WO2017150560A1 - ヒドロキシニトリルリアーゼ - Google Patents

ヒドロキシニトリルリアーゼ Download PDF

Info

Publication number
WO2017150560A1
WO2017150560A1 PCT/JP2017/007910 JP2017007910W WO2017150560A1 WO 2017150560 A1 WO2017150560 A1 WO 2017150560A1 JP 2017007910 W JP2017007910 W JP 2017007910W WO 2017150560 A1 WO2017150560 A1 WO 2017150560A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
hnl
seq
gene
amino acid
millipede
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/007910
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浅野　泰久
拓也 山口
Original Assignee
公立大学法人 富山県立大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 公立大学法人 富山県立大学 filed Critical 公立大学法人 富山県立大学
Priority to CN201780026964.5A priority Critical patent/CN109963943B/zh
Priority to US16/081,476 priority patent/US11214790B2/en
Priority to JP2018503346A priority patent/JP6893361B2/ja
Priority to EP17760025.1A priority patent/EP3425050B1/en
Publication of WO2017150560A1 publication Critical patent/WO2017150560A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/002—Nitriles (-CN)
    • C12P13/004—Cyanohydrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/02—Aldehyde-lyases (4.1.2)
    • C12Y401/02047—(S)-Hydroxynitrile lyase (4.1.2.47)

Definitions

  • the present invention relates to a method for cloning millipede-derived hydroxynitrile lyase (HNL) genes, enzymes produced by expression of these genes, and a method for producing optically active cyanohydrins using the expressed enzymes.
  • HNL millipede-derived hydroxynitrile lyase
  • Optically active cyanohydrin is an important intermediate in the production of pharmaceuticals and fine chemicals.
  • a method for producing cyanohydrin a method in which a hydroxynitrile lyase is allowed to act on an aldehyde or ketone and a cyanide donor has been proposed (Patent Document 1).
  • (R) -Hydroxynitrile lyase found from Yanbarto Sakayase has higher specific activity and better stability to heat and pH than hydroxynitrile lyase found from plants (patented) Document 2, Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 1 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-217590
  • Patent Document 2 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2015-167477
  • Non-Patent Document 1 Dashimapur et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112, 10605-10610 (2015)
  • Patent Document 2 (R) -hydroxynitrile lyase found from Yanbartosaka Yasude is expressed in yeast, but its expression level is very small, and no expression system in E. coli has been constructed. Preparation was difficult.
  • HNL hydroxynitrile lyase
  • the present invention can provide (provide) HNL genes and HNLs derived from millipedes other than Yanbartosaka millipede, and further establish an expression system for the obtained HNL to provide a practically usable amount of HNL.
  • the purpose is to provide a method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing an optically active cyanohydrin using the provided HNL.
  • HNL genes can be cloned from various millipedes by using degenerate primers of specific sequences from sequences conserved among millipede-derived HNL genes.
  • HNL gene and HNL were obtained from Japanese millipede.
  • insect culture cells and specific E. coli a newly found HNL gene can be expressed and HNL can be produced.
  • optically active cyanohydrins can be produced using the expressed HNL, thereby completing the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • HNL millipede-derived hydroxynitrile lyase
  • a method comprising selecting a gene having at least one of a base sequence encoding and a base sequence encoding VPNGKIH (SEQ ID NO: 16).
  • the selection of the gene is performed by performing PCR using a gene present in an organism belonging to the millipede network as a template and using at least one DNA consisting of a base sequence encoding the conserved amino acid sequence as a primer [1 ] Method.
  • the selection of the gene is carried out by performing DNA-DNA hybridization using a gene present in an organism belonging to the millipede network as a template and using a DNA comprising a base sequence encoding the conserved amino acid sequence as a probe. The method according to [1].
  • the selection of the gene is performed by sequencing a gene present in an organism belonging to the millipede net and selecting a gene having a base sequence encoding the conserved amino acid sequence from the sequenced gene sequences.
  • the gene present in the organism belonging to the millipede is a genomic DNA extracted from the organism belonging to the millipede or a cDNA obtained by reverse transcription from RNA extracted from the organism belonging to the millipede.
  • HNL-FW CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG (SEQ ID NO: 21), HNL-RV: ATGAATCTTRTCRCCGGTTGGAAC (SEQ ID NO: 22) HNL-FW2: SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG (SEQ ID NO: 23) HNL-RV2: ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC (SEQ ID NO: 24) [7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the organism belonging to the millipede net is a sea squirrel mosquito, a zelkova, a herabayasde, a kishayasude, a green baysade, or an amabikosude.
  • a method for producing millipede-derived HNL, A millipede-derived HNL gene is prepared by the method according to any one of [1] to [7], The said method including expressing the gene of HNL obtained in a host cell, and obtaining HNL.
  • the host cell is The method according to [8], which is an insect cultured cell.
  • the host cell is The method according to [8], which is Escherichia coli having disulfide bond isomerase expression ability.
  • [12] A plasmid comprising the gene according to [11] in a vector.
  • [13] A transformant comprising a host capable of expressing a plasmid containing the gene according to [11] in a vector, wherein the host is an insect culture cell or Escherichia coli having disulfide bond isomerase expression ability. body.
  • [14] A method for producing millipede-derived HNL, [13] A method for producing HNL, comprising culturing the transformant according to [13] and separating HNL from the culture.
  • [15] [14] The method according to [14], wherein the host is an insect cultured cell, and the HNL gene is an HNL gene derived from a sea squirrel mosquito, a zelkova, a Herababayasde, a Kisha Yasude, a green bay sedge, or an Amabiko Yasude.
  • [16] [14] The method according to [14], wherein the host is Escherichia coli having a disulfide bond isomerase expression ability, and the HNL gene is a gene of HNL derived from a sea squirrel mosquito, a zelkova, or a cricket.
  • the HNL gene can be cloned from various millipedes.
  • millipede-derived (R) -HNL having high specific activity and heat stability can be easily prepared using insect cultured cells or specific genetically modified Escherichia coli, and can be used for the production of optically active cyanohydrins. Since optically active cyanohydrin is an important intermediate in the production of pharmaceuticals and fine chemicals, the present invention is very useful industrially.
  • FIG. 1 shows the result of SDS-PAGE analysis of NttHNL purified from Tamba red millipede.
  • Lane 1 is “Broad Range Marker” (manufactured by Bio-Rad)
  • Lane 2 is purified HNL (NttHNL).
  • FIG. 2 is a diagram showing the effects of heat and pH on OgraHNL purified from E. coli. A is the optimum temperature, B is the optimum pH, C is the thermal stability, and D is the pH stability.
  • FIG. 3 shows the influence of heat and pH on NtmHNL purified from E. coli. A is the optimum temperature and B is the optimum pH.
  • NttHNL protein SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 2 The amino acid sequence of NttHNL protein (SEQ ID NO: 2)
  • the amino acid sequence of NtmHNL protein SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence of NtmHNL gene SEQ ID NO: 4
  • the amino acid sequence of OgraHNL protein SEQ ID NO: 5
  • the base sequence of OgraHNL gene SEQ ID NO: 6
  • PfalHNL protein SEQ ID NO: 7
  • SEQ ID NO: 8 The amino acid sequence of PfalHNL protein (SEQ ID NO: 8) are shown.
  • the amino acid sequence of the Pton1HNL protein (SEQ ID NO: 9) and the base sequence of the Pton1HNL gene (SEQ ID NO: 10) are shown.
  • the amino acid sequence of PlumHNL protein (SEQ ID NO: 11) and the base sequence of PlumHNL gene (SEQ ID NO: 12) are shown.
  • the amino acid sequence of RspHNL protein (SEQ ID NO: 13) and the base sequence of RspHNL gene (SEQ ID NO: 14) are shown.
  • the examination result of the optimal temperature of Pton3HNL is shown.
  • the examination result of the optimum pH of Pton3HNL is shown.
  • the examination result of the temperature stability of Pton3HNL is shown.
  • the examination result of pH stability of Pton3HNL is shown.
  • the production result (pH dependence) of (R) -mandelonitrile in Example 14 is shown.
  • the production result (concentration dependence) of (R) -mandelonitrile in Example 14 is shown.
  • the amino acid sequence of PtokHNL protein (SEQ ID NO: 83) and the base sequence of PtokHNL gene (SEQ ID NO: 84) are shown.
  • the amino acid sequence (sequence number 85) of Pton2HNL protein and the base sequence (sequence number 86) of Pton2HNL gene are shown.
  • the amino acid sequence (sequence number 87) of Pton3HNL protein and the base sequence (sequence number 88) of Pton3HNL gene are shown.
  • the amino acid sequence of the RssHNL protein (SEQ ID NO: 89) and the base sequence of the RssHNL gene (SEQ ID NO: 90) are shown.
  • the present invention relates to a method for producing a millipede-derived hydroxynitrile lyase (HNL) gene.
  • a conserved amino acid sequence TAX 1 DIX 2 G (SEQ ID NO: 15) of a millipede-derived HNL is obtained from a gene present in an organism belonging to the millipede network (where X 1 is L or F, and X 2 is R or K And a gene having at least one of the base sequence encoding VPNGKIH (SEQ ID NO: 16).
  • TALDIRG (SEQ ID NO: 17) TALDIKG (SEQ ID NO: 18) TAFDIRG (SEQ ID NO: 19) TAFDIKG (SEQ ID NO: 20)
  • the conserved amino acid sequence of millipede-derived HNL of SEQ ID NO: 16 is VPNGDKIH.
  • the base sequence encoding the conserved amino acid sequence is not limited.
  • degenerate primers HNL-FW (SEQ ID NO: 21) and HNL-RV (SEQ ID NO: 22) described later, and degenerate primer HNL-FW2 (SEQ ID NO: 23) are used.
  • HNL-RV SEQ ID NO: 24.
  • the HNL gene can be cloned from various millipedes for the first time by using a primer (degenerate primer) having a base sequence encoding a conserved amino acid sequence.
  • HNL genes are cloned from various millipedes using degenerate primers as described above.
  • the present invention has at least one of base sequences encoding conserved amino acid sequences of millipede-derived HNL. Any method that includes selecting a gene is included. Examples of such a method include the following methods (1) to (3). (1) The selection of the gene is performed by performing PCR using a gene present in an organism belonging to the millipede as a template and at least one DNA consisting of a base sequence encoding the conserved amino acid sequence as a primer. Method.
  • the selection of the gene is carried out by DNA-DNA hybridization using a gene present in an organism belonging to the millipede network as a template and DNA comprising a base sequence encoding the conserved amino acid sequence as a probe. How to be. (3) The selection of the gene involves sequencing a gene present in an organism belonging to the millipede net, and selecting a gene having a base sequence encoding the conserved amino acid sequence from the sequenced gene sequences. The method implemented by.
  • the gene present in the organism belonging to the millipede network used in the method of the present invention is, for example, genomic DNA extracted from the organism belonging to the millipede network, or cDNA obtained by reverse transcription from RNA extracted from the organism belonging to the millipede network. be able to.
  • a method for extracting genomic DNA and a method for preparing cDNA from RNA by reverse transcription known methods can be used as appropriate.
  • the gene present in the organism belonging to the millipede network used as a template can be the genomic DNA or cDNA extracted as described above, preferably cDNA, and using these DNAs as templates and represented by SEQ ID NOs: 15 and 16 above.
  • PCR is performed using at least one DNA consisting of a base sequence encoding a conserved amino acid sequence as a primer.
  • the base sequence of the primer is not limited as long as it encodes the conserved amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • PCR can be performed using these degenerate primers to amplify the HNL gene derived from the organism.
  • HNL-FW CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG (SEQ ID NO: 21), HNL-RV: ATGAATCTTRTCRCCGGTTGGAAC (SEQ ID NO: 22) HNL-FW2: SSAACTGCATTGGAYATMMRAGG (SEQ ID NO: 23) HNL-RV2: ATGAATCTTRTCRCCRTTTGGRAC (SEQ ID NO: 24)
  • the gene present in the organism belonging to the millipede network used as a template can be the genomic DNA or cDNA extracted as described above, preferably the extracted genomic DNA, and using these DNAs as templates, the SEQ ID NO: 15 and DNA-DNA hybridization is carried out using at least one DNA consisting of a base sequence encoding the conserved amino acid sequence represented by 16 as a probe.
  • a known method can be used as appropriate.
  • the base sequence of the probe is not limited as long as it encodes the conserved amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 15 and 16.
  • the same base sequence as the degenerate primers HNL-FW and HNL-RV or It can be a base sequence containing a part of these base sequences.
  • DNA-DNA hybridization is performed to obtain an HNL gene derived from the organism.
  • the HNL gene obtained by DNA-DNA hybridization can be appropriately amplified by a known amplification method such as PCR.
  • Method (3) Sequencing of genes present in organisms belonging to the millipede net.
  • the subject to be sequenced can be genomic DNA or cDNA extracted as described above.
  • a known method can be appropriately used as the sequencing method.
  • a gene having a base sequence encoding the conserved amino acid sequence is selected from the sequenced gene sequences.
  • organisms belonging to the millipede family There is no limitation on organisms belonging to the millipede family. Examples of the organism belonging to the millipede net include Obiyasude of the Obiyasude Obiyasude family, Hagayasude of the Obiyasudee deer family, and Obiyasudee family Chibiyasude. In the Examples, it is shown that the HNL genes of Echinoptera spp.
  • the cDNA preparation method and the PCR method using cDNA as a template are known methods. Referring to the description of the examples, the above-described HNL-FW and HNL-RV can be used as degenerate primers.
  • the present invention relates to a gene having any one of the following base sequences (4) to (6).
  • (4) a base sequence encoding a protein having the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 84, 86, 88 or 90 of the sequence listing and having HNL activity; (5) Deletion, substitution and / or addition of 1 to 50 bases in the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 84, 86, 88 or 90 in the sequence listing Or a base sequence encoding a protein having HNL activity; or (6) in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 84, 86, 88 or 90 of the sequence listing
  • the genes having the nucleotide sequences set forth in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 84, 86, 88 and 90 in the sequence table of (4) are respectively, Tamba aka Yasude, Umaga Esia kayade, Yake Yasude.
  • These are HNL genes derived from Herababa Yasude, Midribaba Yasude, Kisha Yasude, a kind of Amabiko Yasude, Parafontaria entokaiensis, Midribaba Yasude, Midribaba Yasude, and Amabiko Yasude.
  • the range of “1 to 50” in the “base sequence having deletion, substitution and / or addition of 1 to 50 bases” referred to in the present specification is not particularly limited, but for example, preferably 1 to 40 bases More preferably, it means 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, still more preferably 1 to 5, particularly preferably about 1 to 3.
  • SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, Based on the information of the nucleotide sequence described in 84, 86, 88 or 90, it can be prepared by any method known to those skilled in the art such as chemical synthesis, genetic engineering techniques or mutagenesis.
  • a method in which a DNA having the base sequence described in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 84, 86, 88 or 90 in the sequence listing is contacted with a mutagen agent, It can be prepared using a method of irradiating ultraviolet rays, a genetic engineering method, or the like.
  • Site-directed mutagenesis which is one of the genetic engineering methods, is useful because it can introduce a specific mutation at a specific position.
  • Molecular cloning 2nd edition Current Protocols in Molecular. It can be performed according to the method described in biology and the like.
  • hybridizes under stringent conditions means a DNA base sequence obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like.
  • a DNA base sequence obtained by using a DNA as a probe and using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like.
  • hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which DNA derived from colonies or plaques or a fragment of the DNA is immobilized 0.
  • Examples thereof include DNA that can be identified by washing a filter at 65 ° C. using a 1 to 2 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC solution is 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate).
  • Hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning 2nd edition.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain degree of identity with the base sequence of DNA used as a probe, for example, 90% or more, preferably 93% or more, more preferably 95%. More preferably, DNA having identity of 98% or more, most preferably 99% or more is mentioned.
  • the method for obtaining the gene of the present invention is not particularly limited, but preferably there is a method for producing the HNL gene of the present invention.
  • the present invention includes a plasmid containing the gene of the present invention in a vector. Furthermore, the present invention includes a transformant containing the plasmid of the present invention in a host organism so that the HNL encoded by the gene of the present invention can be expressed. Examples of the host organism include insect cultured cells and Escherichia coli having disulfide bond isomerase expression ability.
  • the type of vector used in the present invention is not particularly limited.
  • the vector may be a self-replicating vector (for example, a plasmid), or may be integrated into the host cell genome when introduced into the host cell. It may be replicated together with other chromosomes.
  • the vector is an expression vector.
  • elements necessary for transcription for example, a promoter and the like
  • a promoter is a DNA sequence that exhibits transcriptional activity in a host cell, and can be appropriately selected depending on the type of host. That is, the vector used for the plasmid of the present invention is not particularly limited as long as it can express the HNL gene of the present invention in a host organism. Examples of such expression vectors include pFastbac1, BacPAK6, pIEx-1, and pBiEx-1 in the case of insect cultured cells.
  • promoters operable in insect cells include polyhedrin promoter, P10 promoter, autographa caliornica polyhedrosic basic protein promoter, baculovirus immediate early gene 1 promoter, or baculovirus 39K delayed early gene. There are promoters.
  • examples of expression vectors include pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), pBluescript, pET28, pCDF, pRSF, and the like.
  • examples of a promoter operable in E. coli include, for example, a lac, trp or tac promoter.
  • the present invention includes a method for producing millipede-derived HNL.
  • Millipede-derived HNL production method (1) comprises preparing a millipede-derived HNL gene by the method of the present invention, and expressing the obtained HNL gene using insect cultured cells as a host to obtain HNL. It is the method of including.
  • Millipede-derived HNL production method (2) includes preparing a millipede-derived HNL gene by the method of the present invention, expressing the obtained HNL gene using Escherichia coli as a host, and obtaining HNL.
  • the E. coli is E. coli having disulfide bond isomerase expression ability.
  • Millipede-derived HNL production method (3) is a method for producing HNL, comprising culturing the transformant of the present invention and separating HNL from the culture.
  • the host is an insect cultured cell
  • the HNL gene is an HNL gene derived from the sea squirrel mosquito, the zelkova, the king moth, the green lily, or the amobiko pearl And (3-2) a method in which the host is Escherichia coli having the ability to express disulfide bond isomerase, and the HNL gene is a gene of HNL derived from a marine mosquito, a zelkova, or a blackshade.
  • Millipede-derived HNL production method (3-1) is to obtain HNL by expressing an HNL gene derived from insect cultivated cells as a host, using the HNL gene derived from the sea squirrel mosquito, japonicus, herababayashide, kishayasude, greenbayape, or amobikosade It is a method including.
  • Millipede-derived HNL production method (3-2) comprises expressing HNL gene derived from E. coli scallop, zelkova or Kisha Yasude using Escherichia coli as a host to obtain HNL, wherein said Escherichia coli is disulfide-linked isomerase This method is E. coli having expression ability.
  • recombinant gene transfer vectors and baculoviruses are co-introduced into insect cells using known methods, After obtaining the recombinant virus, the insect cells can be further infected with the recombinant virus to express the protein.
  • the baculovirus for example, Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which is a virus that infects Coleoptera insects, can be used.
  • Insect cells include Sf9 and Sf21 [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, WH Freeman & Company (W. H. Freeman and Company), New York (Spodoptera frugiperda ovary cells). New York), (1992)], HiFive (manufactured by Invitrogen), which is an ovary cell of Trichoplusia ni, and the like can be used.
  • Examples of the method for co-introducing a recombinant gene introduction vector into insect cells and the baculovirus for preparing a recombinant virus include the calcium phosphate method and the lipofection method.
  • E. coli having the ability to express disulfide bond isomerase and E. coli having mutations in thioredoxin reductase and glutathione reductase are used.
  • E. coli having the ability to express disulfide bond isomerase include SHuffleSHT7 used in the Examples.
  • E. coli having mutations in thioredoxin reductase and glutathione reductase include Origami and Rosetta-gami series E. coli strains (manufactured by Merck Millipore).
  • the transformation of E. coli may be performed, for example, by using competent cells by a protoplast method or a known method.
  • the above transformant is cultured in an appropriate nutrient medium under conditions that allow expression of the introduced gene.
  • ordinary protein isolation and purification methods may be used. For example, when HNL is expressed in a dissolved state in a cell, after completion of the culture, the cell is collected by centrifugation, suspended in an aqueous buffer solution, disrupted by an ultrasonic crusher, etc., and cell-free extraction Obtain a liquid.
  • an ordinary protein isolation and purification method that is, a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, Anion exchange chromatography using resin such as diethylaminoethyl (DEAE) Sepharose, cation exchange chromatography using resin such as S-Sepharose FF (Pharmacia), resin such as butyl sepharose and phenyl sepharose Purify HNL using methods such as hydrophobic chromatography, gel filtration using molecular sieves, affinity chromatography, chromatofocusing, and electrophoresis such as isoelectric focusing alone or in combination. Can be obtained as
  • the present invention relates to a protein having an amino acid sequence of any one of (1) to (3) below and having HNL activity.
  • Proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 83, 85, 87 and 89 in the sequence listing of (1) are respectively Tamba aka Yasude, Umaga Esia kayade, Yake Yasude. HNL derived from Parafontaria spp., Paramecium spp., Paramecium spp., Parasitella spp.
  • the proteins having the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 9, 85 and 87 are all HNL derived from Midribaba Yasude, but the collection sites are different.
  • the method for measuring the HNL activity of the protein having HNL activity of the present invention is described in “Method for measuring (R) -mandelonitrile synthesis activity” shown in the Examples.
  • the second of the protein of the present invention is a protein having an amino acid sequence having a deletion, substitution and / or addition of 1 to 50 amino acids in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • the range of “1 to 50” in the “amino acid sequence having 1 to 50 amino acid deletions, substitutions and / or additions” mentioned here is a protein having a deletion or the like having an HNL activity. Means that.
  • the range of “1 to 50” is, for example, 1 to 40, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 20, more preferably, from the viewpoint that the ratio of the protein having the HNL activity is high. 1 to 10, more preferably 1 to 7, even more preferably 1 to 5, and particularly preferably about 1 to 3.
  • the (3) of the protein of the present invention is a protein having an amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.
  • the identity in the “amino acid sequence having 90% or more identity to the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing” is as follows.
  • the protein having the identity of the amino acid sequence has the HNL activity. As long as it is an enzyme, it is not particularly limited.
  • the identity of the amino acid sequence is not particularly limited as long as it is 90% or more, but is preferably 95% or more, more preferably 96% or more, further preferably 97% or more, more preferably 98%, and particularly preferably 99%. That's it.
  • the method for obtaining a protein having HNL activity of the present invention is not particularly limited, and may be a protein synthesized by chemical synthesis or a recombinant protein produced by a gene recombination technique.
  • the protein having the HNL activity of the present invention is obtained by mounting a gene encoding the protein having the HNL activity on a vector, transforming a host cell with this vector, culturing the transformed host cell, The protein encoded by the gene can be accumulated therein, and the accumulated protein can be collected by a production method.
  • Examples of the method for obtaining a gene encoding a protein having HNL activity include the aforementioned method of the present invention.
  • the method for preparing the protein of the present invention can be, for example, a method for producing the above-mentioned millipede-derived HNL of the present invention.
  • the present invention includes a method for producing an optically active cyanohydrin. This method comprises preparing an optically active cyanohydrin that causes a millipede-derived HNL to act on a reaction solvent containing an aldehyde or ketone and hydrogen cyanide or a substance that generates cyanide ions in the reaction system.
  • Millipede-derived HNL is the protein having the HNL activity of the present invention or the transformant of the present invention.
  • the protein having HNL activity of the present invention may be a crude enzyme or a purified enzyme.
  • the transformant of the present invention may be a microbial cell itself or a crushed product of the microbial cell.
  • millipede-derived HNL is a protein having the HNL activity of the present invention or a transformant of the present invention.
  • the aldehyde or ketone serving as a reaction substrate can be, for example, a compound represented by the formula (I) R 1 — (C ⁇ O) R 2 .
  • R 1 and R 2 are (i) a hydrogen atom, (ii) a substituted or unsubstituted linear or branched saturated alkyl group having 1 to 18 carbon atoms, or (iii) a substituted group. Or, an unsubstituted ring is an aromatic group having 5 to 22 members. However, R 1 and R 2 do not represent a hydrogen atom at the same time.
  • the substituent is one or more amino groups, imino groups, hydroxy groups, alkoxy groups having 1 to 8 carbon atoms, halogens, carboxyl groups , A cycloalkyl group having 3 to 20 carbon atoms, or an aromatic group having up to 22 carbon atoms that may be substituted with a heteroatom of N, O, or S (where the substituent is a cyclic substituent) Substituted by one or more halogens, hydroxy groups, linear or branched alkyl groups having 1 to 8 carbon atoms, linear or branched alkenyl groups having 2 to 8 carbon atoms May be.)
  • the aromatic group may be a heteroaromatic group in which up to 4 ring members are substituted by N, O and / or S.
  • R 1 and R 2 are substituted aromatic groups
  • the substituents are one or more amino groups, imino groups, hydroxy groups, alkoxy groups having 1 to 8 carbon atoms, allyloxy groups, halogens, carboxyl groups.
  • hydrogen cyanide is used as a raw material.
  • a method of supplying hydrogen cyanide either a method of supplying as a liquid or a method of supplying as a gas can be employed.
  • hydrocyanic acid that is, hydrocyanic acid
  • any substance that generates cyanide ions (CN ⁇ ) when added to the reaction system can be used. Examples thereof include hydrogen cyanide salts such as sodium cyanide and potassium cyanide, and cyanohydrins such as acetone cyanohydrin. It is done.
  • reaction solvent As a reaction solvent, when a large amount of water is present in the reaction system, racemization of the optically active cyanohydrin produced by the enzymatic reaction is likely to occur, or when an aldehyde or ketone having low solubility in water is used as a raw material, the production efficiency It is preferable to use a reaction solvent composed mainly of an organic solvent that is hardly soluble or insoluble in water, from the viewpoint of lowering the temperature. As such an organic solvent, any organic solvent that does not affect the synthesis reaction of the optically active cyanohydrin by an enzymatic reaction can be used without particular limitation. Physical properties of the raw material aldehyde or ketone used in the synthesis reaction, and the product cyanohydrin can be used.
  • aliphatic or aromatic linear, branched or cyclic saturated or unsaturated hydrocarbon solvents which may be halogenated, such as pentane, hexane, toluene, xylene, methylene chloride, etc.
  • An aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated alcohol solvent which may be halogenated, such as isopropyl alcohol, n-butanol, isobutanol, t-butanol, Hexanol, cyclohexanol, n-amyl alcohol, etc .; aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated ether solvents which may be halogenated, such as diethyl ether, dipropyl ether , Diisopropyl ether, dibutyl ether, methyl-t-butyl ether and the like; Aliphatic or aromatic linear or branched or cyclic saturated or unsaturated ester solvents, such as methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate, etc. These may be used alone or in combination. These organic solvents may be saturated with an aqueous buffer solution
  • the concentration of aldehyde or ketone in the reaction solvent is preferably in the range of 0.01 mM to 5 M.
  • a recombinant microbial cell in an amount exhibiting an enzyme activity of 1 unit / mmol or more can be used.
  • the enzyme activity of the bacterial cells is, for example, suspended by suspending the bacterial cells in water or a buffer solution, using a supernatant obtained by centrifugation, using DL-mandelonitrile as a substrate, and the substrate depending on the enzyme. It can be calculated by measuring the change in absorbance when it is decomposed to produce benzaldehyde at a wavelength of 249.6 nm.
  • the pH of the reaction solvent does not need to be adjusted when the organic solvent is used without being saturated with an aqueous buffer, but when the organic solvent is saturated with an aqueous buffer, the pH of the aqueous buffer is 3-7. In the range of 3 to 6, preferably 3 to 6.
  • the reaction temperature is preferably as low as possible within the range in which the enzyme activity is exerted in order to suppress the by-production of racemic cyanohydrin that does not depend on the enzyme reaction, and is usually 0 to 50 ° C., preferably 10 to 45 ° C.
  • reaction solution and the bacterial cells are separated to obtain a reaction product solution.
  • the target optically active cyanohydrin is obtained. Separation of products can be performed by commonly used means such as distillation separation, column chromatography separation, and extraction separation.
  • a dehydrating agent or the like may be added for dehydration treatment, or a stabilizer or the like may be added.
  • Example 1 Purification of HNL (NttHNL) from Tamba red squirrel A Tamba red squirrel, Nedyopus tambanus tambanus (Attems) was collected at Toyama Prefectural University. A crude enzyme solution was extracted from millipede, and NttHNL was purified as follows.
  • NttHNL was adsorbed on ResourceQ and eluted with a NaCl concentration gradient. Thereafter, it was added to Superdex 75 10/300 GL (manufactured by GE Healthcare) and eluted with PBS.
  • the purified NttHNL showed (R) -mandelonitrile synthesis activity, and its specific activity was 4700 U / mg.
  • N-terminal amino acid sequence analysis and internal sequence analysis of purified NttHNL were performed.
  • EEEPLTXDKL an N-terminal amino acid sequence, EEEP (I / L) TCDQ (I / L) PK, and (I / L) QTQAVEVAK were obtained.
  • Example 2 Cloning of NttHNL gene
  • Total RNA was extracted from Tamba akayase using TRIzol (Invitrogen), and cDNA was synthesized using Gene Racer Kit (Invitrogen).
  • a degenerate primer was designed from the N-terminal amino acid sequence of NttHNL and the internal sequence, and a partial sequence of cDNA encoding NttHNL was amplified by PCR.
  • the amplified DNA was connected to pCR-blunt (Invitrogen), and the base sequence of the insert was determined. Subsequently, 5′- and 3′-RACE were performed using primers designed from the internal sequence to determine the full-length base sequence of the cDNA encoding NttHNL.
  • NttHNL-F1 GTTCCAGTTCCTCCGTTAGAAGATTTT (SEQ ID NO: 27)
  • NttHNL-F2 CCCAGCTGCAACTGCATTGGACATT
  • NttHNL-R1 CTCTGCAATTGCAGAACCATTGCACCGTA
  • SEQ ID NO: 29 NttHNL-R1: CCATTTGGGGTGTTCAAATTTAGTAATT (SEQ ID NO: 30)
  • NttHNL-FW ATGCTGTTTTACGTTTCGATTCTTCTAG (SEQ ID NO: 31)
  • NttHNL-RV TTAATAGAAAAGCAAACACACATGGTG (SEQ ID NO: 32)
  • Example 3 Homology Cloning of Millipede-derived Hydroxynitrile Lyase Gene (P. laminata (Attems)), P. tominomine Attems, and one species of Amabiko millipede (Ruukiria sp.), Each from one individual, total RNA was prepared by the method described above, Gene Racer Kit or SMART RACE Combine cDNA using cDNA Amplification Kit (Clontech) Made. A partial sequence of each millipede-derived HNL gene was amplified by PCR using degenerate primers designed from homologous sequences of ChuaHNL and NttHNL. Degenerate primer sequence: HNL-FW: CTGCAACTGCATTGGAMATTCAAGG (SEQ ID NO: 17), HNL-RV: ATGAATCTTRTCRCCGGTTGGAAC (SEQ ID NO: 18)
  • NtmHNL-F1 TGGTGGACCTAATAACTCCGCCATA (SEQ ID NO: 33)
  • NtmHNL-F2 CCCAGATGGAAGTTCATATTGCCGCTTA (SEQ ID NO: 34)
  • NtmHNL-R1 GAGTGGGTCCGGTTCCATTGTTATTAT (SEQ ID NO: 35)
  • NtmHNL-R2 GCCATTGCACGTATAAGCGCAATAT (SEQ ID NO: 36)
  • OgraHNL-F1 CGTTGGTGGTCTCATAATATCTCAGCTAT (SEQ ID NO: 37)
  • OgraHNL-F2 CACCAATCTGAACACTCCAAATGGAA, (SEQ ID NO: 38)
  • OgraHNL-R1 GGATCGGTTCCGTTGTTGTT
  • NtmHNL-FW ATGCTGTTTTACGTCCTGATTCTTC (SEQ ID NO: 57), NtmHNL-RV: TCAATAGAAAGCAAAAAGCCATCATGG (SEQ ID NO: 58), OgraHNL-FW: ATGTTTTACTACGTTTCAAACTACT (SEQ ID NO: 59), OgraHNL-RV: CTAATAGAAAAGCAAAACAGCCATGG (SEQ ID NO: 60), PfalHNL-FW: ATGACTTCGATCATTCTCCACG (SEQ ID NO: 61), PfalHNL-RV: TTAGTAATAGAGAGGGACAGAAAGGG (SEQ ID NO: 62), PlumHNL-FW: ATGACTTCGATCATTCTCCTCATGACTG (SEQ ID NO: 63), PlumHNL-RV: GCTTAATTCAATTGCACTTTATTTTTATATC (SEQ ID NO: 64), Pton1HNL-FW: ATGACTTCAATC
  • Pton2HNL Midribabayase-derived hydroxynitrile lyase
  • Pton3HNL Midribabayase-derived hydroxynitrile lyase
  • RssHNL Amibiko millipede-derived hydroxynitrile lyase
  • the respective amino acid sequences are shown in SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 83, 85, 87, and 89.
  • the base sequences of the respective genes are shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 1484, 86, 88, and 90.
  • the homology of each amino acid sequence is summarized in Table 1. This method revealed that a gene encoding a millipede-derived hydroxynitrile lyase having 41% or more homology with ChuaHNL can be cloned.
  • Example 4 Cloning of ChuaHNL gene
  • Total RNA was prepared from Yanvaltosaka Yasude by the method shown in Example 3, and cDNA was synthesized.
  • a region encoding ChuaHNL was amplified using primers and ligated into pCR-blunt.
  • ChuaHNL-RV aagctttAGTAAAAAAGCAAAGCAACCGTGGGTTTCG (SEQ ID NO: 70)
  • Example 5 Expression of hydroxynitrile lyase gene in insect cultured cells
  • the above-mentioned millipede-derived hydroxynitrile lyase gene was expressed using a baculovirus-insect cell expression system.
  • the insert DNA was prepared by PCR using each plasmid DNA obtained in Examples 2, 3 and 4 as a template and various primers and Tks Gflex DNA polymerase.
  • IFSf-NttHNL-FW gggcgcggatccATGCTGTTTTACGTTTGATTC
  • IFSf-NttHNL-RV acttctcgacaagctttTATAGAGAAAGCAAAACAACCCATGG
  • IFSf-NtmHNL-FW catcggggcgcggatccATGCTGTTTTACGTTTCGATTCTTC
  • IFSf-NtmHNL-RV actctcgacaagcttTCAATAGAAAGCAAAACAGCCCATGG
  • IFSf-OgraHNL-FW catcggggcgcggatccATGTTGTACTACGTTTCAATAC
  • IFSf-OgraHNL-RV actctcgacaagctttCTAATA
  • the insert DNA was connected to the BamHI-HindIII site of pFastbac1 vector (Invitrogen) using In-Fusion HD cloning kit (Takara Bio). Further, a sequence encoding a His tag was introduced directly under the signal peptide cleavage site of each hydroxynitrile lyase using KOD-Plus-Mutageness Kit (Toyobo Co., Ltd.). The signal peptide cleavage site was predicted using SignalP (Nature Methods, 8: 785-786, 2011). Thereafter, the sequence of the insert was sequenced to confirm that there was no mutation due to PCR.
  • Each of the obtained plasmids was introduced into Escherichia coli DH10BAC, and recombinant bacmid DNA was extracted from the transformant using QIAGEN Plasmid Mini Kit (manufactured by Qiagen). Recombinant bacmid DNA was transfected into Sf9 cells using X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (Roche). Recombinant baculovirus was collected and again infected with Sf9 cells to amplify the recombinant baculovirus, and further infected with Sf9 cells to amplify the recombinant baculovirus.
  • the titer of the recombinant baculovirus was calculated by comparing the sample with a baculovirus genomic DNA known in the titer by real-time PCR using the ee1 gene amplification primer (Biotechnol. Prog., 20: 354-360, 2004).
  • the recombinant baculovirus DNA was prepared using NucleoSpin Virus (manufactured by Takara).
  • Each millipede-derived HNL was secreted and expressed by infecting each recombinant baculovirus with Sf9 cells (1.5 ⁇ 10 6 cells / mL) at a multiplicity of infection of 1.
  • Cells were removed by centrifugation 72 hours after infection with the recombinant baculovirus, and the culture supernatant was collected.
  • the culture supernatant was diluted with an equal amount of 20 mM HEPES-NaOH (pH 8.0) and added to cComplete Histag Purification resin (Roche).
  • Each HNL adsorbed on the carrier was eluted with 10 mM HEPES-NaOH (pH 8.0) containing 0.1 M imidazole and 0.1 M NaCl.
  • the protein concentration was measured using TaKaRa BCA Protein Assay Kit (manufactured by Takara) using fetal bovine serum-derived albumin as a standard. Each hydroxynitrile lyase showed (R) -mandelonitrile synthesis activity. See Table 2a.
  • Example 6 Expression of millipede-derived hydroxynitrile lyase gene in E. coli ChuaHNL, NttHNL, NtmHNL, OgraHNL, PfalHNL, PtonHNL, PtonHNL, PtamHNL, PtonHNL, PtamHNL, PtamHNL, PtamHNL, PtamHNL , Pton3HNL, RssHNL gene expression was tried.
  • PCR was carried out using each plasmid DNA obtained in Example 3 as a template and various primers and Tks Gflex DNA polymerase.
  • the insert DNA was ligated to the NdeI-HindIII site of the pET28 vector (Clontech) using an In-Fusion HD cloning kit (Takara Bio) so that it could be expressed as a His tag fusion protein.
  • PlamHNL was connected to the BamHI-HindIII site of the pET28 vector. Thereafter, the sequence of the insert was sequenced to confirm that there was no mutation due to PCR.
  • Each obtained plasmid was introduced into Escherichia coli BL21 (DE3) or SHuffle T7 (manufactured by New England Biolabs).
  • the transformant was cultured in an LB medium containing kanamycin at 30 ° C. for 16 hours, transferred to a TB autoinduction medium, and cultured at 26 ° C. for 24 hours. After collection, the cells were disrupted by ultrasonic waves, and insoluble substances were precipitated by centrifugation to obtain a cell-free extract.
  • the expression of the hydroxynitrile lyase gene was evaluated by the degradation activity of mandelonitrile. That is, the cell-free extract was added to 0.1 M citrate buffer containing 2 mM (R, S) -mandelonitrile, and the formation of benzaldehyde was monitored at 280 nm.
  • E. coli BL21 (DE3), no expression of any hydroxynitrile lyase gene was observed. However, in E. coli SHuffle T7, expression of NtmHNL, OgraHNL, Pton2HNL, Pton3HNL and PlamHNL genes was observed (see Table 2a).
  • Example 7 Purification of OgraHNL OgraHNL was purified as follows. The cell-free extract prepared by the method of Example 6 was added to HisTrap HP (manufactured by GE Healthcare). OgraHNL was eluted with an imidazole concentration gradient (20-500 mM). The fraction from which OgraHNL was eluted was collected and added to ResourceQ (manufactured by GE Healthcare). OgraHNL was eluted with a sodium chloride concentration gradient (0-300 mM). The fraction from which OgraHNL was eluted was collected and concentrated using an Amicon Ultra-4 centrifugal filter unit (Millipore).
  • the purified OgraHNL showed (R) -mandelonitrile synthesis activity, and its specific activity, 1779 U / mg, was almost identical to the specific activity of OgraHNL expressed in insect cultured cells, 2225 U / mg (see Table 2a).
  • Example 8 Effect of temperature and pH on OgraHNL
  • Optimal temperature and temperature stability The optimal temperature and temperature stability of OgraHNL were examined. The enzyme reaction was carried out at 200 ⁇ l of a reaction solution containing 0.4 U OgraHNL, 300 mM citrate buffer (pH 4.2), 50 mM benzaldehyde, 100 mM KCN at each temperature for 5 minutes.
  • (R) -mandelonitrile was quantified using HPLC, and the measurement results are shown in FIG. 2-A. The optimum temperature for OgraHNL was estimated to be 35 ° C.
  • Example 9 Purification of NtmHNL NtmHNL was purified as follows. The cell-free extract prepared by the method of Example 6 was added to HisTrap HP (manufactured by GE Healthcare). NtmHNL was eluted with an imidazole concentration gradient (20-500 mM). The fraction from which NtmHNL was eluted was collected and added to ResourceQ (manufactured by GE Healthcare). NtmHNL was eluted with a sodium chloride concentration gradient (0-300 mM). The purification steps are summarized in Table 3. The purified NtmHNL showed (R) -mandelonitrile synthesis activity, and its specific activity was 1016 U / mg.
  • Example 10 Effect of temperature and pH on NtmHNL
  • a Optimum temperature and temperature stability The optimum temperature and temperature stability of NtmHNL were examined. The enzyme reaction was carried out at 200 ⁇ l of a reaction solution containing 0.4 U of NtmHNL, 300 mM citrate buffer (pH 4.2), 50 mM benzaldehyde, 100 mM KCN at each temperature for 5 minutes.
  • R -mandelonitrile was quantified using HPLC, and the measurement results are shown in FIG. 3-A. The optimum temperature for NtmHNL was estimated to be 30 ° C.
  • Example 11 Purification of PlumHNL Purification of PlamHNL was performed as follows. The cell-free extract prepared by the method of Example 6 was added to Ni Sepharose 6 FastFlow (GE Healthcare). PlumHNL was eluted with 20 mM KPB (pH 8.0) containing 100 mM imidazole and 500 mM sodium chloride. The purified PlumHNL showed (R) -mandelonitrile synthesis activity, and its specific activity was 1156 U / mg.
  • Example 12 Purification of Pton3HNL from recombinant E. coli Purification of Pton3HNL was performed as follows. The cell-free extract prepared by the method of Example 6 was applied to HisTrap HP (manufactured by GE Healthcare) and eluted with an imidazole concentration gradient (20-500 mM). The fraction from which Pton3HNL was eluted was collected, then applied to ResourceQ (manufactured by GE Healthcare), and eluted with a sodium chloride concentration gradient (0-300 mM). The fraction from which Pton3HNL was eluted was collected and used as a purified enzyme.
  • HisTrap HP manufactured by GE Healthcare
  • ResourceQ manufactured by GE Healthcare
  • the purified Pton3HNL showed (R) -mandelonitrile synthesis activity, and its specific activity was 2140 U / mg.
  • Example 13 Effect of temperature and pH on Pton3HNL
  • Optimum temperature and temperature stability The optimum temperature and temperature stability of Pton3HNL were examined. The enzyme reaction was carried out at 200 ⁇ l of a reaction solution containing 0.4 U of Pton3HNL, 300 mM citrate buffer (pH 4.2), 50 mM benzaldehyde, and 100 mM KCN at each temperature for 5 minutes.
  • (R) -mandelonitrile was quantified using HPLC, and the measurement result is shown in FIG. 11a. The optimum temperature for Pton3HNL was estimated to be 30 °C.
  • Example 14 Production of (R) -mandelonitrile using recombinant Escherichia coli Optically active cyanohydrin was synthesized by whole cell reaction in aqueous solution using E. coli Shuffle in which Pton3HNL was expressed. Bacteria were collected from 0.8 mL of the culture solution, suspended in 150 ⁇ L of 0.4 M citrate buffer (pH 3.0), 10 ⁇ L of 1 M benzaldehyde and 20 ⁇ L of 1 M KCN were added, and the mixture was incubated at 22 ° C. for 5 minutes. After extraction, the reaction product was analyzed by HPLC as described above and the enantiomeric excess (ee) was clarified.
  • optically active cyanohydrins are important intermediates in the production of pharmaceuticals and fine chemicals
  • the present invention is useful in fields related to the production of pharmaceuticals and fine chemicals.
  • SEQ ID NO: 1 NttHNL protein SEQ ID NO: 2: NttHNL gene SEQ ID NO: 3: NtmHNL protein SEQ ID NO: 4: NtmHNL gene SEQ ID NO: 5: OgraHNL protein SEQ ID NO: 6: OgraHNL gene SEQ ID NO: 7: PfalHNL protein SEQ ID NO: 8: PfalHNL gene SEQ ID NO: 9: Pton1HNL protein SEQ ID NO: 10: Pton1HNL gene SEQ ID NO: 11: PlamHNL protein SEQ ID NO: 12: PlamHNL gene SEQ ID NO: 13: RspHNL protein SEQ ID NO: 14: RspHNL gene SEQ ID NO: 15: conserveed amino acid sequence of millipede-derived HNL SEQ ID NO: 16: Millipede Conserved amino acid sequence of derived HNL SEQ ID NO: 17: conserveed amino acid sequence of millipede-derived HNL SEQ ID NO: 18: conserveed amino

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

ヤンバルトサカヤスデ以外のヤスデ由来のＨＮＬ遺伝子及びＨＮＬを得ること、実用的に使用できる量のＨＮＬの調製方法を提供すること、このＨＮＬを用いた光学活性シアノヒドリンの製造方法を提供する。　ヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子の製造方法。ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列ＴＡＸ1ＤＩＸ2Ｇ（配列番号１５）またはＶＰＮＧＤＫＩＨ（配列番号１６）をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択することを含む方法。（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつＨＮＬ活性を有するタンパク質。（１）配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列；（２）（１）のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は（３）（１）のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。アルデヒド等とシアン化水素等を生成する物質とを含む反応溶媒に本発明のヤスデ由来ＨＮＬを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製する方法。

Description

ヒドロキシニトリルリアーゼ
　本発明は、ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）遺伝子のクローニング法、これらの遺伝子の発現により生産された酵素、及び発現酵素を用いた光学活性シアノヒドリンの製造方法に関する。
関連出願の相互参照
　本出願は、２０１６年３月１日出願の日本特願２０１６－０３８６４０号の優先権を主張し、その全記載は、ここに特に開示として援用される。
　光学活性シアノヒドリンは、医薬やファインケミカルの製造において重要な中間体である。シアノヒドリンの製造方法としては、アルデヒドまたはケトンとシアニドドナーにヒドロキシニトリルリアーゼを作用させる方法が提唱されている（特許文献１）。ヤンバルトサカヤスデから見出された（Ｒ）-ヒドロキシニトリルリアーゼは、植物から見出されてきたヒドロキシニトリルリアーゼよりも、高い比活性と、熱とｐＨに対する優れた安定性を有している（特許文献２、非特許文献１）。
特許文献１：日本特開２０００－２１７５９０号公報
特許文献２：日本特開２０１５－１６７４７７号公報
非特許文献１：Ｄａｄａｓｈｉｐｕｒら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１１２，　１０６０５－１０６１０　（２０１５）
　特許文献２において、ヤンバルトサカヤスデから見出された（Ｒ）-ヒドロキシニトリルリアーゼは酵母で発現されているが、その発現量は微量で、大腸菌での発現系は構築されておらず、その大量調製は困難であった。
　他のヤスデもヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）を有しているのではないかと推察はされるが、酵素及び酵素遺伝子は見出されておらず、他のヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子のクローニング法は確立されていない。
　そこで本発明は、ヤンバルトサカヤスデ以外のヤスデ由来のＨＮＬ遺伝子及びＨＮＬを得る（提供する）こと、さらに、得られたるＨＮＬの発現系を確立して、実用的に使用できる量のＨＮＬを提供できる手法を提供することを目的とする。さらに本発明は、提供されたＨＮＬを用いた光学活性シアノヒドリンの製造方法を提供することも目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。
　本発明者らは、ヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子間で保存された配列から、特定の配列の縮重プライマーを用いることで、様々なヤスデからＨＮＬ遺伝子をクローニングすることができることを見出し、この方法により、様々なヤスデからＨＮＬ遺伝子及びＨＮＬを得た。さらに、昆虫培養細胞及び特定の大腸菌を用いることで、新たに見出されたＨＮＬ遺伝子を発現させ、ＨＮＬを製造し得ることを見出した。加えて、発現させたＨＮＬを用いて、光学活性シアノヒドリンを製造できることを見出して、本発明を完成した。
　本発明は以下の通りである。
［１］
ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、ＨＮＬ）遺伝子の製造方法であって、
ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列ＴＡＸ1ＤＩＸ2Ｇ(配列番号１５)（但し、Ｘ1はＬ又はＦであり、Ｘ2はＲ又はＫである）をコードする塩基配列およびＶＰＮＧＤＫＩＨ(配列番号１６)をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含む方法。
［２］
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも１つのＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより実施される、［１］に記載の方法。
［３］
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いて、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションを行うことにより実施される、［１］に記載の方法。
［４］
前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行い、シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択することにより実施される、［１］に記載の方法。
［５］
ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子が、ヤスデ網に属する生物より抽出したゲノムDNA、又は、ヤスデ網に属する生物より抽出したRNAより逆転写で得られるcDNAである［１］～［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］
前記プライマーが、下記の縮重プライマーＨＮＬ－ＦＷ及びＨＮＬ－ＲＶである［２］に記載の方法。
ＨＮＬ－ＦＷ：ＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＭＡＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号２１）、
ＨＮＬ－ＲＶ：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号２２）
ＨＮＬ－ＦＷ２：ＳＳＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＹＡＴＭＭＲＡＧＧ（配列番号２３）
ＨＮＬ－ＲＶ２：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＲＴＴＴＧＧＲＡＣ（配列番号２４）
［７］
ヤスデ網に属する生物が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデである［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］
ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法であって、
［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法でヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子を調製し、
得られたＨＮＬの遺伝子を、宿主細胞内で発現させて、ＨＮＬを得ることを含む前記方法。
［９］
前記宿主細胞が、
昆虫培養細胞である［８］に記載の方法。
［１０］
前記宿主細胞が、
ジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、［８］に記載の方法。
［１１］
下記（４）～（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
（４）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
［１２］
［１１］に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
［１３］
［１１］に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む宿主からなる形質転換体であって、前記宿主は、昆虫培養細胞、又はジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、形質転換体。
［１４］
ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法であって、
［１３］に記載の形質転換体を培養し、培養物からＨＮＬを分離することを含む、ＨＮＬの製造方法。
［１５］
宿主が昆虫培養細胞であり、ＨＮＬ遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子である、［１４］に記載の方法。
［１６］
宿主がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌であり、ＨＮＬ遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデまたはキシャヤスデ由来ＨＮＬの遺伝子である、［１４］に記載の前記方法。
［１７］
下記（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつＨＮＬ活性を有するタンパク質。
（１）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
［１８］
下記（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつＨＮＬ活性を有する［１７］に記載のタンパク質。
（１）配列表の配列番号８５又は８７に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号８５又は８７に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号８５又は８７に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
［１９］
アルデヒドまたはケトンとシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質とを含む反応溶媒にヤスデ由来ＨＮＬを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法であって、
前記ヤスデ由来ＨＮＬが、［１７］若しくは［１８］に記載のタンパク質であるか、または［１３］に記載の形質転換体である、前記方法。
　本発明によれば、様々なヤスデからＨＮＬ遺伝子をクローニングすることができる。さらに、昆虫培養細胞や、特定の遺伝子組換え大腸菌を用いて容易に高い比活性と熱安定性を有するヤスデ由来（Ｒ）-ＨＮＬを調製し、光学活性シアノヒドリンの製造に利用することができる。光学活性シアノヒドリンは医薬やファインケミカルの製造における重要な中間体であることから、本発明は、産業上非常に有用である。
図１は、タンバアカヤスデから精製したＮｔｔＨＮＬをＳＤＳ-ＰＡＧＥで分析した結果である。レーン１はＢｒｏａｄ　Ｒａｎｇｅ　Ｍａｒｋｅｒ（バイオラッド社製）を、レーン２は精製したタンバアカヤスデ由来ＨＮＬ（ＮｔｔＨＮＬ）である。 図２は、大腸菌から精製したＯｇｒａＨＮＬに対する熱とｐＨの影響を示した図である。Ａは至適温度、Ｂは至適ｐＨ、Ｃは熱安定性、ＤはｐＨ安定性である。 図３は、大腸菌から精製したＮｔｍＨＮＬに対する熱とｐＨの影響を示した図である。Ａは至適温度、Ｂは至適ｐＨである。 ＮｔｔＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）及びＮｔｔＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号２）を示す。 ＮｔｍＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）及びＮｔｍＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号４）を示す。 ＯｇｒａＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号５）及びＯｇｒａＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号６）を示す。 ＰｆａｌＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号７）及びＰｆａｌＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号８）を示す。 Ｐｔｏｎ１ＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号９）及びＰｔｏｎ１ＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号１０）を示す。： ＰｌａｍＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）及びＰｌａｍＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号１２）を示す。 ＲｓｐＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）及びＲｓｐＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号１４）を示す。 Ｐｔｏｎ３ＨＮＬの至適温度の検討結果を示す。 Ｐｔｏｎ３ＨＮＬの至適ｐＨの検討結果を示す。 Ｐｔｏｎ３ＨＮＬの温度安定性の検討結果を示す。 Ｐｔｏｎ３ＨＮＬのｐＨ安定性の検討結果を示す。 実施例１４における(R)-mandelonitrileの生産結果（ｐＨ依存性）を示す。 実施例１４における(R)-mandelonitrileの生産結果（濃度依存性）を示す。 ＰｔoｋＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８３）及びＰｔｏｋＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号８４）を示す。 Ｐｔｏｎ２ＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８５）及びＰｔｏｎ２ＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号８６）を示す。： Ｐｔｏｎ３ＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８７）及びＰｔｏｎ３ＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号８８）を示す。 ＲｓｓＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列（配列番号８９）及びＲｓｓＨＮＬ遺伝子の塩基配列（配列番号９０）を示す。
＜ＨＮＬ遺伝子の製造方法＞
　本発明は、ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）遺伝子の製造方法に関する。
　この方法は、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列ＴＡＸ1ＤＩＸ2Ｇ(配列番号１５)（但し、Ｘ1はＬ又はＦであり、Ｘ2はＲ又はＫである）をコードする塩基配列およびＶＰＮＧＤＫＩＨ(配列番号１６)をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含む方法である。
　ヤンバルトサカヤスデ以外のヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子のクローニング法は確立されていなかった。そこで本発明者らは、ヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子間で保存された配列を探索し、その結果、配列番号１５および１６で示されるアミノ酸配列は、ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列であることを見出した。
　配列番号１５のヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列は、ＴＡＸ1ＤＩＸ2Ｇであり、Ｘ1はＬ又はＦであり、Ｘ2はＲ又はＫである。Ｘ1およびＸ2の組合せは４通りある。具体的には、以下の４つである。
ＴＡＬＤＩＲＧ（配列番号１７）
ＴＡＬＤＩＫＧ（配列番号１８）
ＴＡＦＤＩＲＧ（配列番号１９）
ＴＡＦＤＩＫＧ（配列番号２０）
　配列番号１６のヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列は、ＶＰＮＧＤＫＩＨである。
　上記保存アミノ酸配列コードする塩基配列に制限はないが、例えば、後述する縮重プライマーＨＮＬ－ＦＷ（配列番号２１）及びＨＮＬ－ＲＶ（配列番号２２）、並びに縮重プライマーＨＮＬ-ＦＷ２（配列番号２３）及びＨＮＬ-ＲＶ（配列番号２４）を挙げることができる。
　さらに、実施例に示すように、保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプライマー（縮重プライマー）を用いることで、初めて、様々なヤスデからＨＮＬ遺伝子をクローニングすることができるようになった。
　実施例では、上記のように縮重プライマーを用いて様々なヤスデからＨＮＬ遺伝子をクローニングすることを示したが、本発明は、ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含む方法であれば、全て包含する。そのような方法の例としては以下の（１）～（３）の方法を例示できる。
（１）前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも１つのＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより実施される方法。
（２）前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いて、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションを行うことにより実施される方法。
（３）前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行い、シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択することにより実施される方法。
　本発明の方法で用いるヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子は、例えば、ヤスデ網に属する生物より抽出したゲノムＤＮＡ、又は、ヤスデ網に属する生物より抽出したＲＮＡより逆転写で得られるｃＤＮＡであることができる。ゲノムＤＮＡの抽出方法および、ＲＮＡから逆転写によるｃＤＮＡの調製方法は、公知の方法を適宜利用できる。
方法（１）：
　鋳型として用いるヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子は上記のように抽出したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができ、好ましくはｃＤＮＡであり、これらのＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１５および１６で示される保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも１つのＤＮＡをプライマーとして用いてＰＣＲを行う。プライマーの塩基配列は、配列番号１５および１６で示される保存アミノ酸配列をコードするものであれば、制限はないが、例えば、下記の縮重プライマーＨＮＬ-ＦＷ及びＨＮＬ-ＲＶ、並びにＨＮＬ－ＦＷ２及びＨＮＬ－ＲＶ２を挙げることができる。これら縮重プライマーを用いてＰＣＲを行い、前記生物由来のＨＮＬ遺伝子を増幅することができる。
ＨＮＬ－ＦＷ：ＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＭＡＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号２１）、
ＨＮＬ－ＲＶ：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号２２）
ＨＮＬ－ＦＷ２：ＳＳＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＹＡＴＭＭＲＡＧＧ（配列番号２３）
ＨＮＬ－ＲＶ２：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＲＴＴＴＧＧＲＡＣ（配列番号２４）
方法（２）：
　鋳型として用いるヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子は上記のように抽出したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができ、好ましくは抽出したゲノムＤＮＡであり、これらのＤＮＡを鋳型とし、前記配列番号１５および１６で示される保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも１つのＤＮＡをプローブとして用いて、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションを行う。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションは、公知の方法を適宜利用できる。プローブの塩基配列は、配列番号１５および１６で示される保存アミノ酸配列をコードするものであれば、制限はないが、例えば、前記の縮重プライマーＨＮＬ-ＦＷ及びＨＮＬ-ＲＶと同様の塩基配列又はこれら塩基配列の一部を含む塩基配列であることができる。これらプローブを用いてＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションを行い、前記生物由来のＨＮＬ遺伝子を得る。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションで得られたＨＮＬ遺伝子は、ＰＣＲなど公知の増幅方法で適宜増幅することができる。
方法（３）：
　ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行う。シーケンシングを行う対象は、上記のように抽出したゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡであることができる。シーケンシングの方法は公知の方法を適宜利用することができる。シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択する。
　ヤスデ科に属する生物には限定はない。ヤスデ網に属する生物には、例えば、オビヤスデ目オビヤスデ科のオビヤスデ、オビヤスデ目ハガヤスデ科のハガヤスデ、オビヤスデ目チビヤスデ科チビヤスデを挙げることができる。
　実施例では、オビヤスデ目ヤケヤスデ科に属すウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、オビヤスデ目ババヤスデ科に属すヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、及びアマビコヤスデのＨＮＬ遺伝子をクローニングすることができたことを示す。
　ｃＤＮＡ調製方法及びｃＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法は、公知の方法である。実施例の記載も参照して、縮重プライマーとして上記ＨＮＬ－ＦＷ及びＨＮＬ－ＲＶを用いることで実施できる。
＜ＨＮＬ遺伝子＞
　本発明は、下記（４）～（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子に関する。
（４）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
（５）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
（６）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（４）の配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８及び９０に記載の塩基配列を有する遺伝子は、それぞれ、タンバアカヤスデ、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、ミドリババヤスデ、キシャヤスデ、アマビコヤスデの一種、パラホンタリア・タカイタメシス（Parafontaria tokaiensis）、ミドリババヤスデ、ミドリババヤスデ、及びアマビコヤスデ由来のＨＮＬ遺伝子である。
（４）、（５）、及び（６）に記載の「ＨＮＬ活性を有するタンパク質」のＨＮＬ活性の測定方法は、実施例に示す「（Ｒ）-マンデロニトリル合成活性の測定方法」に記載がある。
　本明細書で言う「１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列」における「１から５０個」の範囲は特には限定されないが、例えば、好ましくは１から４０個、より好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１０個、さらに好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度を意味する。
　配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列において１から数個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有少なくともタンパク質をコードする塩基配列を有する遺伝子（以下、これらの遺伝子を変異遺伝子と称する）については、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法又は突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。
　例えば、配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列を有するＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて調製することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載の方法に準じて行うことができる。
　上記した「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、ＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味し、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１～２×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡ等を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、プローブとして使用するＤＮＡの塩基配列と一定以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば９０％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
　本発明の遺伝子の取得方法は特に限定されないが、好ましくは前記本発明のＨＮＬ遺伝子の製造方法がある。
　本発明は、上記本発明の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを包含する。さらに本発明は、宿主生物中に、本発明のプラスミドを前記本発明の遺伝子がコードするＨＮＬを発現可能に含む、形質転換体を包含する。前記宿主生物としては、昆虫培養細胞、及びジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌を挙げることができる。
　本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。即ち、本発明のプラスミドに用いるベクターとしては、宿主生物内で本発明のＨＮＬ遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このような発現ベクターとして、昆虫培養細胞の場合には、例えば、pFastbac1、BacPAK6、pIEx-1、pBiEx-1などが挙げられる。
　昆虫細胞で作動可能なプロモータの例としては、ポリヘドリンプロモータ、Ｐ１０プロモータ、オートグラファ・カリホルニカ・ポリヘドロシス塩基性タンパクプロモータ、バキュウロウイルス即時型初期遺伝子１プロモータ、またはバキュウロウイルス３９Ｋ遅延型初期遺伝子プロモータ等がある。
　大腸菌の場合、発現ベクターとしては、例えば、pUC19 (タカラバイオ社製)、pBluescript、pET28、pCDF、pRSF,などが挙げられる。大腸菌で作動可能なプロモータの例としては、例えば、lac、trp若しくはtacプロモータなどが挙げられる。
＜ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法＞
　本発明は、ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法を包含する。
　ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法（１）は、上記本発明の方法でヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子を調製し、得られたＨＮＬの遺伝子を、昆虫培養細胞を宿主として用いて発現させて、ＨＮＬを得ることを含む方法である。
　ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法（２）は、上記本発明の方法でヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子を調製し、得られたＨＮＬの遺伝子を、大腸菌を宿主として用いて発現させて、ＨＮＬを得ることを含み、前記大腸菌がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、方法である。
　ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法（３）は、前記本発明の形質転換体を培養し、培養物からＨＮＬを分離することを含む、ＨＮＬの製造方法である。
　この方法（３）の具体例としては、（３－１）宿主が昆虫培養細胞であり、ＨＮＬ遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子である方法、及び（３－２）宿主がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌であり、ＨＮＬ遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデまたはキシャヤスデ由来ＨＮＬの遺伝子である方法を挙げることができる。
　ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法（３－１）は、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子を昆虫培養細胞を宿主として用いて発現させて、ＨＮＬを得ることを含む方法である。
　ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法（３－２）は、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデまたはキシャヤスデ由来ＨＮＬの遺伝子を、大腸菌を宿主として用いて発現させて、ＨＮＬを得ることを含み、前記大腸菌がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である方法である。
　昆虫細胞を宿主として用いる方法（１）及び（３－１）の場合には、公知の方法を用いて組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、タンパク質を発現させることができる。バキュロウイルスとしては、例えば、ヨトウガ科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus)等を用いることができる。
　昆虫細胞としては、Spodoptera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクターズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W. H. Freeman and Company)、ニューヨーク(New York)、(1992)〕、Trichoplusia niの卵巣細胞であるＨｉＦｉｖｅ(インビトロジェン社製)等を用いることができる。組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法又はリポフェクション法等を挙げることができる。
　宿主微生物として大腸菌を用いる方法（２）及び（３－２）の場合、ジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌やチオレドキシンレダクターゼとグルタチオンレダクターゼに変異を有する大腸菌を用いる。ジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌としては、実施例で用いた、SHuffle T7を挙げることができる。チオレドキシンレダクターゼとグルタチオンレダクターゼに変異を有する大腸菌としては、Origami及びRosetta-gami系列の大腸菌 (メルクミリポア社製)を挙げることができる。大腸菌の形質転換は、例えば、プロトプラスト法、または公知の方法でコンピテント細胞を用いることにより行えばよい。
　上記の形質転換体は、導入された遺伝子の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。形質転換体の培養物から、ＨＮＬを単離精製するには、通常のタンパク質の単離、精製法を用いればよい。例えば、ＨＮＬが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ＨＮＬを精製標品として得ることができる。
＜ＨＮＬ活性を有するタンパク質＞
　本発明は、下記（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつＨＮＬ活性を有するタンパク質に関する。
（１）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列；
（２）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
（３）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
（１）の配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７及び８９に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、それぞれ、タンバアカヤスデ、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、ミドリババヤスデ、キシャヤスデ、アマビコヤスデの一種、パラホンタリア・タカイタメシス（Parafontaria tokaiensis）、ミドリババヤスデ、ミドリババヤスデ、及びアマビコヤスデ由来のＨＮＬである。配列番号９、８５及び８７に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質は、いずれもミドリババヤスデ由来のＨＮＬであるが、採取地が異なる。
　本発明のＨＮＬ活性を有するタンパク質のＨＮＬ活性の測定方法は、実施例に示す「（Ｒ）-マンデロニトリル合成活性の測定方法」に記載がある。
　本発明のタンパク質の（２）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「１から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列」における「１から５０個」の範囲は、欠失等を有するタンパク質が、ＨＮＬ活性を有する酵素であることを意味する。前記「１から５０個」の範囲は、前記ＨＮＬ活性を有するタンパク質である割合が高いという観点から、例えば、１から４０個、好ましくは１から３０個、より好ましくは１から２０個、さらに好ましくは１から１０個、一層好ましくは１から７個、さらに一層好ましくは１から５個、特に好ましくは１から３個程度であることができる。
　本発明のタンパク質の（３）は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質である。ここで言う「配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列」における同一性は、前記アミノ酸配列の同一性を有するタンパク質が、前記ＨＮＬ活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の同一性は、９０％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％、特に好ましくは９９％以上である。
　本発明のＨＮＬ活性を有するタンパク質の取得方法は特に制限されず、化学合成により合成したタンパク質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換えタンパク質でもよい。本発明のＨＮＬ活性を有するタンパク質は、上記ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、生産方法により調製することができる。上記ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の取得方法としては、前述の本発明方法を挙げることができる。本発明のタンパク質の調製方法は、例えば、前述の本発明のヤスデ由来ＨＮＬの製造方法であることができる。
＜光学活性シアノヒドリンの製造方法＞
　本発明は、光学活性シアノヒドリンの製造方法を包含する。
　この方法は、アルデヒドまたはケトンとシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質とを含む反応溶媒にヤスデ由来ＨＮＬを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製することを含む。
　ヤスデ由来ＨＮＬが、前記本発明のＨＮＬ活性を有するタンパク質であるか、または前記本発明の形質転換体である。本発明のＨＮＬ活性を有するタンパク質は、粗酵素であっても精製酵素であっても良い。本発明の形質転換体は、菌体自身であっても、菌体の破砕物等であってもよい。
　光学活性シアノヒドリンの製造方法は、ヤスデ由来ＨＮＬが、本発明のＨＮＬ活性を有するタンパク質であるか、または本発明の形質転換体であること以外は、特許文献１に記載の方法を参照できる。
本発明の製造方法において、反応基質となるアルデヒドまたはケトンは、例えば、式(I) Ｒ1 －（Ｃ＝Ｏ）Ｒ2で表される化合物であることができる。
式(I) において、Ｒ1 とＲ2 は、(i)水素原子、(ii)置換または非置換の炭素数１～18の線状または分枝鎖状の飽和アルキル基、または(iii) 置換または非置換の環員が５～22の芳香族基である。ただし、Ｒ1 とＲ2 は同時に水素原子を表すことはない。上記(ii)で、Ｒ1 とＲ2 が置換アルキル基の場合、置換基は、１個またはそれ以上のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、炭素数１～８のアルコキシ基、ハロゲン、カルボキシル基、炭素数３～20のシクロアルキル基、または N 、O、Sのヘテロ原子で置換されていてもよい炭素数22までの芳香属基である（ここで、置換基が環状置換基の場合は、それ自体が１個またはそれ以上のハロゲン、ヒドロキシ基、炭素数１～８の線状若しくは分枝鎖状のアルキル基、炭素数２～８の線状若しくは分枝鎖状のアルケニル基で置換されていてもよい。）。上記(iii) で、芳香族基は、環員の４個までがＮ、Ｏおよび／またはＳによって置換されているヘテロ芳香族基であってもよい。また、Ｒ1 とＲ2 が置換芳香族基の場合、置換基は、１個またはそれ以上のアミノ基、イミノ基、ヒドロキシ基、炭素数１～８のアルコキシ基、アリルオキシ基、ハロゲン、カルボキシル基、炭素数22までの線状若しくは分枝鎖状の飽和若しくは不飽和のアルキル基である（ここで、一つの芳香族基が少なくとも２個の置換基により置換されてもよい）。
上記のアルデヒドまたはケトンを光学活性なシアノヒドリンに変換するためにはシアン化水素を原料として用いるが、シアン化水素の供給方法は、液体として供給する方法、気体として供給する方法のいずれをも採用できる。また、シアン化水素だけではなく、シアン化水素の水溶液であるシアン化水素酸（すなわち青酸）も全く同様に用いることができる。さらに、反応系へ添加することによってシアン化物イオン（CN- ) を生じる物質であれば用いることができ、例えば、シアン化ナトリウムやシアン化カリウムなどのシアン化水素塩、アセトンシアンヒドリンなどのシアノヒドリン類などが挙げられる。
反応溶媒としては、反応系内に水が大量に存在すると、酵素反応によって生成した光学活性シアノヒドリンのラセミ化が起こりやすくなったり、水に対する溶解度の小さいアルデヒドまたはケトンを原料として用いる場合には生産効率が低下するなどの点から、水に
難溶または不溶である有機溶媒を主成分としてなる反応溶媒を用いることが好ましい。かかる有機溶媒としては、酵素反応による光学活性シアノヒドリンの合成反応に影響を与えないものであれば特に制限なく用いることができ、合成反応に用いる原料のアルデヒドまたはケト
ンの物性、生成物であるシアノヒドリンの物性に応じて適宜選択することができる。具体的には、ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和炭化水素系溶媒、例えば、ペンタン、ヘキサン、トルエン、キシレン、塩化メ
チレンなど；ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和アルコール系溶媒、例えば、イソプルピルアルコール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｔ－ブタノール、ヘキサノール、シクロヘキサノール、ｎ－アミルアルコールなど；ハロゲン化されていてもよい脂肪族また
は芳香族の直鎖状または分枝状または環状の飽和または不飽和エーテル系溶媒、例えば、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソピルエーテル、ジブチルエーテル、メチル－ｔ－ブチルエーテルなど；ハロゲン化されていてもよい脂肪族または芳香族の直鎖状または分枝
状または環状の飽和または不飽和エステル系溶媒、例えば、ギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチルなどが挙げられ、これらを単独で用いても、また複数を混合して用いてもよい。また、これらの有機溶媒は、pH7 以下の水系緩衝液、例えばク
エン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液などで飽和させてもよい。
反応溶媒中のアルデヒドまたはケトンの濃度は0.01mM～5Mの範囲が好ましく、アルデヒドまたはケトン１モルに対してシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質１～20モル、アルデヒドまたはケトンの濃度に対して1unit/mmol以上の酵素活性を示す量の、例えば、組換え微生物菌体を使用することができる。なお、菌体の酵素活性は、例えば、菌体を水または緩衝液に懸濁させてから破砕し、遠心分離によって得た上澄み液を用い、DL-マンデロニトリルを基質として、基質が酵素によって分解されてベンズアルデヒドを生成する際の吸光度変化を249.6nmの波長で測定することによって算出できる。
反応溶媒のｐＨは、上記有機溶媒を水系緩衝液で飽和させずに用いる場合には調整する必要はないが、水系緩衝液で飽和させて用いる場合には、水系緩衝液のｐＨを３～７の範囲、好ましくは３～６の範囲に調
整する。反応温度は酵素反応によらないラセミシアノヒドリンの副生を抑制するために、酵素活性が発揮される範囲でできる限り低いほうが好ましく、通常０～５０℃、好ましくは１０～４５℃とする。
反応が終了したならば、反応液と菌体とを分離して反応生成液を得る。この反応生成液から光学活性シアノヒドリン以外の成分を分離することによって、目的の光学活性シアノヒドリンを得る。生成物の分離に
は、蒸留分離、カラムクロマトグラフィー分離、抽出分離など通常用いられる手段で行いうる。このとき、脱水剤などを添加して脱水処理をしたり、安定剤などを添加してもよい。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
（Ｒ）－マンデロニトリル合成活性の測定方法
０．４ＵのＨＮＬ、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ４～５）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、３０～３５℃の温度で５分間行い、ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）-マンデロニトリルを定量する。
実施例１：タンバアカヤスデ由来ＨＮＬ（ＮｔｔＨＮＬ）の精製
　タンバアカヤスデ、Ｎｅｄｙｏｐｕｓ　ｔａｍｂａｎｕｓ　ｔａｍｂａｎｕｓ（Ａｔｔｅｍｓ）を富山県立大学内で採集した。ヤスデから粗酵素液を抽出し、以下のようにＮｔｔＨＮＬの精製を行った。
　粗酵素液に、硫酸アンモニウムを３５％飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを添加した後に、ＨｉＴｒａｐ　Ｂｕｔｙｌ　ＨＰ（ＧＥ　ヘルスケア社製）に吸着させ、硫酸アンモニウムの濃度勾配で溶出した。脱塩後、ＮｔｔＨＮＬをＲｅｓｏｕｒｃｅＱに吸着させ、ＮａＣｌの濃度勾配で溶出した。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５　１０／３００　ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、ＰＢＳで溶出した。精製したＮｔｔＨＮＬは（Ｒ）－マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性は４７００Ｕ／ｍｇであった。
　精製したＮｔｔＨＮＬのＮ末端アミノ酸配列解析ならびに内部配列解析を行った。その結果、Ｎ末端アミノ酸配列、ＥＥＥＰＬＴＸＤＫＬ、内部アミノ酸配列、ＥＥＥＰ（Ｉ／Ｌ）ＴＣＤＱ（Ｉ／Ｌ）ＰＫ、（Ｉ／Ｌ）ＱＴＱＡＶＥＶＡＫを得た。
実施例２：ＮｔｔＨＮＬ遺伝子のクローニング
　タンバアカヤスデからＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を使用してｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＮｔｔＨＮＬのＮ末端アミノ酸配列と内部配列から縮重プライマーを設計し、ＮｔｔＨＮＬをコードするｃＤＮＡの部分配列をＰＣＲにより増幅した。
縮重プライマー配列：
ＮｔｔＨＮＬ－Ｆ：ＧＡＲＧＡＲＣＣＮＨＴＮＡＣＮＴＧＹＧＡＴＡＡ（配列番号２５）、
ＮｔｔＨＮＬ－Ｒ：ＴＴＹＴＣＮＡＣＮＧＣＹＴＧＮＧＴＣＴＧ（配列番号２６）
　増幅したＤＮＡは、ｐＣＲ-ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へつなぎこみ、インサートの塩基配列を決定した。続いて、内部配列から設計したプライマーを用いて、５’－および３’－ＲＡＣＥを行うことでＮｔｔＨＮＬをコードするｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した。
プライマー配列：
ＮｔｔＨＮＬ－Ｆ１：ＧＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＴＣＣＧＴＴＡＧＡＡＧＡＴＴＴＴ（配列番号２７）、
ＮｔｔＨＮＬ－Ｆ２：ＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＣＡＴＴ（配列番号２８）、
ＮｔｔＨＮＬ－Ｒ１：ＣＴＣＴＧＣＡＡＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＡＣＧＴＡ（配列番号２９）、
ＮｔｔＨＮＬ－Ｒ１：ＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＴＴＣＡＡＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴ（配列番号３０）
　続いて、ジーンスペシフィックプライマーを用いてＮｔｔＨＮＬをコードする領域をＰＣＲにより増幅し、ｐＣＲ-ｂｌｕｎｔへつなぎこみ、塩基配列を決定した。
ジーンスペシフィックプライマー配列：
ＮｔｔＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧ（配列番号３１）、
ＮｔｔＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧ（配列番号３２）
実施例３：ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子のホモロジークローニング
　ウマガエシアカヤスデ（Ｎ．　ｔａｍｂａｎｕｓ　ｍａｎｇａｅｓｉｎｕｓ　（Ａｔｔｅｍｓ））、ヤケヤスデ（Ｏｘｉｄｕｓ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　（Ｃ．　Ｌ．　Ｋｏｃｈ））、ヘラババヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ　ｆａｌｃｉｆｅｒａ　（Ｖｅｒｈｏｅｆｆ））、キシャヤスデ（Ｐ．　ｌａｍｉｎａｔａ　（Ａｔｔｅｍｓ））、ミドリババヤスデ（Ｐ．　ｔｏｎｏｍｉｎｅａ　Ａｔｔｅｍｓ）、アマビコヤスデの１種（Ｒｉｕｋｉａｒｉａ　ｓｐ．）、それぞれ１個体から、前述の方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製し、Ｇｅｎｅ　Ｒａｃｅｒ　ＫｉｔまたはＳＭＡＲＴ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＣｈｕａＨＮＬとＮｔｔＨＮＬの相同配列から設計した縮重プライマーを用いてＰＣＲを行うことで、各ヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子の部分配列を増幅した。
縮重プライマー配列：
ＨＮＬ－ＦＷ：ＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＭＡＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号１７）、
ＨＮＬ－ＲＶ：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号１８）
　続いて、部分配列から設計したプライマーを用いて５’－および３’－ＲＡＣＥを行うことで各ヤスデ由来ＨＮＬをコードするｃＤＮＡの全長の塩基配列を決定した。
プライマー配列：
ＮｔｍＨＮＬ－Ｆ１：ＴＧＧＴＧＧＡＣＣＴＡＡＴＡＡＣＴＣＣＧＣＣＡＴＡ（配列番号３３）、
ＮｔｍＨＮＬ－Ｆ２：ＣＣＣＡＧＡＴＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＡＴＴＧＣＧＣＴＴＡ（配列番号３４）、
ＮｔｍＨＮＬ－Ｒ１：ＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＧＴＴＣＣＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＴ（配列番号３５）、
ＮｔｍＨＮＬ－Ｒ２：ＧＣＣＡＴＴＧＣＡＣＧＴＡＴＡＡＧＣＧＣＡＡＴＡＴ（配列番号３６）、
ＯｇｒａＨＮＬ－Ｆ１：ＣＧＴＴＧＧＴＧＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴＡＴ（配列番号３７）、
ＯｇｒａＨＮＬ－Ｆ２：ＣＡＣＣＡＡＴＣＴＧＡＡＣＡＣＴＣＣＡＡＡＴＧＧＡＡ、（配列番号３８）
ＯｇｒａＨＮＬ－Ｒ１：ＧＧＡＴＣＧＧＴＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＴＴＡ（配列番号３９）、
ＯｇｒａＨＮＬ－Ｒ２：ＣＧＴＡＴＡＧＧＣＧＣＡＡＴＡＧＧＡＧＣＴＴＣＣＡＴＴ（配列番号４０）、
ＰｆａｌＨＮＬ－Ｆ１：ＧＡＣＴＴＣＡＣＣＡＴＴＧＧＴＴＣＴＧＡＴＴＣＴＡＴ（配列番号４１）、
ＰｆａｌＨＮＬ－Ｆ２：ＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＴＡ（配列番号４２）、
ＰｆａｌＨＮＬ－Ｒ１：ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＧＴＡＧＣＴＧＡＴＡＴＧＴ（配列番号４３）、
ＰｆａｌＨＮＬ－Ｒ２：ＣＧＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＡＴ（配列番号４４）、
ＰｌａｍＨＮＬ－Ｆ１：ＡＴＴＣＡＡＧＧＡＡＣＴＣＡＣＡＴＡＡＣＡＡＴＡＡＡＴＧＡＣＴＴＣ（配列番号４５）、
ＰｌａｍＨＮＬ－Ｆ２：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣＴＧＡＴＣＧ（配列番号４６）、
ＰｌａｍＨＮＬ－Ｒ１：ＧＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＡＴＴＣ（配列番号４７）、
ＰｌａｍＨＮＬ－Ｒ２：ＧＡＧＴＴＧＴＴＴＡＧＧＣＧＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＡＴＴＣ（配列番号４８）、
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－Ｆ１：ＧＧＴＣＣＣＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＣＴＡＴＴＴ（配列番号４９）、
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－Ｆ２：ＧＧＴＧＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＴＧＣＡＴＡＣＴＴＴＴ（配列番号５０）、
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－Ｒ１：ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＧＡＴＡＴＧＴＡ（配列番号５１）、
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－Ｒ２：ＧＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＡＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＡＴＡ（配列番号５２）、
ＲｓｐＨＮＬ－Ｆ１：ＣＣＧＧＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＧＴＴＴＧＧＴＡ（配列番号５３）、
ＲｓｐＨＮＬ－Ｆ２：ＧＧＧＴＧＣＣＡＡＣＴＡＴＴＧＣＧＣＡＴＡＣＴＣＴＴ（配列番号５４）、
ＲｓｐＨＮＬ－Ｒ１：ＧＣＣＡＧＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴＧＴＡＴＴ（配列番号５５）、
ＲｓｐＨＮＬ－Ｒ２：ＣＡＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴ（配列番号５６）
ＰｔｏｋＨＮＬ－Ｆ１：ＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＴＴＣＧＡＣＴＡＡＴＴＧＴＧＡＴ(配列番号９１)
ＰｔｏｋＨＮＬ－Ｆ２：ＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＴＡ(配列番号９２)
ＰｔｏｋＨＮＬ－Ｒ１：ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＧＡＴＡＴＧＴＡＴ(配列番号９３)
ＰｔｏｋＨＮＬ－Ｒ２：ＧＣＡＡＧＡＧＴＡＧＣＣＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＡＧＴＴＧ(配列番号９４)
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－Ｆ１：ＣＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＣＴＡ(配列番号９５)
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－Ｆ２：ＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＡＴＡ(配列番号９６)
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－Ｒ１：ＧＧＣＧＡＴＡＴＧＴＡＴＣＣＡＧＴＡＴＴＣＧＴＡＧＴＧＣＡ(配列番号９７)
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－Ｒ２：ＣＧＧＧＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴ(配列番号９８)
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－Ｆ１：ＣＴＧＡＣＡＧＣＣＴＡＴＴＴＧＡＣＴＡＡＴＴＧＴＧＡＴ(配列番号９９)
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－Ｆ２：ＧＣＡＴＡＣＴＣＴＴＧＣＡＡＴＧＧＴＴＣＣＧＡＡＡ(配列番号１００)
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－Ｒ１：ＧＣＣＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＧＧＣＧＡＴＡＴＧＴＡＴ(配列番号１０１)
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－Ｒ２：ＣＧＧＡＡＣＣＡＴＴＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＣＡ(配列番号１０２)
ＲｓｓＨＮＬ－Ｆ１：ＧＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡＴＴＧＴＡＴ(配列番号１０３)
ＲｓｓＨＮＬ－Ｆ２：ＣＧＴＣＧＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＧＣＣＡＡ(配列番号１０４)
ＲｓｓＨＮＬ－Ｒ１：ＧＣＣＡＧＣＴＡＴＡＴＴＧＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＴ(配列番号１０５)
ＲｓｓＨＮＬ－Ｒ２：ＣＣＡＴＣＧＣＡＡＧＡＧＴＡＴＧＣＧＣＡＡＴＡＧＴＴ(配列番号１０６)
　続いて、ジーンスペシフィックプライマーを用いて各ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする領域をＰＣＲにより増幅し、ＰｌａｍＨＮＬはＴ－Ｖｅｃｔｏｒ　ｐＭＤ２０ベクター（タカラ社製）へ、その他はｐＣＲ－ｂｌｕｎｔへつなぎこみ、塩基配列を決定した。
ジーンスペシフィックプライマー配列：
ＮｔｍＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＴＣＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣ（配列番号５７）、
ＮｔｍＨＮＬ－ＲＶ：ＴＣＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧ（配列番号５８）、
ＯｇｒａＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＴＴＣＡＡＴＡＣＴＴＴ（配列番号５９）、
ＯｇｒａＨＮＬ－ＲＶ：ＣＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧ（配列番号６０）、
ＰｆａｌＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＧ（配列番号６１）、
ＰｆａｌＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧ（配列番号６２）、
ＰｌａｍＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＴＧＡＣＴＧ（配列番号６３）、
ＰｌａｍＨＮＬ－ＲＶ：ＧＣＴＴＡＡＴＴＣＡＡＴＴＧＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣ（配列番号６４）、
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧＧ（配列番号６５）、
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＴＧ（配列番号６６）、
ＲｓｐＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧ（配列番号６７）、
ＲｓｐＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号６８）
ＰｔｏｋＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ(配列番号１０７)
ＰｔｏｋＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧ(配列番号１０８)
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ(配列番号１０９)
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＧＧＴＧ(配列番号１１０)
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ(配列番号１１１)
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＧＧ(配列番号１１２)
ＲｓｓＨＮＬ－ＦＷ：ＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＡＡＣ(配列番号１１３)
ＲｓｓＨＮＬ－ＲＶ：ＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧ(配列番号１１４)
　各略語は以下の通りである。
ＣｈｕａＨＮＬ：ヤンバルトサカヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ
ＮｔｔＨＮＬ：タンバアカヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号１）
ＮｔｍＨＮＬ：ウマガエシアカヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号３）
ＯｇｒａＨＮＬ：ヤケヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号５）
ＰｆａｌＨＮＬ：ヘラババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号７）
Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ：ミドリババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号９）
ＰｌａｍＨＮＬ：キシャヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号１１）
ＲｓｐＨＮＬ：アマビコヤスデの１種由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号１３）
ＰｔｏｋＨＮＬ：P. tokaiensis由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号８３）
Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ：ミドリババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号８５）
Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ：ミドリババヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号８７）
ＲｓｓＨＮＬ：アマビコヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（配列番号８９）
　それぞれのアミノ酸配列を配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７、及び８９に示す。
　それぞれの遺伝子の塩基配列を配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４８４、８６、８８、及び９０に示す。それぞれのアミノ酸配列の相同性を表１にまとめた。この方法で、ＣｈｕａＨＮＬと、４１％以上の相同性を有するヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼをコードする遺伝子をクローニングできることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例４：ＣｈｕａＨＮＬ遺伝子のクローニング
　ヤンバルトサカヤスデから実施例３に示した方法でｔｏｔａｌ　ＲＮＡを調製し、ｃＤＮＡを合成した。プライマーを用いてＣｈｕａＨＮＬをコードする領域を増幅し、ｐＣＲ－ｂｌｕｎｔへつなぎこんだ。
プライマー配列：
ＣｈｕａＨＮＬ－ＦＷ：ｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＴＧＡＧＴＴＣＡＣＴＡＧＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＡＡ（配列番号６９）、
ＣｈｕａＨＮＬ－ＲＶ：ａａｇｃｔｔＡＧＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣＧ（配列番号７０）
実施例５：昆虫培養細胞におけるヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の発現
　上記のヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子をバキュロウイルス－昆虫細胞発現系を用いて発現した。インサートＤＮＡは実施例２，３および４で得た各プラスミドＤＮＡを鋳型とし、各種プライマーとＴｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　を用いてＰＣＲにより調製した。
各種プライマー配列：
ＩＦＳｆ－ＮｔｔＨＮＬ－ＦＷ：ｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＧＡＴＴＣ（配列番号７１），
ＩＦＳｆ－ＮｔｔＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧ（配列番号７２），
ＩＦＳｆ－ＮｔｍＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＴＴＴＣＧＡＴＴＣＴＴＣ（配列番号７３），
ＩＦＳｆ－ＮｔｍＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＣＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧＧ（配列番号７４），
ＩＦＳｆ－ＯｇｒａＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＴＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＴＴＣＡＡＴＡＣ（配列番号７５），
ＩＦＳｆ－ＯｇｒａＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＣＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＣＡＡＡＡＣＡＧＣＣＡＴＧ（配列番号７６），
ＩＦＳｆ－ＰｆａｌＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＴＴＣＣＴＣＡＣＧ（配列番号７７），
ＩＦＳｆ－ＰｆａｌＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧ（配列番号７８），
ＩＦＳｆ－Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＡＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＧ（配列番号７９），
ＩＦＳｆ－Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＴＧ（配列番号８０），
ＩＦＳｆ－ＲｓｐＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧ（配列番号８１），
ＩＦＳｆ－ＲｓｐＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＧＣＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＴＡＧＧＧ（配列番号８２）
ＩＦＳｆ－ＰｔｏｋＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ(配列番号１１５)
ＩＦＳｆ－ＰｔｏｋＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＧＧＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＧ(配列番号１１６)
ＩＦＳｆ－Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ(配列番号１１７)
ＩＦＳｆ－Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＧＧＴＧ(配列番号１１８)
ＩＦＳｆ－Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＣＡＣＧ(配列番号１１９)
ＩＦＳｆ－Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔＴＴＡＧＴＡＡＴＡＧＡＧＡＧＧＡＣＡＧＴＡＡＡＧＧ(配列番号１２０)
ＩＦＳｆ－ＲｓｓＨＮＬ－ＦＷ：ｃａｔｃｇｇｇｃｇｃｇｇａｔｃｃＡＴＧＡＣＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＡ(配列番号１２１)
ＩＦＳｆ－ＲｓｓＨＮＬ－ＲＶ：ａｃｔｔｃｔｃｇａｃａａｇｃｔｔｔｔａｇｃＴＡＴＡＧＡＡＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＧＧ(配列番号１２２)
　インサートＤＮＡをｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター（インビトロジェン社製）のＢａｍＨＩ－ＨｉｎｄＩＩＩサイトへＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてつなぎこんだ。さらに、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡社製）を用いて各ヒドロキシニトリルリアーゼのシグナルペプチド切断部位直下にＨｉｓタグをコードする配列を導入した。なお、シグナルペプチド切断部位はＳｉｇｎａｌＰ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：７８５－７８６，２０１１）を用いて予測した。その後、ＰＣＲによる変異がないことをインサートの配列をシークエンスし、確認した。得られた各プラスミドを大腸菌ＤＨ１０ＢＡＣへ導入し、形質転換体から組換えバクミドＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出した。組換えバクミドＤＮＡはＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ　９　ＤＮＡ　トランスフェクション試薬（ロシュ社製）を用いてＳｆ９細胞にトランスフェクションした。組換えバキュロウイルスを回収し、再度、Ｓｆ９細胞に感染させることで組換えバキュロウイルスを増幅し、さらにＳｆ９細胞に感染させることで組換えバキュロウイルスを増幅した。組換えバキュロウイルスのタイターは、ｉｅ１遺伝子増幅プライマー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．，　２０：３５4-３６０，　２００４）を用いたリアルタイムＰＣＲによって、タイター既知のバキュロウイルスゲノムＤＮＡとサンプルを比較することで算出した。なお、組換えバキュロウイルスＤＮＡはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　Ｖｉｒｕｓ（タカラ社製）を用いて調製した。
　各ヤスデ由来ＨＮＬは各組換えバキュロウイルスを多重感染度１で、Ｓｆ９細胞（１．５ｘ１０6細胞／ｍＬ）に感染させることによって、分泌発現させた。組換えバキュロウイルス感染７２時間後に遠心分離で細胞を除き、培養上清を回収した。培養上清と等量の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）で希釈し、ｃＯｍｐｌｅｔｅ　Ｈｉｓｔａｇ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｉｎ（ロシュ社製）に添加した。担体に吸着した各ＨＮＬは０．１Ｍ　イミダゾールと０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）で溶出した。溶出液に、３０％飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた溶液を、ＨｉＴｒａｐ　Ｂｕｔｙｌ　ＨＰ（ＧＥ　ヘルスケア社製）に添加し、硫酸アンモニウムの濃度勾配（３０-０％）で溶出した。脱塩後、各ＨＮＬをＲｅｓｏｕｒｃｅＱに吸着させ、ＮａＣｌの濃度勾配（０-３００ｍＭ）で溶出した。精製したＨＮＬの純度はＳＤＳ-ＰＡＧＥにより解析した。
　タンパク質濃度は、ウシ胎仔血清由来アルブミンをスタンダードとし、ＴａＫａＲａ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（タカラ社製）を用いて測定した。各ヒドロキシニトリルリアーゼは（Ｒ）-マンデロニトリルの合成活性を示した。表２ａ参照。
実施例６：大腸菌におけるヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の発現
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７（ニューイングランドバイオラボ社製）における、ＣｈｕａＨＮＬ、ＮｔｔＨＮＬ、ＮｔｍＨＮＬ、ＯｇｒａＨＮＬ、ＰｆａｌＨＮＬ、Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ、ＰｌａｍＨＮＬ、ＲｓｐＨＮＬ、ＰｔｏｋＨＮＬ、Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ、Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ、ＲｓｓＨＮＬ遺伝子発現を試みた。
　シグナル配列を除いた領域をインサートＤＮＡとするため、実施例３で得た各プラスミドＤＮＡを鋳型とし、各種プライマーとＴｋｓ　Ｇｆｌｅｘ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　を用いてＰＣＲを行った。Ｈｉｓタグ融合タンパク質として発現するように、インサートＤＮＡをｐＥＴ２８ベクター（クロンテック社製）のＮｄｅＩ-ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ、Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてつなぎこんだ。なお、ＰｌａｍＨＮＬはｐＥＴ２８ベクターのＢａｍＨＩ-ＨｉｎｄＩＩＩサイトへつなぎこんだ。その後、ＰＣＲによる変異がないことをインサートの配列をシークエンスし、確認した。得られた各プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７（ニューイングランドバイオラボ社製）に導入した。形質転換体を、カナマイシンを含んだＬＢ培地で３０℃、１６時間培養後、ＴＢオートインダクション培地に植え継ぎ、２６℃で２４時間培養した。集菌後、超音波で破砕し、遠心分離で不溶性物質を沈殿させ、無細胞抽出液を得た。
　ヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の発現は、マンデロニトリルの分解活性で評価した。すなわち、２ｍＭの（Ｒ，Ｓ）-マンデロニトリルを含んだ０．１Ｍクエン酸バッファーに無細胞抽出液を添加し、ベンズアルデヒドの生成を２８０ｎｍでモニターした。
　大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ではいずれのヒドロキシニトリルリアーゼ遺伝子の発現は認められなかった。しかし、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ　Ｔ７においては、ＮｔｍＨＮＬ、ＯｇｒａＨＮＬ、Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ、Ｐｔｏｎ３ＨＮＬおよびＰｌａｍＨＮＬ遺伝子の発現が認められた(表２ａ参照)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　後続の実施例７～１３では、発現した、ＮｔｍＨＮＬ、ＯｇｒａＨＮＬ、ＰｌａｍＨＮＬ、及びＰｔｏｎ３ＨＮＬを精製し、酵素化学的諸性質を解明することにした。
実施例７：ＯｇｒａＨＮＬの精製
　ＯｇｒａＨＮＬの精製は以下のように行った。実施例６の方法で調製した無細胞抽出液をＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に添加した。ＯｇｒａＨＮＬはイミダゾールの濃度勾配（２０-５００ｍＭ）で溶出した。ＯｇｒａＨＮＬが溶出されたフラクションを回収し、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケア社製）に添加した。ＯｇｒａＨＮＬは塩化ナトリウムの濃度勾配（０-３００ｍＭ）で溶出した。ＯｇｒａＨＮＬが溶出されたフラクションを回収し、アミコンウルトラ-４　遠心式フィルターユニット（ミリポア社製）を用いて濃縮した。その後、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５　１０／３００　ＧＬ（ＧＥヘルスケア社製）に添加し、０．１Ｍ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ-ＮａＯＨ（ｐＨ８．０）で溶出した。精製工程を表２ｂにまとめた。
　精製したＯｇｒａＨＮＬは（Ｒ）－マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性、１７７９Ｕ／ｍｇは、昆虫培養細胞で発現させたＯｇｒａＨＮＬの比活性、２２２５Ｕ／ｍｇ（表２ａ参照）とほぼ一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例８：ＯｇｒａＨＮＬに対する温度とｐＨの影響
（ａ）至適温度と温度安定性
　ＯｇｒａＨＮＬの至適温度と温度安定性を検討した。酵素反応は、０．４ＵのＯｇｒａＨＮＬ、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、各温度で、５分間行った。ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）－マンデロニトリルを定量し、測定結果を図２－Ａに示した。ＯｇｒａＨＮＬの至適温度は３５℃と推定された。
　各温度で６０分間加熱した後、残存活性を測定することで、温度安定性を検討した。結果を図２－Ｃに示した。ＯｇｒａＨＮＬは６５℃、１時間加熱後も活性を維持し、９５℃、１時間加熱後も、１８％の残存活性を有していた。既知のＨＮＬで最も安定であると報告されているＣｈｕａＨＮＬは、６５℃で１時間加熱後も１００％の活性を維持し、９０℃、１時間加熱後には失活すると記載されている（Ｄａｄａｓｈｉｐｕｒら、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　１１２，　１０６０５－１０６１０　（２０１５）、非特許文献１）。よってＯｇｒａＨＮＬは、非特許文献１に記載のＨＮＬよりも高い熱安定性を有していることが明らかになった。
（ｂ）至適ｐＨとｐＨ安定性
　ＯｇｒａＨＮＬの至適ｐＨとｐＨ安定性を検討した。酵素反応は、０．４ＵのＯｇｒａＨＮＬ、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ２．５－５．５）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、各温度で、５分間行った。ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）－マンデロニトリルを定量した。測定結果を図２－Ｂに示した。ＯｇｒａＨＮＬの至適ｐＨは５．０と推定された。
　各緩衝液中で２５℃、６０分間インキュベート後、残存活性を測定することで、ｐＨ安定性を検討した。測定結果を図２－Ｄに示した。ＯｇｒａＨＮＬはｐＨ３-１０．５で安定であった。しかし、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中では、不安定であることが示された。
実施例９：ＮｔｍＨＮＬの精製
　ＮｔｍＨＮＬの精製は以下のように行った。実施例６の方法で調製した無細胞抽出液をＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に添加した。ＮｔｍＨＮＬはイミダゾールの濃度勾配（２０－５００ｍＭ）で溶出した。ＮｔｍＨＮＬが溶出されたフラクションを回収し、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケア社製）に添加した。ＮｔｍＨＮＬは塩化ナトリウムの濃度勾配（０－３００ｍＭ）で溶出した。精製工程を表３にまとめた。精製したＮｔｍＨＮＬは（Ｒ）－マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性は、１０１６Ｕ／ｍｇであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例１０：ＮｔｍＨＮＬに対する温度とｐＨの影響
（ａ）至適温度と温度安定性
　ＮｔｍＨＮＬの至適温度と温度安定性を検討した。酵素反応は、０．４ＵのＮｔｍＨＮＬ、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、各温度で、５分間行った。ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）－マンデロニトリルを定量し、測定結果を図３－Ａに示した。ＮｔｍＨＮＬの至適温度は３０℃と推定された。
（ｂ）至適ｐＨ
　ＮｔｍＨＮＬの至適ｐＨとｐＨ安定性を検討した。酵素反応は、０．４ＵのＮｔｍＨＮＬ、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ２．５－５．５）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、各温度で、５分間行った。ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）－マンデロニトリルを定量し、測定結果を図３－Ｂに示した。ＮｔｍＨＮＬの至適ｐＨは４．８と推定された。
実施例１１：　ＰｌａｍＨＮＬの精製
　ＰｌａｍＨＮＬの精製は以下のように行った。実施例６の方法で調製した無細胞抽出液をＮｉ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　６　ＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）に添加した。ＰｌａｍＨＮＬは１００ｍＭ　イミダゾール、５００ｍＭ　塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ　ＫＰＢ（ｐＨ８．０）で溶出した。精製したＰｌａｍＨＮＬは（Ｒ）－マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性は１１５６Ｕ／ｍｇであった。
実施例１２:組換え大腸菌からのPton3HNLの精製
Pton3HNLの精製は以下のように行った。実施例６の方法で調製した無細胞抽出液をＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰ（ＧＥヘルスケア社製）に供し、イミダゾールの濃度勾配（２０-５００ｍＭ）で溶出した。Pton3HNLが溶出されたフラクションを回収後、ＲｅｓｏｕｒｃｅＱ（ＧＥヘルスケア社製）に供し、塩化ナトリウムの濃度勾配（０-３００ｍＭ）で溶出した。Pton3HNLが溶出されたフラクションを回収し、精製酵素として使用した。
　精製したPton3HNLは（Ｒ）－マンデロニトリル合成活性を示し、その比活性、2140U/mgであった。
実施例１３：Pton3HNLに対する温度とｐＨの影響
（ａ）至適温度と温度安定性
　Pton3HNLの至適温度と温度安定性を検討した。酵素反応は、０．４ＵのPton3HNL、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、各温度で、５分間行った。ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）－マンデロニトリルを定量し、測定結果を図１１ａに示した。Pton3HNLの至適温度は30℃と推定された。
　各温度で６０分間加熱した後、残存活性を測定することで、温度安定性を検討した。結果を図１１ｃに示した。Pton3HNLは60℃、１時間加熱後も活性を維持し、９５℃、１時間加熱後も、１８％の残存活性を有していた。
（ｂ）至適ｐＨとｐＨ安定性
　Pton3HNLの至適ｐＨとｐＨ安定性を検討した。酵素反応は、０．４ＵのPton3HNL、３００ｍＭ　クエン酸緩衝液（ｐＨ２．５－５．５）、５０ｍＭ　ベンズアルデヒド、１００ｍＭ　ＫＣＮを含む反応液２００μｌ、各温度で、５分間行った。ＨＰＬＣを用いて（Ｒ）－マンデロニトリルを定量した。測定結果を図１１ｂに示した。Pton3HNLの至適ｐＨは4.5と推定された。
　各緩衝液中で２５℃、６０分間インキュベート後、残存活性を測定することで、ｐＨ安定性を検討した。測定結果を図１１ｄに示した。Pton3HNLはｐＨ３-１０．５で安定であった。
実施例１４
組換え大腸菌体を用いた(R)-mandelonitrileの生産
Pton3HNLを発現させたE.coli Shuffleを用いて水溶液中での全菌体反応による光学活性シアノヒドリン合成を行った。培養液0.8 mLから集菌後、150μLの0.4 Mクエン酸緩衝液 (pH3.0)に懸濁し10 μLの1 M ベンズアルデヒド、20 μLの1 M KCNを加えて22℃で5分インキュベートした。反応産物は、抽出後、上記の通りHPLCにて分析を行い、鏡像体過剰率(ee)を明らかにした結果、図１２の通り、鏡像体過剰率(ee)は、97.6%に達した。
pHを2.5～5.0の範囲で変化させた結果を図１２ａに示し、菌体の濃度を2倍(2x)、4倍(4x)、6倍(6x)を変化させた結果を図１２ｂに示す。
　光学活性シアノヒドリンは医薬やファインケミカルの製造における重要な中間体であることから、本発明は、医薬やファインケミカルの製造に関連する分野に有用である。
配列番号１：ＮｔｔＨＮＬタンパク質
配列番号２：ＮｔｔＨＮＬ遺伝子
配列番号３：ＮｔｍＨＮＬタンパク質
配列番号４：ＮｔｍＨＮＬ遺伝子
配列番号５：ＯｇｒａＨＮＬタンパク質
配列番号６：ＯｇｒａＨＮＬ遺伝子
配列番号７：ＰｆａｌＨＮＬタンパク質
配列番号８：ＰｆａｌＨＮＬ遺伝子
配列番号９：Ｐｔｏｎ１ＨＮＬタンパク質
配列番号１０：Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ遺伝子
配列番号１１：ＰｌａｍＨＮＬタンパク質
配列番号１２：ＰｌａｍＨＮＬ遺伝子
配列番号１３：ＲｓｐＨＮＬタンパク質
配列番号１４：ＲｓｐＨＮＬ遺伝子
配列番号１５：ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列
配列番号１６：ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列
配列番号１７：ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列
配列番号１８：ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列
配列番号１９：ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列
配列番号２０：ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列
配列番号２１：縮重プライマーＨＮＬ-ＦＷ
配列番号２２：縮重プライマーＨＮＬ-ＲＶ
配列番号２３：縮重プライマーＨＮＬ-ＦＷ２
配列番号２４：縮重プライマーＨＮＬ-ＲＶ２
配列番号２５～８２：プライマー
配列番号８３：ＰｔｏｋＨＮＬタンパク質
配列番号８４：ＰｔｏｋＨＮＬ遺伝子
配列番号８５：Ｐｔｏｎ２ＨＮＬタンパク質
配列番号８６：Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ遺伝子
配列番号８７：Ｐｔｏｎ３ＨＮＬタンパク質
配列番号８８：Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ遺伝子
配列番号８９：ＲｓｓＨＮＬタンパク質
配列番号９０：ＲｓｓＨＮＬ遺伝子
配列番号９１～１２２：プライマー

Claims (19)

  1. ヤスデ由来ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、ＨＮＬ）遺伝子の製造方法であって、
    ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子から、ヤスデ由来ＨＮＬの保存アミノ酸配列ＴＡＸ1ＤＩＸ2Ｇ(配列番号１５)（但し、Ｘ1はＬ又はＦであり、Ｘ2はＲ又はＫである）をコードする塩基配列およびＶＰＮＧＤＫＩＨ(配列番号１６)をコードする塩基配列の少なくとも一方を有する遺伝子を選択することを含む方法。
  2. 前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなる少なくとも１つのＤＮＡをプライマーとして用いてPCRを行うことにより実施される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子を鋳型として、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列からなるＤＮＡをプローブとして用いて、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーションを行うことにより実施される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記遺伝子の選択が、ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子のシーケンシングを行い、シーケンシングされた遺伝子配列の中から、前記保存アミノ酸配列をコードする塩基配列を有する遺伝子を選択することにより実施される、請求項１に記載の方法。
  5. ヤスデ網に属する生物に存在する遺伝子が、ヤスデ網に属する生物より抽出したゲノムDNA、又は、ヤスデ網に属する生物より抽出したRNAより逆転写で得られるcDNAである請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記プライマーが、下記の縮重プライマーＨＮＬ－ＦＷ及びＨＮＬ－ＲＶまたはＨＮＬ－ＦＷ２及びＨＮＬ－ＲＶ２である請求項２に記載の方法。
    ＨＮＬ－ＦＷ：ＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＭＡＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号２１）、
    ＨＮＬ－ＲＶ：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号２２）
    ＨＮＬ－ＦＷ２：ＳＳＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＹＡＴＭＭＲＡＧＧ（配列番号２３）
    ＨＮＬ－ＲＶ２：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＲＴＴＴＧＧＲＡＣ（配列番号２４）
  7. ヤスデ網に属する生物が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデである請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法であって、
    請求項１～７のいずれか１項に記載の方法でヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子を調製し、
    得られたＨＮＬの遺伝子を、宿主細胞内で発現させて、ＨＮＬを得ることを含む前記方法。
  9. 前記宿主細胞が、
    昆虫培養細胞である請求項８に記載の方法。
  10. 前記宿主細胞が、
    ジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、請求項８に記載の方法。
  11. 下記（４）～（６）の何れかの塩基配列を有する遺伝子。
    （４）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；
    （５）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列において１から５０個の塩基の欠失、置換及び／又は付加を有する塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列；又は
    （６）配列表の配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、８４、８６、８８又は９０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイスする塩基配列を有し、ＨＮＬ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
  12. 請求項１１に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミド。
  13. 請求項１１に記載の遺伝子をベクター中に含むプラスミドを発現可能に含む宿主からなる形質転換体であって、前記宿主は、昆虫培養細胞、又はジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌である、形質転換体。
  14. ヤスデ由来ＨＮＬの製造方法であって、
    請求項１３に記載の形質転換体を培養し、培養物からＨＮＬを分離することを含む、ＨＮＬの製造方法。
  15. 宿主が昆虫培養細胞であり、ＨＮＬ遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデ、ヘラババヤスデ、キシャヤスデ、ミドリババヤスデ、またはアマビコヤスデ由来ＨＮＬ遺伝子である、請求項１４に記載の方法。
  16. 宿主がジスルフィド結合イソメラーゼ発現能を有する大腸菌であり、ＨＮＬ遺伝子が、ウマガエシアカヤスデ、ヤケヤスデまたはキシャヤスデ由来ＨＮＬの遺伝子である、請求項１４に記載の前記方法。
  17. 下記（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつＨＮＬ活性を有するタンパク質。
    （１）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列；
    （２）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
    （３）配列表の配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、８３、８５、８７又は８９に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
  18. 下記（１）～（３）の何れかのアミノ酸配列を有し、かつＨＮＬ活性を有する請求項１７に記載のタンパク質。
    （１）配列表の配列番号８５又は８７に記載のアミノ酸配列；
    （２）配列表の配列番号８５又は８７に記載のアミノ酸配列において1から５０個のアミノ酸の欠失、置換及び／又は付加を有するアミノ酸配列；又は
    （３）配列表の配列番号８５又は８７に記載のアミノ酸配列に対して９０%以上の同一性を有するアミノ酸配列
  19. アルデヒドまたはケトンとシアン化水素または反応系においてシアン化物イオンを生成する物質とを含む反応溶媒にヤスデ由来ＨＮＬを作用させる光学活性シアノヒドリンを調製することを含む、光学活性シアノヒドリンの製造方法であって、
    前記ヤスデ由来ＨＮＬが、請求項１７若しくは１８に記載のタンパク質であるか、または請求項１３に記載の形質転換体である、前記方法。
PCT/JP2017/007910 2016-03-01 2017-02-28 ヒドロキシニトリルリアーゼ WO2017150560A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201780026964.5A CN109963943B (zh) 2016-03-01 2017-02-28 羟腈裂解酶
US16/081,476 US11214790B2 (en) 2016-03-01 2017-02-28 Hydroxynitrile lyase
JP2018503346A JP6893361B2 (ja) 2016-03-01 2017-02-28 ヒドロキシニトリルリアーゼ
EP17760025.1A EP3425050B1 (en) 2016-03-01 2017-02-28 Hydroxynitrile lyase

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2016-038640 2016-03-01
JP2016038640 2016-03-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2017150560A1 true WO2017150560A1 (ja) 2017-09-08

Family

ID=59742962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2017/007910 WO2017150560A1 (ja) 2016-03-01 2017-02-28 ヒドロキシニトリルリアーゼ

Country Status (5)

Country Link
US (1) US11214790B2 (ja)
EP (1) EP3425050B1 (ja)
JP (1) JP6893361B2 (ja)
CN (1) CN109963943B (ja)
WO (1) WO2017150560A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020009168A1 (ja) * 2018-07-03 2020-01-09 公立大学法人 富山県立大学 新規ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017150560A1 (ja) * 2016-03-01 2017-09-08 公立大学法人 富山県立大学 ヒドロキシニトリルリアーゼ
CN110999872B (zh) * 2019-12-29 2022-01-04 兰州佛慈制药股份有限公司 一种人工养殖陇马陆的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000217590A (ja) 1999-02-03 2000-08-08 Nippon Shokubai Co Ltd 光学活性シアノヒドリンの製造方法
WO2006041226A1 (ja) * 2004-10-15 2006-04-20 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
JP2015167477A (ja) 2014-03-04 2015-09-28 富山県 新規（ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2017150560A1 (ja) * 2016-03-01 2017-09-08 公立大学法人 富山県立大学 ヒドロキシニトリルリアーゼ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000217590A (ja) 1999-02-03 2000-08-08 Nippon Shokubai Co Ltd 光学活性シアノヒドリンの製造方法
WO2006041226A1 (ja) * 2004-10-15 2006-04-20 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. 改良型ヒドロキシニトリルリアーゼ
JP2015167477A (ja) 2014-03-04 2015-09-28 富山県 新規（ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BIOTECHNOL. PROG., vol. 20, 2004, pages 354 - 360
DADASHIPOUR, M. ET AL.: "Discovery and molecular and biocatalytic properties of hydroxynitrile lyase from an invasive millipede, Chamberlinius hualienensis", PNAS, vol. 112, no. 34, 2015, pages 10605 - 10610, XP002770798 *
DADASHIPUR ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA., vol. 112, 2015, pages 10605 - 10610
DUFFEY, S. S. ET AL.: "On the biochemical basis of HCN production in the millipede Harpaphe haydeniana (Xystodesmidae: Polydesmida", CANADIAN JOURNAL OF ZOOLOGY, vol. 56, no. 1, 1978, pages 7 - 16, XP008184247 *
LOBSTEIN, J. ET AL.: "SHuffle, a novel Escherichia coli protein expression strain capable of correctly folding disulfide bonded proteins in its cytoplasm", MICROBIAL CELL FACTORIES, vol. 11, no. 56, 2012, pages 1 - 16, XP021129014 *
NATURE METHODS, vol. 8, 2011, pages 785 - 786
NUYLERT, A. ET AL.: "3D049 Purification and characterization of hydroxynitrile lyase from millipedes, Parafontaria laminata", PROCEEDINGS OF THE 2016 ANNUAL MEETING OF JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, 5 March 2016 (2016-03-05), pages 1038, XP009512441, ISSN: 2186-7976 *
TAKUYA YAMAGUCHI ET AL.: "Molecular cloning of hydroxynitrile lyase from millipedes and heterologous expression in Escherichia coli", PROCEEDINGS OF THE 2016 ANNUAL MEETING OF JAPAN SOCIETY FOR BIOSCIENCE, BIOTECHNOLOGY, AND AGROCHEMISTRY, 5 March 2016 (2016-03-05), pages 1039, XP009512440, ISSN: 2186-7976 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020009168A1 (ja) * 2018-07-03 2020-01-09 公立大学法人 富山県立大学 新規ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体
JPWO2020009168A1 (ja) * 2018-07-03 2021-08-19 公立大学法人 富山県立大学 新規ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体
JP7264354B2 (ja) 2018-07-03 2023-04-25 公立大学法人 富山県立大学 新規ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体

Also Published As

Publication number Publication date
JP6893361B2 (ja) 2021-06-23
US20190071664A1 (en) 2019-03-07
US11214790B2 (en) 2022-01-04
EP3425050A4 (en) 2019-07-31
EP3425050B1 (en) 2022-05-18
EP3425050A1 (en) 2019-01-09
JPWO2017150560A1 (ja) 2019-01-10
CN109963943A (zh) 2019-07-02
CN109963943B (zh) 2023-11-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017150560A1 (ja) ヒドロキシニトリルリアーゼ
JP2020174686A (ja) 酵素を用いた４−アミノ桂皮酸の製造方法
JP7067706B2 (ja) 形質転換微生物及びその利用
US20240101994A1 (en) Recombinant olivetolic acid cyclase polypeptides engineered for enhanced biosynthesis of cannabinoids
CN112779233B (zh) 重组草铵膦脱氢酶、基因工程菌及其在制备l-草铵膦中的应用
EP4377451A2 (en) Recombinant prenyltransferase polypeptides engineered for enhanced biosynthesis of cannabinoids
US7163814B2 (en) Modified reductase and its gene, and use thereof
US8940516B2 (en) Method for the synthesis of chiral cyanohydrins via a hydroxynitrile lyase from brassicaceae
JP5291367B2 (ja) 新規加水分解酵素
JP7311496B2 (ja) 改変型エステラーゼ及びその用途
US7135318B2 (en) Modified reductase and its gene
JP6044974B2 (ja) 組換えカイコ核多角体病ウイルスベクター
WO2022017389A1 (en) Method for the production of musk fragrance ingredient
US7811784B2 (en) Transgenic organisms with lower growth temperature
JP4840847B2 (ja) 改変型２−デオキシリボース５−リン酸アルドラーゼ及びその利用
CN116601300A (zh) 阿魏酸生物转化为香草醛
RU2310687C1 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pETTvDAO2, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ (DAO) ДРОЖЖЕЙ Trigonopsis variabilis В КЛЕТКАХ Escherichia coli И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli C41(DE3)/pETTvDAO2 - ПРОДУЦЕНТ DAO
JP2007089513A (ja) 新規耐酸性改変型ｓ−ヒドロキシニトリルリアーゼ
JPH08506718A (ja) アリールアルカノン酸分割
KR20120086602A (ko) 나이트릴레이즈 ｖｍｎ１을 이용한 카르복실산의 제조방법
KR20120086604A (ko) 나이트릴레이즈 ｒｍｎ２을 이용한 카르복실산의 제조방법
JP2011188799A (ja) 変異型還元酵素
JPH11285385A (ja) ビオチン活性物質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2018503346

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2017760025

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2017760025

Country of ref document: EP

Effective date: 20181001

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17760025

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1