表达载体和重组工程菌。本发明同时还提供了一种对(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯具有高活力的重组脱卤酶，以及利用该重组卤醇脱卤酶或重组工程菌在高底物浓度下制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于Idiomarina salinarum的重组卤醇脱卤酶，所述重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供一种所述重组卤醇脱卤酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明的卤醇脱卤酶基因来源于Idiomarina salinarum。具体制备方法可为：以文献报道的卤醇脱卤酶(Hhe B)作为探针，在NCBI数据库搜索同源氨基酸序列，发现该序列与Genbank中收录的预测为Idiomarina salinarum的短链脱氢酶(GenbankNo.KFZ32061.1)的同源性为45％，通过序列比对发现该短链脱氢酶具有与卤醇脱卤酶相同的催化三联体和一些关键的保守序列，推测该水解蛋白为疑似卤醇脱卤酶。因NCBI公布该短链脱氢酶的基因序列，以及在大肠杆菌异源表达的密码子偏好性，设计合成基因，交送上海旭冠生物科技发展有限公司合成。碱基序列如SEQ ID No.1所示的基因，命名为HHDH_Is，全长684bp。其中，其编码序列从第1个碱基至第684个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明涉及一种所述编码基因构建的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发明的重组卤醇脱卤酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为pET28a(b)。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：设计合成基因并在两端引入Xba I和Xho I酶切位点，交由上海旭冠生物技术有限公司合成，之后将合成基因与表达载体pET28b用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的卤醇脱卤酶基因的重组表达载体pET28b-HHDH_Sg。

本发明涉及一种所述重组载体构建的重组基因工程菌。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的重组卤醇脱卤酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET28b-HHDH_Is转化至(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is。

本发明还涉及重组卤醇脱卤酶的制备方法，其中包括如下步骤：将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。其中，所述的培养重组大肠杆菌所用的培养基可为本领域任何可使重组工程菌生长并产生本发明的卤醇脱卤酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组工程菌能够生长并产生本发明所述的卤醇脱卤酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌接种至含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.8时，在终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组卤醇脱卤酶。

本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在催化卤代醇制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，以pH值为7.5-7.8的缓冲液为反应介质，流加NaCN维持pH值为7.5-7.8(优选先将催化剂加入反应介质中，再加入底物，湿菌体加入时的pH值维持在8.5，底物加入后的pH值维持在7.8)，于10-50℃(优选20-40℃，最优选40℃)、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述湿菌体的用量为10～70g/L缓冲液(优选10-60g/L)，所述底物的初始浓度为10～400g/L缓冲液(优选50-300g/L)。

进一步，本发明所述催化剂(即湿菌体)按如下方法制备：将含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按体积浓度1％的接种量接入LB液体培养基中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD ₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集湿菌体。

本发明所述的催化剂卤醇脱卤酶可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶或者完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞。

本发明的有益效果主要体现在：本发明从NCBI数据库挖掘到一个新的卤醇脱卤酶(与其它卤醇脱卤酶同源性小于50％)。本发明的重组卤醇脱卤酶还可作为催化剂应用于制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。相对于其它卤醇脱卤酶，本发明获得卤醇脱卤酶对底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的催化活性更高((R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯收率达95.2％)，同时可实现300g/L底物的完全转化(目前文献报道中最高，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯收率达89.3％，ee值达99％)，具有很好的工业应用前景。

(四)附图说明

图1卤醇脱卤酶催化(S)-CHBE合成HN。

图2为pET28b-HHDH_Is重组质粒物理图谱。

图3为卤醇脱卤酶SDS-PAGE图；1：蛋白质分子量Marker；2：IPTG未诱导的E.coliBL21/pET28b-HHDH_Is；3：诱导的E.coli BL21/pET28b-HHDH_Is；4：细胞破碎上清液。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1亲本基因的获得及重组表达质粒和重组工程菌的制备

以文献报道的卤醇脱卤酶(Hhe B)作为探针，在NCBI数据库搜索同源氨基酸序列，发现该序列与Genbank中收录的预测为Idiomarina salinarum的短链脱氢酶(GenbankNo.KFZ32061.1)的同源性为45％，通过序列比对发现该短链脱氢酶具有与卤醇脱卤酶相同的催化三联体和一些关键的保守序列，推测该水解蛋白为疑似卤醇脱卤酶。因NCBI公布该短链脱氢酶的基因序列，以及在大肠杆菌异源表达的密码子偏好性，设计合成基因，交送上海旭冠生物科技发展有限公司合成，碱基序列如SEQ ID No.1所示的基因，并在两端引入Xba I和Xho I酶切位点，交由上海旭冠生物技术有限公司合成，氨基酸序列如序列表中SEQID No.2所示。之后将合成基因与表达载体pET28b在37℃用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切5h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)回收目标片段。在T4DNA连接酶的作用下，将目标片段与同样经Xba I和Xho I酶切后的载体质粒pET28b，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28b-HHDH_Sg(如图2所示)。

将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，在含有终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。获得阳性重组转化体大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is。随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定。

实施例2重组卤醇脱卤酶的表达

将实施例1所得的重组大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is，接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD 600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集细胞(即湿菌体)，并用磷酸盐缓冲液洗涤两次，得静息细胞。将所得静息细胞悬浮于20mL pH8.0的磷酸盐缓冲液中，在冰浴中超声破碎15min(功率400W，破2s停1s)，离心收集上清，即为重组卤醇脱卤酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(图3)，重组蛋白在细胞中可溶的形式存在。

实施例3：卤醇脱卤酶催化50g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯

以实施例2中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is湿菌体作为转化用酶(E.coli.BL21(DE3)、E.coli.BL21(DE3)/pET28b及未诱导E.coli.BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is为对照)，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向100mL烧瓶中加入30mL 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，加入湿菌体使菌体浓度为10g/L缓冲液，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入终浓度50g/L的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，用NaCN控制pH在7.8，反应30min。取样，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量和ee值。最终(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率接近100％，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的ee大于99％，收率为95.2％。

反应液中(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为Agilent 7890A，所用毛细管柱型号为HP-5(柱长30m，内径0.25mm，液膜厚度0.25μm，填料为5％Phenyl/95％dimethylpolysiloxane)，进样口温度为230℃，检测器温度为250℃，柱温165℃。载气为氮气。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的保留时间分别为3.02min和3.49min。

产物(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的对映选择性由手性气相色谱测定。气相色谱型号为岛津GC-14C，BGB-174柱，进样口温度和检测器温度为220℃，柱温为160℃。载气为氦气，(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的保留时间分别为23.7和24.2min。酶活单位(U)定义为：在40℃、pH 7.8条件下，在1min内催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯生成1μmol(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯所需要的酶量定义为1U。根据体系中(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表1。

表1：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDH_Is为酶源测定的卤醇脱卤酶活力

菌株/质粒	酶活(U/g(wet cells))
		(E.coli)BL21(DE3)	0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b	0
		(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDH<sub>Sg</sub>(未诱导)	12.7
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDH<sub>Sg</sub>(诱导)	2218.3

实施例4：卤醇脱卤酶催化100g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯

以实施例2中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is湿菌体作为转化用酶，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向100mL烧瓶中加入30mL100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，加入湿菌体使菌体浓度为50g/L缓冲液，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入终浓度100g/L的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，用NaCN控制pH在7.8，反应70min。取样，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量和ee值。最终(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率接近100％，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的ee大于99％，收率为93.7％。

实施例5

以实施例2中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is湿菌体作为转化用酶，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向100mL烧瓶中加入30mL100mM磷酸盐缓冲液溶液(pH 7.5)，加入湿菌体使菌体浓度为10g/L缓冲液，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入终浓度100g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，用NaCN控制pH在7.8，反应3.3h。取样，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量和ee值。最终(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率接近95％，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的ee大于99％，收率为91.8％。

实施例6：卤醇脱卤酶催化200g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯

以实施例2中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is湿菌体作为转化用酶，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向100mL烧瓶中加入30mL100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，加入湿菌体使菌体浓度为40g/L缓冲液，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入终浓度200g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，用NaCN控制pH在7.8，反应5.8h。取样，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量和ee值。最终(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率接近95％，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的ee大于99％，收率为91.2％。

实施例7：卤醇脱卤酶催化300g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯

以实施例2中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-HHDH_Is湿菌体作为转化用酶，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的为底物，进行转化反应制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯。转化体系组成及转化操作如下：向100mL烧瓶中加入30mL100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，加入湿菌体使菌体浓度为65g/L缓冲液，利用恒定pH/电位滴定仪流加NaCN调节pH至7.5，向体系中加入终浓度300g/L(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，用NaCN控制pH在7.8，反应8h。取样，用2倍体积的乙酸乙酯萃取，气相检测(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯含量和ee值。最终(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率接近96％，(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的ee大于99％，收率为89.3％。

综上所述，虽然本发明已以一个优选实施披露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以作各种更动与修改。因此，本发明的保护范围当视所附的申请权利要求书所限定的为准。

Claims

1.一种来源于Idiomarina salinarum的重组卤醇脱卤酶在催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯制备(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的应用，其特征在于所述重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，以pH值为7.5-7.8的磷酸盐缓冲液为反应介质，流加NaCN维持pH值为7.5-7.8，于10-50℃、150rpm条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯；所述湿菌体的用量为10-70g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为10-400g/L缓冲液。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按体积浓度1％的接种量接入LB液体培养基中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集湿菌体。