JP6893361B2 - ヒドロキシニトリルリアーゼ - Google Patents
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Description
関連出願の相互参照
本出願は、2016年3月1日出願の日本特願2016−038640号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
特許文献2:日本特開2015−167477号公報
本発明者らは、ヤスデ由来HNL遺伝子間で保存された配列から、特定の配列の縮重プライマーを用いることで、様々なヤスデからHNL遺伝子をクローニングすることができることを見出し、この方法により、様々なヤスデからHNL遺伝子及びHNLを得た。さらに、昆虫培養細胞及び特定の大腸菌を用いることで、新たに見出されたHNL遺伝子を発現させ、HNLを製造し得ることを見出した。加えて、発現させたHNLを用いて、光学活性シアノヒドリンを製造できることを見出して、本発明を完成した。
[1]
ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(以下、HNL)遺伝子の製造方法であって、
ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列TAX1DIX2G(配列番号15)(但し、X1はL又はFであり、X2はR又はKである)をコードする塩基配列およびVPNGDKIH(配列番号16)をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含む方法。
[2]
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも1つのDNAをプライマーとして用いてPCRを行うことにより実施される、[1]に記載の方法。
[3]
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAをプローブとして用いて、DNA−DNAハイブリダイゼーションを行うことにより実施される、[1]に記載の方法。
[4]
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行い、シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択することにより実施される、[1]に記載の方法。
[5]
ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子が、ヤスデ網に属する生物より抽出したゲノムDNA、又は、ヤスデ網に属する生物より抽出したRNAより逆転写で得られるcDNAである[1]〜[4]のいずれか1項に記載の方法。
[6]
前記プライマーが、下記の縮重プライマーHNL−FW及びHNL−RVである[2]に記載の方法。
HNL−FW:CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(配列番号21)、
HNL−RV:ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(配列番号22)
HNL−FW2:SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG(配列番号23)
HNL−RV2:ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC(配列番号24)
[7]
ヤスデ網に属する生物が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデである[1]〜[6]のいずれか1項に記載の方法。
[8]
ヤスデ由来HNLの製造方法であって、
[1]〜[7]のいずれか1項に記載の方法でヤスデ由来HNL遺伝子を調製し、
得られたHNLの遺伝子を、宿主細胞内で発現させて、HNLを得ることを含む前記方法。
[9]
前記宿主細胞が、
昆虫培養細胞である[8]に記載の方法。
[10]
前記宿主細胞が、
ジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、[8]に記載の方法。
[11]
下記(4)〜(6)の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
(4)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(5)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列において1から50個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;又は
(6)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
[12]
[11]に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
[13]
[11]に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む宿主からなる形質転換体であって、前記宿主は、昆虫培養細胞、又はジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、形質転換体。
[14]
ヤスデ由来HNLの製造方法であって、
[13]に記載の形質転換体を培養し、培養物からHNLを分離することを含む、HNLの製造方法。
[15]
宿主が昆虫培養細胞であり、HNL遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデ由来HNL遺伝子である、[14]に記載の方法。
[16]
宿主がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌であり、HNL遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデまたはキシャヤスデ由来HNLの遺伝子である、[14]に記載の前記方法。
[17]
下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつHNL活性を有するタンパク質。
(1)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[18]
下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつHNL活性を有する[17]に記載のタンパク質。
(1)配列表の配列番号85又は87に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号85又は87に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号85又は87に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
[19]
アルデヒドまたはケトンとシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質とを含む反応溶媒にヤスデ由来HNLを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法であって、
前記ヤスデ由来HNLが、[17]若しくは[18]に記載のタンパク質であるか、または[13]に記載の形質転換体である、前記方法。
本発明は、ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(HNL)遺伝子の製造方法に関する。
この方法は、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列TAX1DIX2G(配列番号15)(但し、X1はL又はFであり、X2はR又はKである)をコードする塩基配列およびVPNGDKIH(配列番号16)をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含む方法である。
配列番号15のヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列は、TAX1DIX2Gであり、X1はL又はFであり、X2はR又はKである。X1およびX2の組合せは4通りある。具体的には、以下の4つである。
TALDIRG(配列番号17)
TALDIKG(配列番号18)
TAFDIRG(配列番号19)
TAFDIKG(配列番号20)
配列番号16のヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列は、VPNGDKIHである。
(1)前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも1つのDNAをプライマーとして用いてPCRを行うことにより実施される方法。
(2)前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAをプローブとして用いて、DNA−DNAハイブリダイゼーションを行うことにより実施される方法。
(3)前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行い、シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択することにより実施される方法。
鋳型として用いるヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子は上記のように抽出したゲノムDNAまたはcDNAであることができ、好ましくはcDNAであり、これらのDNAを鋳型とし、前記配列番号15および16で示される保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも1つのDNAをプライマーとして用いてPCRを行う。プライマーの塩基配列は、配列番号15および16で示される保存アミノ酸配列をコードするものであれば、制限はないが、例えば、下記の縮重プライマーHNL-FW及びHNL-RV、並びにHNL−FW2及びHNL−RV2を挙げることができる。これら縮重プライマーを用いてPCRを行い、前記生物由来のHNL遺伝子を増幅することができる。
HNL−RV:ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(配列番号22)
HNL−FW2:SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG(配列番号23)
HNL−RV2:ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC(配列番号24)
鋳型として用いるヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子は上記のように抽出したゲノムDNAまたはcDNAであることができ、好ましくは抽出したゲノムDNAであり、これらのDNAを鋳型とし、前記配列番号15および16で示される保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも1つのDNAをプローブとして用いて、DNA−DNAハイブリダイゼーションを行う。DNA−DNAハイブリダイゼーションは、公知の方法を適宜利用できる。プローブの塩基配列は、配列番号15および16で示される保存アミノ酸配列をコードするものであれば、制限はないが、例えば、前記の縮重プライマーHNL-FW及びHNL-RVと同様の塩基配列又はこれら塩基配列の一部を含む塩基配列であることができる。これらプローブを用いてDNA−DNAハイブリダイゼーションを行い、前記生物由来のHNL遺伝子を得る。DNA−DNAハイブリダイゼーションで得られたHNL遺伝子は、PCRなど公知の増幅方法で適宜増幅することができる。
ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行う。シーケンシングを行う対象は、上記のように抽出したゲノムDNAまたはcDNAであることができる。シーケンシングの方法は公知の方法を適宜利用することができる。シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択する。
実施例では、オビヤスデ目ヤケヤスデ科に属すウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、オビヤスデ目ババヤスデ科に属すヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、及びアマビコヤスデのHNL遺伝子をクローニングすることができたことを示す。
本発明は、下記(4)〜(6)の何れかの塩基配列を有する遺伝子に関する。
(4)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;
(5)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列において1から50個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;又は
(6)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
本発明は、ヤスデ由来HNLの製造方法を包含する。
ヤスデ由来HNLの製造方法(1)は、上記本発明の方法でヤスデ由来HNL遺伝子を調製し、得られたHNLの遺伝子を、昆虫培養細胞を宿主として用いて発現させて、HNLを得ることを含む方法である。
本発明は、下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつHNL活性を有するタンパク質に関する。
(1)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列において1から50個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列
本発明は、光学活性シアノヒドリンの製造方法を包含する。
この方法は、アルデヒドまたはケトンとシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質とを含む反応溶媒にヤスデ由来HNLを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製することを含む。
式(I) において、R1 とR2 は、(i)水素原子、(ii)置換または非置換の炭素数1〜18の線状または分枝鎖状の飽和アルキル基、または(iii) 置換または非置換の環員が5〜22の芳香族基である。ただし、R1 とR2 は同時に水素原子を表すことはない。上記(ii)で、R1 とR2 が置換アルキル基の場合、置換基は、1個またはそれ以上のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、炭素数1〜8のアルコキシ基、ハロゲン、カルボキシル基、炭素数3〜20のシクロアルキル基、または N 、O、Sのヘテロ原子で置換されていてもよい炭素数22までの芳香属基である(ここで、置換基が環状置換基の場合は、それ自体が1個またはそれ以上のハロゲン、ヒドロキシ基、炭素数1〜8の線状若しくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数2〜8の線状若しくは分枝鎖状のアルケニル基で置換されていてもよい。)。上記(iii) で、芳香族基は、環員の4個までがN、Oおよび/またはSによって置換されているヘテロ芳香族基であってもよい。また、R1 とR2 が置換芳香族基の場合、置換基は、1個またはそれ以上のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、炭素数1〜8のアルコキシ基、アリルオキシ基、ハロゲン、カルボキシル基、炭素数22までの線状若しくは分枝鎖状の飽和若しくは不飽和のアルキル基である(ここで、一つの芳香族基が少なくとも2個の置換基により置換されてもよい)。
難溶または不溶である有機溶媒を主成分としてなる反応溶媒を用いることが好ましい。かかる有機溶媒としては、酵素反応による光学活性シアノヒドリンの合成反応に影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができ、合成反応に用いる原料のアルデヒドまたはケト
ンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。具体的には、ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和炭化水素系溶媒、例えば、ペンタン、ヘキサン、トルエン、キシレン、塩化メ
チレンなど;ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和アルコール系溶媒、例えば、イソプルピルアルコール、n−ブタノール、イソブタノール、t−ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、n−アミルアルコールなど;ハロゲン化されていてもよい脂肪族また
は芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和エーテル系溶媒、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソピルエーテル、ジブチルエーテル、メチル−t−ブチルエーテルなど;ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝
状または環状の飽和または不飽和エステル系溶媒、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどが挙げられ、これらを単独で用いても、また複数を混合して用いてもよい。また、これらの有機溶媒は、pH7 以下の水系緩衝液、例えばク
エン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などで飽和させてもよい。
整する。反応温度は酵素反応によらないラセミシアノヒドリンの副生を抑制するために、酵素活性が発揮される範囲でできる限り低いほうが好ましく、通常0〜50℃、好ましくは10〜45℃とする。
は、蒸留分離、カラムクロマトグラフィー分離、抽出分離など通常用いられる手段で行いうる。このとき、脱水剤などを添加して脱水処理をしたり、安定剤などを添加してもよい。
0.4UのHNL、300mM クエン酸緩衝液(pH4〜5)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、30〜35℃の温度で5分間行い、HPLCを用いて(R)-マンデロニトリルを定量する。
タンバアカヤスデ、Nedyopus tambanus tambanus(Attems)を富山県立大学内で採集した。ヤスデから粗酵素液を抽出し、以下のようにNttHNLの精製を行った。
タンバアカヤスデからTRIzol(インビトロジェン社製)を使用してtotal RNAを抽出し、Gene Racer Kit(インビトロジェン社製)を用いてcDNAを合成した。NttHNLのN末端アミノ酸配列と内部配列から縮重プライマーを設計し、NttHNLをコードするcDNAの部分配列をPCRにより増幅した。
縮重プライマー配列:
NttHNL−F:GARGARCCNHTNACNTGYGATAA(配列番号25)、
NttHNL−R:TTYTCNACNGCYTGNGTCTG(配列番号26)
プライマー配列:
NttHNL−F1:GTTCCAGTTCCTCCGTTAGAAGATTTT(配列番号27)、
NttHNL−F2:CCCAGGCTGCAACTGCATTGGACATT(配列番号28)、
NttHNL−R1:CTCTGCAATTGCAGAACCATTGCACGTA(配列番号29)、
NttHNL−R1:CCATTTGGGGTGTTCAAATTAGTATATT(配列番号30)
ジーンスペシフィックプライマー配列:
NttHNL−FW:ATGCTGTTTTACGTTTCGATTCTTCTAG(配列番号31)、
NttHNL−RV:TTAATAGAAAGCAAAACAACCATGGTG(配列番号32)
ウマガエシアカヤスデ(N. tambanus mangaesinus (Attems))、ヤケヤスデ(Oxidus gracilis (C. L. Koch))、ヘラババヤスデ(Parafontaria falcifera (Verhoeff))、キシャヤスデ(P. laminata (Attems))、ミドリババヤスデ(P. tonominea Attems)、アマビコヤスデの1種(Riukiaria sp.)、それぞれ1個体から、前述の方法でtotal RNAを調製し、Gene Racer KitまたはSMART RACE cDNA Amplification Kit(クロンテック社製)を用いてcDNAを合成した。ChuaHNLとNttHNLの相同配列から設計した縮重プライマーを用いてPCRを行うことで、各ヤスデ由来HNL遺伝子の部分配列を増幅した。
縮重プライマー配列:
HNL−FW:CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(配列番号17)、
HNL−RV:ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(配列番号18)
プライマー配列:
NtmHNL−F1:TGGTGGACCTAATAACTCCGCCATA(配列番号33)、
NtmHNL−F2:CCCAGATGGAAGTTCATATTGCGCTTA(配列番号34)、
NtmHNL−R1:GAGTGGGTCGGTTCCATTGTTATTAT(配列番号35)、
NtmHNL−R2:GCCATTGCACGTATAAGCGCAATAT(配列番号36)、
OgraHNL−F1:CGTTGGTGGTCCTAATAATTCAGCTAT(配列番号37)、
OgraHNL−F2:CACCAATCTGAACACTCCAAATGGAA、(配列番号38)
OgraHNL−R1:GGATCGGTTCCGTTGTTGTTATTA(配列番号39)、
OgraHNL−R2:CGTATAGGCGCAATAGGAGCTTCCATT(配列番号40)、
PfalHNL−F1:GACTTCACCATTGGTTCTGATTCTAT(配列番号41)、
PfalHNL−F2:CCCCAAGGTGCCAACTATTGTGCATA(配列番号42)、
PfalHNL−R1:CAGCCTGACGTTGTGTAGCTGATATGT(配列番号43)、
PfalHNL−R2:CGGGACCATTGCAAGAGTATGCACAAT(配列番号44)、
PlamHNL−F1:ATTCAAGGAACTCACATAACAATAAATGACTTC(配列番号45)、
PlamHNL−F2:ATGAATCTTGTCACCGTTTGGAACTGATCG(配列番号46)、
PlamHNL−R1:GAGTTGTTTAGGCGATATGTATCCAGTATTC(配列番号47)、
PlamHNL−R2:GAGTTGTTTAGGCGATATGTATCCAGTATTC(配列番号48)、
Pton1HNL−F1:GGTCCCGATGCTATGACGGCCTATTT(配列番号49)、
Pton1HNL−F2:GGTGCCAACTATTGTGCATACTTTT(配列番号50)、
Pton1HNL−R1:GCCTGGAGTTGTTGAGGCGATATGTA(配列番号51)、
Pton1HNL−R2:GGGACCATTGCAAAAGTATGCACAATA(配列番号52)、
RspHNL−F1:CCGGGGCAAAACAGGTTTGGTA(配列番号53)、
RspHNL−F2:GGGTGCCAACTATTGCGCATACTCTT(配列番号54)、
RspHNL−R1:GCCAGTATTGGAAGTGCATTTGTATT(配列番号55)、
RspHNL−R2:CAGGGGATCATCGAGGTCGACATATT(配列番号56)
PtokHNL−F1:GGACAGCCTTTTCGACTAATTGTGAT(配列番号91)
PtokHNL−F2:CCCAAGGTGCCAACTACTGTGCATA(配列番号92)
PtokHNL−R1:GCCTGGAGTTGTTGAGGCGATATGTAT(配列番号93)
PtokHNL−R2:GCAAGAGTAGCCTATGCACAGTAGTTG(配列番号94)
Pton2HNL−F1:CCGATGGTCTGACAGCCTATTTGACTA(配列番号95)
Pton2HNL−F2:CCCCAAGGTGCCAACTACTGTGCATA(配列番号96)
Pton2HNL−R1:GGCGATATGTATCCAGTATTCGTAGTGCA(配列番号97)
Pton2HNL−R2:CGGGACCATTGCAAGAGTATGCACAGT(配列番号98)
Pton3HNL−F1:CTGACAGCCTATTTGACTAATTGTGAT(配列番号99)
Pton3HNL−F2:GCATACTCTTGCAATGGTTCCGAAA(配列番号100)
Pton3HNL−R1:GCCTGGAGTTGTTGAGGCGATATGTAT(配列番号101)
Pton3HNL−R2:CGGAACCATTGCAAGAGTATGCACA(配列番号102)
RssHNL−F1:GACTTCCTCATCGCTCCTGATTGTAT(配列番号103)
RssHNL−F2:CGTCGAGGATCCCAAGGGTGCCAA(配列番号104)
RssHNL−R1:GCCAGCTATATTGGAAGTGCATTT(配列番号105)
RssHNL−R2:CCATCGCAAGAGTATGCGCAATAGTT(配列番号106)
ジーンスペシフィックプライマー配列:
NtmHNL−FW:ATGCTGTTTTACGTCTCGATTCTTC(配列番号57)、
NtmHNL−RV:TCAATAGAAAGCAAAACAGCCATGG(配列番号58)、
OgraHNL−FW:ATGTTGTACTACGTTTCAATACTTT(配列番号59)、
OgraHNL−RV:CTAATAGAAAGCAAAACAGCCATGG(配列番号60)、
PfalHNL−FW:ATGACTTCGATCATTTTCCTCACG(配列番号61)、
PfalHNL−RV:TTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGG(配列番号62)、
PlamHNL−FW:ATGACTTCGATCATTCTCCTCATGACTG(配列番号63)、
PlamHNL−RV:GCTTAATTCAATTGCACTTTAATTTTTATATC(配列番号64)、
Pton1HNL−FW:ATGACTTCAATCATTCTCCTCTTGG(配列番号65)、
Pton1HNL−RV:TTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGGTG(配列番号66)、
RspHNL−FW:ATGACTTCGATCATGTTCAGCCTG(配列番号67)、
RspHNL−RV:TTAGCTATAGAAGGGGCAGATAGGG(配列番号68)
PtokHNL−FW:ATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(配列番号107)
PtokHNL−RV:TTAGTAATAGAGGGGACAGAAAAGG(配列番号108)
Pton2HNL−FW:ATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(配列番号109)
Pton2HNL−RV:TTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGGTG(配列番号110)
Pton3HNL−FW:ATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(配列番号111)
Pton3HNL−RV:TTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGG(配列番号112)
RssHNL−FW:ATGACTTCGATCATGCTCTGTTTAAC(配列番号113)
RssHNL−RV:TTAGCTATAGAAGGGGCAGAAAGGG(配列番号114)
ChuaHNL:ヤンバルトサカヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ
NttHNL:タンバアカヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号1)
NtmHNL:ウマガエシアカヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号3)
OgraHNL:ヤケヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号5)
PfalHNL:ヘラババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号7)
Pton1HNL:ミドリババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号9)
PlamHNL:キシャヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号11)
RspHNL:アマビコヤスデの1種由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号13)
PtokHNL:P. tokaiensis由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号83)
Pton2HNL:ミドリババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号85)
Pton3HNL:ミドリババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号87)
RssHNL:アマビコヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(配列番号89)
それぞれの遺伝子の塩基配列を配列番号2、4、6、8、10、12、1484、86、88、及び90に示す。それぞれのアミノ酸配列の相同性を表1にまとめた。この方法で、ChuaHNLと、41%以上の相同性を有するヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子をクローニングできることが明らかとなった。
ヤンバルトサカヤスデから実施例3に示した方法でtotal RNAを調製し、cDNAを合成した。プライマーを用いてChuaHNLをコードする領域を増幅し、pCR−bluntへつなぎこんだ。
プライマー配列:
ChuaHNL−FW:ggatccATGTTGAGTTCACTAGTAGTAACAGTAA(配列番号69)、
ChuaHNL−RV:aagcttAGTAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTCG(配列番号70)
上記のヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をバキュロウイルス−昆虫細胞発現系を用いて発現した。インサートDNAは実施例2,3および4で得た各プラスミドDNAを鋳型とし、各種プライマーとTks Gflex DNA polymerase を用いてPCRにより調製した。
IFSf−NttHNL−FW:gggcgcggatccATGCTGTTTTACGTTTCGATTC(配列番号71),
IFSf−NttHNL−RV:acttctcgacaagcttTTAATAGAAAGCAAAACAACCATGG(配列番号72),
IFSf−NtmHNL−FW:catcgggcgcggatccATGCTGTTTTACGTTTCGATTCTTC(配列番号73),
IFSf−NtmHNL−RV:acttctcgacaagcttTCAATAGAAAGCAAAACAGCCATGG(配列番号74),
IFSf−OgraHNL−FW:catcgggcgcggatccATGTTGTACTACGTTTCAATAC(配列番号75),
IFSf−OgraHNL−RV:acttctcgacaagcttCTAATAGAAAGCAAAACAGCCATG(配列番号76),
IFSf−PfalHNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTTTCCTCACG(配列番号77),
IFSf−PfalHNL−RV:acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGG(配列番号78),
IFSf−Pton1HNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCAATCATTCTCCTCTTG(配列番号79),
IFSf−Pton1HNL−RV:acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGAAAGGGTG(配列番号80),
IFSf−RspHNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATGTTCAGCCTG(配列番号81),
IFSf−RspHNL−RV:acttctcgacaagcttTTAGCTATAGAAGGGGCAGATAGGG(配列番号82)
IFSf−PtokHNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(配列番号115)
IFSf−PtokHNL−RV:acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGGGGACAGAAAAGG(配列番号116)
IFSf−Pton2HNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(配列番号117)
IFSf−Pton2HNL−RV:acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGGTG(配列番号118)
IFSf−Pton3HNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATTCTCCTCACG(配列番号119)
IFSf−Pton3HNL−RV:acttctcgacaagcttTTAGTAATAGAGAGGACAGTAAAGG(配列番号120)
IFSf−RssHNL−FW:catcgggcgcggatccATGACTTCGATCATGCTCTGTTTA(配列番号121)
IFSf−RssHNL−RV:acttctcgacaagcttttagcTATAGAAGGGGCAGAAAGGG(配列番号122)
大腸菌BL21(DE3)及びSHuffle T7(ニューイングランドバイオラボ社製)における、ChuaHNL、NttHNL、NtmHNL、OgraHNL、PfalHNL、Pton1HNL、PlamHNL、RspHNL、PtokHNL、Pton2HNL、Pton3HNL、RssHNL遺伝子発現を試みた。
OgraHNLの精製は以下のように行った。実施例6の方法で調製した無細胞抽出液をHisTrap HP(GEヘルスケア社製)に添加した。OgraHNLはイミダゾールの濃度勾配(20-500mM)で溶出した。OgraHNLが溶出されたフラクションを回収し、ResourceQ(GEヘルスケア社製)に添加した。OgraHNLは塩化ナトリウムの濃度勾配(0-300mM)で溶出した。OgraHNLが溶出されたフラクションを回収し、アミコンウルトラ-4 遠心式フィルターユニット(ミリポア社製)を用いて濃縮した。その後、Superdex75 10/300 GL(GEヘルスケア社製)に添加し、0.1M NaClを含む10mM HEPES-NaOH(pH8.0)で溶出した。精製工程を表2bにまとめた。
(a)至適温度と温度安定性
OgraHNLの至適温度と温度安定性を検討した。酵素反応は、0.4UのOgraHNL、300mM クエン酸緩衝液(pH4.2)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、各温度で、5分間行った。HPLCを用いて(R)−マンデロニトリルを定量し、測定結果を図2−Aに示した。OgraHNLの至適温度は35℃と推定された。
OgraHNLの至適pHとpH安定性を検討した。酵素反応は、0.4UのOgraHNL、300mM クエン酸緩衝液(pH2.5−5.5)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、各温度で、5分間行った。HPLCを用いて(R)−マンデロニトリルを定量した。測定結果を図2−Bに示した。OgraHNLの至適pHは5.0と推定された。
各緩衝液中で25℃、60分間インキュベート後、残存活性を測定することで、pH安定性を検討した。測定結果を図2−Dに示した。OgraHNLはpH3-10.5で安定であった。しかし、Tris−HCl緩衝液中では、不安定であることが示された。
NtmHNLの精製は以下のように行った。実施例6の方法で調製した無細胞抽出液をHisTrap HP(GEヘルスケア社製)に添加した。NtmHNLはイミダゾールの濃度勾配(20−500mM)で溶出した。NtmHNLが溶出されたフラクションを回収し、ResourceQ(GEヘルスケア社製)に添加した。NtmHNLは塩化ナトリウムの濃度勾配(0−300mM)で溶出した。精製工程を表3にまとめた。精製したNtmHNLは(R)−マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性は、1016U/mgであった。
(a)至適温度と温度安定性
NtmHNLの至適温度と温度安定性を検討した。酵素反応は、0.4UのNtmHNL、300mM クエン酸緩衝液(pH4.2)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、各温度で、5分間行った。HPLCを用いて(R)−マンデロニトリルを定量し、測定結果を図3−Aに示した。NtmHNLの至適温度は30℃と推定された。
NtmHNLの至適pHとpH安定性を検討した。酵素反応は、0.4UのNtmHNL、300mM クエン酸緩衝液(pH2.5−5.5)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、各温度で、5分間行った。HPLCを用いて(R)−マンデロニトリルを定量し、測定結果を図3−Bに示した。NtmHNLの至適pHは4.8と推定された。
PlamHNLの精製は以下のように行った。実施例6の方法で調製した無細胞抽出液をNi Sepharose 6 FastFlow(GEヘルスケア社製)に添加した。PlamHNLは100mM イミダゾール、500mM 塩化ナトリウムを含む20mM KPB(pH8.0)で溶出した。精製したPlamHNLは(R)−マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性は1156U/mgであった。
Pton3HNLの精製は以下のように行った。実施例6の方法で調製した無細胞抽出液をHisTrap HP(GEヘルスケア社製)に供し、イミダゾールの濃度勾配(20-500mM)で溶出した。Pton3HNLが溶出されたフラクションを回収後、ResourceQ(GEヘルスケア社製)に供し、塩化ナトリウムの濃度勾配(0-300mM)で溶出した。Pton3HNLが溶出されたフラクションを回収し、精製酵素として使用した。
(a)至適温度と温度安定性
Pton3HNLの至適温度と温度安定性を検討した。酵素反応は、0.4UのPton3HNL、300mM クエン酸緩衝液(pH4.2)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、各温度で、5分間行った。HPLCを用いて(R)−マンデロニトリルを定量し、測定結果を図11aに示した。Pton3HNLの至適温度は30℃と推定された。
Pton3HNLの至適pHとpH安定性を検討した。酵素反応は、0.4UのPton3HNL、300mM クエン酸緩衝液(pH2.5−5.5)、50mM ベンズアルデヒド、100mM KCNを含む反応液200μl、各温度で、5分間行った。HPLCを用いて(R)−マンデロニトリルを定量した。測定結果を図11bに示した。Pton3HNLの至適pHは4.5と推定された。
各緩衝液中で25℃、60分間インキュベート後、残存活性を測定することで、pH安定性を検討した。測定結果を図11dに示した。Pton3HNLはpH3-10.5で安定であった。
組換え大腸菌体を用いた(R)-mandelonitrileの生産
Pton3HNLを発現させたE.coli Shuffleを用いて水溶液中での全菌体反応による光学活性シアノヒドリン合成を行った。培養液0.8 mLから集菌後、150μLの0.4 Mクエン酸緩衝液 (pH3.0)に懸濁し10 μLの1 M ベンズアルデヒド、20 μLの1 M KCNを加えて22℃で5分インキュベートした。反応産物は、抽出後、上記の通りHPLCにて分析を行い、鏡像体過剰率(ee)を明らかにした結果、図12の通り、鏡像体過剰率(ee)は、97.6%に達した。
pHを2.5〜5.0の範囲で変化させた結果を図12aに示し、菌体の濃度を2倍(2x)、4倍(4x)、6倍(6x)を変化させた結果を図12bに示す。
配列番号2:NttHNL遺伝子
配列番号3:NtmHNLタンパク質
配列番号4:NtmHNL遺伝子
配列番号5:OgraHNLタンパク質
配列番号6:OgraHNL遺伝子
配列番号7:PfalHNLタンパク質
配列番号8:PfalHNL遺伝子
配列番号9:Pton1HNLタンパク質
配列番号10:Pton1HNL遺伝子
配列番号11:PlamHNLタンパク質
配列番号12:PlamHNL遺伝子
配列番号13:RspHNLタンパク質
配列番号14:RspHNL遺伝子
配列番号15:ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列
配列番号16:ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列
配列番号17:ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列
配列番号18:ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列
配列番号19:ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列
配列番号20:ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列
配列番号21:縮重プライマーHNL-FW
配列番号22:縮重プライマーHNL-RV
配列番号23:縮重プライマーHNL-FW2
配列番号24:縮重プライマーHNL-RV2
配列番号25〜82:プライマー
配列番号83:PtokHNLタンパク質
配列番号84:PtokHNL遺伝子
配列番号85:Pton2HNLタンパク質
配列番号86:Pton2HNL遺伝子
配列番号87:Pton3HNLタンパク質
配列番号88:Pton3HNL遺伝子
配列番号89:RssHNLタンパク質
配列番号90:RssHNL遺伝子
配列番号91〜122:プライマー
Claims (16)
- ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ(以下、HNL)遺伝子の製造方法であって、
ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来HNLの保存アミノ酸配列TAX1DIX2G(配列番号15)(但し、X1はL又はFであり、X2はR又はKである)をコードする塩基配列およびVPNGDKIH(配列番号16)をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含み、
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも1つのDNAをプライマーとして用いてPCRを行うことにより実施されるか、又は
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるDNAをプローブとして用いて、DNA−DNAハイブリダイゼーションを行うことにより実施される、
方法。 - ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子が、ヤスデ網に属する生物より抽出したゲノムDNA、又は、ヤスデ網に属する生物より抽出したRNAより逆転写で得られるcDNAである請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーが、下記の縮重プライマーHNL−FW及びHNL−RVまたはHNL−FW2及びHNL−RV2である請求項1に記載の方法。
HNL−FW:CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG(配列番号21)、
HNL−RV:ATGAATCTTRTCRCCGTTTGGAAC(配列番号22)
HNL−FW2:SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG(配列番号23)
HNL−RV2:ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC(配列番号24) - ヤスデ網に属する生物が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデである請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- ヤスデ由来HNLの製造方法であって、
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法でヤスデ由来HNL遺伝子を調製し、
得られたHNLの遺伝子を、宿主細胞内で発現させて、HNLを得ることを含む前記方法。 - 前記宿主細胞が、昆虫培養細胞である請求項5に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、ジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、請求項5に記載の方法。
- 下記(4)〜(5)の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
(4)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列;又は
(5)配列表の配列番号2、4、6、8、10、12、14、84、86、88又は90に記載の塩基配列において1から50個の塩基の欠失、置換及び/又は付加を有する塩基配列を有し、HNL活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 - 請求項8に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
- 請求項8に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む宿主からなる形質転換体であって、前記宿主は、昆虫培養細胞、又はジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、形質転換体。
- ヤスデ由来HNLの製造方法であって、
請求項10に記載の形質転換体を培養し、培養物からHNLを分離することを含む、HNLの製造方法。 - 宿主が昆虫培養細胞であり、HNL遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデ由来HNL遺伝子である、請求項11に記載の方法。
- 宿主がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌であり、HNL遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデまたはキシャヤスデ由来HNLの遺伝子である、請求項11に記載の前記方法。
- 下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつHNL活性を有するタンパク質。
(1)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列において1から10個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号1、3、5、7、9、11、13、83、85、87又は89に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - 下記(1)〜(3)の何れかのアミノ酸配列を有し、かつHNL活性を有する請求項14に記載のタンパク質。
(1)配列表の配列番号85又は87に記載のアミノ酸配列;
(2)配列表の配列番号85又は87に記載のアミノ酸配列において1から10個のアミノ酸の欠失、置換及び/又は付加を有するアミノ酸配列;又は
(3)配列表の配列番号85又は87に記載のアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列 - アルデヒドまたはケトンとシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質とを含む反応溶媒にヤスデ由来HNLを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法であって、
前記ヤスデ由来HNLが、請求項14若しくは15に記載のタンパク質であるか、または請求項10に記載の形質転換体中で発現したHNLである、前記方法。
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