CN109963943A - 羟腈裂解酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种获得来自除马陆(Chamberlinius hualienensis)以外的千足虫的HNL基因和HNL、提供可实用地使用的量的HNL的制备方法、使用了该HNL的光学活性氰醇的制造方法。一种来自千足虫的HNL基因的制造方法，其包含：从属于倍足纲(Diplopoda)的生物中存在的基因中，选择具有编码来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列TAX1DIX2G(序列号15)或VPNGDKIH(序列号16)的碱基序列的基因。一种蛋白，其具有(1)～(3)中的任一个氨基酸序列且具有HNL活性，(1)序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列；(2)在(1)的氨基酸序列中具有氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者(3)与(1)的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。一种制备光学活性氰醇的方法，其中，使本发明的来自千足虫的HNL作用于含有醛等和生成氰化氢等的物质的反应溶剂。

Description

羟腈裂解酶
技术领域
本发明涉及来自千足虫(millipede)的羟腈裂解酶(hydroxynitrile lyase，HNL)基因的克隆方法、通过这些基因的表达生产的酶、以及使用了表达酶的光学活性氰醇(cyanohydrin)的制造方法。
相关申请的相互参照
本申请主张2016年3月1日申请的日本特愿2016-038640号的优先权，其全部记载作为公开特别援引到此。
背景技术
光学活性氰醇是医药、精细化工的制造中重要的中间体。作为氰醇的制造方法，提出了使羟腈裂解酶作用于醛或酮和氰化物供体(cyanide donor)(专利文献1)的方法。从马陆(Chamberlinius hualienensis)中发现的(R)-羟腈裂解酶具有比从植物中发现的羟腈裂解酶更高的比活性和对热和pH的更优异的稳定性(专利文献2、非专利文献1)。
专利文献1：日本特开2000-217590号公报
专利文献2：日本特开2015-167477号公报
非专利文献1：Dadashipur等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.112，10605-10610(2015)
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献2中，将从马陆中发现的(R)-羟腈裂解酶在酵母中表达，但其表达量为微量，未能构建大肠杆菌中的表达系统，其大量制备困难。
虽然推测其他的千足虫是否也具有羟腈裂解酶(HNL)，但未发现酶和酶基因，没有确立来自其他千足虫的HNL基因的克隆方法。
因此，本发明的目的在于提供一种能够获得(提供)来自除马陆以外的千足虫的HNL基因和HNL，进而能够确立得到的HNL的表达系统，提供实用上可使用的量的HNL的方法。此外，本发明的目的还在于提供使用了所提供的HNL的光学活性氰醇的制造方法。
用于解决课题的手段
本发明者们为了解决上述课题反复进行了深入研究。
本发明者们发现能够通过使用特定序列的缩聚引物，从来自千足虫的HNL基因间保守的序列克隆来自各种千足虫的HNL基因，并且通过该方法获得了来自各种千足虫的HNL基因和HNL。进一步发现，通过使用昆虫培养细胞和特定的大肠杆菌，可以表达新发现的HNL基因，制造HNL。此外，还发现通过使用所表达的HNL可以制造光学活性氰醇，从而完成了本发明。
本发明如下所述。
[1]一种方法，其为来自千足虫的羟腈裂解酶(以下称为HNL)基因的制造方法，其包含：
从属于倍足纲(Diplopoda)的生物中存在的基因中，选择具有编码来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列TAX1DIX2G(序列号15)(其中，X1为L或F，X2为R或K)的碱基序列和编码VPNGDKIH(序列号16)的碱基序列中的至少一种的基因。
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述基因的选择通过将属于倍足纲的生物中存在的基因作为模板，使用由编码所述保守氨基酸序列的碱基序列构成的至少1个DNA作为引物，进行PCR来实施。
[3]根据[1]所述的方法，其中，所述基因的选择通过将属于倍足纲的生物中存在的基因作为模板，使用由编码所述保守氨基酸序列的碱基序列构成的DNA作为探针，进行DNA-DNA杂交来实施。
[4]根据[1]所述的方法，其中，所述基因的选择通过对属于倍足纲的生物中存在的基因进行测序，从被测序的基因序列中选择具有编码所述保守氨基酸序列的碱基序列的基因来实施。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，属于倍足纲的生物中存在的基因是从属于倍足纲的生物中提取的基因组DNA或由属于倍足纲的生物中提取的RNA通过逆转录而得到的cDNA。
[6]根据[2]所述的方法，其中，所述引物为下述的缩聚引物HNL-FW和HNL-RV。
HNL-FW：CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(序列号21)
HNL-RV：ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(序列号22)
HNL-FW2：SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG(序列号23)
HNL-RV2：ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC(序列号24)
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，属于倍足纲的生物为Nedyopustambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、或Riukiaria。
[8]一种方法，其为来自千足虫的HNL的制造方法，其包含：
通过[1]～[7]中任一项所述的方法制备来自千足虫的HNL基因，使得到的HNL基因在宿主细胞内表达，得到HNL。
[9]根据[8]所述的方法，其中，所述宿主细胞为昆虫培养细胞。
[10]根据[8]所述的方法，其中，所述宿主细胞为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
[11]一种基因，其具有下述(4)～(6)中任一个碱基序列。
(4)具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列，且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列；
(5)具有在序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列中具有1～50个碱基的缺失、替换和/或附加的碱基序列，且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列；或者
(6)具有与序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列，且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列。
[12]一种质粒，其在载体中包含[11]所述的基因。
[13]一种转化体，其是由可表达地含有质粒的宿主形成的转化体，所述质粒在载体中包含[11]所述的基因，其中，所述宿主为昆虫培养细胞或具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
[14]一种方法，其为来自千足虫的HNL的制造方法，其包含：
对[13]所述的转化体进行培养，从培养物中分离HNL。
[15]根据[14]所述的方法，其中，宿主为昆虫培养细胞，HNL基因为来自Nedyopustambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、或Riukiaria的HNL基因。
[16]根据[14]所述的方法，其中，宿主为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌，HNL基因是来自Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)或Parafontaria laminata的HNL的基因。
[17]一种蛋白，其具有下述(1)～(3)中任一个氨基酸序列，且具有HNL活性。
(1)序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列中具有1～50个氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者
(3)与序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
[18]根据[17]所述的蛋白，其具有下述(1)～(3)中任一个氨基酸序列，且具有HNL活性。
(1)序列表的序列号85或87中记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号85或87中记载的氨基酸序列中具有1～50个氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者
(3)与序列号85或87所述的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
[19]一种方法，其为光学活性氰醇的制造方法，其包含：
使来自千足虫的HNL作用于反应溶剂，制备光学活性氰醇，所述反应溶剂含有醛或酮、和氰化氢或在反应体系中生成氰化物离子的物质，其中，所述来自千足虫的HNL为[17]或[18]所述的蛋白、或[13]所述的转化体。
发明效果
根据本发明，能够从各种千足虫中克隆HNL基因。此外，可以使用昆虫培养细胞、特定的基因重组大肠杆菌容易地制备具有高的比活性和热稳定性的来自千足虫的(R)-HNL，用于光学活性氰醇的制造。由于光学活性氰醇为医药、精细化工的制造中的重要中间体，因此本发明在产业上是非常有用的。
附图说明
图1是用SDS-PAGE分析从Nedyopus tambanus tambanus精制的NttHNL的结果。泳道1为Broad Range Marker(Bio-Rad公司制)，泳道2为精制后的来自Nedyopus tambanustambanus的HNL(NttHNL)。
图2是表示热和pH对从大肠杆菌精制的OgraHNL的影响的图。A为最适温度，B为最适pH，C为热稳定性，D为pH稳定性。
图3是表示热和pH对从大肠杆菌精制的NtmHNL的影响的图。A为最适温度，B为最适pH。
图4表示NttHNL蛋白的氨基酸序列(序列号1)和NttHNL基因的碱基序列(序列号2)。
图5表示NtmHNL蛋白的氨基酸序列(序列号3)和NtmHNL基因的碱基序列(序列号4)。
图6表示OgraHNL蛋白的氨基酸序列(序列号5)和OgraHNL基因的碱基序列(序列号6)。
图7表示PfalHNL蛋白的氨基酸序列(序列号7)和PfalHNL基因的碱基序列(序列号8)。
图8表示Pton1HNL蛋白的氨基酸序列(序列号9)和Pton1HNL基因的碱基序列(序列号10)。
图9表示PlamHNL蛋白的氨基酸序列(序列号11)和PlamHNL基因的碱基序列(序列号12)。
图10表示RspHNL蛋白的氨基酸序列(序列号13)和RspHNL基因的碱基序列(序列号14)。
图11a表示Pton3HNL的最适温度的研究结果。
图11b表示Pton3HNL的最适pH的研究结果。
图11c表示Pton3HNL的温度稳定性的研究结果。
图11d表示Pton3HNL的pH稳定性的研究结果。
图12a表示实施例14中的(R)-扁桃腈(mandelonitrile)的生产结果(pH依赖性)。
图12b表示实施例14中的(R)-扁桃腈的生产结果(浓度依赖性)。
图13表示PtokHNL蛋白的氨基酸序列(序列号83)和PtokHNL基因的碱基序列(序列号84)。
图14表示Pton2HNL蛋白的氨基酸序列(序列号85)和Pton2HNL基因的碱基序列(序列号86)。
图15表示Pton3HNL蛋白的氨基酸序列(序列号87)和Pton3HNL基因的碱基序列(序列号88)。
图16表示RssHNL蛋白的氨基酸序列(序列号89)和RssHNL基因的碱基序列(序列号90)。
具体实施方式
<HNL基因的制造方法>
本发明涉及来自千足虫的羟腈裂解酶(HNL)基因的制造方法。
该方法包含：从属于倍足纲的生物中存在的基因中，选择具有编码来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列TAX1DIX2G(序列号15)(其中，X1为L或F，X2为R或K)的碱基序列和编码VPNGDKIH(序列号16)的碱基序列中的至少一种的基因。
尚未确立来自除马陆以外的千足虫的HNL基因的克隆方法。因此，本发明者们探索了来自千足虫的HNL基因间保守的序列，其结果发现序列号15和16所示的氨基酸序列是来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列。
序列号15的来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列为TAX1DIX2G，X1为L或F，X2为R或K。X1和X2的组合为4种。具体而言，为以下的4种。
TALDIRG(序列号17)
TALDIKG(序列号18)
TAFDIRG(序列号19)
TAFDIKG(序列号20)
序列号16的来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列为VPNGDKIH。
编码上述保守氨基酸序列的碱基序列没有限制，可以举出例如后述的缩聚引物HNL-FW(序列号21)和HNL-RV(序列号22)、以及缩聚引物HNL-FW2(序列号23)和HNL-RV(序列号24)。
此外，如实施例所示，通过使用具有编码保守氨基酸序列的碱基序列的引物(缩聚引物)，首次能够从各种千足虫克隆HNL基因。
实施例中，虽然示出的是如上所述使用缩聚引物从各种千足虫克隆HNL基因的方法，但本发明只要是包含选择具有编码来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列的碱基序列中的至少一种的基因的方法，则全部包含在内。作为这样的方法的例子，可例示以下的(1)～(3)的方法。
(1)所述基因的选择通过将属于倍足纲的生物中存在的基因作为模板，使用由编码所述保守氨基酸序列的碱基序列构成的至少1个DNA作为引物，进行PCR来实施的方法。
(2)所述基因的选择通过将属于倍足纲的生物中存在的基因作为模板，使用由编码所述保守氨基酸序列的碱基序列构成的DNA作为探针，进行DNA-DNA杂交来实施的方法。
(3)所述基因的选择通过对属于倍足纲的生物中存在的基因进行测序，从被测序的基因序列中选择具有编码所述保守氨基酸序列的碱基序列的基因来实施的方法。
本发明的方法中使用的属于倍足纲的生物中存在的基因例如可以是从属于倍足纲的生物中提取的基因组DNA、或是由从属于倍足纲的生物提取的RNA通过逆转录而得到的cDNA。基因组DNA的提取方法和由RNA通过逆转录得到cDNA的制备方法可以适当利用公知的方法。
方法(1)：
用作模板的属于倍足纲的生物中存在的基因可以是如上所述提取的基因组DNA或cDNA，优选为cDNA，将这些DNA作为模板，使用由编码上述序列号15和16所示的保守氨基酸序列的碱基序列构成的至少1个DNA作为引物，进行PCR。引物的碱基序列只要是编码序列号15和16所示的保守氨基酸序列的碱基序列，则没有限制，可以举出例如下述的缩聚引物HNL-FW和HNL-RV、以及HNL-FW2和HNL-RV2。可以使用这些缩聚引物进行PCR，对来自所述生物的HNL基因进行扩增。
HNL-FW：CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(序列号21)
HNL-RV：ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(序列号22)
HNL-FW2：SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG(序列号23)
HNL-RV2：ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC(序列号24)
方法(2)：
用作模板的属于倍足纲的生物中存在的基因可以是如上所述提取的基因组DNA或cDNA，优选为提取的基因组DNA，将这些DNA作为模板，使用由编码上述序列号15和16所示的保守氨基酸序列的碱基序列构成的至少1个DNA作为探针，进行DNA-DNA杂交。DNA-DNA杂交可以适当利用公知的方法。探针的碱基序列只要是编码序列号15和16所示的保守氨基酸序列的碱基序列，则没有限制，例如可以是与上述的缩聚引物HNL-FW和HNL-RV同样的碱基序列或包含这些碱基序列的一部分的碱基序列。使用这些探针进行DNA-DNA杂交，得到来自所述生物的HNL基因。通过DNA-DNA杂交得到的HNL基因可以通过PCR等公知的扩增方法适当扩增。
方法(3)：
对属于倍足纲的生物中存在的基因进行测序。进行测序的对象可以是如上所述提取的基因组DNA或cDNA。测序方法可以适当利用公知的方法。从被测序的基因序列中选择具有编码所述保守氨基酸序列的碱基序列的基因。
属于马陆科的生物没有限定。在属于倍足纲的生物中，可以举出例如例如带马陆目(Polydesmida)带马陆科(Polydesmidae)的带马陆、带马陆目(Polydesmida)塔带马陆科(Pyrgodesmidae)的塔带马陆、带马陆目(Polydesmida)チビヤスデ科(Opisotretidae)的チビヤスデ。
实施例中示出了能够克隆属于带马陆目(Polydesmida)奇马陆科(Paradoxosomatidae)的Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidusgracilis)、带马陆目(Polydesmida)光带马陆科(Xystodesmidae)的Parafontariafalcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、以及Riukiaria的HNL基因。
cDNA制备方法及以cDNA为模板的PCR法是公知的方法。也参照实施例的记载，作为缩聚引物，可以通过使用上述HNL-FW和HNL-RV来实施。
<HNL基因>
本发明涉及一种基因，其具有下述(4)～(6)中的任一个碱基序列。
(4)具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列、且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列；
(5)具有在序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列中具有1～50个碱基的缺失、替换和/或附加的碱基序列、且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列；或者
(6)具有与序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列、且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列。
(4)的具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88和90中记载的碱基序列的基因分别为来自Nedyopus tambanus tambanus、Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria tonominea、Parafontaria laminata、Riukiaria的一种、Parafontaria tokaiensis、Parafontariatonominea、Parafontaria tonominea、Parafontaria tonominea、以及Riukiaria的HNL基因。
(4)、(5)和(6)中记载的“具有HNL活性的蛋白”的HNL活性的测定方法在实施例所示的“(R)-扁桃腈合成活性的测定方法”中有记载。
本说明书中所说的“具有1～50个碱基的缺失、替换和/或附加的碱基序列”中的“1～50个”的范围没有特别限定，例如优选为1～40个、更优选为1～30个、更优选为1～20个、进一步优选为1～10个、更进一步优选为1～5个、特别优选为1～3个左右。
关于具有在序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90所记载的碱基序列中具有1～数个碱基的缺失、替换和/或附加的碱基序列、且具有编码至少具有HNL活性的蛋白的碱基序列的基因(以下，将这些基因称为突变基因)，可以基于序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列的信息，通过化学合成、基因工程方法或突变诱导等本领域技术人员已知的任意方法来制作。
例如，对于具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列的DNA，可以使用使其与成为诱变剂的药剂接触作用的方法、照射紫外线的方法、基因工程的方法等来制备。作为基因工程的方法之一的部位特异性突变诱导法是能够在特定位置导入特定突变的方法，因此是有用的，可以按照Molecular Cloning第2版、CurrentProtocols in Molecular Biology等中记载的方法进行。
上述“在严格条件下杂交”是指使用DNA作为探针，通过使用菌落原位杂交(colonyhybridization)法、噬菌斑原位杂交(plaque hybridization)法、或Southern杂交法等得到的DNA的碱基序列，可以举出例如通过使用固定化有来自菌落或噬菌斑的DNA或该DNA的片段的过滤器，在0.7～1.0M的NaCl存在下、在65℃下进行杂交，然后使用0.1～2×SSC溶液(1×SSC溶液为150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)、在65℃条件下清洗过滤器而鉴定的DNA等。杂交可以按照Molecular Cloning第2版等中记载的方法进行。
作为在严格条件下杂交的DNA，可以举出与作为探针使用的DNA的碱基序列具有规定以上的同源性的DNA，可以举出例如具有90％以上、优选93％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、最优选99％以上的同源性的DNA。
本发明的基因的获得方法没有特别限定，优选有上述本发明的HNL基因的制造方法。
本发明包含一种质粒，其在载体中含有上述本发明的基因。此外，本发明包含一种转化体，其在宿主生物中可表达上述本发明的基因所编码的HNL地包含本发明的质粒。作为所述宿主生物，可以列举昆虫培养细胞和具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
本发明中使用的载体的种类没有特别限定，例如可以是进行独立复制的载体(例如质粒等)，或者也可以在导入宿主细胞时组装入宿主细胞的基因组中，与组装后的染色体一起复制。载体优选为表达载体。表达载体中，上述基因在功能上与转录所需的要素(例如启动子等)连接。启动子是在宿主细胞中显示转录活性的DNA序列，可以根据宿主的种类适当选择。即，作为本发明的质粒中使用的载体，只要是在宿主生物内能够表达本发明的HNL基因的载体，则没有特别限定。作为这样的表达载体，在昆虫培养细胞的情况下，可以举出例如pFastbac1、BacPAK6、pIEx-1、pBiEx-1等。
作为可在昆虫细胞中工作的启动子的例子，有多角体启动子、P10启动子、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒蛋白启动子(Autographa californica polyhedrosis virusbasic protein promoter)、杆状病毒即时型早期基因1启动子、或杆状病毒39K延迟型早期基因启动子等。
在大肠杆菌的情况下，作为表达载体，可以举出例如pUC19(Takara Bio公司制)、pBluescript、pET28、pCDF、pRSF等。作为能够在大肠杆菌中工作的启动子的例子，可以举出例如lac、trp或tac启动子等。
<来自千足虫的HNL的制造方法>
本发明包含来自千足虫的HNL的制造方法。
来自千足虫的HNL的制造方法(1)包含通过上述本发明的方法制备来自千足虫的HNL基因，使用昆虫培养细胞作为宿主使得到的HNL基因表达、得到HNL。
来自千足虫的HNL的制造方法(2)包含通过上述本发明的方法制备来自千足虫的HNL基因，使用大肠杆菌作为宿主使得到的HNL的基因表达，得到HNL，上述大肠杆菌为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
来自千足虫的HNL的制造方法(3)包含对上述本发明的转化体进行培养，从培养物中分离HNL。
作为该方法(3)的具体例，可以举出下述方法：(3-1)宿主为昆虫培养细胞，HNL基因是来自Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、或Riukiaria的HNL基因；和(3-2)宿主为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌，HNL基因为来自Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)或Parafontarialaminata的HNL的基因。
来自千足虫的HNL的制造方法(3-1)包含使用昆虫培养细胞作为宿主，使来自Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontariafalcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、或Riukiaria的HNL基因表达，得到HNL。
来自千足虫的HNL的制造方法(3-2)包含使用大肠杆菌作为宿主使来自Nedyopustambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)或Parafontaria laminata的HNL的基因表达，得到HNL，上述大肠杆菌是具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
在将昆虫细胞用作宿主的方法(1)和(3-1)的情况下，可以使用公知的方法将重组基因导入载体和杆状病毒共导入昆虫细胞，在昆虫细胞培养上清液中得到重组病毒后，进一步使重组病毒感染昆虫细胞，使蛋白表达。作为杆状病毒，例如可以使用感染盗夜蛾亚科(Hadeninae)昆虫的病毒即苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus)等。
作为昆虫细胞，可以使用Spodoptera frugiperda的卵巢细胞即Sf9、Sf21〔Baculovirus expression vectors：a laboratory manual、W.H.Freeman and Company、New York、(1992)〕、Trichoplusia ni的卵巢细胞即HiFive(Invitrogen公司制)等。作为用于制备重组病毒的向昆虫细胞导入的重组基因导入载体和上述杆状病毒的共导入方法，可以举出例如磷酸钙法或脂转染法等。
在使用大肠杆菌作为宿主微生物的方法(2)及(3-2)的情况下，使用具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌、或在硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase)和谷胱甘肽还原酶具有突变的大肠杆菌。作为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌，可以列举在实施例中使用的Shuffle T7。作为在生物还原酶和谷胱甘肽还原酶具有突变的大肠杆菌，可以举出Origami和Rosetta-gami系列的大肠杆菌(Merck Millipore公司制)。大肠杆菌的转化例如可以通过原生质体法或公知的方法、使用感受态细胞来进行。
上述转化体在能够表达导入的基因的条件下在适当的营养培养基中培养。为了从转化体的培养物中分离精制HNL，可以使用通常的蛋白的分离、精制法。例如，在HNL以溶解状态在细胞内表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收细胞，悬浮于水系缓冲液后，通过超声波破碎机等将细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过对该细胞提取液进行离心分离而得到的上清液，将通常的蛋白的分离精制法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、二乙基氨基乙基(DEAE)琼脂糖等树脂的阴离子交换层析法、使用S-Sepharose FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法、等电聚焦电泳等电泳法等方法单独使用或组合使用，将HNL作为精制标准品得到。
<具有HNL活性的蛋白>
本发明涉及一种蛋白，其具有下述(1)～(3)中的任一个氨基酸序列且具有HNL活性。
(1)序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列中具有1～50个氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者
(3)与序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
具有(1)序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列的蛋白分别为来自Nedyopus tambanus tambanus、Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria tonominea、Parafontaria laminata、Riukiaria中的一种、Parafontaria tokaiensis、Parafontariatonominea、Parafontaria tonominea、Parafontaria tonominea、以及Riukiaria的HNL。具有序列号9、85及87中记载的氨基酸序列的蛋白均为来自Parafontaria tonominea的HNL，但采集地不同。
本发明的具有HNL活性的蛋白的HNL活性的测定方法记载于实施例所示的“(R)-扁桃腈合成活性的测定方法”中。
本发明的蛋白的(2)是具有在序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中具有1～50个氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列的蛋白。这里所说的“具有1～50个氨基酸缺失、替换和/或附加的氨基酸序列”中的“1～50个”的范围是指具有缺失等的蛋白为具有HNL活性的酶。从具有上述HNL活性的蛋白所占的比例高的观点出发，上述“1～50个”的范围例如可以为1～40个、优选为1～30个、更优选为1～20个、进一步优选为1～10个、更加优选为1～7个、更进一步优选为1～5个、特别优选为1～3个左右。
本发明的蛋白的(3)是与序列表的序列号1中记载的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列的蛋白。这里所说的“相对于序列表的序列号2中记载的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列”中的同源性只要是具有所述氨基酸序列的同源性的蛋白为具有所述HNL活性的酶，则没有特别限定。上述氨基酸序列的同源性只要为90％以上则没有特别限定，优选95％以上、进一步优选96％以上、进一步优选97％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上。
本发明的具有HNL活性的蛋白的获得方法没有特别限制，可以是通过化学合成而合成的蛋白，也可以是通过基因重组技术制作的重组蛋白。本发明的具有HNL活性的蛋白可以通过如下生产方法制备，该生产方法包含：将编码上述具有HNL活性的蛋白的基因搭载在载体上，通过该载体对宿主细胞进行转化，然后对转化得到的宿主细胞进行培养，在培养物中蓄积所述基因编码的蛋白，对所蓄积的蛋白进行收集。作为编码上述具有HNL活性的蛋白的基因的获得方法，可以列举上述的本发明方法。本发明的蛋白的制备方法例如可以为前述的本发明的来自千足虫的HNL的制造方法。
<光学活性氰醇的制造方法>
本发明包含光学活性氰醇的制造方法。
该方法包含使来自千足虫的HNL作用于含有醛或酮、和氰化氢或在反应体系中生成氰化物离子的物质的反应溶剂，制备光学活性氰醇。
来自千足虫的HNL是上述本发明的具有HNL活性的蛋白，或上述本发明的转化体。本发明的具有HNL活性的蛋白可以是粗酶，也可以是精制酶。本发明的转化体可以是菌体本身，也可以是菌体的破碎物等。
光学活性氰醇的制造方法中，除了来自千足虫的HNL为本发明的具有HNL活性的蛋白、或本发明的转化体以外，可以参照专利文献1中记载的方法。
本发明的制造方法中，作为反应底物的醛或酮例如可以为式(I)R1_(C＝O)R2所示的化合物。
式(I)中，R1和R2为(i)氢原子、(ii)取代或未取代的碳数为1～18的线状或支链状的饱和烷基、或(iii)取代或未取代的环原子数为5～22的芳香族基团。其中，R1和R2不同时表示氢原子。上述(ii)中，R1和R2为取代烷基时，取代基为1个或1个以上的氨基、亚氨基、羟基、碳数为1～8的烷氧基、卤素、羧基、碳数为3～20的环烷基、或可以被N、O、S杂原子取代的碳数最多为22的芳香族基团(这里，取代基为环状取代基时，其本身可以被1个或1个以上的卤素、羟基、碳数为1～8的线状或支链状的烷基、碳数为2～8的线状或支链状的链烯基取代)。上述(iii)中，芳香族基团可以是最多4个环原子被N、O和/或S取代的杂芳香族基团。另外，R1和R2为取代芳香族基团时，取代基为1个或1个以上的氨基、亚氨基、羟基、碳数为1～8的烷氧基、烯丙氧基、卤素、羧基、碳数最多为22的线状或支链状的饱和或不饱和的烷基(这里，一个芳香族基团至少可以被2个取代基取代)。
为了将上述醛或酮转换成光学活性的氰醇，使用氰化氢作为原料，氰化氢的供给方法可以采用作为液体供给的方法、作为气体供给的方法中的任一种。另外，不仅是氰化氢，氰化氢的水溶液即氰化氢酸(即青酸)也可以完全同样地使用。此外，只要是通过添加到反应体系中而产生氰化物离子(CN-)的物质即可使用，可以举出例如氰化钠、氰化钾等氰化氢盐、丙酮氰醇等氰醇类等。
作为反应溶剂，如果在反应体系内大量存在水，则容易引起由酶反应生成的光学活性氰醇的外消旋化，或者在使用水中的溶解度小的醛或酮作为原料的情况下，从生产效率降低等方面考虑，优选使用水中难溶或不溶的有机溶剂作为主要成分的反应溶剂。作为该有机溶剂，只要不对通过酶反应进行的光学活性氰醇的合成反应产生影响，则可以没有特别限制地使用，可以根据合成反应中使用的原料醛或酮的物性、产物氰醇的物性来适当选择。具体而言，可以是可以卤化的脂肪族或芳香族的直链状或支链状或环状的饱和或不饱和烃系溶剂，例如戊烷、己烷、甲苯、二甲苯、二氯甲烷等；可以被卤化的脂肪族或芳香族的直链状或支链状或环状的饱和或不饱和醇系溶剂，例如异丙醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、己醇、环己醇、正戊醇等；可以被卤化的脂肪族或芳香族的直链状或支链状或环状的饱和或不饱和醚系溶剂，例如二乙醚、二丙醚、二异丙醚、二丁醚、甲基叔丁醚等；可以被卤化的脂肪族或芳香族的直链状或支链状或环状的饱和或不饱和酯类溶剂，例如甲酸甲酯、乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酸甲酯等，它们可以单独使用，也可以混合多种使用。另外，这些有机溶剂可以用pH为7以下的水系缓冲液、例如柠檬酸缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等使其饱和。
反应溶剂中的醛或酮的浓度优选为0.01mM～5M的范围，可以使用相对于醛或酮1摩尔，在氰化氢或反应体系中生成氰化物离子的物质1～20摩尔，相对于醛或酮的浓度，显示1unit/mmol以上的酶活性的量的、例如重组微生物菌体。需要说明的是，菌体的酶活性例如可以使用通过将菌体悬浮在水或缓冲液中进行破碎、通过离心分离而得到的上清液，将DL-扁桃腈作为底物，在249.6nm的波长下测定底物被酶分解、生成苯甲醛时的吸光度变化。
反应溶剂的pH在不使上述有机溶剂在水系缓冲液中饱和而使用的情况下不需要调整，但在用水系缓冲液使其饱和而使用的情况下，将水系缓冲液的pH调节为3～7的范围、优选为3～6的范围。关于反应温度，为了抑制非酶反应产生的副产品外消旋氰醇，优选在酶活性发挥的范围内尽可能低，通常为0～50℃，优选为10～45℃。
反应结束后，将反应液与菌体分离，得到反应生成液。通过从该反应生成液中分离除光学活性氰醇以外的成分，得到目标光学活性氰醇。产物的分离可以通过蒸级分离、柱色谱分离、提取分离等通常使用的方法进行。此时，可以添加脱水剂等进行脱水处理，或添加稳定剂等。
实施例
以下，基于实施例对本发明进行更详细的说明。但是，实施例是本发明的例示，本发明并不限于实施例。
(R)-扁桃腈合成活性的测定方法
使含有0.4U的HNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为4～5)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl在30～35℃的温度下进行5分钟，使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量。
实施例1：来自Nedyopus tambanus tambanus的HNL(NttHNL)的精制
Nedyopus tambanus tambanus(Attems)在富山县立大学内采集。从千足虫中提取粗酶液，如下进行NttHNL的精制。
向粗酶液中按照硫酸铵浓度达到35％饱和浓度的方式添加硫酸铵，然后使其吸附于HiTrap Butyl HP(GE Healthcare公司制)，用硫酸铵的浓度梯度洗脱。脱盐后，使NttHNL吸附于Resource Q，用NaCl的浓度梯度洗脱。然后，添加到Superdex75 10/300GL(GEHealthcare公司制)中，用PBS洗脱。精制后的NttHNL显示(R)-扁桃腈合成活性，其比活性为4700U/mg。
对精制后的NttHNL进行N末端氨基酸序列解析以及内部序列解析。其结果，得到N末端氨基酸序列为EEEPLTXDKL，内部氨基酸序列为EEEP(I/L)TCDQ(I/L)PK、(I/L)QTQAVEVAK。
实施例2：NttHNL基因的克隆
使用TRIzoL(Invitrogen公司制)从Nedyopus tambanus tambanus提取总RNA，使用Gene Racer Kit(Invitrogen公司制)合成cDNA。根据NttHNL的N末端氨基酸序列和内部序列设计缩聚引物，通过PCR对编码NttHNL的cDNA的部分序列进行扩增。
缩聚引物序列：
NttHNL-F：GARGARCCNHTNACNTGYGATAA(序列号25)、
NttHNL-R：TTYTCNACNGCYTGNGTCTG(序列号26)
扩增后的DNA结合到pCR-blunt(Invitrogen)中，确定插入物的碱基序列。接着，使用根据内部序列设计的引物，进行5’-和3’-RACE，由此确定编码NttHNL的cDNA的全长碱基序列。
引物序列：
NttHNL-F1：GTTCCAGTTCCTCCGTTAGAAGATTTT(序列号27)、
NttHNL-F2：CCCAGGCTGCAACTGCATTGGACATT(序列号28)、
NttHNL-R1：CTCTGCAATTGCAGAACCATTGCACGTA(序列号29)、
NttHNL-R1：CCATTTGGGGTGTTCAAATTAGTATATT(序列号30)
接着，使用基因特异性引物通过PCR对编码NttHNL的区域进行扩增，结合到pCR-blunt中，确定碱基序列。
基因特异性引物：
NttHNL-FW：ATGCTGTTTTACGTTTCGATTCTTCTAG(序列号31)、
NttHNL-RV：TTAATAGAAAGCAAAACAACCATGGTG(序列号32)
实施例3：来自千足虫的羟腈裂解酶基因的同源克隆
将Nedyopus tambanus mangaesinus(N.tambanus mangaesinus(Attems))、Oxidus gracilis(C.L.Koch))、Parafontaria falcifera(Verhoeff)、Parafontarialaminata(P.laminata(Attems))、Parafontaria tonominea(P.tonominea Attems)、Riukiaria的1种(Riukiaria sp.)分别从1个个体，用上述方法制备总RNA，使用Gene RacerKit或SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech公司制)合成cDNA。通过使用根据ChuaHNL和NttHNL的相同序列设计的缩聚引物来进行PCR，对来自各千足虫的HNL基因的部分序列进行扩增。
缩聚引物序列：
HNL-FW：CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(序列号17)、
HNL-RV：ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(序列号18)
接着，使用根据部分序列设计的引物进行5’-和3’-RACE，由此确定编码来自各千足虫的HNL的cDNA的全长碱基序列。
引物序列：
NtmHNL-F1：TGGTGGACCTAATAACTCCGCCATA(序列号33)、
NtmHNL-F2：CCCAGATGGAAGTTCATATTGCGCTTA(序列号34)、
NtmHNL-R1：GAGTGGGTCGGTTCCATTGTTATTAT(序列号35)、
NtmHNL-R2：GCCATTGCACGTATAAGCGCAATAT(序列号36)、
OgraHNL-F1：CGTTGGTGGTCCTAATAATTCAGCTAT(序列号37)、
OgraHNL-F2：CACCAATCTGAACACTCCAAATGGAA、(序列号38)
OgraHNL-R1：GGATCGGTTCCGTTGTTGTTATTA(序列号39)、
OgraHNL-R2：CGTATAGGCGCAATAGGAGCTTCCATT(序列号40)、
PfalHNL-F1：GACTTCACCATTGGTTCTGATTCTAT(序列号41)、
PfalHNL-F2：CCCCAAGGTGCCAACTATTGTGCATA(序列号42)、
PfalHNL-R1：CAGCCTGACGTTGTGTAGCTGATATGT(序列号43)、
PfalHNL-R2：CGGGACCATTGCAAGAGTATGCACAAT(序列号44)、
PlamHNL-F1：ATTCAAGGAACTCACATAACAATAAATGACTTC(序列号45)、
PlamHNL-F2：ATGAATCTTGTCACCGTTTGGAACTGATCG(序列号46)、
PlamHNL-R1：GAGTTGTTTAGGCGATATGTATCCAGTATTC(序列号47)、
PlamHNL-R2：GAGTTGTTTAGGCGATATGTATCCAGTATTC(序列号48)、
Pton1HNL-F1：GGTCCCGATGCTATGACGGCCTATTT(序列号49)、
Pton1HNL-F2：GGTGCCAACTATTGTGCATACTTTT(序列号50)、
Pton1HNL-R1：GCCTGGAGTTGTTGAGGCGATATGTA(序列号51)、
Pton1HNL-R2：GGGACCATTGCAAAAGTATGCACAATA(序列号52)、
RspHNL-F1：CCGGGGCAAAACAGGTTTGGTA(序列号53)、
RspHNL-F2：GGGTGCCAACTATTGCGCATACTCTT(序列号54)、
RspHNL-R1：GCCAGTATTGGAAGTGCATTTGTATT(序列号55)、
RspHNL-R2：CAGGGGATCATCGAGGTCGACATATT(序列号56)
PtokHNL-F1：GGACAGCCTTTTCGACTAATTGTGAT(序列号91)
PtokHNL-F2：CCCAAGGTGCCAACTACTGTGCATA(序列号92)
PtokHNL-R1：GCCTGGAGTTGTTGAGGCGATATGTAT(序列号93)
PtokHNL-R2：GCAAGAGTAGCCTATGCACAGTAGTTG(序列号94)
Pton2HNL-F1：CCGATGGTCTGACAGCCTATTTGACTA(序列号95)
Pton2HNL-F2：CCCCAAGGTGCCAACTACTGTGCATA(序列号96)
Pton2HNL-R1：GGCGATATGTATCCAGTATTCGTAGTGCA(序列号97)
Pton2HNL-R2：CGGGACCATTGCAAGAGTATGCACAGT(序列号98)
Pton3HNL-F1：CTGACAGCCTATTTGACTAATTGTGAT(序列号99)
Pton3HNL-F2：GCATACTCTTGCAATGGTTCCGAAA(序列号100)
Pton3HNL-R1：GCCTGGAGTTGTTGAGGCGATATGTAT(序列号101)
Pton3HNL-R2：CGGAACCATTGCAAGAGTATGCACA(序列号102)
RssHNL-F1：GACTTCCTCATCGCTCCTGATTGTAT(序列号103)
RssHNL-F2：CGTCGAGGATCCCAAGGGTGCCAA(序列号104)
RssHNL-R1：GCCAGCTATATTGGAAGTGCATTT(序列号105)
RssHNL-R2：CCATCGCAAGAGTATGCGCAATAGTT(序列号106)
接着，使用基因特异性引物通过PCR对编码各羟腈裂解酶的区域进行扩增，PlamHNL结合到T-Vector pMD20载体(Takara公司制)中，其他结合到pCR-blunt中，确定碱基序列。
基因特异性引物序列:
NtmHNL-FW：ATGCTGTTTTACGTCTCGATTCTTC(序列号57)、
NtmHNL-RV：TCAATAGAAAGCAAAACAGCCATGG(序列号58)、
OgraHNL-FW：ATGTTGTACTACGTTTCAATACTTT(序列号59)、
OgraHNL-RV：CTAATAGAAAGCAAAACAGCCATGG(序列号60)、
PfalHNL-FW：ATGACTTCGATCATTTTCCTCACG(序列号61)、
PfalHNL-RV：TTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGG(序列号62)、PlamHNL-FW：ATGACTTCGATCATTCTCCTCATGACTG(序列号63)、
PlamHNL-RV：GCTTAATTCAATTGCACTTTAATTTTTATATC(序列号64)、
Pton1HNL-FW：ATGACTTCAATCATTCTCCTCTTGG(序列号65)、Pton1HNL-RV：TTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGGTG(序列号66)、
RspHNL-FW：ATGACTTCGATCATGTTCAGCCTG(序列号67)、
RspHNL-RV：TTAGCTATAGAAGGGGCAGATAGGG(序列号68)
PtokHNL-FW：ATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(序列号107)
PtokHNL-RV：TTAGTAATAGAGGGGACAGAAAAGG(序列号108)
Pton2HNL-FW：ATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(序列号109)
Pton2HNL-RV：TTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGGTG(序列号110)
Pton3HNL-FW：ATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(序列号111)
Pton3HNL-RV：TTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGG(序列号112)
RssHNL-FW：ATGACTTCGATCATGCTCTGTTTAAC(序列号113)
RssHNL-RV：TTAGCTATAGAAGGGGCAGAAAGGG(序列号114)
各缩略语如下。
ChuaHNL：来自马陆的羟腈裂解酶
NttHNL：来自Nedyopus tambanus tambanus的羟腈裂解酶(序列号1)
NtmHNL：来自Nedyopus tambanus mangaesinus的羟腈裂解酶(序列号3)
OgraHNL：来自雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)的羟腈裂解酶(序列号5)
PfalHNL：来自Parafontaria falcifera的羟腈裂解酶(序列号7)
Pton1HNL：来自Parafontaria tonominea的羟腈裂解酶(序列号9)
PlamHNL：来自Parafontaria laminata的羟腈裂解酶(序列号11)
RspHNL：来自Riukiaria的1种的羟腈裂解酶(序列号13)
PtokHNL：来自P.tokaiensis的羟腈裂解酶(序列号83)
Pton2HNL：来自Parafontaria tonominea的羟腈裂解酶(序列号85)
Pton3HNL：来自Parafontaria tonominea的羟腈裂解酶(序列号87)
RssHNL：来自Riukiaria的羟腈裂解酶(序列号89)
将各氨基酸序列示于序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87和89。
将各基因的碱基序列示于序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88和90。将各氨基酸序列的同源性汇总于表1。通过该方法，明确了能够克隆编码与ChuaHNL具有41％以上同源性的来自千足虫的羟腈裂解酶的基因。
表1.来自千足虫的羟腈裂解酶间的同源性(％)
实施例4：ChuaHNL基因的克隆
从马陆(Chamberlinius hualienensis)通过实施例3所示的方法制备总RNA，合成cDNA。使用引物对编码ChuaHNL的区域进行扩增，并结合到pCR-blunt中。
引物序列：
ChuaHNL-FW：ggatccATGTTGAGTTCACTAGTAGTAACAGTAA(序列号69)、
ChuaHNL-RV：aagcttAGTAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTCG(序列号70)
实施例5：昆虫培养细胞中的羟腈裂解酶基因的表达
使用杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达上述的来自千足虫的羟腈裂解酶基因。插入物DNA以实施例2、3和4中得到的各质粒DNA为模板，使用各种引物和Tks Gflex DNA聚合酶通过PCR进行制备。
各种引物序列：
IFSf-NttHNL-FW：gggcgcggatccATGCTGTTTTACGTTTCGATTC(序列号71)，
IFSf-NttHNL-RV：acttctcgacaagcttTTAATAGAAAGCAAAACAACCATGG(序列号72)，
IFSf-NtmHNL-FW：catcgggcgcggatccATGCTGTTTTACGTTTCGATTCTTC(序列号73)，
IFSf-NtmHNL-RV：acttctcgacaagcttTCAATAGAAAGCAAAACAGCCATGG(序列号74)，
IFSf-OgraHNL-FW：catcgggcgcggatccATGTTGTACTACGTTTCAATAC(序列号75)，
IFSf-OgraHNL-RV：acttctcgacaagcttCTAATAGAAAGCAAAACAGCCATG(序列号76)，
IFSf-PfalHNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTTTCCTCACG(序列号77)，
IFSf-PfalHNL-RV：acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGG(序列号78)，
IFSf-Pton1HNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCAATCATTCTCCTCTTG(序列号79)，
IFSf-Pton1HNL-RV：acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGGTG(序列号80)，
IFSf-RspHNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATGTTCAGCCTG(序列号81)，
IFSf-RspHNL-RV：acttctcgacaagcttTTAGCTATAGAAGGGGCAGATAGGG(序列号82)
IFSf-PtokHNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(序列号115)
IFSf-PtokHNL-RV：acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGGGGACAGAAAAGG(序列号116)
IFSf-Pton2HNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(序列号117)
IFSf-Pton2HNL-RV：acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGGTG(序列号118)
IFSf-Pton3HNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(序列号119)
IFSf-Pton3HNL-RV：acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGG(序列号120)
IFSf-RssHNL-FW：catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATGCTCTGTTTA(序列号121)
IFSf-RssHNL-RV：acttctcgacaagcttttagcTATAGAAGGGGCAGAAAGGG(序列号122)
将插入物DNA用In-Fusion HD cloning kit(Takara Bio公司制)结合到pFastbac1载体(Invitrogen公司制)的BamHI-HindIII位点。此外，使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司制)，在各羟腈裂解酶的信号肽剪切部位正下方导入编码His标签的序列。其中，信号肽剪切部位使用SignalP(Nature Methods，8：785-786，2011)进行预测。然后，对插入物序列进行测序，确认没有因PCR导致的突变。将得到的各质粒导入大肠杆菌DH10BAC中，从转化体使用QIAGEN Plasmid Mini Kit(QIAGEN公司制)提取重组杆粒DNA。重组杆粒DNA使用X-tremeGENE 9DNA转染试剂(Roche公司制)转染至Sf9细胞。回收重组杆状病毒，再次感染Sf9细胞，由此对重组杆状病毒进行扩增，进一步感染Sf9细胞，由此对重组杆状病毒进行扩增。重组杆状病毒的滴度通过使用了ie1基因扩增引物(Biotechnol.Prog.，20：354-360，2004)的实时PCR、比较滴度已知的杆状病毒基因组DNA和样品来计算。其中，重组杆状病毒DNA使用NucleoSpin Virus(Takara公司制)制备。
来自各千足虫的HNL通过使各组重组杆状病毒以多重感染性1感染Sf9细胞(1.5×106细胞/mL)来分泌表达。重组杆状病毒感染72小时后通过离心分离除去细胞，回收培养上清液。用与培养上清液等量的20mM HEPES-NaOH(pH为8.0)进行稀释，添加到cOmpleteHistag Purification resin(Roche公司制)中。吸附于载体的各HNL用含有0.1M咪唑和0.1M NaCl的10mM HEPES-NaOH(pH为8.0)洗脱。将按照达到30％饱和浓度的方式在洗脱液中添加硫酸铵而成的溶液添加到HiTrap Butyl HP(GE Healthcare公司制)中，用硫酸铵的浓度梯度(30-0％)洗脱。脱盐后，使各HNL吸附于Resource Q，用NaCl的浓度梯度(0-300mM)洗脱。通过SDS-PAGE分析精制后的HNL的纯度。
蛋白浓度通过将来自胎牛血清的白蛋白作为标准，使用TaKaRa BCA ProteinAssay Kit(Takara公司制)进行测定。各羟腈裂解酶显示(R)-扁桃腈的合成活性。参照表2a。
实施例6：大肠杆菌中的来自千足虫的羟腈裂解酶基因的表达
尝试在大肠杆菌BL21(DE3)及Shuffle T7(New England Biolabs公司制)中表达ChuaHNL、NttHNL、NtmHNL、OgraHNL、PfalHNL、Pton1HNL，PlamHNL、RspHNL、PtokHNL、Pton2HNL、Pton3HNL、RssHNL基因。
为了将除去了信号序列的区域作为插入物DNA，将实施例3中得到的各质粒DNA作为模板，使用各种引物和Tks Gflex DNA聚合酶进行PCR。按照作为His标签融合蛋白进行表达的方式，使用In-Fusion HD cloning kit(Takara Bio公司制)将插入物DNA结合到pET28载体(Clontech公司制)的NdeI-HindIII位点。其中，PlamHNL结合到pET28载体的BamHI-HindIII位点。然后，对插入物序列进行测序，确认没有因PCR导致的突变。将得到的各质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)或Shuffle T7(New England Biolabs公司制)中。将转化体用含有卡那霉素的LB培养基在30℃下培养16小时后，种植到TB自动诱导培养基中，在26℃下培养24小时。集菌后，用超声波破碎，通过离心分离使不溶性物质沉淀，得到无细胞提取液。
羟腈裂解酶基因的表达通过扁桃腈的分解活性进行评价。即，向含有2mM的(R,S)-扁桃腈的0.1M柠檬酸缓冲液中添加无细胞提取液，以280nm检测苯甲醛的生成。
在大肠杆菌BL21(DE3)中没有发现任何羟腈裂解酶基因的表达。但是，在大肠杆菌Shuffle T7中，发现了NtmHNL、OgraHNL、Pton2HNL、Pton3HNL以及PlamHNL基因的表达(参照表2a)。
表2a
在后续的实施例7～13中，将表达的NtmHNL、OgraHNL、PlamHNL及Pton3HNL精制，弄清楚酶化学各性质。
实施例7：OgraHNL的精制
如下进行OgraHNL的精制。将通过实施例6的方法制备的无细胞提取液添加到HisTrap HP(GE Healthcare公司制)中。OgraHNL用咪唑的浓度梯度(20-500mM)洗脱。回收洗脱有OgraHNL的级分，添加到Resource Q(GE Healthcare公司制)中。OgraHNL用氯化钠的浓度梯度(0-300mM)洗脱。回收洗脱有OgraHNL的级分，使用Amicon Ultra-4离心式过滤器单元(Millipore公司制)进行浓缩。然后，添加到Superdex75 10/300GL(GE Healthcare公司制)中，用含有0.1M NaCl的10mM HEPES-NaOH(pH为8.0)洗脱。将精制工序汇总于表2b中。
精制的OgraHNL显示(R)-扁桃腈合成活性，其比活性为1779U/mg，与在昆虫培养细胞中表达的OgraHNL的比活性2225U/mg(参照表2a)基本一致。
表2b.OgraHNL的精制工序
实施例8：温度和pH对OgraHNL的影响
(a)最适温度和温度稳定性
研究了OgraHNL的最适温度和温度稳定性。酶反应在含有0.4U的OgraHNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为4.2)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl、各温度下进行5分钟。使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量，将测定结果示于图2-A。推定OgraHNL的最适温度为35℃。
通过在各温度下加热60分钟后，测定残余活性，研究温度稳定性。将结果示于图2-C。OgraHNL在65℃下加热1小时后也维持活性，在95℃下加热1小时后也具有18％的残余活性。已知的HNL中被报告为最稳定的ChuaHNL在65℃加热1小时后也维持100％的活性，在90℃下加热1小时后记载为失活(见Dadashipur等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.112,10605-10610(2015)，非专利文献1)。由此可知，OgraHNL具有比非专利文献1中记载的HNL更高的热稳定性。
(b)最适pH和pH稳定性
研究了OgraHNL的最适pH和pH稳定性。酶反应在含有0.4U的OgraHNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为2.5-5.5)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl中、各温度下进行5分钟。使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量。将测定结果示于图2-B。推定OgraHNL的最适pH为5.0。
通过在各缓冲液中、在25℃下孵育60分钟后，测定残余活性，研究pH稳定性。将测定结果示于图2-D。OgraHNL在pH3-10.5时稳定。但是，在Tris-HCl缓冲液中显示为不稳定。
实施例9：NtmHNL的精制
NtmHNL的精制如下进行。将通过实施例6的方法制备的无细胞提取液添加到HisTrap HP(GE Healthcare公司制)中。NtmHNL用咪唑的浓度梯度(20-500mM)洗脱。回收洗脱有NtmHNL的级分，添加到Resource Q(GE Healthcare公司制)中。NtmHNL用氯化钠的浓度梯度(0-300mM)洗脱。将精制工序汇总于表3。精制后的NtmHNL显示(R)-扁桃腈合成活性，其比活性为1016U/mg。
表3.NtmHNL的精制工序
实施例10：温度和pH对NtmHNL的影响
(a)最适温度和温度稳定性
研究了NtmHNL的最适温度和温度稳定性。酶反应在含有0.4U的NtmHNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为4.2)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl、各温度下进行5分钟。使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量，将测定结果示于图3-A。推定NtmHNL的最适温度为30℃。
(b)最适pH值
研究了NtmHNL的最适pH和pH稳定性。酶反应在含有0.4U的NtmHNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为2.5-5.5)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl、各温度下进行5分钟。使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量，将测定结果示于图3-B。推定NtmHNL的最适pH为4.8。
实施例11：PlamHNL的精制
PlamHNL的精制如下进行。将通过实施例6的方法制备的无细胞提取液添加到NiSepharose 6FastFlow(GE Healthcare公司制)中。PlamHNL用含有100mM咪唑、500mM氯化钠的20mM KPB(pH为8.0)洗脱。精制后的PlamHNL(R)-扁桃腈合成活性，其比活性为1156U/mg。
实施例12：来自重组大肠杆菌的Pton3HNL的精制
Pton3HNL的精制如下进行。将通过实施例6的方法制备的无细胞提取液供于HisTrap HP(GE Healthcare公司制)，用咪唑的浓度梯度(20-500mM)洗脱。回收洗脱有Pton3HNL的级分后，供于Resource Q(GE Healthcare公司制)，用氯化钠的浓度梯度(0-300mM)洗脱。回收洗脱有Pton3HNL的级分，作为精制酶使用。
精制后的Pton3HNL显示(R)-扁桃腈合成活性，其比活性为2140U/mg。
实施例13：温度和pH对Pton3HNL的影响
(a)最适温度和温度稳定性
研究了Pton3HNL的最适温度和温度稳定性。酶反应在含有0.4U的Pton3HNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为4.2)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl、各温度下进行5分钟。使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量，将测定结果示于图11a。推定Pton3HNL的最适温度为30℃。
通过在各温度下加热60分钟后，测定残余活性，研究温度稳定性。将结果示于图11c。Pton3HNL在60℃加热1小时后也维持活性，在95℃加热1小时后也具有18％的残余活性。
(b)最适pH和pH稳定性
研究了Pton3HNL的最适pH和pH稳定性。酶反应在含有0.4U的Pton3HNL、300mM柠檬酸缓冲液(pH为2.5-5.5)、50mM苯甲醛、100mM KCN的反应液200μl、各温度下进行5分钟。使用HPLC对(R)-扁桃腈进行定量。将测定结果示于图11b。推定Pton3HNL的最适pH为4.5。
在各缓冲液中在25℃下孵育60分钟后，通过测定残余活性，研究pH稳定性。将测定结果示于图11d。Pton3HNL在pH为3-10.5下稳定。
实施例14
使用重组大肠杆菌的(R)-扁桃腈的生产
使用表达Pton3HNL的E.coli Shuffle通过水溶液中的全菌体反应进行光学活性氰醇合成。从培养液0.8mL集菌后，悬浮于150μl的0.4M柠檬酸缓冲液(pH为3.0)中，加入10μl的1M苯甲醛、20μl的1M KCN，在22℃下孵育5分钟。反应产物在提取后如上所述通过HPLC进行分析，弄清楚镜像体过剩率(ee)，其结果如图12所示，镜像体过剩率(ee)达到97.6％。
使pH在2.5～5.0的范围内变化，将其结果示于图12a，将菌体的浓度变化为2倍(2x)、4倍(4x)、6倍(6x)，将其结果示于图12b。
产业上的可利用性
由于光学活性氰醇为医药、精细化工制造中的重要中间体，因此本发明在医药、精细化工制造相关的领域中是有用的。
序列表自由文本
序列号1：NttHNL蛋白
序列号2：NttHNL基因
序列号3：NtmHNL蛋白
序列号4：NtmHNL基因
序列号5：OgraHNL蛋白
序列号6：OgraHNL基因
序列号7：PfalHNL蛋白
序列号8：PfalHNL基因
序列号9：Pton1HNL蛋白
序列号10：Pton1HNL基因
序列号11：PlamHNL蛋白
序列号12：PlamHNL基因
序列号13：RspHNL蛋白
序列号14：RspHNL基因
序列号15：来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列
序列号16：来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列
序列号17：来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列
序列号18：来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列
序列号19：来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列
序列号20：来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列
序列号21：缩聚引物HNL-FW
序列号22：缩聚引物HNL-RV
序列号23：缩聚引物HNL-FW2
序列号24：缩聚引物HNL-RV2
序列号25～82：引物
序列号83：PtokHNL蛋白
序列号84：PtokHNL基因
序列号85：Pton2HNL蛋白
序列号86：Pton2HNL基因
序列号87：Pton3HNL蛋白
序列号88：Pton3HNL基因
序列号89：RssHNL蛋白
序列号90：RssHNL基因
序列号91～122：引物

Claims (19)

1.一种方法，其为来自千足虫的羟腈裂解酶即HNL基因的制造方法，其包含：
从属于倍足纲的生物中存在的基因中，选择具有编码来自千足虫的HNL的保守氨基酸序列TAX1DIX2G(序列号15)的碱基序列和编码VPNGDKIH(序列号16)的碱基序列中的至少一种的基因，其中，X1为L或F，X2为R或K。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因的选择通过将属于倍足纲的生物中存在的基因作为模板，使用由编码所述保守氨基酸序列的碱基序列构成的至少1个DNA作为引物进行PCR来实施。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因的选择通过将属于倍足纲的生物中存在的基因作为模板，使用由编码所述保守氨基酸序列的碱基序列构成的DNA作为探针，进行DNA-DNA杂交来实施。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述基因的选择通过对属于倍足纲的生物中存在的基因进行测序，从被测序的基因序列中选择具有编码所述保守氨基酸序列的碱基序列的基因来实施。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，属于倍足纲的生物中存在的基因是从属于倍足纲的生物中提取的基因组DNA或由属于倍足纲的生物中提取的RNA通过逆转录而得到的cDNA。
6.根据权利要求2所述的方法，其中，所述引物为下述的缩聚引物HNL-FW和HNL-RV、或HNL-FW2及HNL-RV2，
HNL-FW：CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(序列号21)、
HNL-RV：ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(序列号22)、
HNL-FW2：SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG(序列号23)、
HNL-RV2：ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC(序列号24)。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，属于倍足纲的生物为Nedyopustambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、或Riukiaria。
8.一种方法，其为来自千足虫的HNL的制造方法，其包含：
通过权利要求1～7中任一项所述的方法制备来自千足虫的HNL基因，使得到的HNL基因在宿主细胞内表达，得到HNL。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述宿主细胞为昆虫培养细胞。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述宿主细胞为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
11.一种基因，其具有下述(4)～(6)中的任一个碱基序列，
(4)具有序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列，且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列；
(5)具有在序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列中具有1～50个碱基的缺失、替换和/或附加的碱基序列，且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列；或者
(6)具有与序列表的序列号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88或90中记载的碱基序列在严格条件下杂交的碱基序列，且编码具有HNL活性的蛋白的碱基序列。
12.一种质粒，其在载体中包含权利要求11所述的基因。
13.一种转化体，其是由可表达地含有质粒的宿主形成的转化体，所述质粒在载体中包含权利要求11所述的基因，其中，所述宿主为昆虫培养细胞或具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌。
14.一种方法，其为来自千足虫的HNL的制造方法，其包含：
对权利要求13所述的转化体进行培养，从培养物中分离HNL。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，宿主为昆虫培养细胞，HNL基因为来自Nedyopustambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)、Parafontaria falcifera、Parafontaria laminata、Parafontaria tonominea、或Riukiaria的HNL基因。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，宿主为具有二硫键异构酶表达能力的大肠杆菌，HNL基因是来自Nedyopus tambanus mangaesinus、雅丽酸带马陆(Oxidus gracilis)或Parafontaria laminata的HNL的基因。
17.一种蛋白，其具有下述(1)～(3)中的任一个氨基酸序列且具有HNL活性，
(1)序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列中具有1～50个氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者
(3)与序列表的序列号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87或89中记载的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的蛋白，其具有下述(1)～(3)中任一个氨基酸序列，且具有HNL活性。
(1)序列表的序列号85或87中记载的氨基酸序列；
(2)在序列表的序列号85或87中记载的氨基酸序列中具有1～50个氨基酸的缺失、替换和/或附加的氨基酸序列；或者
(3)与序列号85或87所述的氨基酸序列具有90％以上的同源性的氨基酸序列。
19.一种光学活性氰醇的制造方法，其包含：
使来自千足虫的HNL作用于反应溶剂，制备光学活性氰醇，所述反应溶剂含有醛或酮、和氰化氢或在反应体系中生成氰化物离子的物质，其中，所述来自千足虫的HNL为权利要求17或18所述的蛋白，或权利要求13所述的转化体。
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