CN116601300A - 阿魏酸生物转化为香草醛 - Google Patents

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Abstract

遵循化学诱变方法和筛选方案以选择具有以高产率而无任何滞后时间段产生天然香草醛的能力的拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)的突变型菌株。所产生的突变型菌株不含任何外源性基因元件，并且出于监管目的可以被认定为非基因修饰的生物体(非GMO)。

Description

阿魏酸生物转化为香草醛
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年12月18日提交的美国临时专利申请第63/127,449号的权益，所述美国临时专利申请通过全文引用的方式导入本文。
序列表
本申请包含已经以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式特此并入的序列表。创建于2021年12月17日的所述ASCII副本命名为074008_2038_WO_000324_SL.txt并且大小为11,734字节。
技术领域
本公开总体上涉及使用阿魏酸作为原料发酵产生天然香草醛的微生物和生物转化方法。可用于本发明的微生物可以在不将任何外源性核酸序列引入微生物细胞的情况下进行基因工程化。因此，可用于将阿魏酸生物转化为香草醛的本发明的微生物是非基因修饰的生物体(非GMO)。
背景技术
香草香精是世界上最常用的香精之一。其被用于许多食品的调味品，如冰淇淋、乳制产品、甜点、糖果、烘焙产品和烈酒。其也被用于香水、药品和个人卫生产品。
传统上，天然香草香精是从香草兰(Vanilla planifolia)的发酵荚中获得的。其主要是在收获后，在豆类的干燥和发酵过程的若干星期内，通过存在于豆类中的香草醛葡萄糖苷的水解而形成的。香草香精的基本芳香物质是香草醛(4-羟基-3-甲氧基苯甲醛)。
每年消耗约12,000吨香草醛，其中只有20吨至50吨是从香草豆中提取的，其余是合成产生的，主要来自石化衍生的愈创木酚。近年来，对于使用可再生原料(如衍生自米糠中的阿魏酸、来自云杉木质素的松柏醇、来自丁香油的玉米糖和丁香酚)通过生物发酵产生香草醛的兴趣日益增加。使用生物发酵衍生自可再生原料的香草醛被监管和立法机构认定为“天然香草醛”，并且可以作为“天然产品”销售。
放线菌拟无枝酸菌(Amycolatopsis sp.)菌株ATCC 39116已用于将阿魏酸生物转化为香草醛。已知这种微生物通过四种主要途径代谢阿魏酸，所述四种途径与初始反应不同，即非氧化性脱羧、侧链还原、辅酶A非依赖性脱乙酰和辅酶A依赖性脱乙酰。放线菌拟无枝酸菌菌株ATCC 39116内阿魏酸代谢的辅酶A依赖性脱乙酰途径包含两个步骤。在第一步中，对阿魏酸进行非氧化脱乙酰以产生香草醛(图1)。此步骤由两种酶介导，即由fcs基因编码的阿魏酰-辅酶A(CoA)合成酶和由ech基因编码的烯酰-CoA水合酶/醛缩酶。两个基因(ech和fcs)都在单个操纵子内，当放线菌拟无枝酸菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长时，这两个基因的表达受到抑制。只有在添加阿魏酸之后，这些基因的转录才被诱导。结果，当将阿魏酸添加到培养基中时，在可以检测到香草醛合成之前存在约5小时或更长的滞后时间段。通常，滞后时间段为至少4小时，并且至多8小时。一旦香草醛积累，阿魏酸代谢的第二阶段就开始了。在第二步中，香草醛经过β氧化产生香草酸。香草醛转化为香草酸是由vdh基因编码的香草醛脱氢酶介导的。为了增加香草醛产生，需要进行生物工程化，使得阿魏酸向香草醛生物转化在没有任何滞后时间段的情况下开始，并且香草醛向香草酸的转化被阻断或显著降低。
发明内容
本发明提供了一种新方法，用于基因工程化放线菌拟无枝酸菌以增加由阿魏酸产生的香草醛。根据本发明基因工程化的放线菌拟无枝酸菌不携带任何外源性核酸序列，并且可以被认定为非基因修饰的生物体(非GMO)。
本发明提供了一种使用阿魏酸作为原料产生香草醛的生物转化方法。本发明的微生物最初在含葡萄糖的生长培养基中生长，并且通过向所述培养基中添加阿魏酸来启动香草醛的发酵产生。在本发明的一个优选实施例中，所述微生物可以是放线菌目(orderActinomycetales)和拟无枝酸菌属(genus Amycolatopsis)。例如，微生物可以是可在编号ATCC 39116下获得的拟无枝酸菌菌株。与野生型对应物不同，本发明的突变型菌株可以在没有任何滞后时间段的情况下从阿魏酸开始发酵产生香草醛。本菌株可以使用化学诱变获得，并且赋予使用阿魏酸产生香草醛而没有任何滞后时间段的表型的遗传突变的性质可以通过使用全基因组测序来鉴定。
在拟无枝酸菌中，阿魏酸生物转化为香草醛是通过两种酶进行的；即由ech基因编码的烯酰-coA水合酶/醛缩酶和由fcs基因编码的阿魏酰-辅酶A(CoA)合成酶。拟无枝酸菌中的ech和fcs基因位于单个操纵子(ech-fcs操纵子)内，并且由单个启动子控制。当拟无枝酸菌在含葡萄糖的培养基中生长时，ech-fcs操纵子的转录受到抑制。当添加阿魏酸时，尽管需要若干小时才能检测到阿魏酸生物转化为香草醛，但对ech-fcs操纵子的抑制会减轻。
在本发明的一方面，对拟无枝酸菌ATCC 39116的孢子进行化学诱变(例如，使用甲磺酸甲酯)，并且可以筛选得到的菌落以选择其中ech-fcs操纵子已经克服抑制的突变型菌株。使用全基因组测序，本发明人出乎意料地发现，具有期望的香草醛产生表型而没有滞后时间段的突变型菌株在内源性基因中包括一个或多个突变，所述内源性基因包括SEQ IDNO:4(本发明人将其命名为echR基因，因为其编码ech-fcs操纵子的阻遏蛋白)的核苷酸序列。此EchR蛋白包括SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且被发现含有MarR型转录阻遏蛋白结构域。根据本发明，根据本发明的突变型菌株可以包含echR基因中的一个或多个突变，所述突变选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变以及其组合，其中此类突变能够引起EchR蛋白的功能失活，从而导致ech-fcs操纵子的去抑制。
另一方面，本发明涉及在使用阿魏酸作为原料的香草醛产生中，echR基因中的一个或多个突变导致EchR蛋白功能失活的作用。在一个实施例中，本发明涉及具有功能失活的echR基因的拟无枝酸菌突变型菌株，其能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。在本发明的另一个实施例中，具有功能失活的echR基因的拟无枝酸菌突变型菌株在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内可以产生至少0.75g香草醛/升培养基。在本发明的又另一个实施例中，具有功能失活的echR基因的拟无枝酸菌突变型菌株在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的3小时内可以产生至少0.5g香草醛/升培养基。
在本发明的一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，在包括SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性echR基因上具有一个或多个突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少100％的香草醛。在本发明的另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，在具有如SEQ IDNO:4的核酸序列的内源性echR基因中具有突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少200％的香草醛。在本发明的又另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，在具有如SEQ IDNO:4的核酸序列的内源性echR基因上具有突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少300％的香草醛。在本发明的另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，在具有如SEQ IDNO:4的核酸序列的内源性echR基因上具有突变的拟无枝酸菌突变型菌株产生多出至少400％的香草醛。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于防止在具有内源性echR基因中的突变的拟无枝酸菌菌株内使用阿魏酸产生的香草醛的分解代谢的方法。一旦香草醛在拟无枝酸菌细胞内产生，其就会通过由vdh基因编码的香草醛脱氢酶(Vdh)转化为香草酸。在本发明的一方面，对vdh基因进行一种或多种无标志物的基因修饰；例如，通过使用CRISPR技术或本领域技术人员已知的任何其它合适的重组DNA技术，使得香草醛脱氢酶基因在拟无枝酸菌细胞内不再具有功能。香草醛脱氢酶的功能失活可以通过突变vdh基因来实现。根据本发明，vdh基因中能够引起香草醛脱氢酶功能失活的任一个突变(选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变和点突变)将阻止香草醛转化为香草酸。
一方面，本公开涉及一种使用在echR基因中具有突变的分离的基因工程化拟无枝酸菌菌株产生香草醛的方法。进一步地，本拟无枝酸菌菌株的特征在于不具有外源性核酸分子，并且因此可以被认定为非基因修饰的生物体(非GMO)。在一些实施例中，由阿魏酸产生香草醛的本生物转化方法可以包含(i)在培养基中培养分离的非GMO宿主细胞；(ii)向培养基中添加阿魏酸以开始将阿魏酸生物向香草醛的生物转化；以及(iii)从培养基中提取香草醛。
本文所描述的生物转化方法可以包含从混合物中回收香草醛。香草醛的回收可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行。在回收香草醛之前，所述方法还可以包含从发酵混合物中去除生物质(酶、细胞材料等)。
使用本文所描述的方法和/或分离的重组宿主细胞产生的香草醛可以被收集、纯化，并且掺入许多可消费产品中。例如，香草醛可以与可消费产品混合。在一些实施例中，香草醛可以以足以赋予、改变、促进或增强期望的味道、风味或感觉的量掺入可消费产品中，或以隐藏、改变或最小化可消费产品的不期望的味道、风味或者感觉的量掺入可消费产品中。例如，可消费产品可以选自由以下组成的组：食品、食品成分、食品添加剂、饮料、药品和烟草。例如，可消费产品可以选自由以下组成的组：香水、化妆品、洗漱用品、家庭和身体护理、洗涤剂、驱蚊剂、肥料、空气清新剂和肥皂。
第一实施例是非GMO拟无枝酸菌突变型菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基，在此实施例中，所述菌株是非天然存在的，在一些实施例中，所述菌株是非天然存在的菌株。
第二实施例是第一实施例的菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基，在此实施例中，所述菌株是非天然存在的。
第三实施例是第一实施例的菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基，在此实施例中，所述菌株是非天然存在的。
第四实施例是第一至第三实施例的菌株，其中所述突变型菌株包括具有SEQ IDNO:4的核酸序列的内源性基因中的突变，其中所述突变减少或消除ech-fcs操纵子的抑制。
第五实施例是第一至第四实施例的菌株，其中所述菌株编码在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中具有突变的内源性蛋白。
第六实施例是第一至第五实施例的突变型菌株，其进一步包含具有SEQ ID NO:6的核酸序列的vdh基因中的突变。
第七实施例是第四实施例的突变型菌株，其中所述突变是缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变。
第八实施例是第七实施例的突变型菌株，其中所述突变是缺失。
第九实施例是第七实施例的突变型菌株，其中所述突变是移码突变。
第十实施例是第七实施例的突变型菌株，其中所述突变是启动子突变。
第十一实施例是第一至第十实施例的菌株，其中所述菌株是可在编号ATCC 39116下获得的菌株拟无枝酸菌的突变体。
第十二实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少100％的香草醛。
第十三实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少200％的香草醛。
第十四实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少300％的香草醛。
第十五实施例是第一至第十一实施例的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少400％的香草醛。
第十六实施例是第一至第十五实施例的突变型菌株，其中通过使用基于无标志物CRISPR的重组DNA技术获得所述突变型菌株，而不通过引入任何外源性遗传物质对所述突变型菌株进行永久修饰。
第十七实施例是第一至第十五实施例的突变型菌株，其中所述突变型菌株是通过使菌株与突变原甲磺酸甲酯接触获得的。
第十八实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。第十九实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的5小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。
第二十实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。
第二十一实施例是拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌的非天然存在的菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。
第二十二实施例是第十八至第二十一实施例的菌株，其包括：具有SEQ ID NO:4的核酸序列的基因中的突变，其中所述突变减少或消除ech-fcs操纵子的抑制。
第二十三实施例是第十八至第二十一实施例的菌株，其中所述菌株中的基因编码在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中具有突变的蛋白质。
第二十四实施例是第十八至第二十三实施例的菌株，其包含具有SEQ IS NO:6的核酸序列的vdh基因中的突变。
第二十五实施例是第十八至第二十四实施例的菌株，其中所述突变是缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变。
第二十六实施例是第二十五实施例的菌株，其中所述突变是缺失。
第二十七实施例是第二十五实施例的菌株，其中所述突变是移码突变。
第二十八实施例是第二十五实施例的菌株，其中所述突变是启动子突变。
第二十九实施例是第十八至第二十八实施例的菌株，其中所述菌株源自可在编号ATCC 39116下获得的拟无枝酸菌。
第三十实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少100％的香草醛。
第三十一实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少200％的香草醛。
第三十二实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少300％的香草醛。
第三十三实施例是第十八至第二十九实施例的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少400％的香草醛。
第三十四实施例是产生香草醛的方法，其包括在包括底物的适当培养基中培养第一至第三十三实施例中任一项所述的菌株，并且回收产生的香草醛。
第三十五实施例是一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：在含有碳源的培养基中培养第一至第十七实施例中任一项所述的拟无枝酸菌突变型菌株；以及将阿魏酸进料给所述突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间段。
第三十六实施例是一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：在含有碳源的培养基中培养第十八至第三十三实施例中任一项所述的拟无枝酸菌菌株；以及将阿魏酸进料给所述菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间段。
本发明的其它特征和优点将在以下参考附图的详细描述中变得显而易见。
附图说明
为了更好地理解本公开，可以参考附图。
图1.阿魏酸转化为香草醛的代谢途径。
图2.通过六种拟无枝酸菌突变型菌株和野生型拟无枝酸菌(WT)从阿魏酸早期产生香草醛。虽然用野生型拟无枝酸菌产生香草醛中存在滞后时间段，但根据本发明的六种突变型菌株的香草醛产生没有显示出香草醛产生的滞后时间段。
图3.通过野生型拟无枝酸菌(上)和清除报告质粒的示例性拟无枝酸菌突变型菌株(下)将阿魏酸生物转化为香草醛。
序列简要说明
表1简要描述了本文和所附序列表中所公开的序列。如本领域技术人员所知，注意到原核生物使用交替的起始密码子，主要是GUG和UUG，其被翻译为甲酰基-甲硫氨酸。
具体实施方式
如本文所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个/种(a/an)”、和“所述”包含复数个指示物。
就描述或权利要求中使用的术语“包含”、“具有”等而言，该术语旨在以类似于术语“包括”的方式具有包容性，因为“包括”是在权利要求中用作过渡词时被解释。
单词“示例性”在本文中用于意指“用作示例、实例或说明”。在此描述为“示例性”的任何实施例不必被解释为比其它实施例更优选或有利。
“细胞系统”是提供异位蛋白质的表达的任何细胞。细胞系统包含细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。细胞系统包含原核细胞和真核细胞两者。细胞系统还包含基于如核糖体等细胞组分的蛋白质的体外表达。
“编码序列”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指编码特定氨基酸序列的DNA序列。
“生长”或“培养”细胞系统包含提供将会允许细胞繁殖和分裂的适合的培养基。生长还包含提供资源使得细胞或细胞组分可以转译和制备重组蛋白。
术语“互补”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且用于但不限于描述能够相互杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，就DNA而言，腺苷与胸腺嘧啶互补，并且胞嘧啶与鸟嘌呤互补。因此，本发明的技术还包含分离的核酸片段，其与如所附序列表中所报告的完整序列互补，以及那些基本相似的核酸序列。
术语“核酸”和“核苷酸”应赋予本领域普通技术人员其相应的普通和习惯含义，并且用于但不限于指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸以及其聚合物。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还明确涵盖其保守修饰的或简并变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。
术语“分离的”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且当在分离的核酸或分离的多肽的上下文中使用时，其用于但不限于指通过人工存在于其天然环境之外的核酸或多肽，并且因此不是自然产物。分离的核酸或多肽可以以纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境中，例如转基因宿主细胞中。
如本文所使用的，术语“温育”(“incubating”和“incubation”)是指将两种或更多种化学或生物实体(如化合物和酶)混合，并且允许其在有利于产生香草醛的条件下相互作用的过程。
术语“简并变体”是指具有残基序列的核酸序列，所述残基序列与参考核酸序列的不同之处在于一个或多个简并密码子取代。简并密码子取代可以通过产生一个或多个所选(或全部)密码子的第三位用混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列实现。核酸序列及其所有简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。
术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”应赋予本领域普通技术人员其相应的普通和习惯含义；三个术语有时可互换使用，并且不受限制地用于指氨基酸的聚合物或氨基酸类似物，不管其大小或功能如何。尽管“蛋白质”通常用于指相对较大的多肽，而“肽”通常用于指较小的多肽，但这些术语在本领域中的使用是重叠和变化的。除非另有说明，否则如本文所使用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在当提及多核苷酸产物时，在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包含多核苷酸产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段以及前述的其它等同物、变体和类似物。
当用于指多肽时，术语“多肽片段”和“片段”对本领域普通技术人员而言具有其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指与参考多肽本身相比氨基酸残基缺失的多肽，但是其中剩余的氨基酸序列通常与参考多肽中的对应位置相同。此类缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端处，或可替代地发生在以上二者处。
多肽或蛋白质的术语“功能片段”是指作为全长多肽或蛋白质一部分的肽片段，并且具有与所述全长多肽或蛋白基本相同的生物活性，或者执行与所述全长多肽或者蛋白质基本相同的功能(例如，执行相同的酶促反应)。
可互换使用的术语“变体多肽”、“经修饰的氨基酸序列”或“经修饰的多肽”是指与参考多肽有一个或多个氨基酸不同的氨基酸序列，例如一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加。一方面，变体是保留参考多肽的一些或全部能力的“功能变体”。
术语“功能变体”进一步包含保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指具有与参考肽的一个或多个保守氨基酸取代不同的氨基酸序列，并且维持参考肽的一些或全部活性的肽。“保守氨基酸取代”是指用功能相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包含用一个非极性(疏水性)残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个；用一个带电荷或极性(亲水性)残基取代另一个，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、苏氨酸与丝氨酸之间；一种碱性残基，如赖氨酸或精氨酸被另一种取代；或用一个酸性残基，如天冬氨酸或谷氨酸取代另一个；或用一个芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸取代另一个。预期此类取代对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点几乎没有影响。短语“保守取代的变体”还包含其中残基被化学衍生的残基置换的肽，前提是所得肽维持如本文所描述的参考肽的一些或全部活性。
与本主题技术的多肽相关的术语“变体”进一步包含具有氨基酸序列的功能活性多肽，所述氨基酸序列与参考多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以及甚至100％相同。
术语“同源”在其所有语法形式和拼写变体中都指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽之间的关系，包含来自超家族的多核苷酸或多肽以及来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质(Reeck等人,《细胞(Cell)》50:667,1987)。此类多核苷酸或多肽具有序列同源性，如其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面，还是在保守位置处存在特定氨基酸或基序方面。例如，两种同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％，至少97％、至少98％、至少99％以及甚至100％相同的氨基酸序列。
“合适的调控序列”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指位于编码序列上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)的核苷酸序列，并且其影响转录、RNA加工或稳定性，或相关联的编码序列的翻译。调控序列可以包含启动子、翻译前导序列、内含子和多聚腺苷酸化识别序列。
“启动子”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'处。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于在自然界中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成DNA区段。本领域技术人员应理解，不同的启动子可以指导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件的表达。启动子导致基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达，通常被称为“组成型启动子”进一步认识到，由于在大多数情况下条款序列的确切边界尚未完全限定，因此不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上的核酸序列的缔合，以使得一者的功能受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制之下)，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。编码序列可以按照有义或反义定向与调控序列可操作地连接。
如本文所使用的，术语“表达”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且其用于但不限于指源自本主题技术的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”是指转基因或重组生物体中的基因产物的产生超过正常或未经转换的生物体中的产生水平。
“转化”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且用于但不限于指将多核苷酸转移到靶细胞中。转移的多核苷酸可以结合到靶细胞的基因组或染色体DNA中，从而产生基因稳定的遗传，或者其可以独立于宿主染色体进行复制。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”或“转化的”或“重组”。
当在本文中与宿主细胞结合使用时，术语“转化的”、“转基因”和“重组”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯的含义，并且被用于但不限于指已被引入异源核酸分子的宿主生物体的细胞，如植物或微生物细胞。核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或核酸分子可以作为染色体外分子存在。此类染色体外分子可以是自动复制的。转化的细胞、组织或受试者被理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，而且涵盖其转基因子代。
当在本文中与多核苷酸一起使用时，术语“重组”、“异源”和“外源性”应赋予对于本领域普通技术人员而言其普通和习惯含义，并且用于但不限于指源自特定宿主细胞外来来源的多核苷酸(例如，DNA序列或基因)，如果来自同一来源，则从其原始形式修饰。因此，宿主细胞中的异源基因包含特定宿主细胞内源性但已通过使用例如定点诱变或其它重组技术进行修饰的基因。所述术语还包含天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，所述术语是指与细胞外源性或异源，或与细胞同源但在宿主细胞内通常未发现元件的位置或形式的DNA区段。
如本发明中所定义的，包括源自另一种生物体的外源性核酸的生物体被认为是非基因修饰的生物体(GMO)。如果生物体在没有引入外源性核酸分子的情况下进行了基因修饰，其将被视为非基因修饰的生物体(非GMO)。非GMO可以在其内源性核酸中具有一个或多个基因修饰，如基因的编码序列中的点突变或基因的整个编码区的缺失，而不具有任何外源性核酸序列。
类似地，当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，术语“重组”、“异源”和“外源性”是指源自特定宿主细胞外源性的来源，或者如果来自相同来源，则从其原始形式修饰的多肽或氨基酸序列。因此，重组DNA区段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。
“蛋白质表达”是指基因表达后出现的蛋白质产生。蛋白质产生由将DNA转录为信使RNA(mRNA)后的阶段组成。然后将mRNA转译成多肽链，该多肽链最终折叠成蛋白质。DNA通过转染—将核酸有意地引入到细胞中的过程—而存在于细胞中。此术语常用于真核细胞中的非病毒方法。此术语还可以指其它方法和细胞类型，但优选其它术语：“转化”更常用于描述细菌、包含植物细胞在内的非动物真核细胞中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化还用于指在这些细胞中发展成癌性状态(致癌作用)。转导通常用于描述了病毒介导的DNA转移。转化、转导和病毒性感染包含在本申请的转染定义下。
术语“质粒”、“载体”和“盒”将被赋予对于本领域普通技术人员而言其相应的普通和习惯含义，并且被用于但不限于指通常携带不属于细胞的中央代谢的基因的额外染色体元件，并且通常呈环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性或环状，其中许多核苷酸序列已经接合或重组为独特的结构，所述结构能够将所选基因产物的启动子片段和DNA序列以及适当的3'未翻译序列引入细胞中。“转化盒”是指含有外来基因，并且除外来基因外还具有促进特定宿主细胞转化的元件的特异性载体。“表达盒”是指含有外来基因，并且除外来基因外还具有允许该基因在外来宿主中增强表达的元件的特异性载体。
如本文所使用的，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分，例如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的完全相同的组分的数量除以参考序列区段，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分中的组分总数。
如本文所使用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在两个序列进行最佳比对(在比较窗口上，适合的核苷酸插入、缺失或间隙总计小于参考序列的20％)时参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)与测试(“受试者”)多核苷酸分子(或其互补链)相比线性多核苷酸序列中完全相同的核苷酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员公知的，并且可以通过工具如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法来执行，并且优选地通过这些算法的计算机化实施方式如作为Wisconsin/>(马萨诸塞州柏林顿的Accelrys公司(Accelrys Inc.,Burlington,MA))的一部分可得到的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA来执行。测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是两个比对序列共享的完全相同的组分的数量除以参考序列区段即整个参考序列或参考序列的较小定义部分中的组分总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其部分的比较或者与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，还可以使用用于翻译核苷酸序列的BLASTX 2.0版和用于多核苷酸序列的BLASTN 2.0版来确定“同一性百分比”。
序列同一性百分比优选使用序列分析软件包(Sequence Analysis SoftwarePackageTM)(第10版；威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机集团公司(Genetics ComputerGroup,Inc.,Madison,WI))的“最佳拟合(Best Fit)”或“间隙(Gap)”程序来确定。“间隙”利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志(Journal ofMolecular Biology)》48:443-453,1970)来找到两个序列的、最大化匹配数并最小化间隙数的比对。“最佳拟合”使用Smith和Waterman的局部同源性算法来进行在两个序列之间具有相似性的最佳区段的最佳比对，并插入间隙以最大化匹配数(Smith和Waterman,《应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)》2:482-489,1981:Smith等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》11:2205-2220,1983)。最优选使用“最佳拟合”程序来确定百分比同一性。
用于确定序列同一性的有用方法还公开在局部比对搜索基本工具(BLAST)程序中，所述局部比对搜索基本工具程序可从马里兰州贝塞斯达的国家卫生研究所国家医学图书馆(National Library of Medicine,National Institute of Health,Bethesda,Md.20894)的国家生物技术信息中心(National Center Biotechnology Information，NCBI)获得，参见《BLAST手册(BLAST Manual),Altschul等人,NCBI,NLM,NIH；Altschul等人,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410(1990)；BLAST程序的2.0版或更高版本允许将间隙(缺失和插入)引入到比对中；对于肽序列，可以使用BLASTX来确定序列同一性；并且对于多核苷酸序列，可以使用BLASTN来确定序列同一性。
如本文所使用的，术语“相当大的序列同一性百分比”是指序列同一性百分比为至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或甚至更大的序列同一性，如约98％或约99％序列同一性。因此，本发明的一个实施例是与如本文所描述的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性或甚至更大的序列同一性，如约98％或约99％序列同一性的多核苷酸分子。具有本发明的活性基因的多核苷酸分子能够引导产生香草醛，并且与本文所提供的多核苷酸序列具有相当大的序列同一性，并且涵盖在本发明的范围内。
同一性是在序列比对(该比对可以使用仅序列信息或结构信息或其它某个信息来完成，但其通常是单独基于序列信息)后一对序列之间相同的氨基酸分数，并且相似性是基于使用某个相似性矩阵的比对分配的得分。相似性指数可以是以下中的任一个：BLOSUM62、PAM250或GONNET，或本领域技术人员用于蛋白质序列比对的任何矩阵。
同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有间隙)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18％至25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关的或随机的序列(大于100个残基)可以具有高于20％的同一性。相似性是在比较两个序列时这两个序列之间的相似程度。这取决于其同一性。
本领域普通技术人员将了解可用于制备表达载体的分子生物学技术。如本文所描述的，用于并入本主题技术的表达载体的多核苷酸可以通过常规技术，如聚合酶链式反应(PCR)制备。在分子克隆中，载体是一种DNA分子，用作媒剂，将外来遗传物质人工携带到另一个细胞中，在其中其可以复制和/或表达(例如质粒、粘粒、λ噬菌体)。含有外来DNA的载体被认为是重组DNA。四种主要类型的载体是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。其中，最常用的载体是质粒。所有工程化载体共有的是复制起源、多克隆位点和选择性标志物。
已经开发了许多分子生物学技术，以通过互补的内聚末端将DNA与载体可操作地连接。在一个实施例中，互补均聚物束可以被添加到待插入载体DNA中的核酸分子中。载体和核酸分子然后通过互补均聚物尾部之间的氢键接合以形成重组DNA分子。
在一个替代实施例中，含有所提供的一个或多个限制性位点的合成接头用于将主题技术的多核苷酸与表达载体可操作地连接。在一个实施例中，多核苷酸是通过限制性核酸内切酶消化产生的。在一个实施例中，用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I处理核酸分子，这些酶以其3'-5'核酸外切酶活性去除突出的3'单链末端，并且以其聚合活性填充凹陷的3'端，由此产生钝端DNA区段。然后在能够催化钝端的DNA分子的连接的酶(如噬菌体T4 DNA连接酶)的存在下，将钝端的区段与大摩尔过量的接头分子一起温育。因此，反应的产物是在其末端携带聚合物接头序列的多核苷酸。然后用适当的限制酶切割这些多核苷酸，并且连接至表达载体，所述表达载体已经用产生与多核苷酸的末端相容的末端的酶切割。
可替代地，可以使用具有连接非依赖性克隆(LIC)位点的载体。然后，所需的PCR扩增的多核苷酸可以在没有限制性消化或连接的情况下克隆到LIC载体中(Aslanidis和deJong,《核酸研究》18 6069-74,(1990)；Haun等人,《生物技术(Biotechniques)》13,515-18(1992)，所述文献中的每一个通过引用并入本文)。
在一个实施例中，为了分离和/或修饰所关注的多核苷酸以插入所选择的质粒中，适合使用PCR。用于序列的PCR制备的合适引物可以设计为分离核酸分子所需的编码区，添加限制性核酸内切酶或LIC位点，并将编码区置于期望的阅读框中。
在一个实施例中，使用适合PCR的寡核苷酸引物制备用于结合到本主题技术的表达载体中的多核苷酸。编码区被扩增，而引物本身被结合到扩增的序列产物中。在一个实施例中，扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点，其允许扩增的序列产物被克隆到合适的载体中。
表达载体可以通过常规转化或转染技术引入微生物宿主细胞中。用本主题技术的表达载体转化合适的细胞是通过本领域已知的方法实现的，并且通常取决于载体和细胞两者的类型。合适的技术包含磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质转染、化学蒸发(chemoporation)或电穿孔。
成功转化的细胞，即那些含有表达载体的细胞可以通过本领域众所周知的技术进行鉴定。例如，用本主题技术的表达载体转染的细胞可以被培养以产生本文所描述的多肽。可以通过本领域众所周知的技术来检查细胞是否存在表达载体DNA。
宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，或可替代地，表达载体的多个拷贝。
香草醛的发酵产生
参考图1，在拟无枝酸菌菌株中，阿魏酸代谢通过非β-氧化脱乙酰途径。所述途径由两种酶介导，即由fcs基因编码的阿魏酰-辅酶A(CoA)合成酶(Fcs)和由ech基因编码的烯酰-CoA水合酶/醛缩酶(Ech)。具体地，Fcs酶介导阿魏酸转化为阿魏酰-CoA，并且Ech酶首先向阿魏酰-CoA中添加H2O以提供4-羟基-3-甲氧基苯基-β-羟基丙酰-CoA，然后将其转化为香草醛。ech和fcs基因都在操纵子内，并且当拟无枝酸菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长时，这两个基因的表达通常受到抑制。诱导这些基因的转录需要添加阿魏酸或另一种单体木质素前体，如肉桂酸、对香豆酸和咖啡酸。结果，在可以检测香草醛合成之前，在将阿魏酸添加到培养基中之后存在通常从4小时至长达8小时的滞后时间段。香草醛的产生中的此类延迟和完成阿魏酸生物转化为香草醛的较长时间导致香草醛由于被另外的酶进一步氧化而损失。因此，需要避免使用阿魏酸的香草醛产生中的初始滞后时间段。本发明提供了一种用于分离产生菌株的突变体的方法，所述产生菌株具有使用阿魏酸作为原料产生香草醛的能力，而没有ech和fcs基因表达的诱导期。
在拟无枝酸菌中克服与用阿魏酸产生香草醛相关的滞后时间段的一种方法是在组成型启动子下组成型表达编码阿魏酰-辅酶A(CoA)合成酶的fcs基因和编码烯酰-CoA水合酶/醛缩酶的ech基因。这可以通过在一个或多个组成型启动子下构建具有ech和fcs基因两者的质粒载体并用此类质粒载体转化拟无枝酸菌细胞来实现。为了将质粒载体稳定地维持在拟无枝酸菌细胞内，质粒载体必须整合到宿主基因组中，或使用适当的抗生素选择标志物并在培养基中提供对应的抗生素维持在细胞内。这需要将外源性核酸引入拟无枝酸菌细胞，使此类重组细胞成为基因修饰的生物体(GMO)。另一方面，本发明提供了一种在不将任何外源性核酸分子引入拟无枝酸菌细胞中的情况下增加已经存在于拟无枝酸菌细胞内的内源性ech和fcs基因的表达的方法。本发明是基于以下的想法：即ech和fcs基因的表达被阻遏蛋白蛋白所抑制，而通过此类内源性基因的体内基因突变使编码该阻遏蛋白蛋白的基因失活将解除阻遏蛋白蛋白对ech和fcs基因的转录的抑制。本发明进一步基于以下期望：即阻遏蛋白蛋白通过与涵盖ech和fcs基因的操纵子的启动子区结合而对ech和fcs基因表达发挥其抑制作用。本发明的另一个总体想法是，在ech-fcs基因操纵子的启动子的控制下的质粒载体中的报告基因将在抑制ech和fcs基因转录的阻遏蛋白的控制下。结果，当在ech-fcs操纵子的启动子的控制下用携带报告基因的质粒载体转化拟无枝酸菌细胞并在以葡萄糖为碳源的培养基中生长时，由于阻遏蛋白蛋白与控制报告基因的转录的启动子区的结合，将不会有任何报告基因的表达。然而，在那些编码阻遏蛋白蛋白的基因中有突变的细胞中，报告基因将在拟无枝酸菌细胞中表达。因此，使用在ech-fcs操纵子的启动子的控制下的报告基因，可以筛选在编码阻遏蛋白蛋白的基因中具有突变的细胞，所述阻遏蛋白蛋白与ech-fcs操纵子的启动子结合并抑制ech和fcs基因的转录。
本发明中有用的报告基因预期具有易于检测的表型。例如，报告基因可以编码蛋白质，所述蛋白质可以将底物转化为可以易于检测的显色产物。在本发明的优选实施例中，荧光蛋白，如绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白用作报告基因，用于筛选具有编码阻遏蛋白蛋白的基因突变的拟无枝酸菌细胞，所述阻遏蛋白蛋白具有与ech-fcs操纵子的启动子区结合并抑制fcs和ech基因的转录的能力。
在一个实施例中，本发明提供了一种涉及诱变化学品的诱变方案，用于增加编码阻遏蛋白蛋白的基因的诱变频率，所述阻遏蛋白蛋白具有与ech/fcs操纵子的启动子区结合的能力。
许多不同的化学诱变剂在本领域中是众所周知的。其中的任一种都可以用于本发明，以增加编码阻遏蛋白蛋白的基因的突变频率，所述阻遏蛋白蛋白具有与ech-fcs操纵子的启动子结合并抑制其转录的能力。一类化学诱变剂是类似于DNA的四个碱基之一的碱基类似物，并且此类碱基类似物的掺入会导致稳定的突变。一氧化二氮是另一种诱变化学品，可以通过氧化脱氨基将碱基的氨基转化为酮基。脱氨基(去除氨基)的频率顺序是腺嘌呤>胞嘧啶>鸟嘌呤。烷基化剂是另一组诱变剂，可用于将烷基添加到DNA的鸟嘌呤和腺嘌呤残基的氢键氧上。作为烷基化的结果，电离的可能性随着配对误差的引入而增加。烷基化剂的一些广泛使用的实例包含硫酸二甲酯、甲烷磺酸乙酯、乙烷磺酸乙酯和甲烷磺酸甲酯。也可以使用某些染料，如吖啶橙、普罗黄素和吖啶黄，其是与嘌呤嘧啶对尺寸相似的三环分子。在水溶液中，这些染料可以通过一种称为嵌入的过程将自身插入相邻碱基对之间的DNA中。这些嵌入剂使DNA扭曲，导致DNA分子复制后的缺失或插入。由于嵌入剂引起的此类缺失或插入，可以发生移码突变。任何上述种类的诱变剂都可以用于本发明。
一方面，具有期望的表型的突变型菌株(在这种情况下，没有滞后时间段的香草醛产生)可以通过按照本领域众所周知的程序使产生香草醛的生物，如拟无枝酸菌的孢子经受化学突变原来获得。为了帮助有效地鉴定具有期望的表型的突变型菌株，可以首先用携带报告基因的质粒转化孢子。在本发明的优选方面，在ech-fcs操纵子的启动子的控制下，使用绿色或红色荧光蛋白作为报告基因。在具有能够与ech-fcs操纵子的启动子区结合的阻遏蛋白的孢子中，该报告基因的表达将在含葡萄糖的培养基中受到抑制(即处于关闭状态)，并且仅在阿魏酸存在的情况下才会打开。相比之下，在编码阻遏蛋白蛋白的基因中具有突变的孢子中，阻遏蛋白蛋白是有缺陷的，并且报告基因(例如，红色荧光蛋白)即使在不存在阿魏酸的情况下也会表达。因此，在不存在阿魏酸的情况下表现出强红色荧光的细胞是在编码阻遏蛋白蛋白的基因中含有突变的突变型菌株，所述阻遏蛋白与ech-fcs操纵子的启动子结合，并且已经失去了抑制ech和fcs基因的转录的能力。此类突变型菌株可以使用FACS(荧光激活的细胞分选)装置有效地分选和分离。一旦分离出具有在不存在阿魏酸的情况下显示强红色荧光的期望的表型的突变的孢子，将其生长到预定的细胞密度，然后测试以证实其在添加阿魏酸时产生香草醛而不显示任何滞后时间段的能力。
然后可以对所选择的突变型菌株进行全基因组测序，以鉴定由化学诱变过程引起的突变。为了证实所选菌株的染色体DNA中的特定突变确实是观察到的所关注的表型的唯一原因，使用微生物遗传学领域中众所周知的技术从所选突变型菌株中清除携带报告基因的质粒。如果所选菌株即使在清除所报告的质粒载体后仍继续表现出所观察到的表型，则可以安全地得出在所选菌株中鉴定的突变确实是所观察到表型的原因的结论。鉴定的突变在诱导观察到的表型中的作用可以通过将鉴定的突变引入野生型拟无枝酸菌细胞中并证明所引入的突变确实赋予了期望的新表型来进一步验证。将鉴定的突变引入野生型拟无枝酸菌细胞中可以使用微生物遗传学领域中的一种或多种众所周知的技术进行。在本发明的优选方面中，使用能够不将外源性核酸引入拟无枝酸菌细胞中技术将阻遏蛋白蛋白中鉴定的突变引入野生型拟无枝酸菌细胞中，以维持非GMO的状态。
上述突变型菌株的基因组测序揭示了这些突变型菌株中的每一个在具有如SEQID NO:4中所示的核酸序列的基因中包括至少一个突变。此基因被确定含有MarR型转录阻遏蛋白结构域，这表明其确实负责负调控阿魏酸代谢调节子。导致其活性显著降低或消除的此基因的突变导致ech-fcs操纵子的抑制减轻，这反过来导致ech和fcs基因的表达，而不需要用阿魏酸预诱导。因此，香草醛产生迅速进行，没有滞后时间段。从SEQ ID NO:4的核酸序列翻译的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在一些实施例中，echR基因(SEQ ID NO:4)中的突变是缺失。在一些实施例中，echR基因中的突变是移码突变。例如，移码突变可以在bp 252之后。在另一个实例中，移码突变可以在bp 166之后。在一些实施例中，突变可以是启动子突变。例如，其可以是启动子突变G-11A。更一般地，echR基因中的突变可以选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变和点突变，其中所述突变能够引起EchR蛋白的功能失活，由此减轻ech-fcs操纵子的抑制。
与在echR基因中没有突变的野生型菌株相比，根据本教导鉴定的突变型菌株在更短的产生时间内产生更多的香草醛。例如，在将阿魏酸初始地进料给突变型菌株后的5小时内，根据本教导的突变型菌株可以产生至少0.5g香草醛/升培养基。在另一个实施例中，在将阿魏酸初始地进料给突变型菌株后的5小时内，所述突变型菌株可以产生至少0.75g香草醛/升培养基。在又另一个实施例中，在将阿魏酸初始地进料给突变型菌株后的3小时内，所述突变型菌株可以产生至少0.5g香草醛/升培养基。
在本发明的一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，突变型菌株可以产生多出至少100％的香草醛。在另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，突变型菌株可以产生多出至少200％的香草醛。在又另一个实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，突变型菌株可以产生多出至少300％的香草醛。在优选实施例中，在将阿魏酸进料给突变型菌株或野生型菌株后的8小时内，当与在内源性echR基因中没有突变的野生型菌株相比时，突变型菌株可以产生多出至少400％的香草醛。
一旦拟无枝酸菌突变型菌株被选择为具有使用阿魏酸产生香草醛而没有任何滞后时间段的能力，则此菌株的性能可以进一步提高，例如，通过阻断所选菌株内存在的香草醛降解途径。例如，香草醛脱氢酶(Vdh)将香草醛氧化为香草酸可以通过突变编码香草醛脱氢酶的vdh基因来阻断。使用本领域众所周知的技术，可以引入一个或多个突变，包含但不限于缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变，所述突变已知可使香草醛脱氢酶功能失活。在本发明的优选方面中，导致香草醛脱氢酶功能失活的vdh基因的突变是使用微生物遗传学领域中众所周知的一种或多种技术进行的，所述技术将允许vdh基因中期望的突变，而不将任何外源性核酸序列引入所选的拟无枝酸菌突变型菌株，以维持非GMO的状态。
据报道，在大肠杆菌中参与苯甲醛转化为苄醇的酶也负责将香草醛还原为香草醇。大肠杆菌中yeaE、dkgA、yqhC、yqhD、yahK和yjgB的缺失消除了香草醛的进一步还原。可以在本发明的拟无枝酸菌突变型菌株中鉴定这些基因的同源物，所述突变型菌株在ech-fcs操纵子的启动子区中具有突变，并且可用于使用阿魏酸作为原料产生香草醛。预期在本发明的echR突变型菌株中，选自由以下组成的组的一个或多个基因的突变将导致香草酸产生的减少或消除，从而导致香草醛产率的增加：yeaE、dkgA、yqhC、yqhD、yahK和yjgB基因。
在本发明的优选实施例中，可以使用微生物遗传学领域众所周知的CRISPAR/CAS系统对本发明的拟无枝酸菌突变型细胞进行任何进一步的基因修饰(参见例如，美国专利申请公开2016/0298096-CRISPR-CAS系统、材料和方法(CRISPR-CAS System,Materialsand Methods)；Wang等人,(2016),用CRISPR-Cas9进行细菌基因组编辑：以贝氏梭菌为例的缺失、整合、单核苷酸修饰和期望的“清洁”突变体选择为例(Bacterial Genome Editingwith CRISPR-Cas9:Deletion,Integration,Single Nucleotide Modification,andDesirable“Clean”Mutant Selection in Clostridium beijerinckii as an Example),《ACS合成生物学(ACS Synth.Biol.)》,DOI:10.1021/acssynbio.6b00060；Huang等人,(2016),CRISPR干扰(CRISPRi)对藻青菌S.elongatus PCC 7942基因调控和琥珀酸产生的影响(CRISPR interference(CRISPRi)for gene regulation and succinate productionin cyanobacterium S.elongatus PCC 7942),《微生物细胞杂志(Microb Cell Fact)》,15:196；Kuivanen等人,(2016),工程化黑曲霉用于半乳糖酸产生：通过使用RNA测序和CRISPR/Cas9消除半乳糖酸分解代谢(Engineering Aspergillus niger for galactaricacid production:elimination of galactaric acid catabolism by usingRNAsequencing and CRISPR/Cas9)，《微生物细胞杂志》,15:210；Peng等人,(2017),使用CRISPR/Cas9系统在谷氨酸棒杆菌中进行高效基因编辑(Efficient gene editing inCorynebacterium glutamicum using the CRISPR/Cas9 System),《微生物细胞杂志》,16:201；Gorter de Vries等人,(2017),储藏啤酒酵母巴氏酵母中CRISPR-Cas9介导的基因缺失(CRISPR-Cas9 mediated gene deletions in lager yeast Saccharomycespastorianus),《微生物细胞杂志》,16:222；Wu等人,(2019),在细菌中开发基于CRISPR的基因编辑方法的策略(Strategies for Developing CRISPR-Based Gene Editing Methodsin Bacteria),《小方法(Small Methods)》,DOI:10.1002/smtd.201900560；RamachandranG和Bikard D(2019),用CRISPR方法编辑微生物组(Editing the microbiome the CRISPRway),《自然科学会报乙(Phil.Trans.R.Soc.B)》374:20180103http://dx.doi.org/10.1098/rstb.2018.0103)。
在一些实施例中，可以使用反义RNA技术或RNAi技术使功能酶失活(参见例如，Xu等人,(2018),反义RNA：遗传学研究的新宠(Antisense RNA:the new favorite ingenetic research),《生物医学和生物技术(Biomed&Biotechnol)》,19(10):739-749；Zheng等人,(2019),用于代谢工程化的微生物CRISPRi和CRISPRa系统(Microbial CRISPRiand CRISPRa Systems for Metabolie Engineering),《生物技术和生物过程工程化(Biotechnology and Bioprocess Engineering)》,24:579-591)。然而，在本发明的精神中使用非GMO菌株将阿魏酸生物转化为香草醛，有必要确保使用反义RNA技术和RNAi技术使功能蛋白失活而不会将任何外源性核酸引入选择用于以商业规模从阿魏酸产生香草醛的拟无枝酸菌突变型菌株中，并且维持非GMO状态。
培养肉汤可以在生物反应器中制备和灭菌。然后可以将根据本发明的工程化宿主菌株接种到培养肉汤中以启动生长阶段。生长阶段的适当持续时间可以为约5小时至40小时，优选地约10小时至35小时，并且最优选地约10小时至20小时。
生长阶段终止后，可以将底物阿魏酸进料到培养物中。合适量的底物进料可以是0.1g/L至40g/L的发酵肉汤，优选地约0.3g/L至30g/L。底物可以作为固体材料或水溶液或悬浮液进料。底物的总量可以在一个步骤、两个或多个进料步骤中进料，或连续进料。
使用本发明中开发的拟无枝酸菌菌株的生物转化阶段从底物进料开始，并且可以持续约5小时至50小时，优选地10小时至40小时，并且最优选地15小时至30小时，直到所有底物转化为产物和副产物。与野生型拟无枝酸菌细胞在香草醛产生开始前显示若干小时的滞后时间段不同，本发明中开发的拟无枝酸菌菌株将能够在引入阿魏酸的情况下立即产生香草醛而不显示任何滞后时间段。
生物转化阶段结束后，可以通过任何众所周知的方法，如离心或膜过滤等将生物质从发酵肉汤中分离出来，以获得无细胞发酵肉汤。
可以使用例如水不混溶的有机溶剂、植物油或任何固体提取剂(例如，树脂；优选地中性树脂)将提取相添加到发酵肉汤中。发酵肉汤可以进一步灭菌或巴氏杀菌。在一些实施例中，发酵肉汤可以被浓缩。可以使用例如连续液-液提取工艺或分批提取工艺从发酵肉汤中选择性地提取香草醛。
本发明的优点包含，除其它外，本发明中开发的拟无枝酸菌菌株能够在没有任何滞后时间段的情况下开始将阿魏酸生物转化为香草醛以缩短产生期。这大幅简化了产生过程，使过程高效且经济，从而允许扩大到工业产生水平。
本领域技术人员将认识到，通过本文所描述的方法制备的香草醛组合物可以进一步纯化并与如上文所描述的芳香和/或调味的可消费产品、以及用于营养的膳食补充剂、医疗组合物和化妆品以及药物产品混合。
通过考虑以下非限制性实例，本公开将得到更充分的理解。应理解，这些实例在指示本主题技术的优选实施例的同时仅通过说明的方式给出。通过以上讨论和这些实例，本领域技术人员可以确定本主题技术的必要特征，并且在不偏离其精神和范围的情况下可以对本主题技术进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。
实例
菌株、质粒和培养条件。
DH5α和BL21的大肠杆菌菌株(DE3)购自英杰公司(Invitrogen)。质粒pET28a购自美国马萨诸塞州比勒利卡的EMD密理博公司(EMD Millipore(Billerica,MA,USA))，其用于基因克隆。
DNA操纵。
所有DNA操纵均按照标准程序进行。限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)。根据制造商的指导，使用新英格兰生物实验室的Phusion PCR系统进行所有PCR反应。
实例1
用报告基因构建质粒
在本发明中使用红色荧光蛋白(RFP)作为报告基因。ech-fcs操纵子的启动子(在ech基因之前紧邻包括305bp)是从拟无枝酸菌ATCC 39116基因组中PCR扩增的。然后将此片段与密码子优化的红色荧光蛋白(RFP)变体一起克隆到pRLE6载体中，以产生质粒MPL210。
实例2
化学诱变与突变型菌株的选择
用突变原甲磺酸甲酯处理含有MPL210报告质粒的拟无枝酸菌ATCC 39116的单细胞孢子。使诱变的孢子流过流式细胞仪，并且将最亮的红细胞分选出来并铺板在缺乏阿魏酸的培养基上。对菌落进行红色视觉扫描，并且选择六种突变型菌落用于进一步分析。
实例3
测定用于将阿魏酸生物转化为香草醛的突变型菌株
选择了六种突变型菌落，并且测试了阿魏酸向香草醛的生物转化(图2)。所有六种突变型菌株立即开始将阿魏酸转化为香草醛，而没有野生型菌株表现出的典型滞后时间段。使用本领域众所周知的技术从这些突变型菌株中清除具有报告基因的质粒，以恢复这些突变型菌株的非GMO状态。对这些经过清除的突变型菌株进行了阿魏酸生物转化为香草醛的测定，发现所有经过清除的突变型菌株都保持了阿魏酸生物转化为香草醛而没有任何滞后时间段的表型(图3)，表明引起期望的生物转化表型的突变存在于突变型菌株的染色体DNA中，而不存在于携带报告基因的质粒中。在生物转化的早期阶段期间，香草酸的积累也很少，而野生型菌株产生的香草酸比香草醛多(图3)。
在与浓度为13g/L的阿魏酸一起温育8小时后，其中一种突变型菌株产生6.43g/L的香草醛，与野生型拟无枝酸菌将阿魏酸生物转化为香草醛(1.32g/L香草醛)相比，是其香草醛产生的4.87倍。同样重要的是要注意，在8小时的温育期期间，与拟无枝酸菌的野生型菌株中1.67g/L的香草酸积累相比，突变型菌株显示出香草酸积累减少(0.497g/L)。
实例4
突变型基因的鉴定
对两种突变型菌株进行全基因组测序，以鉴定导致观察到的阿魏酸生物转化为香草醛而没有任何滞后时间段的表型的突变。两种突变型菌株的基因组测序显示，突变位于一个特定基因中：基因座标签AMY39116_RS0323770(表1)。在选自化学诱变中的所有六种突变型菌株中也发现了相同的基因突变(表2)。此突变基因含有MarR型转录阻遏蛋白结构域，表明其确实通过与ech-fcs操纵子的启动子区结合来负调控阿魏酸代谢。在所有六种突变型菌株中显示一个或多个突变的此基因在本申请中被称为echR。
实例5
HPLC分析
香草醛的HPLC分析是用Vanquish Ultimate 3000系统进行的。通过其保留时间以及对应的光谱来鉴定化合物，所述光谱是用系统中的二极管阵列检测器鉴定的。
实例6
阿魏酸生物转化为香草醛
将拟无枝酸菌的野生型和突变型菌株在10mL种子培养基(酵母提取物12g/L、葡萄糖10g/L、MgSO4 0.2g/L、K2HPO4 7.5g/L、KH2PO4 1g/L、pH 7.2)中在37℃下生长至饱和24小时，以1:20稀释到10mL转化培养基(酵母菌提取物5g/L，葡萄糖8g/L，麦芽提取物10g/L，MgSO4 0.2g/L)中在37℃下培养24小时，并且进料阿魏酸作为底物。在指定的时间通过将细菌培养物收集到甲醇中进行HPLC分析来采集样品。
参考图2，虽然野生型菌株直到5小时后才开始产生香草醛，但根据本发明选择的六种突变型菌株中的每一种几乎立即显示出可检测的香草醛水平，并且在3小时时，六种突变型菌株中的五种产生了至少约0.5g/L的香草醛，并且在5小时时，六种突变型菌株中的每一种都产生了至少0.75g/L的香草醛。在7小时时，六种突变型菌株中的每一种都产生了至少1.25g/L的香草醛，而野生型菌株只产生了约0.2g/L的香草醛。
参考图3，可以看出，在24小时的转化时间内，根据本发明的突变型菌株能够在添加阿魏酸后的8小时内产生>6g/L的香草醛。相比之下，野生型菌株在添加阿魏酸后的8小时内能够产生<2g/L的香草醛。另外，对于野生型菌株，注意到香草醛对香草酸的降解也相对较高。例如，在8小时时，野生型菌株已积累了约2g/L的香草酸，而突变型菌株已积累的香草酸少于0.5g/L。
本申请涉及各种已授权的专利、公开的专利申请、期刊文章和其它出版物，它们都通过引用并入本文。本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以说明书为准。另外，落入现有技术内的本公开的任何特定实施例可以明确地从任意一项或多项权利要求排除。因为此类实施例被视为对于本领域的普通技术人员是已知的，所以即使没有在此明确地提出这种排除，其也可以被排除。出于任何原因，无论是否与现有技术的存在相关，可以从任何权利要求中排除本公开的任何特定实施例。
本领域技术人员会认识到或能够使用不超过例行实验确定本文描述的具体实施例的许多等同方案。本文描述的本实施例的范围无意限于以上描述，而是如所附权利要求所述。本领域普通技术人员将了解，在不背离如所附权利要求所限定的本公开的精神或范围的情况下，可以对该描述作出各种修改和改变。
所关注的序列
SEQ ID NO:1：ech-fcs操纵子的启动子区的核酸序列
SEQ ID NO:2：红色荧光蛋白的核酸序列-针对拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)进行密码子优化
SEQ ID NO:3：报告基因的终止子的核酸序列
SEQ ID NO:4：echR(ech-fcs操纵子的阻遏蛋白)的核酸序列
/>
SEQ ID NO:5：EchR(ech-fcs操纵子的阻遏蛋白)的氨基酸序列
SEQ ID NO:6：vdh(香草醛脱氢酶)的核酸序列
SEQ ID NO:7：Vdh(香草醛脱氢酶)蛋白的氨基酸序列
/>
序列表
<110> 巴斯夫欧洲公司（BASF SE）
<120> 阿魏酸生物转化为香草醛
<130> 074008-2034-WO-000324
<150> US 63/127,449
<151> 2020-12-18
<160> 7
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 305
<212> DNA
<213> 拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）ATCC 39116
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(305)
<223> ech-fcs操纵子的启动子区的核酸序列
<400> 1
gcccccgatt gtccgcaccg gccgcggccg ccgggaaggc gccgcccggt cgcggcaacc 60
gcgctcaccg gcgcgtcgcg cccgagcccg tcaccctcag tccgctggag gcgcgggcgg 120
cggtgcagtc agcgccgaac ggcctgttca ccgggctcgg cggttcctgt ccgaggcgct 180
gctgctggcc gcgctcggcg ggctggtcgc cgccgtcctg atcggcgcgc cggccatctg 240
accttgacgc cgtcggcccg ctcttgctat ccctatatca gaactactga tatagggagc 300
gatgc 305
<210> 2
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(678)
<223> 红色荧光蛋白的核酸序列-针对拟无枝酸菌属（Amycolatopsis）进行
密码子优化
<220>
<221> misc_feature
<222> (676)..(678)
<223> 终止密码子
<400> 2
atggccagca gcgaggatgt gatcaaggag tttatgcgct tcaaggtgcg catggagggg 60
tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggtgagggcg agggccgccc gtacgagggg 120
acccagaccg caaagctgaa ggtcaccaag ggcggccccc tgcccttcgc gtgggacatc 180
ctgagcccac agttccagta cggctccaag gcgtacgtca agcacccggc ggacatcccc 240
gactacctga agctgagctt cccggagggc ttcaagtggg agcgggtcat gaacttcgag 300
gacgggggcg tggtcacggt gacgcaggac agctcgttgc aggatggcga gttcatctac 360
aaggtgaagc tgcgcggcac gaacttcccc agcgacggcc ccgtgatgca gaaaaagacg 420
atgggctggg aggcgtccac cgagaggatg tacccggagg acggcgccct gaagggcgag 480
atcaagatgc ggctgaaact gaaggacgga ggccactacg acgcggaggt caagacgacg 540
tacatggcga agaagcccgt gcagcttccg ggcgcataca agacggacat caagctggac 600
atcacgtccc acaacgagga ctatacgatc gtcgagcagt acgagcgggc ggagggccgc 660
cactccacgg gcgcgtga 678
<210> 3
<211> 137
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(137)
<223> 报告基因的终止子的核酸序列
<400> 3
aggtccaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 60
tgttgtttgt cggtgaacgc tctctactag agtcacactg gctcaccttc gggtgggcct 120
ttctgcgttt atagctt 137
<210> 4
<211> 483
<212> DNA
<213> 拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）ATCC 39116
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(483)
<223> echR（ech-fcs操纵子的阻遏蛋白）的核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (481)..(483)
<223> 终止密码子
<400> 4
gtggtgaccg aatcccgcgc cgaggacgcc ccgctgaccc tctacctggt caagcggctg 60
gagctggtga tccgctcgct gatggacgac gcgctgcgcc cgttcgggct gaccaccctg 120
cagtacaccg cgctgaccgc gctgcggcac cgcaacgggc tgtcgtccgc gcagctcgcg 180
cgccgctcgt tcgtccggcc ccagaccatg cacaccatgg tgctcacgct ggagaagtac 240
gggctcatcg agcgcgcgga ggacccggcc aaccgccggg tcctgctcgc caccctcacc 300
gagcgcggca agcaggtcct cgacgagtgc acgccgctgg tccgggagct cgaagaccgg 360
atgctctccg gcatggacga cgaccgccgc gccgggttcc gccgggacct ggaggacggc 420
tacggcatgc tcgcctcgca cgccaacgct cagcgcgcgt tgacgaacgg cggcggcgag 480
taa 483
<210> 5
<211> 160
<212> PRT
<213> 拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）ATCC 39116
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(160)
<223> EchR（ech-fcs操纵子的阻遏蛋白）的氨基酸序列
<400> 5
Met Val Thr Glu Ser Arg Ala Glu Asp Ala Pro Leu Thr Leu Tyr Leu
1 5 10 15
Val Lys Arg Leu Glu Leu Val Ile Arg Ser Leu Met Asp Asp Ala Leu
20 25 30
Arg Pro Phe Gly Leu Thr Thr Leu Gln Tyr Thr Ala Leu Thr Ala Leu
35 40 45
Arg His Arg Asn Gly Leu Ser Ser Ala Gln Leu Ala Arg Arg Ser Phe
50 55 60
Val Arg Pro Gln Thr Met His Thr Met Val Leu Thr Leu Glu Lys Tyr
65 70 75 80
Gly Leu Ile Glu Arg Ala Glu Asp Pro Ala Asn Arg Arg Val Leu Leu
85 90 95
Ala Thr Leu Thr Glu Arg Gly Lys Gln Val Leu Asp Glu Cys Thr Pro
100 105 110
Leu Val Arg Glu Leu Glu Asp Arg Met Leu Ser Gly Met Asp Asp Asp
115 120 125
Arg Arg Ala Gly Phe Arg Arg Asp Leu Glu Asp Gly Tyr Gly Met Leu
130 135 140
Ala Ser His Ala Asn Ala Gln Arg Ala Leu Thr Asn Gly Gly Gly Glu
145 150 155 160
<210> 6
<211> 1461
<212> DNA
<213> 拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）ATCC 39116
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1461)
<223> vdh（香草醛脱氢酶）的核酸序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1459)..(1461)
<223> 终止密码子
<400> 6
gtgagctttc tcgacgacga gaagtggacc ggacgcgtct tcaccggcag ctgggagcgc 60
gcggcgggcg gcgacgcggc cgtcatcgag cccgcgaccg gcgacgaact ggggcgcgtc 120
ggcatcgcct cgccccagga cctggcggcc tccgcggcca aggcggccga ggcgcagcgc 180
gcctgggcgg cgacctcctt ccaagaacgc gccgcggtcc tgcgccgcgc cggcgacctg 240
tggcagcagc acgccgccga gctgaaggac tggctgatcc gcgagtcggg cagcatcccc 300
ggcaaggccg acttcgaact gcacgtcgcc gcgcaggagt gctacgaggc cgccgcgctg 360
ccctcccacc cgacgggtga ggtcctgccg agcgaggcgc cgcggctgag catggcccgc 420
cgcgtgcccg ccggcgtggt cggcgtgatc gcgccgttca acgcgccgct gatcctgtcg 480
atccgctcgg tcgcgccggc gctggcgctg ggcaacagcg tcgtgctcaa gccggacccc 540
cgcaccgcgg tctgcggtgg cgtggcgctg gccagggtct tcgaggaggc cgggctgccc 600
gccggggtcc tgcacgtgct gccgggcggc ccggacgtcg gcgccgcgct ggtcgaggac 660
aagcacgtcc gcgtcatctc gttcaccgga tcgaccgccg cgggccgcgc ggtcggcgag 720
tccgcgggcc gccacctcaa gcgcgcccac ctggaactgg gcggcaactc ggcgctgatc 780
gtgctcgacg acgccgacct ggagcaggcg atgagcgccg ccgcgtgggg ctcgttcttc 840
caccagggcc agatctgcat gaccaccggg cggcacctgg tgcacgcctc actctacgac 900
gaatacgtgg accgcctggc ggacaaggcc agccacctgc cggtgggcaa cccgttcacc 960
gagcaggtcg cgctcggccc gatcatcgac gccaagcagc gcgacaagat ccacggcctg 1020
gtgacgtcca gtgtggacgc cggcgcgaag gtcgccgcgg gcggcaccta cgaggacctc 1080
ttctaccgcg ccaccgtgct cgccggcgcg ggcccctcgg tgcccgccta cgaccaggag 1140
gtgttcggcc cggtcgcccc ggtcgcgaag ttcaccagcc tggacgaggc cgcgaagctc 1200
gcgtcggaga gcgagtacgg gctgtcgctg ggcatcatca ccgcggacgt ggcgaaggga 1260
ctggcgctgg ccgaccgcat cccgaccggc atcgcgcaca tcaacgacca gacggtcaac 1320
gacgaggcgc tggccccgtt cggcggcgtg ttcgactccg gcaccggctc ccgcttcggc 1380
gggccggccg cgaacatcga ggcgttcacc gagacccgct gggtcacgat gcgcggcgac 1440
gtcgccggct acccgttctg a 1461
<210> 7
<211> 486
<212> PRT
<213> 拟无枝酸菌（Amycolatopsis sp.）ATCC 39116
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(486)
<223> Vdh（香草醛脱氢酶）蛋白的氨基酸序列
<400> 7
Val Ser Phe Leu Asp Asp Glu Lys Trp Thr Gly Arg Val Phe Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Glu Arg Ala Ala Gly Gly Asp Ala Ala Val Ile Glu Pro Ala
20 25 30
Thr Gly Asp Glu Leu Gly Arg Val Gly Ile Ala Ser Pro Gln Asp Leu
35 40 45
Ala Ala Ser Ala Ala Lys Ala Ala Glu Ala Gln Arg Ala Trp Ala Ala
50 55 60
Thr Ser Phe Gln Glu Arg Ala Ala Val Leu Arg Arg Ala Gly Asp Leu
65 70 75 80
Trp Gln Gln His Ala Ala Glu Leu Lys Asp Trp Leu Ile Arg Glu Ser
85 90 95
Gly Ser Ile Pro Gly Lys Ala Asp Phe Glu Leu His Val Ala Ala Gln
100 105 110
Glu Cys Tyr Glu Ala Ala Ala Leu Pro Ser His Pro Thr Gly Glu Val
115 120 125
Leu Pro Ser Glu Ala Pro Arg Leu Ser Met Ala Arg Arg Val Pro Ala
130 135 140
Gly Val Val Gly Val Ile Ala Pro Phe Asn Ala Pro Leu Ile Leu Ser
145 150 155 160
Ile Arg Ser Val Ala Pro Ala Leu Ala Leu Gly Asn Ser Val Val Leu
165 170 175
Lys Pro Asp Pro Arg Thr Ala Val Cys Gly Gly Val Ala Leu Ala Arg
180 185 190
Val Phe Glu Glu Ala Gly Leu Pro Ala Gly Val Leu His Val Leu Pro
195 200 205
Gly Gly Pro Asp Val Gly Ala Ala Leu Val Glu Asp Lys His Val Arg
210 215 220
Val Ile Ser Phe Thr Gly Ser Thr Ala Ala Gly Arg Ala Val Gly Glu
225 230 235 240
Ser Ala Gly Arg His Leu Lys Arg Ala His Leu Glu Leu Gly Gly Asn
245 250 255
Ser Ala Leu Ile Val Leu Asp Asp Ala Asp Leu Glu Gln Ala Met Ser
260 265 270
Ala Ala Ala Trp Gly Ser Phe Phe His Gln Gly Gln Ile Cys Met Thr
275 280 285
Thr Gly Arg His Leu Val His Ala Ser Leu Tyr Asp Glu Tyr Val Asp
290 295 300
Arg Leu Ala Asp Lys Ala Ser His Leu Pro Val Gly Asn Pro Phe Thr
305 310 315 320
Glu Gln Val Ala Leu Gly Pro Ile Ile Asp Ala Lys Gln Arg Asp Lys
325 330 335
Ile His Gly Leu Val Thr Ser Ser Val Asp Ala Gly Ala Lys Val Ala
340 345 350
Ala Gly Gly Thr Tyr Glu Asp Leu Phe Tyr Arg Ala Thr Val Leu Ala
355 360 365
Gly Ala Gly Pro Ser Val Pro Ala Tyr Asp Gln Glu Val Phe Gly Pro
370 375 380
Val Ala Pro Val Ala Lys Phe Thr Ser Leu Asp Glu Ala Ala Lys Leu
385 390 395 400
Ala Ser Glu Ser Glu Tyr Gly Leu Ser Leu Gly Ile Ile Thr Ala Asp
405 410 415
Val Ala Lys Gly Leu Ala Leu Ala Asp Arg Ile Pro Thr Gly Ile Ala
420 425 430
His Ile Asn Asp Gln Thr Val Asn Asp Glu Ala Leu Ala Pro Phe Gly
435 440 445
Gly Val Phe Asp Ser Gly Thr Gly Ser Arg Phe Gly Gly Pro Ala Ala
450 455 460
Asn Ile Glu Ala Phe Thr Glu Thr Arg Trp Val Thr Met Arg Gly Asp
465 470 475 480
Val Ala Gly Tyr Pro Phe
485

Claims (36)

1.一种拟无枝酸菌(Amycolaptosis sp.)的非GMO突变型菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。
2.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的5小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。
3.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述突变型菌株后的3小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。
4.根据权利要求1所述的突变型菌株，所述突变型菌株包括具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中的突变，其中所述突变减少或消除ech-fcs操纵子的抑制。
5.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述菌株编码在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中具有突变的内源性蛋白。
6.根据权利要求1所述的突变型菌株，其进一步包含具有SEQ ID NO:6的核酸序列的vdh基因中的突变。
7.根据权利要求4所述的突变型菌株，其中所述突变是缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变。
8.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中所述突变是缺失。
9.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中所述突变是移码突变。
10.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中所述突变是启动子突变。
11.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株是可在编号ATCC 39116下获得的菌株拟无枝酸菌的突变体。
12.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述突变型菌株产生多出至少100％的香草醛。
13.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述突变型菌株产生多出至少200％的香草醛。
14.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述突变型菌株产生多出至少300％的香草醛。
15.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQ ID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述突变型菌株产生多出至少400％的香草醛。
16.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中通过使用基于无标志物CRISPR的重组DNA技术获得所述突变型菌株，而不通过引入任何外源性遗传物质对所述突变型菌株进行永久修饰。
17.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株是通过使菌株与突变原甲磺酸甲酯接触获得的。
18.一种拟无枝酸菌菌株，其包括：存在的拟无枝酸菌菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给突变型菌株后的5小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。
19.一种拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的5小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。
20.一种拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.5g香草醛/升培养基。
21.一种拟无枝酸菌菌株，其包括：拟无枝酸菌菌株，其中所述菌株能够在将阿魏酸初始地进料给所述菌株后的3小时内产生至少0.75g香草醛/升培养基。
22.根据权利要求18所述的菌株，所述菌株包括具有SEQ ID NO:4的核酸序列的基因中的突变，其中所述突变减少或消除ech-fcs操纵子的抑制。
23.根据权利要求18所述的菌株，其中所述菌株中的基因编码在SEQ ID NO:5的氨基酸序列中具有突变的蛋白质。
24.根据权利要求18所述的菌株，其进一步包含具有SEQ ID NO:6的核酸序列的vdh基因中的突变。
25.根据权利要求22所述的菌株，其中所述突变是缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变或点突变。
26.根据权利要求25所述的菌株，其中所述突变是缺失。
27.根据权利要求25所述的菌株，其中所述突变是移码突变。
28.根据权利要求25所述的菌株，其中所述突变是启动子突变。
29.根据权利要求18所述的菌株，其中所述菌株源自可在编号ATCC 39116下获得的拟无枝酸菌。
30.根据权利要求18所述的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少100％的香草醛。
31.根据权利要求18所述的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少200％的香草醛。
32.根据权利要求18所述的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少300％的香草醛。
33.根据权利要求18所述的菌株，其中在将阿魏酸进料给所述突变型菌株或在具有SEQID NO:4的核酸序列的内源性基因中没有突变的野生型菌株后的8小时内，当与所述野生型菌株相比时，所述菌株产生多出至少400％的香草醛。
34.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括在包括底物的适当培养基中培养根据权利要求1所述的突变型菌株，并且回收所产生的香草醛。
35.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：
a.在含有碳源的培养基中培养根据权利要求1所述的拟无枝酸菌突变型菌株；以及
b.将阿魏酸进料给所述突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间段。
36.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：
a.在含有碳源的培养基中培养根据权利要求18所述的拟无枝酸菌菌株；以及
b.将阿魏酸进料给所述菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间段。
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