CN115927276A - 卤醇脱卤酶突变体及其合成手性噁唑烷酮的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过酶法动力学拆分，以外消旋的环氧化物为底物，同时制备手性4‑取代‑2‑噁唑烷酮化合物和手性环氧化合物的方法。本发明采用人工构建的卤醇脱卤酶突变体来催化完成，实验证明可以催化以外消旋的环氧苯乙烷或其它衍生物为底物，以氰酸盐为亲核试剂，合成手性的(R)‑4‑取代噁唑烷酮化合物，同时保留手性的(R)‑构型的环氧化合物。以环氧苯乙烷为例，50 mM的底物浓度，(R)‑4‑苯基‑噁唑烷‑2‑酮的收率47%，ee值97%，(R)‑环氧苯乙烷收率49%，ee值98%，E>200。
Description
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及手性化合物的制备，具体的涉及采用生物催化剂卤醇脱卤酶手性拆分消旋的环氧化合物后，同时获得手性噁唑烷酮和手性环氧化合物。
背景技术
环氧化合物因其特殊的三元环结构存在分子内张力，能在亲核试剂(如NO2 -、N3 -、CN-、OCN-)存在时发生开环反应，进而构建新的C-S，C-C，C-N，C-O键，在有机合成中是非常重要的中间体，手性环氧化合物能够在开环反应中保留手性，是药物和精细化工品合成中的重要中间体。但手性环氧化合物的制备一直是化学合成工业中的难题。化学法制备存在环境代价高、手性试剂昂贵、催化效能低等缺点，近年来，虽然关于生物法制备手性环氧化物的报道越来越多，烯烃的单加氧酶类对烯烃的不对称氧化，但因其反应构建复杂，活性偏低，底物应用范围窄的问题(Lin,H.；Liu,J.-Y.；Wang,H.-B.；Ahmed,A.A.Q.；Wu,Z.-L.,Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic 2011,72,77-89)，很难得到广泛应用。因此，拓展手性环氧化合物的制备路径，提高制备效率，是非常必要的。
噁唑烷酮是一类含氧、含氮的杂环化合物，因其优异的生物活性在药物化学中受到广泛关注。手性恶唑烷酮类化合物本身就是一类新型的杀菌剂、抗菌剂、杀虫剂。如：利奈唑胺(Linezolid)，可用于治疗由对其他种类抗生素有抗药性的革兰氏阳性菌引起的严重感染，其在体内代谢中，具有组织分布广，口服制剂吸收迅速、安全的特点。2019年，利奈唑胺在国内的销售额达17.5亿元。特地唑胺(Tedizolid)是利奈唑胺的类似物，作用于细菌核糖体50S亚基，阻断细菌蛋白质的合成。他们都是以手性的噁唑烷酮作为母核的全合成抗生素，与其他抗生素产生交叉耐药的风险很小，为耐药性细菌感染引起的疾病提供了新思路。噁唑烷酮还可以在酸、碱条件下水解获得氨基醇化合物，手性氨基醇类化合物是有机合成中非常重要的中间体(Gonda,J.；Fazekasova,S.；Martinkova,M.；Mitrikova,T.；Roman,D.；Pilatova,M.B.,Org Biomol Chem 2019,17(13),3361-3373；Vujjini,S.K.；Mothukuri,V.R.；Islam,A.；Bandichhor,R.；Kagga,M.；Malakondaiah,G.C.,SyntheticCommunications 2013,43,3294-3306)。
化学合成中，通常以手性1，2-氨基醇作为初始材料合成、金属催化的不对称还原、叠氮甲酸酯的C(sp3)-H胺化以及脒基催化的不对称N-酰化反应等方法进行4-取代2-噁唑烷酮的制备，这些方式存在需要有毒试剂或剧烈而苛刻的反应条件、环境不友好，副产物多等缺点(Pridgen,L.N.；J.Prol,J.,J.Org.Chem.1989,54,3231-3233；Wu,Y.；Shen,X.,Tetrahedron:Asymmetry 2000,11,4359–4363；Wang,Q.；Tan,X.；Zhu,Z.；Dong,X.-Q.；Zhang,X.,Tetrahedron Letters 2016,57,658-662；Wang,G.；Zhou,Z.；Shen,X.；Ivlev,S.；Meggers,E.,Chem Commun(Camb)2020,56,7714-7717)。2019年，有报道采用卤醇脱卤酶HheG制备4-芳基-噁唑烷-2-酮的方法，但只能合成外消旋的产物(An,M.；Liu,W.；Zhou,X.；Ma,R.；Wang,H.；Cui,B.；Han,W.；Wan,N.；Chen,Y.,RSC Advances 2019,9,16418-16422)。
因此，开发一种绿色高效的，高区域选择性、高立体选择性合成手性噁唑烷酮的方法是非常必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何通过酶法制备手性噁唑烷酮或其苯环上有取代基团的衍生物，并同时制备相应的手性环氧苯乙烷或其衍生物。具体是通过酶法动力学拆分，以外消旋的环氧化物为底物，同时制备手性4-取代噁唑烷酮化合物和手性环氧化合物的方法。
本发明首先提供一种卤醇脱卤酶突变体，其在对应于SEQ ID NO.1的氨基酸序列的第1至226位中存在下述之一的突变：Y15M；N182G；N182K；N182S；Y15M且N182G；Y15M且N182H；Y15M且N182S；Y15M且N182W。
本发明还提供了所述的卤醇脱卤酶突变体的编码基因，编码基因的表达载体，编码基因的重组细胞。
本发明还提供了一种制备(R)-4-取代苯基-噁唑烷酮和/或(R)-环氧取代苯乙烷的方法，以下式I的消旋环氧取代苯乙烷化合物作为底物催化拆分合成手性4-取代苯基噁唑烷酮式II和/或手性环氧化合物式III：
R＝F，Cl，Br，CH3。
在具体例子，以环氧苯乙烷为底物，制备得到(R)-4-苯基-噁唑烷酮和/或(R)-环氧苯乙烷；以2-氟苯基-环氧乙烷为底，制备得到(R)-4-(2-氟苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(2-氟苯基)-环氧乙烷；以3-氟苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-氟苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-氟苯基)-环氧乙烷；以4-氟苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-氟苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-氟苯基)-环氧乙烷；以3-氯苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-氯苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-氯苯基)-环氧乙烷；以4-氯苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-氯苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-氯苯基)-环氧乙烷；以3-溴苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-溴苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-溴苯基)-环氧乙烷；以4-溴苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-溴苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-溴苯基)-环氧乙烷；以2-甲基苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(2-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(2-甲基苯基)-环氧乙烷；以3-甲基苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-甲基苯基)-环氧乙烷；以4-甲基苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-甲基苯基)-环氧乙烷。
具体的，所述催化反应是以表达如SEQ ID NO.1的所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以消旋环氧取代苯乙烷化合物为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。
优选的，反应体系中的催化底物浓度为20-150g/L，含有菌体量为10-150g/L，反应体系的pH为6.0-9.0，反应温度为25℃-35℃。
在另外的优选方式中，在反应体系还添加有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种作为助溶剂。
本发明采用人工构建的蛋白质突变体来进行催化完成，实验证明可以催化以外消旋的环氧苯乙烷或其它衍生物为底物，以氰酸盐为亲核试剂，合成手性的(R)-4-取代噁唑烷酮化合物，同时保留手性的(R)-构型的环氧化合物。以环氧苯乙烷为例，50mM的底物浓度，(R)-4-苯基-噁唑烷-2-酮的收率47％，ee值97％，(R)-环氧苯乙烷收率49％，ee值98％，E>200。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下面通过具体实施方式对本发明作进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但并不构成对本发明的限制。其中，如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“Y15M”表示第15位的酪氨酸Y突变为甲硫氨酸M，以此类推。
在本发明的优选实施方式中，本发明的卤醇脱卤酶突变体的制备方法如下：大肠杆菌为表达宿主。
具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)卤醇脱卤酶相应突变位点的基因构建到pET-21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌BL21(DE3))，获得相应的工程菌株。(3)将工程菌株接种至LB培养基中，37℃培养12小时，以接种量1％转接至新的培养基，再培养2小时后加入0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃培养6-12小时。(4)离心收集菌体。
实施例1:卤醇脱卤酶库的筛选
通过文献调研合成已知卤醇脱卤酶、以该类酶极端保守的序列为模板，在数据库进行挖掘和表达鉴定，构建起卤醇脱卤的酶库。以环氧苯乙烷为筛选底物，对卤醇脱卤酶库进行筛选。筛选体系为1mL：底物浓度为10mM，NaOCN为15mM，反应缓冲液为50mM(pH 7.5)Tris-SO4，表达卤醇脱卤酶的大肠杆菌25g/L，30℃反应3h后0.9mL乙酸乙酯萃取，取有机相风干，TLC初步检测产物生成情况，对有明显产物生成的反应样品，以0.7mL的溶剂(正己烷:异丙醇50:50)溶解，用高效液相检测产物构型。检测方法：IC柱(大赛璐)，流动相正己烷：异丙醇(80：20)，流速1mL/min，检测波长210nm。经过液相复筛，有明显产物生成的菌株有15株，通过液相检测产物生成量，转化结果最优的是一株Acidimicrobiia bacterium，其中的卤醇脱卤酶AbHheG(NDE59729.1)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，优化后的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。
实施例2:卤醇脱卤酶AbHheG突变位点的选择
利用AlphaFold2(AlphaFold2 TIB Server(biodesign.ac.cn))网站对AbHheG蛋白结构进行预测，使用软件Discover Studio 4.1(Accelrys,USA)与底物进行Docking，推测与底物有相互作用的氨基酸为：15，90，138，151，155，181，182，184。其中，138，151，155为该类酶催化所必须的催化三联体，故选择其余5个氨基酸位点进行饱和突变。
实施例3：卤醇脱卤酶的氨基酸序列对应的核苷酸序列SEQ ID NO.2优化为核苷酸SEQ ID NO.3序列全合成并克隆到pET-21a载体的限制性内切酶位点NdeI和XhoI之间，得到重组质粒pET-21a-AbHheG，进一步转化至表达宿主E.coliBL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coliBL21(DE3)/pET-21a-AbHheG。
构建卤醇脱卤酶单点突变体：以pET-21a-AbHheG为模板，对15，90，181，182，184氨基酸位点进行定点突变。设计引物(引物序列见表1)，采用质粒滚环扩增的方法构建突变体，高保真聚合酶KOD-plus进行PCR。PCR反应条件如下：总体积为50μL的PCR反应体系中，加入5μL 10×KODbuffer，5μL dNTP(2mM)，2μLMgSO4(25mM)，模板20～100ng，一对突变引物各1μL(10μM)，1μL KOD聚合酶，加灭菌蒸馏水至50μL。PCR反应程序：(1)94℃变性3min，(2)94℃变性30sec，(3)55℃退火30sec，(4)68℃延伸7min，步骤(2)～(4)共进行20～30个循环。4℃保存PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后，加入限制性内切酶DpnI在37℃消化2h。将消化产物转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有氨苄抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。挑取单克隆进行测序，测序正确即获得相应突变体。组合突变体的构建方法同单点突变体，Y15M/N182X以pET-21a-AbHheG-Y15M为模板，N182S/Y15X以pET-21a-AbHheG-N182S为模板。
表1单点饱和突变引物
其中，表中加粗字体“XXX”代表突变成不同的氨基酸用相应的密码子替换，其中，丙氨酸(缩写“A”)密码子GCA，半胱氨酸(缩写“C”)密码子TGT，天冬氨酸(缩写“D”)密码子GAT，谷氨酸(缩写“E”)密码子GAA，苯丙氨酸(缩写“F”)密码子TTT，甘氨酸(缩写“G”)密码子GGT，组氨酸(缩写“H”)密码子CAT，异亮氨酸(缩写“I”)密码子ATT，赖氨酸(缩写“K”)密码子AAA，亮氨酸(缩写“L”)密码子CTG，甲硫氨酸(缩写“M”)ATG，天冬酰胺(缩写“N”)AAT，脯氨酸(缩写“P”)CCG，谷氨酰胺(缩写“Q”)密码子CAG，精氨酸(缩写“R”)密码子CGU，丝氨酸(缩写“S”)密码子AGC，苏氨酸(缩写“T”)密码子ACC，缬氨酸(缩写“V”)密码子GTT，色氨酸(缩写“W”)密码子TGG，酪氨酸(缩写“Y”)密码子TAT。
实施例4：卤醇脱卤酶突变体的诱导表达
将上述突变体的基因工程菌的单菌落分别接入4mL含有氨苄抗生素的LB液体培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中，于37℃，200rpm摇床中培养过夜，即为种子液。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到30mL含有氨苄抗生素的LB培养基，37℃，200rpm培养至OD600为0.6-1.0左右，加入0.1mM的IPTG，并置于25℃，200rpm诱导8～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体。用30mL的50mM Tris-SO4缓冲液重悬，8000rpm离心5分钟获得静息细胞。
实施例5：AbHheG突变子以静息细胞形式的活力和选择性测定
向1mL 50mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入环氧苯乙烷10mM、氰酸钠15mM、DMSO1％、实施例4得到的AbHheG突变子静息细胞(0.025g)，于30℃，200rpm摇床中，反应3h。处理方法如实施例1所述，样品通过TLC薄层层析检测(展开剂为石油醚：乙酸乙酯1：1)，茚三酮染色，有明显产物生成的突变子催化的样品，再进行HPLC检测确定活性和选择性。
突变子明显活性的突变子催化样品结果如表2所述，定义野生型活性为100％。
表2.卤醇脱卤酶AbHheG突变子活性及选择性测定
其中，表中负数表示生成的另一构型(S构型)的产物多
以活性和选择性双重指标，进行突变子的筛选，从上表中单点突变的突变子催化结果看，各位点都有活性保持一定程度的突变子，但15Y和182N是影响选择性的关键位点，Y15M及N182的单位点突变表现出更好的立体选择性。为此，以单突变中选择性最好的单突变子Y15M和N182K为模板，进分别行了另一位点的饱和突变，最终筛选到选择性最好的突变子Y15M/N182S，产物ee值达到99％，并且维持了较好的活性。由于酶对底物的选择性提升，非偏好型的底物的消耗下降，造成形式上活性的降低。为获得更为准确的催化活性数据，选择选择性和活性都在60％以上的(N182K选择性最高，纳入其中)突变子，以手性的环氧苯乙烷为底物，重新构建催化反应。结果见表3，从表中看出，突变子和野生型的酶相比，这些较优突变子的相对活性在80-120之间。
表3.突变子活性验证
实施例6：卤醇脱卤酶突变子AbHheGY15M/N182S的催化反应条件优化
在该动力学拆分反应过程中，反应温度、pH、菌体浓度、亲核试剂浓度、以及反应时间等条件，均对反应结果产生一定的影响，将以上条件作为单一变量，，构建反应体系具体变量变化范围见表4。其中基本反应条件为，向1mL 50mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入环氧苯乙烷10mM、氰酸钠15mM、DMSO 1％、实施例4得到的AbHheG突变子静息细胞(0.025g)，于30℃，200rpm摇床中，反应3h。涉及到优化的条件时，该条件变为变量。
结果显示：反应体系中的催化底物浓度为20-150g/L，含有菌体量为10-150g/L，有机助溶剂乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中，在pH为6.0-10.0，在20℃-45℃条件下进行反应，都能够较好的实现发明内容中所提到的反应。再开展包括反应pH值、反应温度、菌体添加量、亲核试剂添加比例、以及反应时长的优化后，更优反应条件是在pH7.5，或25℃，或1.5-2倍底物当量的氰酸钠添加量，或50g/L的菌体添加量时。
实施例7：利用卤醇脱卤酶突变子AbHheGY15M/N182S催化制备(R)-4-苯基-噁唑烷酮以及(R)-环氧苯乙烷
将突变体AbHheGY15M/N182S，按照实施例4培养诱导表达方法进行蛋白诱导表达后收集菌体，以静息细胞作为生物催化剂。
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入环氧苯乙烷(0.24g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheGY15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-环氧苯乙烷，产量为0.117g，收率49％，ee值98％；水相再次用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-苯基-噁唑烷酮，产量为0.153g，收率47％，ee值97％。
实施例8：利用AbHheGY15M/N182S催化制备(R)-4-(2-氟苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(2-氟苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入2-氟苯基-环氧乙烷(0.276g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(2-氟苯基)-环氧乙烷，产量为0.086g，收率31％，ee值92％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(2-氟苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.167g，收率46％，ee值99％。
实施例9：利用AbHheGY15M/N182S催化制备(R)-4-(3-氟苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(3-氟苯基)-环氧乙烷
向50mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入3-氟苯基-环氧乙烷(0.248g)、氰酸钠(0.175g)、DMSO(1.25mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2.5g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(3-氟苯基)-环氧乙烷，产量为0.067g，收率27％，ee值92％；萃余相用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(25mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(3-氟苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.153g，收率47％，ee值99％。
实施例10：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(4-氟苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(4-氟苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入4-氟苯基-环氧乙烷(0.248g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(4-氟苯基)-环氧乙烷，产量为0.075g，收率27％，ee值84％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(4-氟苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.167g，收率46％，ee值95％。
实施例11：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(3-氯苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(3-氯苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入3-氯苯基-环氧乙烷(0.248g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(3-氯苯基)-环氧乙烷，产量为0.158g，收率51％，ee值96％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(3-氯苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.166g，收率42％，ee值99％。
实施例12：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(4-氯苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(4-氯苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入4-氯苯基-环氧乙烷(0.248g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(4-氯苯基)-环氧乙烷，产量为0.158g，收率51％，ee值84％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(4-氯苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.174g，收率44％，ee值99％。
实施例13：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(3-溴苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(3-溴苯基)-环氧乙烷
向50mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入3-溴苯基-环氧乙烷(0.199g)、氰酸钠(0.098g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得((R)-(3-溴苯基)-环氧乙烷，产量为0.098g，收率49％，ee值99％；萃余相用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(25mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(3-溴苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.116g，收率48％，ee值99％。
实施例14：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(4-溴苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(4-溴苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入4-溴苯基-环氧乙烷(0.318g)、氰酸钠(0.156g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(4-溴苯基)-环氧乙烷，产量为0.169g，收率53％，ee值75％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(4-溴苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.166g，收率43％，ee值99％。
实施例15：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(2-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(2-甲基苯基)-环氧乙烷
向100mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入2-甲基苯基-环氧乙烷(0.268g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(4g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(2-甲基苯基)-环氧乙烷，产量为0.159g，收率45％，ee值98％；萃余相用乙酸乙酯萃取(100mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(40mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(2-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.139g，收率52％，ee值88％。
实施例16：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(3-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(3-甲基苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入3-甲基苯基-环氧乙烷(0.268g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(3-甲基苯基)-环氧乙烷，产量为0.102g，收率38％，ee值99％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(3-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.166g，收率47％，ee值99％。
实施例17：利用AbHheG-Y15M/N182S催化制备(R)-4-(4-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮以及(R)-(4-甲基苯基)-环氧乙烷
向40mL的100mM Tris-SO4缓冲液(pH 7.5)中加入4-甲基苯基-环氧乙烷(0.268g)、氰酸钠(0.195g)、DMSO(1mL)、实施例2得到的AbHheG-Y15M/N182S静息细胞(2g)，于25℃，200rpm摇床中，反应6h。然后，用石油醚萃取(40mL×3)，合并有机相，无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-(4-甲基苯基)-环氧乙烷，产量为0.131g，收率49％，ee值99％；萃余相用乙酸乙酯萃取(40mL×3)，合并有机相，用饱和氯化钠溶液反洗(20mL×3)，有机相无水硫酸钠干燥后旋干，得(R)-4-(4-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮，产量为0.170g，收率48％，ee值99％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，在对应于SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的第1至226位中存在下述之一的突变：Y15M；N182G；N182K；N182S；Y15M且N182G；Y15M且N182H；Y15M且N182S；Y15M且N182W。
2.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的编码基因。
3.含有如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的编码基因的表达载体。
4.含有如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体的编码基因的重组细胞。
5.如SEQ ID NO. 1的所示氨基酸序列的卤醇脱卤酶或如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体在制备手性噁唑烷酮和/或手性环氧化合物中的应用。
6.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用是以下式I的消旋环氧取代苯乙烷化合物作为底物催化拆分合成手性4-取代苯基噁唑烷酮式II和手性环氧化合物式III：
R=F，Cl，Br，CH3。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述催化反应是以表达如权利要求1所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以消旋环氧取代苯乙烷化合物为底物，以pH为6.0-11.0的缓冲液作为反应介质，在20℃-50℃条件下进行反应。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述催化反应中，反应体系中的催化底物浓度为20-150 g/L，含有菌体量为10-150 g/L，反应体系的pH为6.0-9.0，反应温度为20℃-35℃。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，在反应体系还添加有乙腈、丙酮、甲醇、乙醇、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、1,4-二氧六环中的一种作为助溶剂。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于，以环氧苯乙烷为底物，制备得到(R)-4-苯基-噁唑烷酮和/或(R)-环氧苯乙烷；以2-氟苯基-环氧乙烷为底，制备得到(R)-4-(2-氟苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(2-氟苯基)-环氧乙烷；以3-氟苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-氟苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-氟苯基)-环氧乙烷；以4-氟苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-氟苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-氟苯基)-环氧乙烷；以3-氯苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-氯苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-氯苯基)-环氧乙烷；以4-氯苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-氯苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-氯苯基)-环氧乙烷；以3-溴苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-溴苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-溴苯基)-环氧乙烷；以4-溴苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-溴苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-溴苯基)-环氧乙烷；以2-甲基苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(2-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(2-甲基苯基)-环氧乙烷；以3-甲基苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(3-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(3-甲基苯基)-环氧乙烷；以4-甲基苯基-环氧乙烷为底物，制备得到(R)-4-(4-甲基苯基)-噁唑烷-2-酮和/或(R)-(4-甲基苯基)-环氧乙烷。
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