JPH11285385A - ビオチン活性物質の製造法 - Google Patents
ビオチン活性物質の製造法Info
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- JPH11285385A JPH11285385A JP10089987A JP8998798A JPH11285385A JP H11285385 A JPH11285385 A JP H11285385A JP 10089987 A JP10089987 A JP 10089987A JP 8998798 A JP8998798 A JP 8998798A JP H11285385 A JPH11285385 A JP H11285385A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ビオチン活性物質の効率の良い、工業的に有
利な製造法を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、ｄ−ビオチンの生合成
に関与する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた
ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質の
製造法、および該形質転換体を用いたビオチン活性物質
の製造法を提供することができる。
利な製造法を提供する。 【解決手段】 本発明によれば、ｄ−ビオチンの生合成
に関与する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコードする
ＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え
体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用いた
ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質の
製造法、および該形質転換体を用いたビオチン活性物質
の製造法を提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ｄ−ビオチンの生
合成に関与する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用
いたｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白
質の製造法、および該形質転換体を用いたビオチン活性
物質の製造法に関する。
合成に関与する活性を有する蛋白質、該蛋白質をコード
するＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組
換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、該形質転換体を用
いたｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白
質の製造法、および該形質転換体を用いたビオチン活性
物質の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ビオチン活性物質とは、サッカロミセス
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 7754
のビオチン要求性を相補する活性を有するビオチン関連
物質の総称であり、具体的には、ビオチンおよびビオチ
ン生合成経路上の中間体であるｄ−デチオビオチン、
７，８−ジアミノペラルゴン酸、および７−ケト−８−
アミノペラルゴン酸のことをいう〔緒方浩一ら、日本生
化学会（編）「生化学実験講座（１３、上）ビタミンと
補酵素」、p. 345-361、東京化学同人(1975)〕。
セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) ATCC 7754
のビオチン要求性を相補する活性を有するビオチン関連
物質の総称であり、具体的には、ビオチンおよびビオチ
ン生合成経路上の中間体であるｄ−デチオビオチン、
７，８−ジアミノペラルゴン酸、および７−ケト−８−
アミノペラルゴン酸のことをいう〔緒方浩一ら、日本生
化学会（編）「生化学実験講座（１３、上）ビタミンと
補酵素」、p. 345-361、東京化学同人(1975)〕。
【０００３】ｄ−ビオチンは水溶性ビタミンの一種であ
り、飼料添加物、化粧品の原料、あるいは医薬品として
用いられる有用な化合物である。ｄ−デチオビオチンは
生体においてｄ−ビオチン生合成経路の最終中間体であ
りｄ−ビオチン生成の前駆物質として、また、７，８−
ジアミノペラルゴン酸および７−ケト−８−アミノペラ
ルゴン酸はｄ−ビオチン生合成の中間体として重要であ
る。
り、飼料添加物、化粧品の原料、あるいは医薬品として
用いられる有用な化合物である。ｄ−デチオビオチンは
生体においてｄ−ビオチン生合成経路の最終中間体であ
りｄ−ビオチン生成の前駆物質として、また、７，８−
ジアミノペラルゴン酸および７−ケト−８−アミノペラ
ルゴン酸はｄ−ビオチン生合成の中間体として重要であ
る。
【０００４】ｄ−ビオチンは現在、化学合成法によって
工業的に生産されている。その製造方法として、Ｌ−シ
ステイン、クロロ酢酸、グルタル酸からｄｌ−ビオチン
を生産する方法、ピメリン酸からｄｌ−ビオチンを生産
する方法、フマル酸からｍｅｓｏ−ジアミノコハク酸を
経由して光学分割によりｄ−ビオチンを生産する方法、
Ｄ−マンノースからｄ−ビオチンを生産する方法、Ｄ−
グルコースからｄ−ビオチンを生産する方法、Ｌ−シス
テインからｄ−ビオチンを生産する方法などが知られて
いる〔和泉好計ら、日本ビタミン学会編「ビタミン学実
験法（ＩＩ）」、ｐ．４７５−５２１、東京化学同人
（１９８３）〕。
工業的に生産されている。その製造方法として、Ｌ−シ
ステイン、クロロ酢酸、グルタル酸からｄｌ−ビオチン
を生産する方法、ピメリン酸からｄｌ−ビオチンを生産
する方法、フマル酸からｍｅｓｏ−ジアミノコハク酸を
経由して光学分割によりｄ−ビオチンを生産する方法、
Ｄ−マンノースからｄ−ビオチンを生産する方法、Ｄ−
グルコースからｄ−ビオチンを生産する方法、Ｌ−シス
テインからｄ−ビオチンを生産する方法などが知られて
いる〔和泉好計ら、日本ビタミン学会編「ビタミン学実
験法（ＩＩ）」、ｐ．４７５−５２１、東京化学同人
（１９８３）〕。
【０００５】一方、微生物を用いたビオチンの生産も古
くから研究されている。これまでに、細菌（特開平６−
３３９３７１、特開昭６０−１３３８８２、特公昭４４
−１４７９５）、放線菌（特公昭４１−２１７５６、特
公昭４２−３０７４）、酵母〔Lett. Appl. Microbio
l., 2, 25 (1986)〕、およびカビ（特公昭４２−８９１
８）を用いた生産が報告されている。さらに近年では、
組換えＤＮＡ技術を適用したビオチン生産菌の改良も進
められている。たとえば、セラチア（Serratia）属細菌
（特開平５−１９９８６７）、エシェリヒア（Escheric
hia）属細菌（特開平８−７０８５７、特開平８−２１
４８７４、特開平８−５０１６９４）、バシルス（Baci
llus）属細菌（特開平７−２３１７８９、特開平３−１
５１８７０、特開平４−１１８９４）、ブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属細菌（特開平７−８７９６
３）でビオチン生合成遺伝子を増幅した組換え微生物を
用いることによりｄ−ビオチンの比較的高い生産性が得
られている。
くから研究されている。これまでに、細菌（特開平６−
３３９３７１、特開昭６０−１３３８８２、特公昭４４
−１４７９５）、放線菌（特公昭４１−２１７５６、特
公昭４２−３０７４）、酵母〔Lett. Appl. Microbio
l., 2, 25 (1986)〕、およびカビ（特公昭４２−８９１
８）を用いた生産が報告されている。さらに近年では、
組換えＤＮＡ技術を適用したビオチン生産菌の改良も進
められている。たとえば、セラチア（Serratia）属細菌
（特開平５−１９９８６７）、エシェリヒア（Escheric
hia）属細菌（特開平８−７０８５７、特開平８−２１
４８７４、特開平８−５０１６９４）、バシルス（Baci
llus）属細菌（特開平７−２３１７８９、特開平３−１
５１８７０、特開平４−１１８９４）、ブレビバクテリ
ウム（Brevibacterium）属細菌（特開平７−８７９６
３）でビオチン生合成遺伝子を増幅した組換え微生物を
用いることによりｄ−ビオチンの比較的高い生産性が得
られている。
【０００６】ｄ−ビオチンの前駆体であるｄ−デチオビ
オチンについては、クルチア（Kurthia）属細菌を利用
した生産方法（特開平８−２５６７８５）が知られてい
るが、生産性は低い。
オチンについては、クルチア（Kurthia）属細菌を利用
した生産方法（特開平８−２５６７８５）が知られてい
るが、生産性は低い。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】化学合成法によるビオ
チン活性物質の合成は工程が複雑なことから、かなり高
価となるため、微生物を利用した発酵法によるビオチン
活性物質の生産技術の開発が望まれている。ビオチン活
性物質、例えば、ｄ−ビオチン、ｄ−デチオビオチン等
は、発酵法による従来の技術において生産される量は必
ずしも満足のいくレベルには至っていない。従って、さ
らに効率の良い、工業的に有利な、ビオチン活性物質の
製造法が強く望まれている。
チン活性物質の合成は工程が複雑なことから、かなり高
価となるため、微生物を利用した発酵法によるビオチン
活性物質の生産技術の開発が望まれている。ビオチン活
性物質、例えば、ｄ−ビオチン、ｄ−デチオビオチン等
は、発酵法による従来の技術において生産される量は必
ずしも満足のいくレベルには至っていない。従って、さ
らに効率の良い、工業的に有利な、ビオチン活性物質の
製造法が強く望まれている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の状
況に鑑み、ビオチン活性物質の高生産能を有する微生物
を自然界より新たに検索し、シュードモナス属に属する
微生物が野生株としては極めて多量のｄ−ビオチンを培
地中に生成することを見いだし、該微生物よりｄ−ビオ
チンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコードす
る遺伝子を取得することにより、本発明を完成するに至
った。
況に鑑み、ビオチン活性物質の高生産能を有する微生物
を自然界より新たに検索し、シュードモナス属に属する
微生物が野生株としては極めて多量のｄ−ビオチンを培
地中に生成することを見いだし、該微生物よりｄ−ビオ
チンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコードす
る遺伝子を取得することにより、本発明を完成するに至
った。
【０００９】即ち、本願の第１の発明は、シュードモナ
ス(Pseudomonas)属に属する微生物由来の、ｄ−ビオチ
ンの生合成に関与する活性を有する蛋白質である。ｄ−
ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質として
は、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡへの生合成に関与
する活性を有する蛋白質、ピメリル−ＣｏＡから７−ケ
ト−８−アミノペラルゴン酸への生合成に関与する活性
を有する蛋白質、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸か
ら７，８−ジアミノペラルゴン酸への生合成に関与する
活性を有する蛋白質、７，８−ジアミノペラルゴン酸か
らデチオビオチンへの生合成に関与する活性を有する蛋
白質、デチオビオチンからビオチンへの生合成に関与す
る活性を有する蛋白質をあげることができ、具体的に
は、ピメリル−ＣｏＡシンセターゼ、７−ケト−８−ア
ミノペラルゴン酸シンセターゼ、７，８−ジアミノペラ
ルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、デチオビオチンシ
ンセターゼ、ビオチンシンセターゼ等をあげることがで
きる。
ス(Pseudomonas)属に属する微生物由来の、ｄ−ビオチ
ンの生合成に関与する活性を有する蛋白質である。ｄ−
ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質として
は、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡへの生合成に関与
する活性を有する蛋白質、ピメリル−ＣｏＡから７−ケ
ト−８−アミノペラルゴン酸への生合成に関与する活性
を有する蛋白質、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸か
ら７，８−ジアミノペラルゴン酸への生合成に関与する
活性を有する蛋白質、７，８−ジアミノペラルゴン酸か
らデチオビオチンへの生合成に関与する活性を有する蛋
白質、デチオビオチンからビオチンへの生合成に関与す
る活性を有する蛋白質をあげることができ、具体的に
は、ピメリル−ＣｏＡシンセターゼ、７−ケト−８−ア
ミノペラルゴン酸シンセターゼ、７，８−ジアミノペラ
ルゴン酸アミノトランスフェラーゼ、デチオビオチンシ
ンセターゼ、ビオチンシンセターゼ等をあげることがで
きる。
【００１０】シュードモナス属に属する微生物として
は、例えば、シュードモナス エスピー等をあげること
ができる。具体的には、シュードモナス エスピー Ｄ
−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）またはＤ−
０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成に
関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物を
あげることができる。
は、例えば、シュードモナス エスピー等をあげること
ができる。具体的には、シュードモナス エスピー Ｄ
−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）またはＤ−
０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成に
関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物を
あげることができる。
【００１１】本願の第２の発明は、以下の(a)または(b)
の蛋白質： (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつｄ−ビオチンの生合成に関与
する活性を有する蛋白質、である。
の蛋白質： (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつｄ−ビオチンの生合成に関与
する活性を有する蛋白質、である。
【００１２】上記のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸
とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは
付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。かかる１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor L
aboratory Press (1989)（以下、Molecular Cloning, S
econd Editionと略す）、Current Protocols in Molecu
lar Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nuclei
c Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (198
5)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法
に準じて調製することができる。
は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により
実施することができ、また、１若しくは数個のアミノ酸
とは、部位特異的変異誘発法により欠失、置換若しくは
付加できる程度の数のアミノ酸を意味する。かかる１若
しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された
アミノ酸配列からなり、かつβ1,4-ガラクトース転移酵
素活性を有する蛋白質は、Molecular Cloning, A Labor
atory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor L
aboratory Press (1989)（以下、Molecular Cloning, S
econd Editionと略す）、Current Protocols in Molecu
lar Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、Nuclei
c Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Aca
d. Sci., USA, 79, 6409(1982)、Gene, 34, 315 (198
5)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc.
Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)等に記載の方法
に準じて調製することができる。
【００１３】本願の第３の発明は、上記蛋白質をコード
するＤＮＡである。本願の第４の発明は、以下の(a)ま
たは(b)のＤＮＡ： (a) 図１または２で示される、ｄ−ビオチンの生合成
に関与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
(b) (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、である。
するＤＮＡである。本願の第４の発明は、以下の(a)ま
たは(b)のＤＮＡ： (a) 図１または２で示される、ｄ−ビオチンの生合成
に関与する活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
(b) (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、である。
【００１４】上記の「ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡ」とは、図１または２で示される
ＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片をプローブとして、コロニ
ー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダ
イゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション
法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体
的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは
該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．
７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイ
ゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液
（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナ
トリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を
用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより
同定できるＤＮＡをあげることができる。
ブリダイズするＤＮＡ」とは、図１または２で示される
ＤＮＡまたは該ＤＮＡの断片をプローブとして、コロニ
ー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダ
イゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション
法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味し、具体
的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡまたは
該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、０．
７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイ
ゼーションを行った後、０．１〜２倍程度のＳＳＣ溶液
（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナ
トリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を
用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより
同定できるＤＮＡをあげることができる。
【００１５】ハイブリダイゼーションは、Molecular Cl
oning, Second Edition、Current Protocols in Molecu
lar Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cl
oning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Se
cond Edition, Oxford University (1995)等の実験書に
記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブ
リダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、図１または２
で表される塩基配列と少なくとも80％以上の相同性を有
するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮ
Ａをあげることができる。
oning, Second Edition、Current Protocols in Molecu
lar Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cl
oning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Se
cond Edition, Oxford University (1995)等の実験書に
記載されている方法に準じて行うことができる。ハイブ
リダイズ可能なＤＮＡとして具体的には、図１または２
で表される塩基配列と少なくとも80％以上の相同性を有
するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相同性を有するＤＮ
Ａをあげることができる。
【００１６】本願の第５の発明は、以下の(a)または(b)
のＤＮＡ： (a) 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)
(a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ、である。
のＤＮＡ： (a) 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ、(b)
(a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有
する蛋白質をコードするＤＮＡ、である。
【００１７】上記の「ストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズするＤＮＡ」とは、第４の発明に記載された
方法により、配列番号２で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡまたは該ＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・
ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等
を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
ブリダイズするＤＮＡ」とは、第４の発明に記載された
方法により、配列番号２で表される塩基配列を有するＤ
ＮＡまたは該ＤＮＡ断片をプローブとして、コロニー・
ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼ
ーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等
を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
【００１８】ハイブリダイズ可能なＤＮＡとして具体的
には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも80％
以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相
同性を有するＤＮＡをあげることができる。本願の第６
の発明は、上記ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡである。
には、配列番号２で表される塩基配列と少なくとも80％
以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは95％以上の相
同性を有するＤＮＡをあげることができる。本願の第６
の発明は、上記ＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡである。
【００１９】本願の第７の発明は、上記組換え体ＤＮＡ
を宿主細胞に導入して得られる形質転換体である。本願
の第８の発明は、上記形質転換体を培地に培養し、培養
物中に本願の第１の発明で記載した蛋白質から選ばれる
蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取す
ることを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
を宿主細胞に導入して得られる形質転換体である。本願
の第８の発明は、上記形質転換体を培地に培養し、培養
物中に本願の第１の発明で記載した蛋白質から選ばれる
蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から該蛋白質を採取す
ることを特徴とする該蛋白質の製造方法である。
【００２０】本願の第９の発明は、上記形質転換体を培
地に培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積さ
せ、該培養物からビオチン活性物質を採取することを特
徴とする、ビオチン活性物質の製造方法である。本願の
第１０の発明は、シュードモナス(Pseudomonas)属に属
し、ビオチン活性物質の生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、
該培養物からビオチン活性物質を採取することを特徴と
する、ビオチン活性物質の製造方法である。
地に培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積さ
せ、該培養物からビオチン活性物質を採取することを特
徴とする、ビオチン活性物質の製造方法である。本願の
第１０の発明は、シュードモナス(Pseudomonas)属に属
し、ビオチン活性物質の生産能を有する微生物を培地に
培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、
該培養物からビオチン活性物質を採取することを特徴と
する、ビオチン活性物質の製造方法である。
【００２１】シュードモナス属に属する微生物として
は、例えば、シュードモナス エスピー等をあげること
ができる。具体的には、シュードモナス エスピー Ｄ
−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）またはＤ−
０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成に
関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物を
あげることができる。
は、例えば、シュードモナス エスピー等をあげること
ができる。具体的には、シュードモナス エスピー Ｄ
−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）またはＤ−
０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成に
関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物を
あげることができる。
【００２２】第９および１０の発明において、ビオチン
活性物質として、例えば、d−ビオチン、ｄ−デチオビ
オチン等をあげることができる。第９および１０の発明
において、培養時、培地中にエタノールを０．２〜２０
容量％の範囲で添加することによりｄ−ビオチンの生産
量を一層高めることができる。
活性物質として、例えば、d−ビオチン、ｄ−デチオビ
オチン等をあげることができる。第９および１０の発明
において、培養時、培地中にエタノールを０．２〜２０
容量％の範囲で添加することによりｄ−ビオチンの生産
量を一層高めることができる。
【００２３】本願の第１１の発明は、シュードモナス
エスピー Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８
８）である。以下に、本発明を詳細に説明する。
エスピー Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８
８）である。以下に、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
【発明の実施の形態】（１）ビオチンの生合成に関与す
る遺伝子の単離 ビオチンの生合成に関与する遺伝子を単離するための微
生物としては、シュードモナス属に属する微生物であれ
ばいずれも用いることができ、好ましくは、シュードモ
ナス エスピー（Pseudomonas sp.）Ｄ−０１１０株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）をあげることができる。
る遺伝子の単離 ビオチンの生合成に関与する遺伝子を単離するための微
生物としては、シュードモナス属に属する微生物であれ
ばいずれも用いることができ、好ましくは、シュードモ
ナス エスピー（Pseudomonas sp.）Ｄ−０１１０株
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）をあげることができる。
【００２５】該Ｄ−０１１０株は、本発明者らが土壌試
料から新たに分離した菌株である。Ｄ−０１１０株の菌
学的性質を以下第１〜５表に示す。
料から新たに分離した菌株である。Ｄ−０１１０株の菌
学的性質を以下第１〜５表に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】
【表２】
【００２８】
【表３】
【００２９】
【表４】
【００３０】
【表５】
【００３１】
【表６】 以上の菌学的性質を有する菌について、バージェイのマ
ニュアル〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriolo
gy, Vol.2 (1986)〕の記載と照合することにより、本菌
株をシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌と同
定し、該菌株をシュードモナス エスピー Ｄ−０１１
０(Pseudomonas sp. D-0110)と命名した。
ニュアル〔Bergey's Manual of Systematic Bacteriolo
gy, Vol.2 (1986)〕の記載と照合することにより、本菌
株をシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌と同
定し、該菌株をシュードモナス エスピー Ｄ−０１１
０(Pseudomonas sp. D-0110)と命名した。
【００３２】該菌株は、ブダペスト条約に基づいて、平
成１０年３月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術
研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号３０５-００４６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８と
して寄託されている。シュードモナス属に属する微生物
より、公知の方法〔例えば、Biochim.Biophys.Acta, 7
2, 619 (1963)、Current Protocols in Molecular Biol
ogy, John Wiley & Sons (1987-1997)等〕により、該微
生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
成１０年３月１０日付けで工業技術院生命工学工業技術
研究所、日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号（郵便
番号３０５-００４６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８と
して寄託されている。シュードモナス属に属する微生物
より、公知の方法〔例えば、Biochim.Biophys.Acta, 7
2, 619 (1963)、Current Protocols in Molecular Biol
ogy, John Wiley & Sons (1987-1997)等〕により、該微
生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
【００３３】得られた染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、
例えば、ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲI等で切断し、シューク
ロース密度勾配超遠心分離等の手法によりＤＮＡ断片を
分画し、2〜１５ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。該回収
ＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、Molecular Cloning,
Second Edition、Current Protocols in Molecular Bi
ology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning
1: Core Techniques, A Practical Approach, Second E
dition,Oxford University Press (1995)等に記載され
た方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Pl
asmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Clonin
g（ライフ・テクノロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesi
s Kit〔ストラタジーン（Staratagene)社製〕を用いク
ローニングベクターを作製し、作製した該クローニング
ベクターを用い、各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した
大腸菌を形質転換する。
例えば、ＨｉｎｄIII、ＥｃｏＲI等で切断し、シューク
ロース密度勾配超遠心分離等の手法によりＤＮＡ断片を
分画し、2〜１５ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。該回収
ＤＮＡ断片を用い、常法、例えば、Molecular Cloning,
Second Edition、Current Protocols in Molecular Bi
ology, John Wiley & Sons (1987-1997)、DNA Cloning
1: Core Techniques, A Practical Approach, Second E
dition,Oxford University Press (1995)等に記載され
た方法、あるいは市販のキット、例えばSuperScript Pl
asmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Clonin
g（ライフ・テクノロジーズ社製）やZAP-cDNA Synthesi
s Kit〔ストラタジーン（Staratagene)社製〕を用いク
ローニングベクターを作製し、作製した該クローニング
ベクターを用い、各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した
大腸菌を形質転換する。
【００３４】該大腸菌を形質転換するためのクローニン
グベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できる
ものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター
等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express
〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、
pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17,
9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社
製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical App
roach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテック社
製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファ
ルマシア社製）、pcD2〔H.Okayama and P.Berg；Mol. C
ell. Biol., 3, 280 (1983)〕、pMW218（和光純薬社
製）等を挙げることができる。
グベクターとしては、大腸菌K12株中で自立複製できる
ものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター
等いずれでも使用できる。具体的には、ZAP Express
〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、
pBluescript II SK(+)〔Nucleic Acids Research, 17,
9494 (1989)〕、Lambda ZAP II（ストラタジーン社
製）、λgt10、λgt11〔DNA Cloning, A Practical App
roach, 1, 49 (1985)〕、λTriplEx（クローンテック社
製）、λExCell（ファルマシア社製）、pT7T318U（ファ
ルマシア社製）、pcD2〔H.Okayama and P.Berg；Mol. C
ell. Biol., 3, 280 (1983)〕、pMW218（和光純薬社
製）等を挙げることができる。
【００３５】各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸
菌は以下の方法により取得することができる。大腸菌、
例えばＭＭ２９４株を、ＬＢ培地〔トリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、NaCl １０ｇを水１Lに含み、ｐＨ７．
２に調整した培地〕等の培地を用い、通常の方法により
培養する。
菌は以下の方法により取得することができる。大腸菌、
例えばＭＭ２９４株を、ＬＢ培地〔トリプトン１０ｇ、
酵母エキス５ｇ、NaCl １０ｇを水１Lに含み、ｐＨ７．
２に調整した培地〕等の培地を用い、通常の方法により
培養する。
【００３６】培養後、得られた菌体を、Ｎ−メチル−
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤を用
い、常法に従い、変異処理する。該変異処理菌体を０．
８５％食塩水等を用い、適当に希釈し、ＬＢ寒天平板培
地〔ＬＢ培地に寒天１．５％を添加した培地〕等の天然
寒天平板培地あるいは合成寒天平板培地上に塗布し、培
養する。
Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤を用
い、常法に従い、変異処理する。該変異処理菌体を０．
８５％食塩水等を用い、適当に希釈し、ＬＢ寒天平板培
地〔ＬＢ培地に寒天１．５％を添加した培地〕等の天然
寒天平板培地あるいは合成寒天平板培地上に塗布し、培
養する。
【００３７】培養後、出現したコロニーを、Ｍ９寒天平
板培地〔グルコース ２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2
ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、Ｍ
ｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．０１ｇ、
チアミン塩酸塩 ０．１ｍｇ、寒天１５ｇを水1Lに含
み、ｐＨ7.2に調整した培地〕等の最少寒天平板培地お
よび該最少寒天平板培地にビオチンを添加した寒天平板
培地にレプリカし、培養する。
板培地〔グルコース ２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2
ＰＯ4 ３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、Ｍ
ｇＳＯ 4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．０１ｇ、
チアミン塩酸塩 ０．１ｍｇ、寒天１５ｇを水1Lに含
み、ｐＨ7.2に調整した培地〕等の最少寒天平板培地お
よび該最少寒天平板培地にビオチンを添加した寒天平板
培地にレプリカし、培養する。
【００３８】最少寒天平板培地では生育できず最少寒天
平板培地にビオチンを添加した寒天平板培地でコロニー
を形成した菌株がビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸
菌変異株（ビオチン要求性変異株）である。該ビオチン
要求性変異株のビオチン生合成経路の欠損箇所は、大腸
菌由来のビオチン生合成遺伝子群を持つプラスミド、例
えば、ｐＬＣ２５−２３〔J. Mol.Biol., 148, 63 (198
1)〕を利用した生育の相補試験により同定することがで
きる。
平板培地にビオチンを添加した寒天平板培地でコロニー
を形成した菌株がビオチン生合成遺伝子の欠損した大腸
菌変異株（ビオチン要求性変異株）である。該ビオチン
要求性変異株のビオチン生合成経路の欠損箇所は、大腸
菌由来のビオチン生合成遺伝子群を持つプラスミド、例
えば、ｐＬＣ２５−２３〔J. Mol.Biol., 148, 63 (198
1)〕を利用した生育の相補試験により同定することがで
きる。
【００３９】即ち、プラスミドｐＬＣ２５−２３より、
ｂｉｏＣ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏ
Ｂ遺伝子から選ばれる遺伝子を一つ以上含有するプラス
ミドを調製し、これらプラスミドを用い、取得した該ビ
オチン要求性変異株を形質転換し、いずれのプラスミド
を導入したときに、該ビオチン要求性変異株が最少培地
で生育可能となるかによりビオチン生合成経路の欠損箇
所を同定することができる。
ｂｉｏＣ、ｂｉｏＦ、ｂｉｏＡ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏ
Ｂ遺伝子から選ばれる遺伝子を一つ以上含有するプラス
ミドを調製し、これらプラスミドを用い、取得した該ビ
オチン要求性変異株を形質転換し、いずれのプラスミド
を導入したときに、該ビオチン要求性変異株が最少培地
で生育可能となるかによりビオチン生合成経路の欠損箇
所を同定することができる。
【００４０】以上の方法により、ピメリン酸からピメリ
ル−ＣｏＡへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＣ欠損
株）、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノペラ
ルゴン酸への生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＦ欠損
株）、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−
ジアミノペラルゴン酸への生合成経路の欠損した株（ｂ
ｉｏＡ欠損株）、７，８−ジアミノペラルゴン酸からデ
チオビオチンへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＤ欠
損株）、デチオビオチンからビオチンへの生合成経路の
欠損した株（ｂｉｏＢ欠損株）およびこれら生合成経路
を複数欠損した株等を取得することができる。
ル−ＣｏＡへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＣ欠損
株）、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノペラ
ルゴン酸への生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＦ欠損
株）、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，８−
ジアミノペラルゴン酸への生合成経路の欠損した株（ｂ
ｉｏＡ欠損株）、７，８−ジアミノペラルゴン酸からデ
チオビオチンへの生合成経路の欠損した株（ｂｉｏＤ欠
損株）、デチオビオチンからビオチンへの生合成経路の
欠損した株（ｂｉｏＢ欠損株）およびこれら生合成経路
を複数欠損した株等を取得することができる。
【００４１】該各種ビオチン生合成遺伝子の欠損した大
腸菌を、上記で作製したクローニングベクターで形質転
換した後、該形質転換体をＭ９培地等の最少寒天平板培
地で培養する。培養後、該培地上にコロニーを形成した
菌株を取得する。該菌株は、シュードモナス属由来のビ
オチン生合成に関与する遺伝子を含有したプラスミドを
有している。
腸菌を、上記で作製したクローニングベクターで形質転
換した後、該形質転換体をＭ９培地等の最少寒天平板培
地で培養する。培養後、該培地上にコロニーを形成した
菌株を取得する。該菌株は、シュードモナス属由来のビ
オチン生合成に関与する遺伝子を含有したプラスミドを
有している。
【００４２】該菌株より、シュードモナス属由来のビオ
チン生合成に関与する遺伝子を含有したプラスミドを常
法、例えば、Molecular Cloning, Second Edition、Cur
rentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & S
ons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A
Practical Approach, Second Edition, Oxford Univer
sity Press (1995)等に記載された方法により取得する
ことができる。
チン生合成に関与する遺伝子を含有したプラスミドを常
法、例えば、Molecular Cloning, Second Edition、Cur
rentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & S
ons (1987-1997)、DNA Cloning 1: Core Techniques, A
Practical Approach, Second Edition, Oxford Univer
sity Press (1995)等に記載された方法により取得する
ことができる。
【００４３】このようにして取得されたプラスミドとし
て、例えば７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，
８−ジアミノペラルゴン酸への生合成に関与する遺伝子
を含有するプラスミドｐＭＢ−００１、ピメリン酸から
ピメリル−ＣｏＡ、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸、７−ケト−８−アミノペラルゴ
ン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸、７，８−ジア
ミノペラルゴン酸からデチオビオチンおよびデチオビオ
チンからビオチンへの生合成に関与する遺伝子を含有す
るプラスミドｐＭＢ−００２等をあげることができる。 （２）ビオチンの生合成に関与する蛋白質の製造 上記のようにして得られるビオチンの生合成に関与する
遺伝子を宿主細胞中で発現させるためには、まず、該遺
伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分
解酵素類で、該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片と
した後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入
し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現
ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
て、例えば７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から７，
８−ジアミノペラルゴン酸への生合成に関与する遺伝子
を含有するプラスミドｐＭＢ−００１、ピメリン酸から
ピメリル−ＣｏＡ、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８
−アミノペラルゴン酸、７−ケト−８−アミノペラルゴ
ン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸、７，８−ジア
ミノペラルゴン酸からデチオビオチンおよびデチオビオ
チンからビオチンへの生合成に関与する遺伝子を含有す
るプラスミドｐＭＢ−００２等をあげることができる。 （２）ビオチンの生合成に関与する蛋白質の製造 上記のようにして得られるビオチンの生合成に関与する
遺伝子を宿主細胞中で発現させるためには、まず、該遺
伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素類あるいはＤＮＡ分
解酵素類で、該遺伝子を含む適当な長さのＤＮＡ断片と
した後に、発現ベクター中プロモーターの下流に挿入
し、次いで上記ＤＮＡを挿入した発現ベクターを、発現
ベクターに適合した宿主細胞中に導入する。
【００４４】宿主細胞としては、目的とする遺伝子を発
現できるものは全て用いることができる。例えば、エッ
シェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、
ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセ
ス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、
トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母や
動物細胞、昆虫細胞等をあげることができる。
現できるものは全て用いることができる。例えば、エッ
シェリヒア属、セラチア属、コリネバクテリウム属、ブ
レビバクテリウム属、シュードモナス属、バチルス属、
ミクロバクテリウム属等に属する細菌、クルイベロミセ
ス属、サッカロマイセス属、シゾサッカロマイセス属、
トリコスポロン属、シワニオミセス属等に属する酵母や
動物細胞、昆虫細胞等をあげることができる。
【００４５】発現ベクターとしては、上記宿主細胞にお
いて自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能
で、ビオチンの生合成に関与する遺伝子を転写できる位
置にプロモーターを含有しているものが用いられる。細
菌等を宿主細胞として用いる場合は、ビオチンの生合成
に関与する遺伝子発現ベクターは該細菌中で自立複製可
能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配
列、ビオチンの生合成に関与する遺伝子および転写終結
配列より構成された組換えベクターであることが好まし
い。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよ
い。
いて自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能
で、ビオチンの生合成に関与する遺伝子を転写できる位
置にプロモーターを含有しているものが用いられる。細
菌等を宿主細胞として用いる場合は、ビオチンの生合成
に関与する遺伝子発現ベクターは該細菌中で自立複製可
能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配
列、ビオチンの生合成に関与する遺伝子および転写終結
配列より構成された組換えベクターであることが好まし
い。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよ
い。
【００４６】発現ベクターとしては、例えば、ｐＢＴｒ
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社
製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega
社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-1106
00）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry,4
8, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 27
7 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社
製）、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社
製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、
pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacterio
l., 172, 2392 (1990)〕等を例示することができる。
ｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリン
ガーマンハイム社より市販）、pKK233-2（Pharmacia社
製）、pSE280（Invitrogen社製）、pGEMEX-1（Promega
社製）、pQE-8（QIAGEN社製）、pKYP10（特開昭58-1106
00）、pKYP200〔Agricultural Biological Chemistry,4
8, 669 (1984)〕、pLSA1〔Agric. Biol. Chem., 53, 27
7 (1989)〕、pGEL1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,
4306 (1985)〕、pBluescript II SK(-)（Stratagene社
製）、pGEX（Pharmacia社製）、pET-3（Novagen社
製）、pTerm2(USP4686191、USP4939094、USP5160735)、
pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400〔J. Bacterio
l., 172, 2392 (1990)〕等を例示することができる。
【００４７】プロモーターとしては、宿主細胞中で発現
できるものであればいかなるものでもよい。例えば、tr
pプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、
PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等
の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプ
ロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ
直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモータ
ー、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人
為的に設計改変されたプロモーター等も用いることがで
きる。
できるものであればいかなるものでもよい。例えば、tr
pプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、
PLプロモーター、PRプロモーター、PSEプロモーター等
の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰ
Ｏ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプ
ロモーター等をあげることができる。またＰtrpを２つ
直列させたプロモーター（Ｐtrpｘ２）、tacプロモータ
ー、letIプロモーター、lacT7プロモーターのように人
為的に設計改変されたプロモーター等も用いることがで
きる。
【００４８】リボソーム結合配列としては、宿主細胞中
で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シ
ャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドン
との間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した
プラスミッドを用いることが好ましい。本発明のビオチ
ンの生合成に関与する遺伝子の発現には転写終結配列は
必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転
写終結配列を配置することが望ましい。
で発現できるものであればいかなるものでもよいが、シ
ャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドン
との間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節した
プラスミッドを用いることが好ましい。本発明のビオチ
ンの生合成に関与する遺伝子の発現には転写終結配列は
必ずしも必要ではないが、好適には構造遺伝子直下に転
写終結配列を配置することが望ましい。
【００４９】宿主細胞としては、エシェリヒア属、セラ
チア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、
例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia col
i XL2-Blue、Escherichia coliDH1、Escherichia coli
MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coliW
1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB1
01、Escherichia coliNo.49、Escherichia coli W311
0、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacil
lus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagene
s、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Breviba
cterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium
glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum
ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、C
orynebacterium acetoacidophilumATCC13870、Microbac
terium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-
0110等をあげることができる。
チア属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム
属、シュードモナス属、バチルス属等に属する微生物、
例えば、Escherichia coli XL1-Blue、Escherichia col
i XL2-Blue、Escherichia coliDH1、Escherichia coli
MC1000、Escherichia coli KY3276、Escherichia coliW
1485、Escherichia coli JM109、Escherichia coli HB1
01、Escherichia coliNo.49、Escherichia coli W311
0、Escherichia coli NY49、Bacillus subtilis、Bacil
lus amyloliquefaciens、Brevibacterium ammmoniagene
s、Brevibacterium immariophilum ATCC14068、Breviba
cterium saccharolyticum ATCC14066、Corynebacterium
glutamicum ATCC13032、Corynebacterium glutamicum
ATCC14067、Corynebacterium glutamicum ATCC13869、C
orynebacterium acetoacidophilumATCC13870、Microbac
terium ammoniaphilum ATCC15354、Pseudomonas sp. D-
0110等をあげることができる。
【００５０】組換えベクターの導入方法としては、上記
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene,
17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168,
111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用い
ることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法
〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、
プロトプラスト法（特開昭63-2483942）、またはGene,
17, 107 (1982)やMolecular & General Genetics, 168,
111 (1979)に記載の方法等をあげることができる。
【００５１】また、接合伝達法により異属微生物に組換
えベクターを導入することもできる。具体的な接合伝達
法としては、例えば、以下のように大腸菌の含有する組
換えベクターをシュードモナスに属する微生物に導入す
る方法をあげることができる。
えベクターを導入することもできる。具体的な接合伝達
法としては、例えば、以下のように大腸菌の含有する組
換えベクターをシュードモナスに属する微生物に導入す
る方法をあげることができる。
【００５２】組換えベクターを含有する大腸菌、シュー
ドモナスに属する微生物およびｔｒａおよびｍｏｂを含
むヘルパープラスミドを含有する大腸菌を各々培養し、
得られた培養液を等量混合する。該混合液をフィルター
（例えば、Millipore、TypeHA、0.45μｍ）上で濃縮し
た後、フィルターを菌体を含む面を上にして、ＬＢ寒天
平板培地等の天然培地あるいは合成寒天平板培地上に乗
せる。
ドモナスに属する微生物およびｔｒａおよびｍｏｂを含
むヘルパープラスミドを含有する大腸菌を各々培養し、
得られた培養液を等量混合する。該混合液をフィルター
（例えば、Millipore、TypeHA、0.45μｍ）上で濃縮し
た後、フィルターを菌体を含む面を上にして、ＬＢ寒天
平板培地等の天然培地あるいは合成寒天平板培地上に乗
せる。
【００５３】数時間静置培養後、適度に希釈し、大腸菌
は生育できず、大腸菌の含有する組換えベクターの導入
されたシュードモナスに属する微生物のみ生育可能な寒
天平板培地、例えば、５００ｍｇ／ｌのアンピシリンと
５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを同時に含むＬＢ
培地等の上に塗布し、培養する。生育してきたコロニー
を分離することにより、目的の組換えベクターの導入さ
れたシュードモナスに属する微生物を取得することがで
きる。
は生育できず、大腸菌の含有する組換えベクターの導入
されたシュードモナスに属する微生物のみ生育可能な寒
天平板培地、例えば、５００ｍｇ／ｌのアンピシリンと
５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを同時に含むＬＢ
培地等の上に塗布し、培養する。生育してきたコロニー
を分離することにより、目的の組換えベクターの導入さ
れたシュードモナスに属する微生物を取得することがで
きる。
【００５４】ヘルパープラスミドとしては、例えばｐＲ
Ｋ２０１３〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1648
(1979)〕等を利用することができる。酵母を宿主細胞と
して用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｙ
Ｅｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、Ｙ
Ｃｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を
例示することができる。
Ｋ２０１３〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 1648
(1979)〕等を利用することができる。酵母を宿主細胞と
して用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｙ
Ｅｐ１３（ATCC37115）、ＹＥｐ２４（ATCC37051）、Ｙ
Ｃｐ５０（ATCC37419）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を
例示することができる。
【００５５】プロモーターとしては、酵母中で発現でき
るものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、
ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロ
モーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモー
ター等のプロモーターをあげることができる。
るものであればいかなるものでもよく、例えば、ＰＨＯ
５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモー
ター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ １プロモーター、
ｇａｌ １０プロモーター、ヒートショック蛋白質プロ
モーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ １プロモー
ター等のプロモーターをあげることができる。
【００５６】宿主細胞としては、サッカロミセス・セレ
ビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュ
イベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ト
リコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces
alluvius）等をあげることができる。
ビシエ（Saccharomyces cerevisae）、シゾサッカロミ
セス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、クリュ
イベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ト
リコスポロン・プルランス（Trichosporon pullulan
s）、シュワニオミセス・アルビウス（Schwanniomyces
alluvius）等をあげることができる。
【００５７】組換えベクターの導入方法としては、酵母
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. E
nzymol., 194, 182 (1990〕、スフェロプラスト法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Ba
cteriol.）、153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 75, 1929(1978)記載の方法等をあげることが
できる。
にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることが
でき、例えば、エレクトロポレーション法〔Methods. E
nzymol., 194, 182 (1990〕、スフェロプラスト法〔Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)〕、酢酸リ
チウム法〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Ba
cteriol.）、153, 163 (1983)〕、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 75, 1929(1978)記載の方法等をあげることが
できる。
【００５８】動物細胞を宿主細胞として用いる場合に
は、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤ
Ｍ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平
3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ
３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329,
840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社
製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３
〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＧＥ２１０
等を例示することができる。
は、発現ベクターとして、例えば、pｃＤＮＡI、ｐｃＤ
Ｍ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７〔特開平
3-22979；Cytotechnology, 3, 133, (1990)〕、ｐＡＳ
３−３（特開平2-227075）、ｐＣＤＭ８〔Nature, 329,
840, (1987)〕、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（Invitrogen社
製）、ｐＲＥＰ４（Invitrogen社製）、ｐＡＧＥ１０３
〔J. Biochem., 101, 1307 (1987)〕、ｐＡＧＥ２１０
等を例示することができる。
【００５９】プロモーターとしては、動物細胞中で発現
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（imme
diateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、
ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒ
トＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと
共に用いてもよい。
できるものであればいずれも用いることができ、例え
ば、サイトメガロウイルス（ヒトＣＭＶ）のＩＥ（imme
diateearly）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プ
ロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチ
オネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、
ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒ
トＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと
共に用いてもよい。
【００６０】宿主細胞としては、ナマルバ細胞、ＨＢＴ
５６３７（特開昭６３―２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯ
Ｓ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。動物細
胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤ
ＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例
えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology,
3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２―２２
７０７５）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA, 84, 7413(1987)〕、virology, 52, 456 (1973)
に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取
得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるい
は特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法
に準じて行なうことができる。
５６３７（特開昭６３―２９９）、ＣＯＳ１細胞、ＣＯ
Ｓ７細胞、ＣＨＯ細胞等をあげることができる。動物細
胞への組換えベクターの導入法としては、動物細胞にＤ
ＮＡを導入できるいかなる方法も用いることができ、例
えば、エレクトロポーレーション法〔Cytotechnology,
3, 133(1990)〕、リン酸カルシウム法（特開平２―２２
７０７５）、リポフェクション法〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA, 84, 7413(1987)〕、virology, 52, 456 (1973)
に記載の方法等を用いることができる。形質転換体の取
得および培養は、特開平２−２２７０７５号公報あるい
は特開平２−２５７８９１号公報に記載されている方法
に準じて行なうことができる。
【００６１】昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例
えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expr
ession Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
サプルメント1-３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6,4
7 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現す
ることができる。
えばバキュロウイルス・イクスプレッション・ベクター
ズ・ア・ラボラトリー・マニュアル（Baculovirus Expr
ession Vectors, A Laboratory Manual）、カレント・
プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー
サプルメント1-３８(1987-1997)、Bio/Technology, 6,4
7 (1988)等に記載された方法によって、蛋白質を発現す
ることができる。
【００６２】即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバ
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができ
る。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとし
ては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢ
ｌｕｅＢａｃIII（ともにインビトロジェン社製）等を
あげることができる。
キュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上
清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルス
を昆虫細胞に感染させ、蛋白質を発現させることができ
る。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとし
ては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢ
ｌｕｅＢａｃIII（ともにインビトロジェン社製）等を
あげることができる。
【００６３】バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodop
tera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman an
d Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、T
richoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビ
トロジェン社製）等を用いることができる。
蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カ
リフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス
(Autographa californica nuclear polyhedrosis viru
s)等を用いることができる。昆虫細胞としては、Spodop
tera frugiperdaの卵巣細胞であるＳｆ９、Ｓｆ２１
〔バキュロウイルス・エクスプレッション・ベクター
ズ、ア・ラボラトリー・マニュアル、ダブリュー・エイ
チ・フリーマン・アンド・カンパニー（W.H.Freeman an
d Company）、ニューヨーク（New York）、(1992)〕、T
richoplusia niの卵巣細胞であるＨｉｇｈ ５（インビ
トロジェン社製）等を用いることができる。
【００６４】組換えウイルスを調製するための、昆虫細
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行う
ことができる。
胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウ
イルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウ
ム法（特開平2-227075）、リポフェクション法〔Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 84,7413 (1987)〕等をあげるこ
とができる。遺伝子の発現方法としては、直接発現以外
に、モレキュラー・クローニング第２版に記載されてい
る方法等に準じて、分泌生産、融合蛋白質発現等を行う
ことができる。
【００６５】酵母、動物細胞または昆虫細胞により発現
させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を
得ることができる。ビオチンの生合成に関与する遺伝子
を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培
地に培養し、培養物中にビオチンの生合成に関与する蛋
白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する
ことにより、ビオチンの生合成に関与する蛋白質を製造
することができる。
させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を
得ることができる。ビオチンの生合成に関与する遺伝子
を組み込んだ組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体を培
地に培養し、培養物中にビオチンの生合成に関与する蛋
白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する
ことにより、ビオチンの生合成に関与する蛋白質を製造
することができる。
【００６６】本発明のビオチンの生合成に関与する蛋白
質製造用の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の
培養に用いられる通常の方法に従って行うことができ
る。本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌
等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地
は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であ
れば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
質製造用の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の
培養に用いられる通常の方法に従って行うことができ
る。本発明の形質転換体が大腸菌等の原核生物、酵母菌
等の真核生物である場合、これら微生物を培養する培地
は、該微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等
を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であ
れば天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００６７】炭素源としては、それぞれの微生物が資化
し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、
スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいは
デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸
等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモ
ニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン
加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵
菌体およびその消化物等が用いられる。
し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、
スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいは
デンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸
等の有機酸、エタノール、プロパノールなどのアルコー
ル類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化
アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
リン酸アンモニウム、等の各種無機酸や有機酸のアンモ
ニウム塩、その他含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉
エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン
加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵
菌体およびその消化物等が用いられる。
【００６８】無機物としては、リン酸第一カリウム、リ
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６
時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて行う。
ン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫
酸銅、炭酸カルシウム等が用いられる。培養は、振盪培
養または深部通気攪拌培養などの好気的条件下で行う。
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常１６
時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に
保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アル
カリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニアなどを用
いて行う。
【００６９】また培養中必要に応じて、アンピシリンや
テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、tr
pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微
生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）等を培地に添加してもよい。
テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた
発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときに
は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよ
い。例えば、lacプロモーターを用いた発現ベクターで
形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）等を、tr
pプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微
生物を培養するときにはインドールアクリル酸（ＩＡ
Ａ）等を培地に添加してもよい。
【００７０】動物細胞を宿主細胞として得られた形質転
換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲ
ＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Me
dical Association, 199, 519 (1967)〕、Ｅａｇｌｅの
ＭＥＭ培地〔Science, 122,501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培
地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceed
ing of the Society for the Biological Medicine, 7
3, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加
した培地等が用いられる。
換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲ
ＰＭＩ１６４０培地〔The Journal of the American Me
dical Association, 199, 519 (1967)〕、Ｅａｇｌｅの
ＭＥＭ培地〔Science, 122,501 (1952)〕、ＤＭＥＭ培
地〔Virology, 8, 396 (1959)〕、１９９培地〔Proceed
ing of the Society for the Biological Medicine, 7
3, 1 (1950)〕またはこれら培地に牛胎児血清等を添加
した培地等が用いられる。
【００７１】培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、
５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主細胞と
して得られた形質転換体を培養する培地としては、一般
に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Pharmingen社
製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、Ｅｘ
Ｃｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもJRHBio
sciences社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.
C.,Nature, 195, 788(1962)〕等を用いることができ
る。
５％ＣＯ2存在下等の条件下で１〜７日間行う。また、
培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗
生物質を培地に添加してもよい。昆虫細胞を宿主細胞と
して得られた形質転換体を培養する培地としては、一般
に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地〔Pharmingen社
製〕、Sf-900 II SFM培地（ギブコＢＲＬ社製）、Ｅｘ
Ｃｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５〔いずれもJRHBio
sciences社製〕、Grace's Insect Medium〔Grace, T.C.
C.,Nature, 195, 788(1962)〕等を用いることができ
る。
【００７２】培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等
の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じ
て、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。本発明の形質転換体の培養物から、本発明のビオチ
ンの生合成に関与する蛋白質を単離精製するには、通常
の酵素の単離、精製法を用いればよい。
の条件下で、１〜５日間行う。また、培養中必要に応じ
て、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよ
い。本発明の形質転換体の培養物から、本発明のビオチ
ンの生合成に関与する蛋白質を単離精製するには、通常
の酵素の単離、精製法を用いればよい。
【００７３】例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解
状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離
により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フ
レンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイ
ノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該
無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か
ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安
等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION
HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交
換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシ
ア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース
等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子
篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等
の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用
い、精製標品を得ることができる。
状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離
により回収し水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フ
レンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイ
ノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該
無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清か
ら、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安
等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、DIAION
HPA-75（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交
換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシ
ア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラ
フィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース
等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子
篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフ
ィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等
の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用
い、精製標品を得ることができる。
【００７４】また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成し
て発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分
離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法
により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変
性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含ま
ないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない
程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を
正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製
法により精製標品を得ることができる。
て発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分
離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法
により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変
性剤で可溶化する。該可溶化液を、蛋白質変性剤を含ま
ないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない
程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を
正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製
法により精製標品を得ることができる。
【００７５】本発明の蛋白質あるいはその糖修飾体等の
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋
白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること
ができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の
手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該
可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いること
により、精製標品を得ることができる。
誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋
白質あるいはその糖鎖付加体等の誘導体を回収すること
ができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の
手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該
可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いること
により、精製標品を得ることができる。
【００７６】また、上記方法により発現させた蛋白質
を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル
法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化
学合成法によっても製造することができる。また、桑和
貿易(米国Advanced chemTech社製)、パーキンエルマー
ジャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオ
テク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米
国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米
国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテ
ッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合
成機を利用し合成することもできる。 （３）ビオチン活性物質の製造 上記（２）で取得された形質転換体を、上記（２）の方
法に準じて培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成
蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取するこ
とによりビオチン活性物質を製造することができる。
を、Ｆｍｏｃ法(フルオレニルメチルオキシカルボニル
法)、ｔＢｏｃ法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の化
学合成法によっても製造することができる。また、桑和
貿易(米国Advanced chemTech社製)、パーキンエルマー
ジャバン(米国Perkin-Elmer社製)、ファルマシアバイオ
テク(スウューデンPharmacia Biotech社製)、アロカ(米
国Protein Technology Instrument社製)、クラボウ(米
国Synthecell-Vega社製)、日本パーセプティブ・リミテ
ッド(米国PerSeptive社製)、島津製作所等のペプチド合
成機を利用し合成することもできる。 （３）ビオチン活性物質の製造 上記（２）で取得された形質転換体を、上記（２）の方
法に準じて培養し、培養物中にビオチン活性物質を生成
蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取するこ
とによりビオチン活性物質を製造することができる。
【００７７】また、形質転換させていない、シュードモ
ナス属に属し、ビオチン活性物質の生産能を有する微生
物を上記（２）の方法に準じて培養し、培養物中にビオ
チン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活
性物質を採取することによりビオチン活性物質を製造す
ることもできる。培養時にエタノールを０．２〜２０容
量％の範囲で培地に添加して培養することにより、ｄ−
ビオチン生産効率を高めることができる。
ナス属に属し、ビオチン活性物質の生産能を有する微生
物を上記（２）の方法に準じて培養し、培養物中にビオ
チン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活
性物質を採取することによりビオチン活性物質を製造す
ることもできる。培養時にエタノールを０．２〜２０容
量％の範囲で培地に添加して培養することにより、ｄ−
ビオチン生産効率を高めることができる。
【００７８】また、培養中に、培養に用いる培地成分お
よびエタノールを適宜途中添加あるいは連続添加するこ
とにより、ｄ−ビオチンの生産効率を高めることができ
る。培養液からのビオチン活性物質の単離・精製は、ビ
オチン活性物質の諸性質を利用して、一般の天然物から
抽出精製する通常の方法により行うことができる。即
ち、培養液から遠心分離等の方法により不溶物を除いた
後、活性炭やマクロポーラス非イオン系樹脂等に吸着さ
せ、その後溶出させ、さらにイオン交換樹脂に通して精
製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹脂で処
理して精製し、水またはアルコールより再結晶すること
によりビオチン活性物質を単離・精製することができる
〔遠藤 勲ら、化学工学会（編）「バイオセパレーショ
ンプロセス便覧」、共立出版(1996)〕。
よびエタノールを適宜途中添加あるいは連続添加するこ
とにより、ｄ−ビオチンの生産効率を高めることができ
る。培養液からのビオチン活性物質の単離・精製は、ビ
オチン活性物質の諸性質を利用して、一般の天然物から
抽出精製する通常の方法により行うことができる。即
ち、培養液から遠心分離等の方法により不溶物を除いた
後、活性炭やマクロポーラス非イオン系樹脂等に吸着さ
せ、その後溶出させ、さらにイオン交換樹脂に通して精
製するか、あるいは培養濾液を直接イオン交換樹脂で処
理して精製し、水またはアルコールより再結晶すること
によりビオチン活性物質を単離・精製することができる
〔遠藤 勲ら、化学工学会（編）「バイオセパレーショ
ンプロセス便覧」、共立出版(1996)〕。
【００７９】以下に本発明の実施例を示すが、本発明は
これらの実施例に限定されるものではない。
これらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
【実施例】実施例１ ビオチン活性物質高生産微生物の
検索 土壌試料中よりビオチン活性物質高生産能を有する微生
物を以下のように検索した。土壌試料を滅菌済の０．８
５％食塩水に懸濁し適当に希釈した後に、ＢＹ寒天平板
培地〔普通ブイヨン ２０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ポリペ
プトン ５ｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２
に調整した培地〕に塗布し、３０℃で１〜３日間培養し
た。
検索 土壌試料中よりビオチン活性物質高生産能を有する微生
物を以下のように検索した。土壌試料を滅菌済の０．８
５％食塩水に懸濁し適当に希釈した後に、ＢＹ寒天平板
培地〔普通ブイヨン ２０ｇ、酵母エキス ５ｇ、ポリペ
プトン ５ｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２
に調整した培地〕に塗布し、３０℃で１〜３日間培養し
た。
【００８１】形成されたコロニーを新たなＢＹ寒天平板
培地に塗布して３０℃で１〜２日間培養した後、評価培
地ＰＭ１〔グリセロール ２０ｇ、ペプトン ２０ｇ、カ
ザミノ酸 １０ｇ、酵母エキス ２ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩
５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０ ０．５
ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調
整した培地〕８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３０℃
で３日間振とう培養した。
培地に塗布して３０℃で１〜２日間培養した後、評価培
地ＰＭ１〔グリセロール ２０ｇ、ペプトン ２０ｇ、カ
ザミノ酸 １０ｇ、酵母エキス ２ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩
５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ4 ２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2０ ０．５
ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．２に調
整した培地〕８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３０℃
で３日間振とう培養した。
【００８２】培養終了後、遠心分離により培養物から菌
体を除去し、上清中のｄ−ビオチンおよびビオチン活性
物質を定量した。ｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質
の定量は、それぞれ、ラクトバシルス プランタルム
（Lactobacillus plantarum ATCC8014）、サッカロミセ
ス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ATCC775
4）を用いる微生物定量法〔和泉好計ら、日本ビタミン
学会（編）「ビタミン学実験法 ＩＩ」、ｐ．４７５−
５２１、東京化学同人（１９８３）〕により行った。
体を除去し、上清中のｄ−ビオチンおよびビオチン活性
物質を定量した。ｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質
の定量は、それぞれ、ラクトバシルス プランタルム
（Lactobacillus plantarum ATCC8014）、サッカロミセ
ス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae ATCC775
4）を用いる微生物定量法〔和泉好計ら、日本ビタミン
学会（編）「ビタミン学実験法 ＩＩ」、ｐ．４７５−
５２１、東京化学同人（１９８３）〕により行った。
【００８３】ｄ−ビオチン含量に関しては、高速液体ク
ロマトグラフィー（YMC A-313カラム、５０ｍＭ ＮＨ4
Ｈ2ＰＯ4：アセトニトリル＝８５：１５、２１０ｎｍ）
でも確認した。検索の結果、多数のｄ−ビオチンおよび
ビオチン活性物質の高い生産能を有する菌株を取得した
が、特にシュードモナス エスピー Ｄ−０１１０株
（以下、Ｄ−０１１０株ともいう）が野生株としては極
めて高いｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の生産性
を示し、培地中に各々約１ｍｇ／ｌおよび約３0ｍｇ／
ｌ生産・蓄積した。
ロマトグラフィー（YMC A-313カラム、５０ｍＭ ＮＨ4
Ｈ2ＰＯ4：アセトニトリル＝８５：１５、２１０ｎｍ）
でも確認した。検索の結果、多数のｄ−ビオチンおよび
ビオチン活性物質の高い生産能を有する菌株を取得した
が、特にシュードモナス エスピー Ｄ−０１１０株
（以下、Ｄ−０１１０株ともいう）が野生株としては極
めて高いｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の生産性
を示し、培地中に各々約１ｍｇ／ｌおよび約３0ｍｇ／
ｌ生産・蓄積した。
【００８４】シュードモナス エスピー Ｄ−０１１０
株と既知のビオチン高生産株を評価培地ＰＭ１または評
価培地ＰＭ２〔評価培地ＰＭ１にピメリン酸 ０．１％
を添加した培地〕８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３
０℃で３日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離に
より培養物から菌体を除去し、上清中のｄ−ビオチンお
よびビオチン活性物質を上記と同様な方法により定量し
た。
株と既知のビオチン高生産株を評価培地ＰＭ１または評
価培地ＰＭ２〔評価培地ＰＭ１にピメリン酸 ０．１％
を添加した培地〕８ｍｌを含む太型試験管に接種し、３
０℃で３日間振とう培養した。培養終了後、遠心分離に
より培養物から菌体を除去し、上清中のｄ−ビオチンお
よびビオチン活性物質を上記と同様な方法により定量し
た。
【００８５】結果を第６表に示す。
【００８６】
【表７】 Ｄ−０１１０株は、既知のビオチン高生産微生物と比べ
て、極めて高いｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の
生産能を有していた。
て、極めて高いｄ−ビオチンおよびビオチン活性物質の
生産能を有していた。
【００８７】実施例２ Ｄ−０１１０株のビオチン生合
成遺伝子のクローニング エシェリヒア コリ ＭＭ２９４株を３０ｍｌのＬＢ培
地を含む三角フラスコに接種し、３０℃で対数増殖期の
中期まで振とう培養した。該培養液を遠心分離して得た
菌体を、常法に従い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンを用いて変異処理後、０．８５％食
塩水で適当に希釈してＬＢ寒天平板培地に塗布し、３０
℃で２日間培養した。
成遺伝子のクローニング エシェリヒア コリ ＭＭ２９４株を３０ｍｌのＬＢ培
地を含む三角フラスコに接種し、３０℃で対数増殖期の
中期まで振とう培養した。該培養液を遠心分離して得た
菌体を、常法に従い、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−
ニトロソグアニジンを用いて変異処理後、０．８５％食
塩水で適当に希釈してＬＢ寒天平板培地に塗布し、３０
℃で２日間培養した。
【００８８】形成されたコロニーをＭ９寒天平板培地
〔グルコース ２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．０１ｇ、チアミン
塩酸塩 ０．１ｍｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ
７．２に調整した培地〕およびｄ−ビオチン１０ｍｇ／
ｌを含むＭ９寒天平板培地にそれぞれ塗布し、３０℃で
2日間培養した。該培養において、ｄ−ビオチンを含む
Ｍ９寒天平板培地でのみ生育可能なｄ−ビオチン要求性
変異株を４株取得した。以後、これら変異株をそれぞれ
ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９株、およびＲ
Ｂ１０２株と呼ぶ。
〔グルコース ２ｇ、Ｎａ2ＨＰＯ4 ６ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
３ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ4Ｃｌ １ｇ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣｌ2 ０．０１ｇ、チアミン
塩酸塩 ０．１ｍｇ、寒天１５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ
７．２に調整した培地〕およびｄ−ビオチン１０ｍｇ／
ｌを含むＭ９寒天平板培地にそれぞれ塗布し、３０℃で
2日間培養した。該培養において、ｄ−ビオチンを含む
Ｍ９寒天平板培地でのみ生育可能なｄ−ビオチン要求性
変異株を４株取得した。以後、これら変異株をそれぞれ
ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９株、およびＲ
Ｂ１０２株と呼ぶ。
【００８９】ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３株、ＲＢ１０９
株、およびＲＢ１０２株における欠損遺伝子の同定は、
エシェリシア コリ由来のビオチン生合成遺伝子群を持
つプラスミドpLC25-23〔J. Mol. Biol., 148, 63 (198
1)〕を利用した生育の相補試験により行った。即ち、pL
C25-23からビオチン生合成遺伝子群の中に部分的に欠損
を持った欠失プラスミド、あるいは同遺伝子群の中の一
部をサブクローニングして得た誘導体プラスミドを常法
によって種々作製し、これらの一連のプラスミドで各ビ
オチン要求株を形質転換して、ビオチン要求性の相補の
有無を調べた。
株、およびＲＢ１０２株における欠損遺伝子の同定は、
エシェリシア コリ由来のビオチン生合成遺伝子群を持
つプラスミドpLC25-23〔J. Mol. Biol., 148, 63 (198
1)〕を利用した生育の相補試験により行った。即ち、pL
C25-23からビオチン生合成遺伝子群の中に部分的に欠損
を持った欠失プラスミド、あるいは同遺伝子群の中の一
部をサブクローニングして得た誘導体プラスミドを常法
によって種々作製し、これらの一連のプラスミドで各ビ
オチン要求株を形質転換して、ビオチン要求性の相補の
有無を調べた。
【００９０】その結果、変異株ＲＢ１１０株、ＲＢ１０
３株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株は、それぞれ
ｂｉｏＡ欠損株、ｂｉｏＢ欠損株、ｂｉｏＤ欠損株、お
よびｂｉｏＦ欠損株と同定された。シュードモナス エ
スピー Ｄ−０１１０株を２５０ｍｌの評価培地ＰＭ１
を含む２Ｌ三角フラスコに接種し、３０℃で対数増殖期
の後期まで振とう培養した。
３株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株は、それぞれ
ｂｉｏＡ欠損株、ｂｉｏＢ欠損株、ｂｉｏＤ欠損株、お
よびｂｉｏＦ欠損株と同定された。シュードモナス エ
スピー Ｄ−０１１０株を２５０ｍｌの評価培地ＰＭ１
を含む２Ｌ三角フラスコに接種し、３０℃で対数増殖期
の後期まで振とう培養した。
【００９１】該培養液を遠心分離して得られた菌体か
ら、Saitoらの方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 61
9 (1963)〕に従って染色体ＤＮＡを調製した。該染色体
ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩで完
全に消化した後に、プラスミドベクターｐＭＷ２１８
（和光純薬）の、それぞれ対応する制限酵素切断部位に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
ら、Saitoらの方法〔Biochim. Biophys. Acta., 72, 61
9 (1963)〕に従って染色体ＤＮＡを調製した。該染色体
ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩまたはＥｃｏＲＩで完
全に消化した後に、プラスミドベクターｐＭＷ２１８
（和光純薬）の、それぞれ対応する制限酵素切断部位に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【００９２】該ＤＮＡ連結物を用いて、上記の各種ビオ
チン生合成遺伝子欠損株を塩化カルシウム法〔Molecula
r Cloning, Second Edition〕により形質転換した。該
形質転換体をカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＭ９寒天
平板培地で培養し、該培地で生育可能な形質転換体を取
得した。これら形質転換体を、ＬＢ培地８ｍｌを含む太
型試験管に接種し、３０℃で１日間振とう培養した。
チン生合成遺伝子欠損株を塩化カルシウム法〔Molecula
r Cloning, Second Edition〕により形質転換した。該
形質転換体をカナマイシン５０ｍｇ／ｌを含むＭ９寒天
平板培地で培養し、該培地で生育可能な形質転換体を取
得した。これら形質転換体を、ＬＢ培地８ｍｌを含む太
型試験管に接種し、３０℃で１日間振とう培養した。
【００９３】培養後、得られた培養液を遠心分離により
菌体を取得した。該菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法〔Mole
cular Cloning, Second Edition〕によりプラスミドを
取得した。取得したプラスミドの内、２種類の組換え体
プラスミドｐＭＢ−００１およびｐＭＢ−００２につい
て、各種制限酵素による切断解析を行った。
菌体を取得した。該菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法〔Mole
cular Cloning, Second Edition〕によりプラスミドを
取得した。取得したプラスミドの内、２種類の組換え体
プラスミドｐＭＢ−００１およびｐＭＢ−００２につい
て、各種制限酵素による切断解析を行った。
【００９４】該解析の結果、ｐＭＢ−００１はｐＭＷ２
１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位に約７．５ｋｂの、またｐＭ
Ｂ−００１はｐＭＷ２１８のＥｃｏＲＩ部位に約１２ｋ
ｂの、シュードモナス由来のＤＮＡ断片を有していた。
両ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を図１および２に示
す。上記２種のＤＮＡ断片に含まれるビオチン生合成遺
伝子を同定するために、組換え体プラスミドｐＭＢ−０
０１およびｐＭＢ−００２をそれぞれ、上記で取得し
た、ビオチン要求性変異株ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３
株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株に導入して、ビ
オチン非存在下での生育相補能を調べた。
１８のＨｉｎｄＩＩＩ部位に約７．５ｋｂの、またｐＭ
Ｂ−００１はｐＭＷ２１８のＥｃｏＲＩ部位に約１２ｋ
ｂの、シュードモナス由来のＤＮＡ断片を有していた。
両ＤＮＡ断片の制限酵素切断地図を図１および２に示
す。上記２種のＤＮＡ断片に含まれるビオチン生合成遺
伝子を同定するために、組換え体プラスミドｐＭＢ−０
０１およびｐＭＢ−００２をそれぞれ、上記で取得し
た、ビオチン要求性変異株ＲＢ１１０株、ＲＢ１０３
株、ＲＢ１０９株、およびＲＢ１０２株に導入して、ビ
オチン非存在下での生育相補能を調べた。
【００９５】ｐＭＢ−００１に挿入されている約７．５
ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片には７−ケト−８−アミノペ
ラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸の生合成
に関与する遺伝子（ｂｉｏＡに対応）が、ｐＭＢ−００
２に挿入されている約１２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には、
デチオビオチンからビオチンの生合成に関与する遺伝子
（ｂｉｏＢに対応）、７，８−ジアミノペラルゴン酸か
らデチオビオチンの生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＤ
に対応）、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノ
ペラルゴン酸の生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＦに対
応）の各遺伝子が存在することが判明した。
ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片には７−ケト−８−アミノペ
ラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸の生合成
に関与する遺伝子（ｂｉｏＡに対応）が、ｐＭＢ−００
２に挿入されている約１２ｋｂのＥｃｏＲＩ断片には、
デチオビオチンからビオチンの生合成に関与する遺伝子
（ｂｉｏＢに対応）、７，８−ジアミノペラルゴン酸か
らデチオビオチンの生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＤ
に対応）、ピメリル−ＣｏＡから７−ケト−８−アミノ
ペラルゴン酸の生合成に関与する遺伝子（ｂｉｏＦに対
応）の各遺伝子が存在することが判明した。
【００９６】さらに、両断片のサブクローニングとその
相補試験により、ｂｉｏＡはＨｉｎｄＩＩＩ断片中の、
内部にＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩＩ部位を有する約２．
９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位内に、ｂｉｏＢ
はＥｃｏＲＩ断片中の約３．９ｋｂのＰｓｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉ部位内に存在することがわかった。ＰｓｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉ部位内にはＳａｌＩ部位が数カ所存在し、これらＳａ
ｌＩ部位内の約１．９ｋｂ断片内にｂｉｏＢは存在する
ことがわかった。
相補試験により、ｂｉｏＡはＨｉｎｄＩＩＩ断片中の、
内部にＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩＩ部位を有する約２．
９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位内に、ｂｉｏＢ
はＥｃｏＲＩ断片中の約３．９ｋｂのＰｓｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉ部位内に存在することがわかった。ＰｓｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉ部位内にはＳａｌＩ部位が数カ所存在し、これらＳａ
ｌＩ部位内の約１．９ｋｂ断片内にｂｉｏＢは存在する
ことがわかった。
【００９７】ｂｉｏＢを含む約１．９ｋｂのＳａｌＩ断
片の塩基配列を常法に従って決定した。ｂｉｏＢは１０
５３ｂｐ長で、３５１アミノ酸をコードしていた。ｂｉ
ｏＢのＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、該ＤＮＡにコ
ードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
片の塩基配列を常法に従って決定した。ｂｉｏＢは１０
５３ｂｐ長で、３５１アミノ酸をコードしていた。ｂｉ
ｏＢのＤＮＡの塩基配列を配列番号２に、該ＤＮＡにコ
ードされる蛋白質のアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００９８】実施例３ 組換え体プラスミドｐＥＢ−０
０２の作製 組換え体プラスミドｐＭＢ−００１をＨｉｎｄＩＩＩお
よびＰｓｔＩで切断し、ｂｉｏＡを含む約２．９ｋｂの
ＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片を、プラスミドベ
クターｐＥＧ４００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
０２の作製 組換え体プラスミドｐＭＢ−００１をＨｉｎｄＩＩＩお
よびＰｓｔＩで切断し、ｂｉｏＡを含む約２．９ｋｂの
ＤＮＡ断片を取得した。該ＤＮＡ断片を、プラスミドベ
クターｐＥＧ４００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ部位に
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。
【００９９】該連結プラスミドを用い、エシェリヒア
コリ ＤＨ５α株を塩化カルシウム法により形質転換し
た。得られた形質転換体をスペクチノマイシン５０ｍｇ
／ｌを含むＬＢ寒天平板培地で培養し、該培地で生育す
る形質転換株を目的をする形質転換体として取得した。
コリ ＤＨ５α株を塩化カルシウム法により形質転換し
た。得られた形質転換体をスペクチノマイシン５０ｍｇ
／ｌを含むＬＢ寒天平板培地で培養し、該培地で生育す
る形質転換株を目的をする形質転換体として取得した。
【０１００】これら形質転換株の１株からアルカリ−Ｓ
ＤＳ法によりプラスミドｐＥＢ−００１を取得した。該
ｐＥＢ−００１は、各種制限酵素による切断解析の結
果、ベクターｐＥＧ４００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ
部位に、ｂｉｏＡを含む約２．９ｋｂＤＮＡ断片を有し
ていることがわかった（図３）。
ＤＳ法によりプラスミドｐＥＢ−００１を取得した。該
ｐＥＢ−００１は、各種制限酵素による切断解析の結
果、ベクターｐＥＧ４００のＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ
部位に、ｂｉｏＡを含む約２．９ｋｂＤＮＡ断片を有し
ていることがわかった（図３）。
【０１０１】組換え体プラスミドｐＭＢ−００２につい
ては、ＥｃｏＲＩで切断し、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤおよび
ｂｉｏＦを含む約１２ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。該
断片を、上記で得た組換え体プラスミドｐＥＢ−００１
のＥｃｏＲＩ切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結した。該連結プラスミドを用い、エシェリヒア コリ
ＤＨ５α株を塩化カルシウム法により形質転換した。
ては、ＥｃｏＲＩで切断し、ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤおよび
ｂｉｏＦを含む約１２ｋｂのＤＮＡ断片を取得した。該
断片を、上記で得た組換え体プラスミドｐＥＢ−００１
のＥｃｏＲＩ切断部位にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連
結した。該連結プラスミドを用い、エシェリヒア コリ
ＤＨ５α株を塩化カルシウム法により形質転換した。
【０１０２】得られた形質転換体をスペクチノマイシン
５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天平板培地で培養し、該培地
で生育する形質転換株を目的をする形質転換体として取
得した。これら形質転換株の１株からアルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドｐＥＢ−００２を取得した。
５０ｍｇ／ｌを含むＬＢ寒天平板培地で培養し、該培地
で生育する形質転換株を目的をする形質転換体として取
得した。これら形質転換株の１株からアルカリ−ＳＤＳ
法によりプラスミドｐＥＢ−００２を取得した。
【０１０３】該ｐＥＢ−００２は、各種制限酵素による
切断解析の結果、ｐＥＢ−００１のＥｃｏＲＩ部位に、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏＦを含む約１２ｋｂの
ＤＮＡ断片を有していることがわかった（図３）。ｐＥ
Ｂ−００２を保有するエシェリヒア コリ ＤＨ５α株
は、ブダペスト条約に基づいて、平成１０年３月１０日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４
６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６２８９号として寄託されてい
る。
切断解析の結果、ｐＥＢ−００１のＥｃｏＲＩ部位に、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤおよびｂｉｏＦを含む約１２ｋｂの
ＤＮＡ断片を有していることがわかった（図３）。ｐＥ
Ｂ−００２を保有するエシェリヒア コリ ＤＨ５α株
は、ブダペスト条約に基づいて、平成１０年３月１０日
付けで工業技術院生命工学工業技術研究所、日本国茨城
県つくば市東１丁目１番３号（郵便番号３０５−００４
６）にＦＥＲＭ ＢＰ−６２８９号として寄託されてい
る。
【０１０４】実施例４ 組換え体プラスミドｐＥＢ−０
０２によるＤ−０１１０株の形質転換 組換え体プラスミドｐＥＢ−００２を保有するエシェリ
ヒア コリ ＤＨ５α株およびヘルパープラスミドｐＲ
Ｋ２０１３を保有するエシェリヒア コリ ＨＢ１０１
株を、各々スペクチノマイシン(５０ｍｇ／ｌ)、カナマ
イシン(５０ｍｇ／ｌ)を添加したＬＢ培地４０ｍｌを含
む三角フラスコに接種し、３０℃で１２時間振とう培養
した。
０２によるＤ−０１１０株の形質転換 組換え体プラスミドｐＥＢ−００２を保有するエシェリ
ヒア コリ ＤＨ５α株およびヘルパープラスミドｐＲ
Ｋ２０１３を保有するエシェリヒア コリ ＨＢ１０１
株を、各々スペクチノマイシン(５０ｍｇ／ｌ)、カナマ
イシン(５０ｍｇ／ｌ)を添加したＬＢ培地４０ｍｌを含
む三角フラスコに接種し、３０℃で１２時間振とう培養
した。
【０１０５】シュードモナス エスピー Ｄ−０１１０
株をＬＢ培地４０ｍｌを含む三角フラスコに接種し、３
０℃で１２時間振とう培養した。これら３菌株の培養液
からそれぞれ遠心分離により菌体を調製し、４０ｍｌの
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．３で２回遠心洗
浄後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。
株をＬＢ培地４０ｍｌを含む三角フラスコに接種し、３
０℃で１２時間振とう培養した。これら３菌株の培養液
からそれぞれ遠心分離により菌体を調製し、４０ｍｌの
１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．３で２回遠心洗
浄後、１０ｍｌの同緩衝液に懸濁した。
【０１０６】これら菌体懸濁液をそれぞれ１ｍｌずつ抜
き取り混合した後、１０ｍｌの注射筒とフィルターホル
ダー（Millipore, Swinnex ４７ｍｍ）を用いてフィル
ター（Millipore, Type HA、４７ｍｍ、０．４５μｍ）
上に濃縮した。該フィルターを菌体が濃縮された面を上
にしてＬＢ寒天平板培地上に乗せ、３０℃で４〜６時間
培養した。フィルター上の混合菌体を上記リン酸カリウ
ム緩衝液に懸濁し、適当に希釈後、５００ｍｇ／ｌのア
ンピシリンと５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを同
時に含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３０℃で１日間培
養した。
き取り混合した後、１０ｍｌの注射筒とフィルターホル
ダー（Millipore, Swinnex ４７ｍｍ）を用いてフィル
ター（Millipore, Type HA、４７ｍｍ、０．４５μｍ）
上に濃縮した。該フィルターを菌体が濃縮された面を上
にしてＬＢ寒天平板培地上に乗せ、３０℃で４〜６時間
培養した。フィルター上の混合菌体を上記リン酸カリウ
ム緩衝液に懸濁し、適当に希釈後、５００ｍｇ／ｌのア
ンピシリンと５００ｍｇ／ｌのスペクチノマイシンを同
時に含むＬＢ寒天平板培地に塗布し、３０℃で１日間培
養した。
【０１０７】該培地で生育可能なアンピシリンおよびス
ペクチノマイシン耐性の形質転換株は、シュードモナス
エスピー Ｄ−０１１０株と同一の菌学的性質を示し
た。該形質転換株の中の１株よりプラスミドを調製し
た。該プラスミドを各種の制限酵素により切断し、解析
を行うことにより、該形質転換株がｐＥＢ−００２を保
有していることを確認した。
ペクチノマイシン耐性の形質転換株は、シュードモナス
エスピー Ｄ−０１１０株と同一の菌学的性質を示し
た。該形質転換株の中の１株よりプラスミドを調製し
た。該プラスミドを各種の制限酵素により切断し、解析
を行うことにより、該形質転換株がｐＥＢ−００２を保
有していることを確認した。
【０１０８】実施例５ ビオチン活性物質の生産 Ｄ−０１１０株およびｐＥＢ−００２を保有するＤ−０
１１０株についてｄ−ビオチンおよびｄ−デチオビオチ
ンの生産を以下のように行った。ＬＢ培地８ｍｌを用
い、３０℃で２４時間振とう培養し、得られた種培養液
０．８ｍｌを８ｍｌの生産培地ＢＭ１〔グリセロール
２０ｇ、酵母エキス ２ｇ、ペプトン ２０ｇ、カザミノ
酸 １０ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩 ５ｇ、Ｌ−アラニン１
ｇ、Ｌ−メチオニン １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５
ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ ４２ｇ、ＦｅＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ１０ｍ
ｇ、ビタミンＢ1 ０．２ｍｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．
２に調整した培地〕の入った太型試験管に上記２菌株を
それぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。な
お、プラスミド保有株の種培養および生産培地での培養
はスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。
１１０株についてｄ−ビオチンおよびｄ−デチオビオチ
ンの生産を以下のように行った。ＬＢ培地８ｍｌを用
い、３０℃で２４時間振とう培養し、得られた種培養液
０．８ｍｌを８ｍｌの生産培地ＢＭ１〔グリセロール
２０ｇ、酵母エキス ２ｇ、ペプトン ２０ｇ、カザミノ
酸 １０ｇ、Ｌ−リジン塩酸塩 ５ｇ、Ｌ−アラニン１
ｇ、Ｌ−メチオニン １ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５
ｇ、ＫＣｌ ０．５ｇ、Ｋ2ＨＰＯ ４２ｇ、ＦｅＳＯ4・
７Ｈ2Ｏ １０ｍｇ、ＭｎＳＯ4・４〜６Ｈ2Ｏ１０ｍ
ｇ、ビタミンＢ1 ０．２ｍｇを水１Ｌに含み、ｐＨ７．
２に調整した培地〕の入った太型試験管に上記２菌株を
それぞれ接種し、３０℃で７２時間振とう培養した。な
お、プラスミド保有株の種培養および生産培地での培養
はスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。
【０１０９】培養終了後、遠心分離により培養物から菌
体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチ
ンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマ
トグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量し
た。結果を第７表に示す。
体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチ
ンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマ
トグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量し
た。結果を第７表に示す。
【０１１０】
【表８】
【０１１１】実施例６ エタノール添加効果 ＬＢ培地にｐＥＢ−００２を保有するＤ−０１１０株を
接種し、実施例５と同様な方法により振とう培養した。
該種培養液０．８ｍｌを、生産培地ＢＭ１を８ｍｌ含
み、フィルター滅菌したエタノールを５０〜１５０μｌ
の範囲で種々添加した太型試験管に接種し、３０℃で７
２時間振とう培養した。なお、種培養および生産培地で
の培養はスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行
った。
接種し、実施例５と同様な方法により振とう培養した。
該種培養液０．８ｍｌを、生産培地ＢＭ１を８ｍｌ含
み、フィルター滅菌したエタノールを５０〜１５０μｌ
の範囲で種々添加した太型試験管に接種し、３０℃で７
２時間振とう培養した。なお、種培養および生産培地で
の培養はスペクチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行
った。
【０１１２】培養終了後、遠心分離により培養物から菌
体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチ
ンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマ
トグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量し
た。結果を第８表に示す。
体を除去し、上清中のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチ
ンおよびｄ―デチオビオチンについて、高速液体クロマ
トグラフィーを用い、実施例１と同様の方法で定量し
た。結果を第８表に示す。
【０１１３】
【表９】 エタノールを培地に添加して培養することにより、ｄ―
デチオビオチンの生成量は増加しなかったが、ｄ−ビオ
チンの生成量は２倍以上高まった。
デチオビオチンの生成量は増加しなかったが、ｄ−ビオ
チンの生成量は２倍以上高まった。
【０１１４】実施例7 ビオチン活性物質の製造 ｐＥＢ−００２を保有するＤ−０１１０株を用いて、２
Ｌジャーファーメンターによる製造を以下のように行っ
た。ＢＹ寒天平板培地上に菌体を塗布し、３０℃、２４
時間培養後、４５mlの種培地Ｄ１〔グルコース ２g、酵
母エキス ０．５g、ポリペプトン １．５g、ＮａＣｌ
１．５g、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １g、ＣａＣＯ3 ２gを水１
Ｌに含み、ｐＨ６．５に調整した培地〕の入った３００
ml容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２４
時間振とう培養した。
Ｌジャーファーメンターによる製造を以下のように行っ
た。ＢＹ寒天平板培地上に菌体を塗布し、３０℃、２４
時間培養後、４５mlの種培地Ｄ１〔グルコース ２g、酵
母エキス ０．５g、ポリペプトン １．５g、ＮａＣｌ
１．５g、（ＮＨ4）2ＳＯ4 １g、ＣａＣＯ3 ２gを水１
Ｌに含み、ｐＨ６．５に調整した培地〕の入った３００
ml容バッフル付き三角フラスコに接種し、３０℃、２４
時間振とう培養した。
【０１１５】該種培養液１０ｍｌを、８００ｍｌの種培
地Ｅ１〔コーン・スチープ・リカー５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、（ＮＨ4）2
ＳＯ4０．５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ６．８に調整した
培地〕の入った２Ｌジャーファーメンターに接種し、３
０℃、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、８００ｒｐｍの条件下で、
培地中のｐＨを硫酸で７．５に調整しながら培養した。
地Ｅ１〔コーン・スチープ・リカー５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4
０．２ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ、（ＮＨ4）2
ＳＯ4０．５ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ６．８に調整した
培地〕の入った２Ｌジャーファーメンターに接種し、３
０℃、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、８００ｒｐｍの条件下で、
培地中のｐＨを硫酸で７．５に調整しながら培養した。
【０１１６】約１２時間後、該種培養液６０mlを４４０
mlの生産培地Ｆ１〔グルコース ４ｇ、コーン・スチー
プ・リカー ３ｇ、グルタミン酸ナトリウム ０．５ｇ、
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ６．
８に調整した培地〕の入った２Ｌジャーファーメンター
に接種し、３２℃、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、９００ｒｐｍ
の条件下で、培地中のｐＨをアンモニア水で６．７に調
整しながら培養した。
mlの生産培地Ｆ１〔グルコース ４ｇ、コーン・スチー
プ・リカー ３ｇ、グルタミン酸ナトリウム ０．５ｇ、
（ＮＨ4）2ＳＯ4 ０．５ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．２ｇ、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．１ｇを水１Ｌに含み、ｐＨ６．
８に調整した培地〕の入った２Ｌジャーファーメンター
に接種し、３２℃、通気量１Ｌ／ｍｉｎ、９００ｒｐｍ
の条件下で、培地中のｐＨをアンモニア水で６．７に調
整しながら培養した。
【０１１７】培養開始時点からフィルター滅菌したエタ
ノールを流加速度約１．０ｍｌ／ｈで連続的に添加し
た。更に、培地中のグルコースが消費された時点でグル
コース・フィード液〔グルコース５００ｇを水１Ｌに含
む培地〕を連続的に添加した。該フィード液の流加速度
は最初５．０ｍｌ／ｈで行い、溶存酸素濃度が約１ｐｐ
ｍまで低下後、溶存酸素濃度１〜２ｐｐｍの範囲に維持
されるように、流加速度を調整しながらフィード液を添
加した。
ノールを流加速度約１．０ｍｌ／ｈで連続的に添加し
た。更に、培地中のグルコースが消費された時点でグル
コース・フィード液〔グルコース５００ｇを水１Ｌに含
む培地〕を連続的に添加した。該フィード液の流加速度
は最初５．０ｍｌ／ｈで行い、溶存酸素濃度が約１ｐｐ
ｍまで低下後、溶存酸素濃度１〜２ｐｐｍの範囲に維持
されるように、流加速度を調整しながらフィード液を添
加した。
【０１１８】培養開始後、約１２０時間で培養を終了し
た。なお、種培養および生産培地での培養はすべてスペ
クチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。培養終
了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中
のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチンおよびｄ―デチオ
ビオチンについて、高速液体クロマトグラフィーを用
い、実施例１と同様の方法で定量した。
た。なお、種培養および生産培地での培養はすべてスペ
クチノマイシン５００ｍｇ／ｌ存在下で行った。培養終
了後、遠心分離により培養物から菌体を除去し、上清中
のビオチン活性物質の内ｄ−ビオチンおよびｄ―デチオ
ビオチンについて、高速液体クロマトグラフィーを用
い、実施例１と同様の方法で定量した。
【０１１９】結果を第９表に示す。
【０１２０】
【表１０】
【０１２１】
【発明の効果】 本発明によれば、ビオチン活性物質の
生産能を有するシュードモナス属に属する微生物、ある
いは該微生物由来のｄ−ビオチン生合成に関与するDNA
を導入した微生物を用いることにより、工業的に有利な
ビオチン活性物質の製造方法を提供することができる。
生産能を有するシュードモナス属に属する微生物、ある
いは該微生物由来のｄ−ビオチン生合成に関与するDNA
を導入した微生物を用いることにより、工業的に有利な
ビオチン活性物質の製造方法を提供することができる。
【０１２２】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：351 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：Pseudomonas sp. 株名：Ｄ−０１１０ 配列 Met Ser Ala Ser Thr Thr Ala Thr Leu Arg His Asp Trp Thr Leu Ala 1 5 10 15 Glu Val Lys Ala Leu Phe Val Gln Pro Phe Asn Asp Leu Leu Phe Gln 20 25 30 Ala Gln Thr Val His Arg Ala His Phe Asp Ala Asn Arg Val Gln Val 35 40 45 Ser Thr Leu Leu Ser Ile Lys Thr Gly Ala Cys Pro Glu Asp Cys Lys 50 55 60 Tyr Cys Pro Gln Ser Gly His Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Lys Glu Lys 65 70 75 80 Leu Met Glu Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Ala Ala Arg Ala Lys Ala 85 90 95 Ile Gly Ser Thr Arg Phe Cys Met Gly Ala Ala Trp Lys His Pro Ser 100 105 110 Ala Lys Asp Met Pro Tyr Val Leu Lys Met Ile Glu Gly Val Lys Ala 115 120 125 Met Gly Leu Glu Thr Cys Met Thr Leu Gly Arg Leu Asp Gln Asp Gln 130 135 140 Thr Glu Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn His Asn Leu 145 150 155 160 Asp Thr Ser Pro Glu Phe Tyr Gly Ser Ile Ile Thr Thr Arg Thr Tyr 165 170 175 Ser Glu Arg Leu Gln Thr Leu Ala Tyr Val Arg Asp Ala Gly Met Lys 180 185 190 Ile Cys Ser Gly Gly Ile Leu Gly Met Gly Glu Ser Leu Asp Asp Arg 195 200 205 Ala Asn Leu Leu Ile Gln Leu Ala Asn Leu Pro Glu His Pro Glu Ser 210 215 220 Val Pro Ile Asn Met Leu Val Lys Val Ala Gly Thr Pro Leu Glu Asn 225 230 235 240 Ala Asp Asp Val Asp Pro Phe Asp Phe Ile Arg Met Leu Ala Val Ala 245 250 255 Arg Ile Leu Met Pro Gln Ser His Val Arg Leu Ser Ala Gly Arg Glu 260 265 270 Ala Met Asn Glu Gln Met Gln Ala Leu Ala Phe Phe Ala Gly Ala Asn 275 280 285 Ser Ile Phe Tyr Gly Asp Lys Leu Leu Thr Thr Ala Asn Pro Gln Ala 290 295 300 Asp Lys Asp Met Gln Leu Phe Ala Arg Leu Gly Ile Gln Pro Glu Ala 305 310 315 320 Arg Glu Glu His Ala Asp Glu Val His Gln Ala Ala Ile Glu Gln Ala 325 330 335 Leu Val Glu Gln Lys Ser Ser Glu Gln Phe Tyr Asn Ala Ala Val 340 345 350
【０１２３】 配列番号：２ 配列の長さ：1053 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 起源 生物名：Pseudomonas sp. 株名：Ｄ−０１１０ 配列 ATG AGC GCC AGC ACC ACT GCC ACC CTG CGT CAC GAC TGG ACT TTG GCC 48 Met Ser Ala Ser Thr Thr Ala Thr Leu Arg His Asp Trp Thr Leu Ala 1 5 10 15 GAA GTC AAA GCA CTC TTC GTT CAG CCA TTC AAC GAC TTG CTG TTC CAG 96 Glu Val Lys Ala Leu Phe Val Gln Pro Phe Asn Asp Leu Leu Phe Gln 20 25 30 GCG CAG ACG GTG CAC CGC GCA CAT TTC GAC GCC AAC CGC GTC CAG GTT 144 Ala Gln Thr Val His Arg Ala His Phe Asp Ala Asn Arg Val Gln Val 35 40 45 TCC ACC CTG CTG TCG ATC AAG ACC GGC GCC TGC CCG GAA GAT TGC AAA 192 Ser Thr Leu Leu Ser Ile Lys Thr Gly Ala Cys Pro Glu Asp Cys Lys 50 55 60 TAT TGT CCG CAG TCC GGT CAC TAC AAC ACC GGG CTG GAA AAA GAA AAG 240 Tyr Cys Pro Gln Ser Gly His Tyr Asn Thr Gly Leu Glu Lys Glu Lys 65 70 75 80 CTG ATG GAA GTG CAG AAA GTC CTC GAA GAG GCT GCC CGC GCC AAG GCC 288 Leu Met Glu Val Gln Lys Val Leu Glu Glu Ala Ala Arg Ala Lys Ala 85 90 95 ATC GGT TCG ACC CGT TTC TGC ATG GGC GCG GCG TGG AAA CAC CCG TCG 336 Ile Gly Ser Thr Arg Phe Cys Met Gly Ala Ala Trp Lys His Pro Ser 100 105 110 GCC AAG GAC ATG CCT TAC GTG TTG AAA ATG ATT GAA GGC GTG AAG GCC 384 Ala Lys Asp Met Pro Tyr Val Leu Lys Met Ile Glu Gly Val Lys Ala 115 120 125 ATG GGC CTG GAA ACC TGC ATG ACC CTC GGT CGT CTC GAT CAG GAT CAG 432 Met Gly Leu Glu Thr Cys Met Thr Leu Gly Arg Leu Asp Gln Asp Gln 130 135 140 ACC GAA GCA CTG GCC AAG GCC GGG CTC GAC TAC TAC AAC CAC AAC CTC 480 Thr Glu Ala Leu Ala Lys Ala Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn His Asn Leu 145 150 155 160 GAC ACC TCG CCT GAG TTC TAC GGC AGC ATC ATC ACC ACC CGT ACC TAC 528 Asp Thr Ser Pro Glu Phe Tyr Gly Ser Ile Ile Thr Thr Arg Thr Tyr 165 170 175 AGC GAG CGT CTG CAA ACC CTG GCC TAT GTG CGC GAT GCG GGT ATG AAA 576 Ser Glu Arg Leu Gln Thr Leu Ala Tyr Val Arg Asp Ala Gly Met Lys 180 185 190 ATC TGC TCC GGC GGC ATC CTC GGC ATG GGC GAG TCT CTC GAT GAC CGC 624 Ile Cys Ser Gly Gly Ile Leu Gly Met Gly Glu Ser Leu Asp Asp Arg 195 200 205 GCG AAC CTG CTG ATC CAG CTG GCC AAC CTG CCG GAG CAC CCG GAG TCG 672 Ala Asn Leu Leu Ile Gln Leu Ala Asn Leu Pro Glu His Pro Glu Ser 210 215 220 GTG CCG ATC AAC ATG CTG GTG AAA GTT GCC GGC ACG CCG CTG GAG AAC 720 Val Pro Ile Asn Met Leu Val Lys Val Ala Gly Thr Pro Leu Glu Asn 225 230 235 240 GCC GAC GAC GTC GAT CCG TTC GAC TTC ATC CGC ATG CTC GCC GTG GCG 768 Ala Asp Asp Val Asp Pro Phe Asp Phe Ile Arg Met Leu Ala Val Ala 245 250 255 CGC ATC CTG ATG CCG CAA TCC CAC GTG CGC CTG TCC GCC GGC CGC GAA 816 Arg Ile Leu Met Pro Gln Ser His Val Arg Leu Ser Ala Gly Arg Glu 260 265 270 GCG ATG AAC GAG CAG ATG CAG GCC CTG GCG TTC TTC GCC GGC GCC AAC 864 Ala Met Asn Glu Gln Met Gln Ala Leu Ala Phe Phe Ala Gly Ala Asn 275 280 285 TCG ATC TTC TAC GGC GAC AAA CTG CTC ACC ACC GCC AAT CCG CAG GCC 912 Ser Ile Phe Tyr Gly Asp Lys Leu Leu Thr Thr Ala Asn Pro Gln Ala 290 295 300 GAC AAG GAC ATG CAA CTG TTC GCA CGT CTG GGC ATT CAG CCG GAA GCC 960 Asp Lys Asp Met Gln Leu Phe Ala Arg Leu Gly Ile Gln Pro Glu Ala 305 310 315 320 CGC GAA GAA CAT GCC GAC GAA GTG CAT CAG GCT GCC ATC GAA CAG GCG 1008 Arg Glu Glu His Ala Asp Glu Val His Gln Ala Ala Ile Glu Gln Ala 325 330 335 CTG GTG GAG CAG AAG AGC AGC GAG CAG TTC TAC AAC GCG GCG GTC 1053 Leu Val Glu Gln Lys Ser Ser Glu Gln Phe Tyr Asn Ala Ala Val 340 345 350
【図１】図１は、Ｄ−０１１０株よりクローン化した、
ｂｉｏＡを含むビオチンの生合成に関与する遺伝子を含
有する約７．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地
図を示す。ｂｉｏＡは内部にＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩ
Ｉ切断部位を有する約２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ｐ
ｓｔＩ部位に存在する。
ｂｉｏＡを含むビオチンの生合成に関与する遺伝子を含
有する約７．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片の制限酵素地
図を示す。ｂｉｏＡは内部にＮｃｏＩおよびＨｉｎｃＩ
Ｉ切断部位を有する約２．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ｐ
ｓｔＩ部位に存在する。
【図２】図２は、Ｄ−０１１０株よりクローン化した、
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦを含むビオチンの生合成
に関与する遺伝子を含有する、約１２ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片の制限酵素地図を示す。ｂｉｏＢは約３．９ｋｂの
ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位に存在する。
ｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、ｂｉｏＦを含むビオチンの生合成
に関与する遺伝子を含有する、約１２ｋｂのＥｃｏＲＩ
断片の制限酵素地図を示す。ｂｉｏＢは約３．９ｋｂの
ＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ部位に存在する。
【図３】図３は、ｐＥＢ−００１およびｐＥＢ−００２
の作製工程を示す。図中、黒塗りの太線で示した部分
が、Ｄ−０１１０株からクローン化したｂｉｏＡを含む
ＤＮＡ断片を示す。灰色の太線で示した部分は、Ｄ−０
１１０株からクローン化したｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、ｂｉ
ｏＦを含むＤＮＡ断片を示す。Ｋｍはカナマイシン耐性
遺伝子を、Ｓｍ／Ｓｐｃはストレプトマイシンおよびス
ペクチノマイシン耐性遺伝子を示す。
の作製工程を示す。図中、黒塗りの太線で示した部分
が、Ｄ−０１１０株からクローン化したｂｉｏＡを含む
ＤＮＡ断片を示す。灰色の太線で示した部分は、Ｄ−０
１１０株からクローン化したｂｉｏＢ、ｂｉｏＤ、ｂｉ
ｏＦを含むＤＮＡ断片を示す。Ｋｍはカナマイシン耐性
遺伝子を、Ｓｍ／Ｓｐｃはストレプトマイシンおよびス
ペクチノマイシン耐性遺伝子を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｎ 9/00 Ｃ１２Ｒ 1:39） (72)発明者 池田 正人 山口県防府市新田517−６
Claims (22)
- 【請求項１】 シュードモナス属に属する微生物由来
の、ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白
質。 - 【請求項２】 ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性を
有する蛋白質が、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡへの
生合成に関与する活性を有する蛋白質、ピメリル−Ｃｏ
Ａから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸への生合成に
関与する活性を有する蛋白質、７−ケト−８−アミノペ
ラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸への生合
成に関与する活性を有する蛋白質、７，８−ジアミノペ
ラルゴン酸からデチオビオチンへの生合成に関与する活
性を有する蛋白質およびデチオビオチンからビオチンへ
の生合成に関与する活性を有する蛋白質から選ばれる蛋
白質である、請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項３】 蛋白質が、ピメリル−ＣｏＡシンセター
ゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンセターゼ、
７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェラー
ゼ、デチオビオチンシンセターゼおよびビオチンシンセ
ターゼから選ばれる蛋白質である、請求項１または２記
載の蛋白質。 - 【請求項４】 微生物が、シュードモナス エスピー
Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）またはＤ
−０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成
に関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物
である、請求項１記載の蛋白質。 - 【請求項５】 以下の(a)または(b)の蛋白質。 (a) 配列番号１記載のアミノ酸配列からなる蛋白質 (b) (a)の蛋白質の有するアミノ酸配列において１若し
くは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたア
ミノ酸配列からなり、かつｄ−ビオチンの生合成に関与
する活性を有する蛋白質 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の蛋白質
をコードするＤＮＡ。 - 【請求項７】 以下の(a)または(b)のＤＮＡ。 (a) 図１または２の制限酵素切断地図で示される、ｄ
−ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質をコ
ードするＤＮＡ (b) (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ - 【請求項８】 以下の(a)または(b)のＤＮＡ。 (a) 配列番号２記載の塩基配列を有するＤＮＡ (b) (a)のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブ
リダイズし、かつｄ−ビオチンの生合成に関与する活性
を有する蛋白質をコードするＤＮＡ - 【請求項９】 ＤＮＡがシュードモナス エスピー由来
のＤＮＡである、請求項６、7、または８記載のＤＮ
Ａ。 - 【請求項１０】 請求項６〜９のいずれかに記載のＤＮ
Ａから選ばれるＤＮＡをベクターに組み込んで得られる
組換え体ＤＮＡ。 - 【請求項１１】 請求項１０記載の組換え体ＤＮＡを宿
主細胞に導入して得られる形質転換体。 - 【請求項１２】 形質転換体がエシェリヒア属に属する
微生物またはシュードモナス属に属する微生物である、
請求項１１記載の形質転換体。 - 【請求項１３】 形質転換体が、宿主微生物としてエシ
ェリヒア・コリまたはシュードモナス エスピー Ｄ−
０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）を用いて得ら
れた形質転換体である、請求項１１記載の形質転換体。 - 【請求項１４】 請求項１１、１２または１３記載の形
質転換体を培地に培養し、培養物中にｄ−ビオチンの生
合成に関与する活性を有する蛋白質を生成蓄積させ、該
培養物から該蛋白質を採取することを特徴とする、ｄ−
ビオチンの生合成に関与する活性を有する蛋白質の製造
方法。 - 【請求項１５】 ｄ−ビオチンの生合成に関与する活性
を有する蛋白質が、ピメリン酸からピメリル−ＣｏＡへ
の生合成に関与する活性を有する蛋白質、ピメリル−Ｃ
ｏＡから７−ケト−８−アミノペラルゴン酸への生合成
に関与する活性を有する蛋白質、７−ケト−８−アミノ
ペラルゴン酸から７，８−ジアミノペラルゴン酸への生
合成に関与する活性を有する蛋白質、７，８−ジアミノ
ペラルゴン酸からデチオビオチンへの生合成に関与する
活性を有する蛋白質およびデチオビオチンからビオチン
への生合成に関与する活性を有する蛋白質から選ばれる
蛋白質である、請求項１４記載の製造方法。 - 【請求項１６】 蛋白質が、ピメリル−ＣｏＡシンセタ
ーゼ、７−ケト−８−アミノペラルゴン酸シンセター
ゼ、７，８−ジアミノペラルゴン酸アミノトランスフェ
ラーゼ、デチオビオチンシンセターゼおよびビオチンシ
ンセターゼから選ばれる蛋白質である、請求項１４また
は１５記載の製造方法。 - 【請求項１７】 請求項１１、１２または１３記載の形
質転換体を培地に培養し、培養物中にビオチン活性物質
を生成蓄積させ、該培養物からビオチン活性物質を採取
することを特徴とする、ビオチン活性物質の製造方法。 - 【請求項１８】 シュードモナス属に属し、ビオチン活
性物質の生産能を有する微生物を培地に培養し、培養物
中にビオチン活性物質を生成蓄積させ、該培養物からビ
オチン活性物質を採取することを特徴とする、ビオチン
活性物質の製造方法。 - 【請求項１９】 ビオチン活性物質が、ｄ−ビオチン、
ｄ−デチオビオチン、７，８−ジアミノペラルゴン酸お
よび７−ケト−８−アミノペラルゴン酸から選ばれる物
質である、請求項１７または１８記載の製造方法。 - 【請求項２０】 微生物がシュードモナス エスピー
Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）またはＤ
−０１１０株から誘導され、かつｄ−ビオチンの生合成
に関与する活性を有する蛋白質の生産能を有する微生物
であることを特徴とする、請求項１７記載の製造方法。 - 【請求項２１】 培養時、培地中にエタノールを０．２
〜２０容量％の範囲で添加することを特徴とする、請求
項１７〜２０のいずれかに記載のシュードモナス エス
ピー Ｄ−０１１０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６２８８）。 - 【請求項２２】 シュードモナス エスピー Ｄ−０１
１０株（ＦＥＲＭＢＰ−６２８８）。
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| CN114480525A (zh) * | 2022-01-06 | 2022-05-13 | 浙江圣达生物药业股份有限公司 | 一种提高d-生物素产量的生产方法 |
-
1998
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