CN104745556B - 一种重组卤醇脱卤酶、突变体、工程菌及其应用 - Google Patents

一种重组卤醇脱卤酶、突变体、工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组卤醇脱卤酶、突变体、工程菌及其应用，所述重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列为SEQ ID No:2所示；本发明还公开了重组卤醇脱卤酶及其突变体催化1,3‑二氯丙醇不对称脱卤合成(S)‑环氧氯丙烷及在制备其它手性环氧化物以及β‑取代醇的应用；相对于其它卤醇脱卤酶，本发明获得卤醇脱卤酶及其突变体具有更高的对映选择性，具有很好的工业应用前景。

Description

一种重组卤醇脱卤酶、突变体、工程菌及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种卤醇脱卤酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体及重组菌，利用重组菌制备重组酶的方法，以及该重组卤醇脱卤酶制备环氧化物、手性环氧化物、β-取代醇的方法。
(二)背景技术
卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进行脱卤反应，也可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N3 -、NO2 -、CN-等所介导的环氧化物开环反应。卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低酪氨酸的pKa值，酪氨酸从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧化物。卤醇脱卤酶介导的生物催化反应，优势主要体现在：1.酶催化反应条件温和；2.酶催化手性选择高。3.酶催化转化率高
卤醇脱卤酶可以广泛应用于合成环氧化物以及β-取代醇。其中叠氮化醇、氰取代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和高分子化学领域中有着广泛应用。卤醇脱卤酶更已成功应用于他汀类药物关键手性中间体(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的合成。
手性环氧氯丙烷在医药、农药、化工、材料等领域应用广泛。随着手性药物行业的发展，使得手性环氧氯丙烷作为一种重要医药中间体的地位更加突出。目前，合成手性环氧氯丙烷主要有化学法和生物法拆分两大类。生物法拆分法具有反应条件温和、环境友好的优点。但是生物拆分法获得的手性环氧氯丙烷的最高收率只有50％。利用卤醇脱卤酶直接不对称脱卤合成手性环氧氯丙烷，其理论收率可以达到100％，原子经济效益高，具有潜在的工业应用前景。但是利用卤醇脱卤酶直接不对称脱卤合成手性环氧氯丙烷的文献较少。Tetsuji等利用来源于Corynebacterium sp.N-1074中的Hhe B催化5mM 1,3-二氯丙醇生成(R)-环氧氯丙烷。反应初始阶段(R)-环氧氯丙烷的ee值最大可达90％，但随着反应的进行，ee值慢慢下降直至最终为零。Lutje Spelberg等利用来源于Agrobacterium radiobacterAD1的卤醇脱卤酶Hhe C催化1,3-二氯丙醇或2,3-二氯-1-丙醇合成环氧氯丙烷，其ee值小于5％。本课题组也从运动替斯崔纳菌中克隆得到了新的卤醇脱卤酶，催化1,3-DCP不对称脱卤合成(S)-环氧氯丙烷，但是ee值最高只有60％，而且随着反应的进行，ee值同样在下降(CN104263713A)。
近年来，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化合成环氧化物及β-取代醇。目前已知的卤醇脱卤酶，仅有8种已成功在大肠杆菌中表达，并进行了催化特性的研究。但是目前发现的卤醇脱卤酶，催化特性优异的卤醇脱卤酶不易获得，使得大多数不对称脱卤反应，收率低，产物ee值低，无法真正应用于工业生产。因此，开发新型且具有应用潜力的卤醇脱卤酶一直是生物脱卤和生物开环的重点研究方向之一。随着DNA测序技术的进步，急剧增加的生物信息为新酶的开发带来了前所未有的机遇，近年来基因数据挖掘技术已成为快速开发新酶的有力手段。利用已获得的卤醇脱卤酶序列作为探针，在整个基因数据库中挖掘同源序列，获得候选酶基因，利用蛋白质工程手段可以进一步改造所获得的天然酶，从而得到具有所需催化特性的突变酶。通过随机突变、定点突变等蛋白质工程的手段对卤醇脱卤酶进行立体选择性的改造，提高其对应选择性，将具有较高的应用价值。
(三)发明内容
本发明所要解决的问题是，针对之前报道的卤醇脱卤酶催化1,3-二氯丙醇不对称脱卤合成手性环氧氯丙烷ee值偏低的问题，提供一种卤醇脱卤酶及其编码基因、卤醇脱卤酶突变体及其编码基因，含有所述编码基因的重组表达载体和重组工程菌，以及将该卤醇脱卤酶、突变体、表达该卤醇脱卤酶或突变体的重组工程菌作为催化剂催化1,3-二氯丙醇，制备光学纯(S)-环氧氯丙烷。本发明同时还提供了该重组卤醇脱卤酶和突变体在催化其它卤代醇生物脱卤或不对称拆分环氧化物合成手性环氧化物和β-取代醇中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种来源于Sneathiella glossodoripedis的重组卤醇脱卤酶，所述重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述重组卤醇脱卤酶的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
本发明的卤醇脱卤酶基因具体制备方法为：以来源于运动替斯崔纳菌(Tistrellamobilis ZJB1405，CN104263713A)的卤醇脱卤酶作为探针，在NCBI数据库搜索同源氨基酸序列，发现该序列与Genbank中收录的预测为Sneathiella glossodoripedishypothetical protein(Genbank No.WP_037493663)的同源性为42％，通过序列比对发现该hypothetical protein具有与卤醇脱卤酶相同的催化三联体和一些关键的保守序列，推测该水解蛋白为疑似卤醇脱卤酶。因NCBI未公布该hypothetical protein的基因序列，根据其氨基酸序列，以及在大肠杆菌异源表达的密码子偏好性，设计合成基因，交送上海旭冠生物科技发展有限公司合成。碱基序列如SEQ ID No.1所示的基因，命名为HHDHSg，全长732bp，氨基酸编码序列从第1个碱基至第729个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明涉及一种所述重组卤醇脱卤酶编码基因构建的重组载体。其可通过本领域常规方法将本发明的重组卤醇脱卤酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为pET28a(b)。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：设计合成基因并在两端引入XbaI和Xho I酶切位点，交由上海旭冠生物技术有限公司合成，之后将合成基因与表达载体pET28b用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的卤醇脱卤酶基因的重组表达载体pET28b-HHDHSg。
本发明涉及一种所述重组载体构建的重组基因工程菌。其可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的重组卤醇脱卤酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET28b-HHDHTm转化至(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg。
本发明还涉及重组卤醇脱卤酶的制备方法，其中包括如下步骤：将所述含重组卤醇脱卤酶基因的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。培养本发明的重组工程菌，获得重组表达卤醇脱卤酶，所述的培养重组工程菌所用的培养基可为本领域任何可使重组工程菌生长并产生本发明的卤醇脱卤酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组工程菌能够生长并产生本发明所述的卤醇脱卤酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌重组表达转化体接种至含有终浓度50mg/L卡那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度OD600达到0.8时，在终浓度为0.2mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组卤醇脱卤酶。
本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在催化卤代醇制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以卤代醇为底物，在pH值为7～11(优选8-10)的缓冲液中，于10-50℃(优选20-40℃，更优选35℃)、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述卤代醇为1,3-二氯丙醇、1,3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2,3-二溴丙醇，所述湿菌体的用量为1～50g/L缓冲液(优选10-40g/L，更优选20g/L)，所述底物的初始浓度为5～60mmol/L缓冲液(优选20-40mmol/L)。
进一步，本发明所述用于重组卤醇脱卤酶催化的催化剂(即湿菌体)按如下方法制备：将含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按体积浓度1％的接种量接入LB液体培养基中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集湿菌体。
本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在拆分环氧化物制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以环氧化物为底物，加入亲核试剂，在pH值为4～7(优选5-6)的缓冲液中，于10-50℃(优选20-40℃)、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述环氧化物为环氧氯丙烷，所述湿菌体的用量为1～50g/L缓冲液(优选20g/L)，所述底物的初始浓度为10～100mmol/L缓冲液(优选20-40mmol/L，更优选40mmol/L)，所述亲核试剂为NaN3、NaNO2、NaCN或NaBr(优选NaNO2)，所述亲核试剂的加入量为20～200mmol/L缓冲液(优选50-100mmol/L，更优选50mmol/L)。
本发明还提供所述重组卤醇脱卤酶在制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁腈或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，在pH值为8～10的缓冲液中，于35℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述湿菌体的用量为10-50g/L缓冲液(优选20g/L)，所述底物的初始浓度为5-60mmol/L缓冲液(优选30mmol/L)。
此外，本发明还提供一种所述重组卤醇脱卤酶的突变体，所述突变体是将SEQ IDNo:2所示氨基酸序列的137位的V(Val，缬氨酸)突变为I(Ile，异亮氨酸)，获得的重组卤醇脱卤酶的突变体(氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，核苷酸序列为SEQ ID No.3所示)。
本发明提供一种由所述重组卤醇脱卤酶突变体构建的重组载体，由所述含突变体重组载体转化获得的重组基因工程菌。
本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶突变体在催化卤代醇制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以卤代醇为底物，在pH值为7～11(优选8-10)的缓冲液中，于10-50℃(优选20-40℃，更优选35℃)、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述卤代醇为1,3-二氯丙醇、1,3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2,3-二溴丙醇，所述湿菌体的用量为1～50g/L缓冲液(优选10-40g/L，更优选20g/L)，所述底物的初始浓度为5～60mmol/L缓冲液(优选20-40mmol/L)。
进一步，本发明所述用于重组卤醇脱卤酶突变体的催化剂(即湿菌体)按如下方法制备：将含重组卤醇脱卤酶突变体基因的工程菌接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按体积浓度1％的接种量接入LB液体培养基中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集湿菌体。
本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶突变体在拆分环氧化物制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以环氧化物为底物，加入亲核试剂，在pH值为4～7(优选5-6)的缓冲液中，于10-50℃(优选20-40℃)、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述环氧化物为环氧氯丙烷，所述湿菌体的用量为1～50g/L缓冲液(优选20g/L)，所述底物的初始浓度为10～100mmol/L缓冲液(优选20-40mmol/L，更优选40mmol/L)，所述亲核试剂为NaN3、NaNO2、NaCN或NaBr(优选NaNO2)，所述亲核试剂的加入量为20～200mmol/L缓冲液(优选50-100mmol/L，更优选50mmol/L)。
本发明还提供所述重组卤醇脱卤酶突变体在制备手性环氧化物中的应用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以(S)-4-氯-3-羟基丁腈或(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为底物，在pH值为8～10的缓冲液中，于35℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述湿菌体的用量为10-50g/L缓冲液(优选20g/L)，所述底物的初始浓度为5-60mmol/L缓冲液(优选30mmol/L)。
本发明所述的卤醇脱卤酶及其突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶或者完全纯化的酶的形式使用。如果需要，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞。
本发明的有益效果主要体现在：本发明从NCBI数据库挖掘到一个新的卤醇脱卤酶(与其它卤醇脱卤酶同源性小于50％)，并通过定点饱和突变提高了该卤醇脱卤酶催化1,3-二氯丙醇不对称脱卤合成(S)-环氧氯丙烷对映选择性(ee值从85％提高到可达92.5％，高于文献报道的60％)。本发明的重组卤醇脱卤酶还可作为催化剂应用于制备其它环氧化物或手性环氧化物以及β-取代醇。相对于其它卤醇脱卤酶，本发明获得卤醇脱卤酶及其突变体具有更高的对映选择性，具有很好的工业应用前景。
(四)附图说明
图1为pET28b-HHDHSg重组质粒物理图谱；
图2为卤醇脱卤酶SDS-PAGE图；M：蛋白质分子量Marker；1：IPTG未诱导的E.coliBL21/pET28b-HHDHSg；2：诱导的E.coli BL21/pET28b-HHDHSg；3：细胞破碎上清液；
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1亲本基因的获得及重组表达质粒和重组工程菌的制备
根据GenBank中收录预测为水解蛋白(Sneathiella glossodoripedis)(GenbankNo.WP_037493663)的氨基酸序列，氨基酸序列见SEQ ID No.2，设计在大肠杆菌密码子偏好性合成基因，交送上海旭冠生物科技发展有限公司合成。碱基序列如SEQ ID No.1所示的基因，并在两端引入Xba I和Xho I酶切位点，交由上海旭冠生物技术有限公司合成，之后将合成基因与表达载体pET28b在37℃用限制性内切酶Xba I和Xho I双酶切5h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(爱思进生物技术(杭州)有限公司)回收目标片段。在T4DNA连接酶的作用下，将目标片段与同样经Xba I和Xho I酶切后的载体质粒pET28b，在16℃下连接过夜得到重组表达质粒pET28b-HHDHSg(如图1所示)。
将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，在含有终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。获得阳性重组转化体大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg。随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定。
实施例2卤醇脱卤酶突变体的制备
定点饱和突变技术参考(Current Protocols in Protein Science 2011,26.6.1-26.6.10；Anal.Biochem.2008,375:376-378)所述方案进行操作。首先设计含有突变点的突变引物：V137-F：5’-AGCTCCGCCNNSCCGAAGCACGGTCTGCC-3’，V137-R：5’-GTGCTTCGGSNN GGCGGAGCTCACGAACAG-3’。以质粒pET28b-HHDHSg为模板进行全质粒扩增。PCR体系为：5×PS Buffer 10μl，dNTP(2.5mM each)4μl，突变引物F和R各0.5μl，质粒pET28b-HHDHSg 0.5μl，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μl，补水至50μl。PCR条件为98℃预变性2min，27个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min 30s，最后72℃10min。经0.9％琼脂糖凝胶电泳分析PCR为阳性后，取PCR溶液20μl，加入1μl DpnⅠ，37℃酶切3h去除模板质粒DNA，65℃灭活10min，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(50μg/ml)的LB平板，37℃培养过夜，获得饱和突变体库。利用手性气相色谱分析各个突变体转化底物所得产物环氧氯丙烷的ee值，筛选出ee值提高的阳性突变体，从筛选的阳性克隆中抽提质粒，送上海桑尼生物技术有限公司进行测序。测序结果用DNAssist软件与野生型卤醇脱卤酶基因序列进行比对，确认突变前后基因序列及相应的氨基酸序列的差异，获得将重组卤醇脱卤酶编码基因的137位的V(Val)突变为I(Ile)的突变体(氨基酸序列为SEQ ID No.4所示，核苷酸序列为SEQ IDNo.3所示)。
实施例3重组卤醇脱卤酶的表达
将实施例1和实施例2所得的重组大肠杆菌，分别接种至含终浓度50mg/L硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD 600达到0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，28℃诱导10h，将培养液离心，收集细胞(即湿菌体)，并用磷酸盐缓冲液洗涤两次，得静息细胞。将所得静息细胞悬浮于20mL pH 8.0的缓冲液中，在冰浴中超声破碎15min，离心，收集上清，即为重组卤醇脱卤酶的粗酶液。粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(图2)，重组蛋白在细胞中可溶的形式存在。
实施例4：卤醇脱卤酶和突变体V137I催化1,3-二氯丙醇合成(S)-环氧氯丙烷
野生型转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g野生型卤醇脱卤酶湿菌体(实施例3制备)和30mM的1,3-二氯丙醇，在35℃、150r/min条件下摇床反应，反应2.5min后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。反应2.5min后，1,3-二氯丙醇的转化率达到95％以上，(S)-环氧氯丙烷的收率达88.6％，ee值达到84.5％。
突变体转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g突变体V137I湿菌体(实施例3制备)和30mM的1,3-二氯丙醇，在35℃、150r/min条件下摇床反应，反应6min后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。反应6min后，1,3-二氯丙醇的转化率达到94％以上，(S)-环氧氯丙烷的收率达90.6％，ee值达到92.5％。
采用气相检测环氧氯丙烷的浓度和ee值，采用GC-14C系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 10.0条件下，在1min内催化1,3-二氯丙醇生成1μmol环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表1，以实施例3中未诱导的野生型重组菌、不含载体的宿主菌以及含空载体的宿主菌为对照。
表1：野生型卤醇脱卤酶和突变体酶活力比较
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
(E.coli)BL21(DE3) 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(未诱导) 32.7
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(诱导) 2136.3
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg-V137I(诱导) 1446.2
实施例5：卤醇脱卤酶和突变体V137I催化1,3-二溴丙醇脱卤合成(S)-环氧溴丙烷
野生型转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g野生型卤醇脱卤酶湿菌体(实施例3制备)和30mM的1,3-二溴丙醇，在35℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。反应1min后，1,3-二溴丙醇的转化率达到96％以上，(S)-环氧溴丙烷的收率达82.5％，ee值达到71.2％。
突变体转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g突变体V137I湿菌体(实施例3制备)和30mM的1,3-二溴丙醇，35℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。反应1min后，1,3-二溴丙醇的转化率达到95％以上，(S)-环氧溴丙烷的收率达88.7％，ee值达到86.6％。
采用气相检测环氧溴丙烷的浓度，采用GC-14C系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 8.0条件下，在1min内催化1,3-二溴丙醇生成1μmol环氧溴丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧溴丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表2，以实施例3中未诱导的野生型重组菌、不含载体的宿主菌以及含空载体的宿主菌为对照。
表2：野生型卤醇脱卤酶和突变体酶活力比较
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
(E.coli)BL21(DE3) 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(未诱导) 60.5
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(诱导) 4352.6
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg-V137I(诱导) 3946.3
实施例6：卤醇脱卤酶和突变体V137I催化2,3-二溴丙醇脱卤合成(S)-环氧溴丙烷
野生型转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g野生型卤醇脱卤酶湿菌体(实施例3制备)和10mM的2,3-二溴丙醇，在35℃、150r/min条件下摇床反应，反应5min后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。2,3-二溴丙醇的转化率达到85％以上，(S)-环氧溴丙烷的收率达73.2％，ee值达到83.3％。
突变体转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g突变体V137I湿菌体(实施例3制备)和10mM的2,3-二溴丙醇，在35℃、150r/min条件下摇床反应，反应5min后，用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率和ee值。2,3-二溴丙醇的转化率达到85％以上，(S)-环氧溴丙烷的收率达81.7％，ee值达到91％。
采用气相检测环氧溴丙烷的浓度，采用GC-14C系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 8.0条件下，在1min内催化2,3-二溴丙醇生成1μmol环氧溴丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧溴丙烷的生成量推知重组菌酶活。测定结果见表3，以实施例3中未诱导的野生型重组菌、不含载体的宿主菌以及含空载体的宿主菌为对照。
表3：野生型卤醇脱卤酶和突变体酶活力比较
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
(E.coli)BL21(DE3) 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(未诱导) 17.37
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(诱导) 286.6
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg-V137I(诱导) 295.4
实施例7：卤醇脱卤酶和突变体V137I催化(S)-4-氯-3-羟基丁腈脱卤反应
野生型转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g野生型卤醇脱卤酶湿菌体(实施例3制备)和30mM的(S)-4-氯-3-羟基丁腈，反应温度35℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率，反应30min后，(S)-4-氯-3-羟基丁腈的转化率为31.5％。
突变体转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g突变体V137I湿菌体(实施例3制备)和30mM的(S)-4-氯-3-羟基丁腈，反应温度35℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率,反应30min后，(S)-4-氯-3-羟基丁腈的转化率为29.7％。
采用气相检测(S)-4-氯-3-羟基丁腈的浓度，采用GC-14A系统，色谱柱类型：BGB-174毛细管柱；色谱条件：柱温100℃4min,5℃/min到15min保持4min，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 8.0条件下，在1min内催化(S)-4-氯-3-羟基丁腈转化1μmol所需要的酶量定义为1U。根据体系中(S)-4-氯-3-羟基丁腈的减少量推知重组菌酶活。测定结果见表4，以实施例3中未诱导的野生型重组菌、不含载体的宿主菌以及含空载体的宿主菌为对照。
表4：野生型卤醇脱卤酶和突变体酶活力比较
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
(E.coli)BL21(DE3) 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(未诱导) 7.87
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(诱导) 65.9
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg-V137I(诱导) 58.2
实施例8卤醇脱卤酶和突变体V137I催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯脱卤反应
野生型转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g野生型卤醇脱卤酶湿菌体(实施例3制备)和30mM的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，反应温度35℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率，反应30min后(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率为94.3％。
突变体转化体系组成及转化操作如下：在10mL甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH 10.0)中加入0.2g突变体V137I湿菌体(实施例3制备)和30mM的(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，反应温度35℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定底物的转化率，反应30min(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化率为74.3％。
采用气相检测(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的浓度，采用GC-14C系统，色谱柱类型：BGB-174毛细管柱；色谱条件：柱温100℃4min，5℃/min到15min保持4min，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 10.0条件下，在1min内催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯转化1μmol所需要的酶量定义为1U。根据体系中(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的减少量推知重组菌酶活。测定结果见表5，以实施例3中未诱导的野生型重组菌、不含载体的宿主菌以及含空载体的宿主菌为对照。
表5：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHSg为酶源测定的卤醇脱卤酶活力
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
(E.coli)BL21(DE3) 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(未诱导) 10.87
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg(诱导) 317.5
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHSg-V137I(诱导) 245.1
实施例9：卤醇脱卤酶催化环氧氯丙烷的拆分合成(R)-ECH
野生型转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)中加入0.2g野生型卤醇脱卤酶湿菌体(实施例3制备)和40mM的(R,S)-环氧氯丙烷，50mM NaNO2，反应温度30℃、150r/min条件下摇床反应，反应结束后，将反应液用2倍体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，并加入1-氯正己烷，用气相色谱分析测定单一构型底物的收率和ee值，反应15min后，(R)-环氧氯丙烷的收率为25.6，ee值大于99％。
采用气相检测环氧氯丙烷的浓度和选择性，采用GC-14C系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为40:1。酶活单位(U)定义为：在35℃、pH 7.0条件下，在1min内催化环氧氯丙烷开环生成1μmol 1-硝基-3-氯2-丙醇所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的消耗量推知重组菌酶活。测定结果见表6，以实施例3中未诱导的野生型重组菌、不含载体的宿主菌以及含空载体的宿主菌为对照。
表6：以重组大肠杆菌BL21/pET28b-HHDHTm为酶源测定的卤醇脱卤酶活力
菌株/质粒 酶活(U/g(wet cells))
(E.coli)BL21(DE3) 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b 0
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(未诱导) 2.17
(E.coli)BL21(DE3)/pET28b-HHDHTm(诱导) 40.24
综上所述，虽然本发明已以一个优选实施披露如上，然其并非用以限定本发明。本发明所属技术领域中的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可以作各种更动与修改。因此，本发明的保护范围当视所附的申请权利要求书所限定的为准。

Claims (4)

1.一种重组卤醇脱卤酶制备的突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID No:2所示氨基酸序列第137位缬氨酸突变为异亮氨酸。
2.一种由权利要求1所述重组卤醇脱卤酶突变体构建的重组基因工程菌。
3.一种权利要求1所述重组卤醇脱卤酶突变体在催化卤代醇制备手性环氧化物中的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以卤代醇为底物，在pH值为8～10的缓冲液中，于35℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述卤代醇为1,3-二氯丙醇、1,3-二溴丙醇或2,3-二溴丙醇，所述湿菌体的用量为1-50g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为5-60mmol/L缓冲液。
4.一种权利要求1所述重组卤醇脱卤酶突变体在拆分环氧化物制备手性环氧化物中的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶突变体基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以环氧化物为底物，加入亲核试剂，在pH值为5～8的缓冲液中，于30℃、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物；所述环氧化物为环氧氯丙烷，所述湿菌体的用量为1-50g/L缓冲液，所述底物的初始浓度为10-100mmol/L缓冲液，所述亲核试剂为NaN3、NaNO2、NaCN或NaBr，所述亲核试剂的加入量为20-200mmol/L缓冲液。
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105132488A (zh) * 2015-09-22 2015-12-09 江苏理工学院 （r）-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的制备方法
CN105838700A (zh) * 2016-03-25 2016-08-10 浙江工业大学 一种固定化卤醇脱卤酶及其应用
CN107881182B (zh) * 2017-11-21 2020-05-19 盐城工学院 一种利用卤醇脱卤酶工程菌制备r-苯基缩水甘油醚的方法
CN109295044A (zh) * 2018-10-26 2019-02-01 浙江大学 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN109593749B (zh) * 2018-12-24 2020-09-25 浙江工业大学 卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用
CN109593069B (zh) * 2019-01-24 2022-12-23 遵义医学院 一种生物催化合成4-取代噁唑烷酮化合物的方法
CN110423740B (zh) * 2019-08-15 2023-02-21 盐城工学院 一种提高对映选择性的卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN112680429B (zh) * 2019-10-18 2022-10-14 中国科学院微生物研究所 一种脱卤酶HadD14及其编码基因与应用
CN113846084B (zh) * 2021-10-27 2023-09-05 南京师范大学 卤醇脱卤酶突变体、编码基因、质粒、基因工程菌及其应用
CN115927409A (zh) * 2022-07-13 2023-04-07 合肥学院 一种立体选择性和活性改良的卤醇脱卤酶突变体及其应用
CN115927276A (zh) * 2022-08-31 2023-04-07 中国科学院天津工业生物技术研究所 卤醇脱卤酶突变体及其合成手性噁唑烷酮的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007099107A1 (en) * 2006-03-03 2007-09-07 Basf Se Process for the preparation of optically active 5-substituted 2-oxazolidinones from racemic epoxides and cyanate employing a halohydrin dehalogenase
CN101760468A (zh) * 2008-12-25 2010-06-30 安琪酵母股份有限公司 卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用
CN102978193A (zh) * 2012-11-13 2013-03-20 浙江工业大学 卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用
CN104263713A (zh) * 2014-08-29 2015-01-07 浙江工业大学 运动替斯崔纳菌、卤醇脱卤酶、基因、载体、重组菌及其应用
CN104357468A (zh) * 2014-10-17 2015-02-18 浙江工业大学 食清洁剂细小棒菌zjb14001、卤醇脱卤酶基因、酶、工程菌及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007099107A1 (en) * 2006-03-03 2007-09-07 Basf Se Process for the preparation of optically active 5-substituted 2-oxazolidinones from racemic epoxides and cyanate employing a halohydrin dehalogenase
CN101760468A (zh) * 2008-12-25 2010-06-30 安琪酵母股份有限公司 卤醇脱卤酶突变体菌株、卤醇脱卤酶突变体及其制备方法和应用
CN102978193A (zh) * 2012-11-13 2013-03-20 浙江工业大学 卤醇脱卤酶、编码基因、载体、菌株及应用
CN104263713A (zh) * 2014-08-29 2015-01-07 浙江工业大学 运动替斯崔纳菌、卤醇脱卤酶、基因、载体、重组菌及其应用
CN104357468A (zh) * 2014-10-17 2015-02-18 浙江工业大学 食清洁剂细小棒菌zjb14001、卤醇脱卤酶基因、酶、工程菌及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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