CN116670295A

CN116670295A - 用于在抑制香草酸形成的情况下产生香草醛的拟无枝酸菌属菌株

Info

Publication number: CN116670295A
Application number: CN202180084982.5A
Authority: CN
Inventors: N·A·莱昂斯; R·周; D·纳恩
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2020-12-18
Filing date: 2021-12-17
Publication date: 2023-08-29
Also published as: US20240060098A1; WO2022133254A1; KR20230121065A; JP2024503213A; MX2023007249A; EP4263814A1

Abstract

本发明公开了适于使用阿魏酸(ferulic acid)作为原料来产生天然香草醛的突变型拟无枝酸菌属(Amycolatopsis sp.)菌株ATCC 39116。更具体地说，本发明公开了具有减少香草醛向香草酸的降解的突变的突变型菌株。

Description

用于在抑制香草酸形成的情况下产生香草醛的拟无枝酸菌属菌株

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年12月18日提交的美国临时专利申请第63/127,519号的权益，所述美国临时专利申请在此通过引用以其整体引入。

序列表

本申请含有已经以ASCII格式以电子方式提交并且在此通过引用以其整体并入的序列表。所述ASCII副本，创建于2021年12月14日，被命名为074008_2039_00_WO_000325_SL.txt，并且大小为29,167字节。

技术领域

本公开总体上涉及适于使用可再生原料产生天然香草醛的非基因修饰的微生物。更具体地，本发明公开了具有影响其香草醛降解通路的突变的拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)菌株，因此此类菌株能够以增加的产率产生香草醛。

背景技术

香草香精是全球最常用的香精。其用于多种食品，如冰淇淋、乳产品、甜点、糖果、烘焙产品和烈酒的调味剂。其还用于香水、药品和个人卫生产品。

传统上，天然香草香精是从香草兰(香荚兰(Vanilla planifolia))的发酵豆荚中获得的。其主要是在采集后在豆的几周干燥和发酵过程期间通过豆中存在的香草醛葡萄糖苷水解形成的。香草香精的主要芳香物质是香草醛(4-羟基3-甲氧基苯甲醛)。

每年消耗约12,000吨香草醛，其中仅20-50吨是从香草豆中萃取的。其余的是合成地产生的，主要由石化衍生的愈创木酚产生。近年来，通过使用可再生原料，如源自米糠的阿魏酸、来自云杉树木质素的松柏醇、玉米糖和来自丁香油的丁香酚进行生物发酵来产生香草醛得到越来越多关注。源自可再生原料的使用生物发酵得到的香草醛被监管和立法机构公认为是“天然香草醛”，并且可以作为“天然产品”销售。

放线菌类拟无枝酸菌菌株ATCC 39116已用于将阿魏酸生物转化为香草醛。已知这种微生物使用以下通过初始反应区分的四种主要通路使阿魏酸发生代谢：即非氧化脱羧、侧链还原、辅酶A非依赖性脱乙酰和辅酶A依赖性脱乙酰。拟无枝酸菌菌株ATCC 39116内的阿魏酸代谢的辅酶A依赖性脱乙酰通路有两个步骤。在第一步中，阿魏酸经受非氧化脱乙酰以产生香草醛(图1)。这一步骤由两种酶介导，即由fcs基因编码的阿魏酰辅酶A(CoA)合成酶和由ech基因编码的烯酰CoA水合酶/醛缩酶。这两种基因(ech和fcs)都位于单个操纵子内，并且当拟无枝酸菌在含有葡萄糖作为碳源的培养基中生长时，这两种基因的表达受到抑制。仅在添加阿魏酸后，这些基因的转录才会被诱导。因此，在将阿魏酸添加到培养基中时，在可以检测到香草醛合成之前存在约5小时或更长时间的滞后时间段。通常，滞后时间段为至少4小时，并且为至多8小时。一旦香草醛开始积累，阿魏酸代谢的第二阶段就会开始。在第二步中，香草醛经受β-氧化以产生香草酸。香草醛向香草酸的转化是由vdh基因编码的香草醛脱氢酶介导的。为了提高香草醛产量，需要对拟无枝酸菌进行基因工程化，使得负责将香草醛降解为香草酸的通路被阻断。

发明内容

本发明提供了具有影响其香草醛降解通路的突变的微生物。在本发明的一优选实施例中，所述微生物可以为放线菌目(Actinomycetale)和拟无枝酸菌属。例如，所述微生物可以是可在编号ATCC 39116下获得的拟无枝酸菌菌株的菌株。与拟无枝酸菌ATCC 39116用于将阿魏酸生物转化为香草醛的用途相关的一个主要挑战是同时由vdh基因编码的香草醛脱氢酶Vdh将香草醛降解为香草酸。由于香草醛脱氢酶对香草醛的作用，可从野生型拟无枝酸菌ATCC 39116中获得的香草醛的产率是有限的。与其野生型对应物不同，根据本发明开发的拟无枝酸菌菌株显示出香草醛向香草酸的降解显著减少。本发明的突变型拟无枝酸菌ATCC 39116菌株是使用化学诱变获得的，并且通过使用全基因组测序鉴定了赋予香草醛降解为香草酸减少的表型的基因突变的性质。重要的是，根据本发明的突变型菌株是在不缺失或失活负责编码将香草醛转化为香草酸的香草醛脱氢酶的vdh基因的情况下获得的。

本发明的一个目的是鉴定具有影响香草醛降解通路的基因突变的突变型菌株。因为香草醛的降解产生了用于拟无枝酸菌细胞的能量源，因此筛选当香草醛是唯一碳源时不再可以生长的突变体将揭示影响香草醛降解通路的突变。另外，由于香草醇被拟无枝酸菌细胞转化为香草醛，并且相比于香草醛，香草醇对拟无枝酸菌细胞的毒性较小，因此筛选还可以通过使用香草醇代替香草醛作为唯一碳源来进行。

因此，一方面，本发明提供了一种用于选择突变型拟无枝酸菌菌株的方法，与野生型拟无枝酸菌菌株相比，所述突变型菌株表现出香草醛向香草酸的降解减少。根据本发明的方法，将拟无枝酸菌ATCC 39116的孢子暴露于化学诱变剂(例如，甲磺酸甲酯)，并且使所述孢子在含有香草醛或香草醇作为唯一碳源的液体培养基中生长。另外，本发明的筛选方法还包括将抗生素，如盘尼西林(penicillin)添加到液体培养基中(这被称为盘尼西林富集技术)。盘尼西林富集技术利用了这样的事实，即盘尼西林可以通过抑制对细胞壁的结构完整性来说至关重要的肽聚糖聚合物的交联来仅杀死生长中的细胞。因为具有位于香草酸利用通路中的突变的拟无枝酸菌细胞将不能够在含有香草醛或香草醇作为唯一能量源的生长培养基中生长并经历细胞分裂，因此所述拟无枝酸菌细胞将在盘尼西林处理后存活下来。同时，正在生长并且以香草醛或香草醇为进料的野生型拟无枝酸菌细胞被盘尼西林杀死。

与野生型菌株相比，根据本发明鉴定的突变型菌株显示出显著更少的香草酸积累。在一个实施例中，根据本发明的突变型拟无枝酸菌菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时，积累少于0.5g香草酸/升生长培养基。在另一实施例中，根据本发明的突变型拟无枝酸菌菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时，积累少于0.25g香草酸/升生长培养基。在又另一实施例中，根据本发明的突变型拟无枝酸菌菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时，积累少于0.5g香草酸/升生长培养基。在另一实施例中，本发明的突变型菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时，积累少于0.25g香草酸/升生长培养基。

另一方面，本发明提供了一种位于gltBD操纵子中的突变的拟无枝酸菌菌株。发明人通过全基因组测序意外地发现，位于gltBD操纵子中的突变可能导致所述香草酸利用通路的缺陷，并且因此导致香草醛向香草酸的降解减少的表型。在一些实施例中，根据本教导的突变型拟无枝酸菌菌株可以包括gltB基因中的一个或多个突变，所述gltB基因包括SEQID NO:1的核酸序列。在一些实施例中，本发明提供了一种具有位于gltD基因中的一个或多个突变的拟无枝酸菌菌株，所述gltD基因包括SEQ ID NO:3的核酸序列。位于所述gltBD操纵子或所述gltB基因或所述gltD基因中的所述一个或多个突变可以选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变及其任何组合。根据本发明，位于所述gltBD操纵子或所述gltB基因或所述gltD基因中的选自由缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变及其任何组合组成的组的所述突变中的任一突变可以引起所述香草酸利用通路的功能性失活，所述功能性失活导致香草醛向香草酸的降解减少。

另一方面，本发明提供了一种用于在拟无枝酸菌菌株ATCC 39116中使用阿魏酸作为原料来提高香草醛产量的方法。所述方法包括引起位于拟无枝酸菌菌株ATCC 39116中的一个或多个突变；具体地，引起位于负责调节香草醛向香草酸的降解的内源基因中的一个或多个突变。所述一个或多个突变可以位于：内源gltBD操纵子内；gltB基因内，所述gltB基因包括SEQ ID NO:1的核酸序列；gltD基因内，所述gltD基因包括SEQ ID NO:3的核酸序列；或其任何组合内。在优选的实施例中，所述方法还可以包括引起位于负责调节阿魏酸向香草醛的代谢的内源基因中的一个或多个突变。例如，所述一个或多个突变可以位于包括SEQID NO:5的核酸序列的内源基因(echR基因)中。如未决申请中所述，发明人意外地发现，位于包括SEQ ID NO:5的核酸序列的所述内源基因中的一个或多个突变可能导致包括SEQ IDNO:6的氨基酸序列的蛋白质(EchR蛋白)的功能性失活，所述蛋白质起到ech-fcs操纵子的阻遏子的作用。ech-fcs操纵子调节编码阿魏酰辅酶A(CoA)合成酶和烯酰CoA水合酶/醛缩酶的基因，所述酶负责阿魏酸向香草醛的生物转化。通过使EchR蛋白失活，编码Ech蛋白和Fcs蛋白的基因的转录不再受到抑制。因此，香草醛几乎是在一将阿魏酸进料到菌株就立即产生的，没有通常观察到的4小时或更长时间的滞后时间段。因此，一方面，本发明进一步提供了一种突变型拟无枝酸菌菌株，所述突变型菌株具有位于gltBD操纵子中的第一突变和位于echR基因中的第二突变，所述echR基因包括SEQ ID NO:5的核酸序列。位于所述gltBD操纵子和所述echR基因中的所述突变独立地可以选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变及其任何组合。在前述实施例中的任何实施例中，所述的突变中的任何突变可能是通过使拟无枝酸菌ATCC 39116菌株的孢子经受化学诱变引起的。在替代性实施例中，位于所述gltBD操纵子和所述echR基因中的所述突变中的至少一个突变可能是通过使用CRISPR技术或任何其它合适的重组DNA技术进行无标志物基因修饰，使得所述gltB基因、所述gltD基因和/或所述echR基因在拟无枝酸菌细胞内不再是功能性的引起的。在某些实施例中，位于所述gltB基因、所述gltD基因和/或所述echR基因中的所述突变中的至少一个突变可能是由化学诱变引起的，并且位于所述gltB基因、所述gltD基因和/或所述echR基因中的所述突变中的至少一个突变可能是由基因编辑引起的。

一方面，本公开涉及一种使用本文所述的突变型拟无枝酸菌菌株产生香草醛的方法。在优选实施例中，所使用的所述突变型菌株包括位于gltBD操纵子中的一个或多个突变以及位于echR基因中的一个或多个突变。在某些实施例中，用于使用阿魏酸作为原料来产生香草醛的本发明方法中使用的突变型菌株不具有外源核酸分子，并且因此可以被定量为非基因修饰的生物体(非GMO)。在一些实施例中，由阿魏酸产生香草醛的所述方法可以包含(i)在培养基中培养所述突变型菌株；(ii)将阿魏酸添加到所述培养基中以开始阿魏酸向香草醛的生物转化；以及(iii)从所述培养基中萃取香草醛。

本文所述的生物转化方法可以包含从混合物中回收香草醛。香草醛的回收可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行。在回收香草醛之前，所述方法还可以包含从发酵混合物中去除生物质(酶、细胞材料等)。

使用本文所述的方法和/或分离的重组宿主细胞产生的香草醛可以被收集、纯化并且掺入到多种可消耗产品中。例如，香草醛可以与可消耗产品混合。在一些实施例中，香草醛可以以足以在可消耗产品中赋予、改变、促进或增强期望的味道、风味或感觉，或隐藏、改变或最小化不期望的味道、风味或感觉的量掺入到可消耗产品中。可消耗产品例如可以选自由以下组成的组：食物、食物成分、食物添加剂、饮料、药物和烟草。可消耗产品例如可以选自由以下组成的组：香水、化妆品、洗漱用品、家居和身体护理、洗涤剂、驱虫剂、肥料、空气清新剂和肥皂。

第一实施例，一种非GMO突变型拟无枝酸菌菌株，其包括：通过将能够产生香草醛并且能够将香草醛代谢成香草酸的拟无枝酸菌菌株暴露于至少一种突变原形成的突变型拟无枝酸菌菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株能够产生香草醛，并且相较于所述菌株进行的降解表现出更少的香草醛向香草酸的降解，如通过所述突变型菌株相对于所述菌株中的香草酸的积累水平所测量的，在一些实施例中，所述突变型菌株是非天然存在的。

第二实施例，根据第一实施例所述的菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株是ATCC 39116的突变体。

第三实施例，根据第一实施例和第二实施例所述的菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时，积累少于0.5克香草酸/升培养基。

第四实施例，根据第一实施例和第二实施例所述的菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时，积累少于0.25克香草酸/升培养基。

第五实施例，根据第一实施例和第二实施例所述的菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时，积累少于0.5克香草酸/升培养基。

第六实施例，根据第一实施例和第二实施例所述的菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时，积累少于0.25克香草酸/升培养基。

第七实施例，根据第一实施例至第六实施例所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌菌株的基因组包括位于gltBD操纵子中的一个或多个突变。

第八实施例，根据第七实施例所述的突变型菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变包含位于gltB基因中的至少一个突变。

第九实施例，根据第八实施例所述的突变型菌株，其中所述一个或多个突变位于gltB基因中，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核酸序列。

第十实施例，根据第八实施例所述的突变型菌株，其中所述一个或多个突变位于gltB基因中，所述gltB基因包括SEQ ID NO:1。

第十一实施例，根据第七实施例至第十实施例所述的突变型菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变位于gltD基因中，所述gltD基因包括与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核酸序列。

第十二实施例，根据第七实施例至第十实施例所述的突变型菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变位于gltD基因中，所述gltD基因包括核酸序列SEQID NO:3。

第十三实施例，根据第七实施例至第十二实施例所述的突变型菌株，其进一步包含位于内源基因echR中的突变，所述内源基因echR包括核酸序列SEQ ID NO:5。

第十四实施例，根据第七实施例至第十三实施例中任一项所述的突变型菌株，其中所述一个或多个突变为至少一个选自由以下组成的组的突变：缺失、插入、移码突变、错义突变、无义突变、切片突变和点突变。

第十五实施例，根据第十四实施例所述的突变型菌株，其中所述突变是包括2bp插入的移码突变。

第十六实施例，根据第一实施例至第十五实施例所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株是在不通过引入任何外源遗传物质对所述突变型菌株进行永久修饰的情况下获得的。

第十七实施例，其中所述突变型菌株是通过使菌株与突变原甲磺酸甲酯接触获得的。

第十八实施例，一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：

在包括底物的适当培养基中培养根据第一实施例至第十六实施例中任一项所述的突变型菌株；以及回收所产生的香草醛。

第十九实施例，一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括：在含有碳源的培养基中培养根据第一实施例至第十八中任一项所述的突变型拟无枝酸菌菌株；以及将阿魏酸进料到所述突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间。

第二十实施例，一种拟无枝酸菌菌株，其包括：非天然存在的拟无枝酸菌菌株，所述非天然存在的拟无枝酸菌菌株包含编码香草醛脱氢酶的基因和位于gltBD操纵子中的至少一个突变，其中相比于不具有所述位于gltBD操纵子中的至少一个突变的拟无枝酸菌菌株进行的转化，所述拟无枝酸菌菌株将较少香草醛转化为香草酸。

第二十一实施例，根据第二十实施例所述的菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的一个或多个突变包含位于gltB基因中的至少一个突变。

第二十二实施例，根据第二十一实施例所述的菌株，其中所述一个或多个突变位于所述gltB基因中，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核酸序列。

第二十三实施例，根据第二十一实施例所述的菌株，其中所述一个或多个突变位于所述gltB基因中，所述gltB包括SEQ ID NO:1。

第二十四实施例，根据第二十实施例所述的菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变位于gltD基因中。

第二十五实施例，根据第二十四实施例所述的菌株，其中位于所述gltD基因中的所述一个或多个突变包括与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核酸序列。

第二十六实施例，根据第二十四实施例所述的菌株，其中位于所述gltD基因中的所述一个或多个突变包括核酸序列SEQ ID NO:3。

第二十七实施例，根据第二十实施例至第二十六实施例所述的菌株，其进一步包含位于内源基因echR中的突变，所述内源基因echR包括核酸序列SEQ ID NO:5。

第二十八实施例，根据第二十实施例至第二十七实施例中的一项所述的菌株，其中所述非天然存在的拟无枝酸菌菌株为重组菌株。

第二十九实施例，一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括培养第二十实施例至第二十八实施例中任一项的所述非天然存在的菌株，所述方法包含以下步骤：

a.在包括底物的适当培养基中培养所述非天然存在的拟无枝酸菌菌株，其中所述底物的至少一部分通过所述非天然存在的拟无枝酸菌菌株的活动转化为香草醛；以及

b.回收所产生的香草醛。

第三十实施例，一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括：在包含碳源的培养基中培养第二十实施例至第二十八实施例中任一项的所述非天然存在的拟无枝酸菌菌株；以及将阿魏酸进料到突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间。

本发明的其它特征和优点将在以下参考附图的详细描述中变得明显。

序列简要说明

表1简要描述了本文和所附序列表中公开的序列。如本领域的技术人员已知的，注意到原核生物使用交替的起始密码子，主要是GUG和UUG，其被翻译为甲酰甲硫氨酸。

附图说明

为了更好地理解本公开，可以参考附图。

图1：拟无枝酸菌内的香草醛的代谢通路。

图2：在使用阿魏酸作为原料的44小时生物转化过程结束时，野生型和突变型拟无枝酸菌菌株中的香草醛、香草酸和香草醇的水平。两种突变型菌株6-E11和12-H11具有位于gltBD操纵子和缺陷型香草酸利用通路中的突变。

图3：阿魏酸利用以及香草醛、香草酸和香草醇在野生型和6-E11拟无枝酸菌菌株中的产生的动力学。突变型菌株6-E11具有位于gltBD操纵子和缺陷型香草酸利用通路中的突变。

具体实施方式

如本文所使用的，除非内容另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”、和“所述(the)”包含复数指示物。

就说明书或权利要求中使用术语“包含”、“具有”等而言，此类术语旨在以类似于术语“包括”的方式包含在内，因为“包括”在权利要求中在被采用时被解释为作为过渡词。

如本文所用的，词语“示例性”是指用作实例、例子或说明。本文描述为“示例性”的任何实施例不一定被解释为优于或胜过其它实施例。

“细胞系统”是提供异位蛋白的表达的任何细胞。其包含细菌、酵母、植物细胞和动物细胞。其包含原核细胞和真核细胞。其还包含基于细胞组分，如核糖体的蛋白质的体外表达。

“编码序列”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指代编码特定氨基酸序列的DNA序列。

使细胞系统“生长”或“培养”细胞系统包含提供将允许细胞繁殖和分裂的适当的培养基。其还包含提供资源，使得细胞或细胞组分可以翻译和制造重组蛋白。

术语“互补”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于描述能够彼此杂交的核苷酸碱基之间的关系。例如，对于DNA，腺苷与胸腺嘧啶是互补的，并且胞嘧啶与鸟嘌呤是互补的。因此，主题技术还包含与所附序列表中报告的完整序列互补的分离的核酸片段以及那些基本上相似的核酸序列。

术语“核酸”和“核苷酸”将被赋予对本领域的普通技术人员来说其相应的普通和惯用的含义，并且不受限地用于指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。除非具体限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述已知类似物具有与参考核酸类似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸类似的方式代谢。除非另有说明，否则特定核酸序列还明确涵盖其保守修饰的变体或简并变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指明的序列。

术语“分离的”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且当在分离的核酸或分离的多肽的上下文中使用时，不受限地用于指通过人为手段，脱离其自然环境而存在，因此不是自然产物的核酸或多肽。分离的核酸或多肽可以以纯化形式存在或可以存在于非天然环境中，例如转基因宿主细胞中。

如本文所用，术语“温育(incubating)”和“温育(incubation)”是指将两种或更多种化学或生物实体(如化学化合物和酶)混合并允许其在有利于产生香草醛的条件下相互作用的过程。

术语“简并变体”是指具有与参考核酸序列相差一个或多个简并密码子取代的残基序列的核酸序列。简并密码子取代可以通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现。核酸序列及其所有简并变体将表达相同的氨基酸或多肽。

术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其相应的普通和惯用的含义；这三个术语有时可互换使用，并且不受限地用于指代氨基酸的聚合物或氨基酸类似物，无论其大小或功能如何。尽管“蛋白质”经常用于指代相对大的多肽，并且“肽”经常用于指代小的多肽，但是这些术语在本领域中的使用重叠且变化。除非另有说明，否则本文所用的术语“多肽”是指肽、多肽和蛋白质。当提及多核苷酸产物时，术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。因此，示例性多肽包含多核苷酸产物、天然存在的蛋白质、同源物、直系同源物、旁系同源物、片段和前述的其它等同物、变体和类似物。

术语“多肽片段”和“片段”当用于参考多肽时，应赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指其中相比于其参考多肽，氨基酸残基缺失，但其中其余的氨基酸序列通常与参考多肽中的对应位置相同的多肽。此类缺失可以发生在参考多肽的氨基末端或羧基末端处，或可替代地发生在两者处。

术语多肽或蛋白质的“功能片段”是指作为全长多肽或蛋白质的一部分的肽片段，并且具有与全长多肽或蛋白质基本上相同的生物学活性，或执行与全长多肽或蛋白质基本上相同的功能(例如，进行相同的酶促反应)。

可互换使用的术语“变体多肽”、“经修饰的氨基酸序列”或“经修饰的多肽”是指与参考多肽相差一个或多个氨基酸，例如一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加的氨基酸序列。一方面，变体是保留参考多肽的能力中的一些或全部能力的“功能变体”。

术语“功能变体”进一步包含保守取代的变体。术语“保守取代的变体”是指具有与参考肽相差一个或多个保守氨基酸取代并保持参考肽的活性中的一些或全部活性的氨基酸序列的肽。“保守氨基酸取代”是用功能上相似的残基取代氨基酸残基。保守取代的实例包含一个非极性(疏水)残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸被另一个残基取代；一个带电或极性(亲水)残基被另一个残基取代，如精氨酸与赖氨酸之间、谷氨酰胺与天冬酰胺之间、苏氨酸与丝氨酸之间的取代；一种碱性残基，如赖氨酸或精氨酸被另一个残基取代；或一个酸性残基，如天冬氨酸或谷氨酸被另一个残基取代；或一个芳香族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸被另一个残基取代。预期此类取代对蛋白质或多肽的表观分子量或等电点具有很小影响或没有影响。短语“保守取代的变体”还包含其中残基被化学衍生的残基替代的肽，条件是所产生的肽保持如本文所述的参考肽的活性中的一些或全部活性。

与主题技术的多肽结合的术语“变体”进一步包含具有与参考多肽的氨基酸序列至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以及甚至100％相同的氨基酸序列的功能活性多肽。

术语“同源”在其所有语法形式和拼写变体中是指具有“共同进化起源”的多核苷酸或多肽，包含来自超家族的多核苷酸或多肽和来自不同物种的同源多核苷酸或蛋白质之间的关系(Reeck等人,《细胞(Cell)》50:667,1987)。此类多核苷酸或多肽具有序列同源性，如通过其序列相似性所反映的，无论是在同一性百分比方面还是特定氨基酸或基序在保守位置处的存在方面都是如此。例如，两种同源多肽可以具有至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％以及甚至100％相同的氨基酸序列。

“合适的调节序列”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、编码序列内或编码序列下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包含启动子、翻译前导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。

“启动子”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。通常，编码序列位于启动子序列的3'。启动子可以全部来源于天然基因，或者由来源于在自然界中存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包括合成DNA区段。本领域的技术人员应理解，不同的启动子可以引导基因在不同组织或细胞类型中、或在不同发育阶段、或响应于不同环境条件的表达。使基因在大多数细胞类型中在大多数时间内表达的启动子通常被称为“组成启动子”。进一步认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切边界尚未完全限定，因此不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

术语“可操作地连接”是指单一核酸片段上的核酸序列缔合，使得一者的功能受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时(即，编码序列处于启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以按照有义或反义定向与调节序列可操作地连接。

如本文所用，术语“表达”将赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指代衍生自主题技术的核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定积累。“过表达”是指超过正常或未经转化的生物体中的产量水平的转基因或重组生物体中的基因产物的产量。

“转化”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指将多核苷酸转移到靶细胞中。转移的多核苷酸可以并入到靶细胞的基因组或染色体DNA中，从而产生遗传稳定的遗传，或者其可以独立于宿主染色体进行复制。含有经转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因的”或“经转化的”或“重组的”。

术语“经转化的”、“转基因的”和“重组的”在本文中与宿主细胞结合使用时，应赋予对于本领域的普通技术人员来说其相应普通和惯用的含义，并且不受限地用于指代异源核酸分子引入到其中的宿主生物体的细胞，如植物或微生物细胞。核酸分子可以稳定地整合到宿主细胞的基因组中，或者核酸分子可以以染色体外分子的形式存在。这种染色体外分子可以自动复制。经转化的细胞、组织或对象被理解为不仅涵盖转化过程的最终产物，而且还包含其转基因后代。

术语“重组”、“异源”和“外源”当在本文中与多核苷酸结合使用时，应赋予对于本领域的普通技术人员来说其普通和惯用的含义，并且不受限地用于指代源自特定宿主细胞外来的来源，或者如果来自相同来源，则由其原始形式进行修饰的多核苷酸(例如，DNA序列或基因)。因此，宿主细胞中的异源基因包含对特定宿主细胞来说是内源的但已通过使用例如定点诱变或其它重组技术修饰的基因。这些术语还包含天然存在的DNA序列的非天然存在的多个拷贝。因此，这些术语是指对于细胞来说外来的或对于细胞来说异源的，但位于宿主细胞内的其中元素通常不存在的位置中或形式中的DNA区段。

如本发明所定义的，包括源自另一生物体的外源核酸的生物体被视为是经基因修饰的生物体(GMO)。如果生物体在没有引入外源核酸分子的情况下进行基因修饰，则其可以被视为非基因修饰的生物体(非GMO)。非GMO可以具有位于其内源核酸中的一个或多个基因修饰，如位于基因的编码序列中的点突变或不具有任何外源核酸序列的基因的整个编码区的缺失。

类似地，术语“重组的”、“异源的”和“外源的”当在本文中与多肽或氨基酸序列结合使用时，是指源自对特定宿主细胞来说外来的来源，或者，如果来自同一来源的话，则是由其原始形式修饰的多肽或氨基酸序列。因此，重组DNA区段可以在宿主细胞中表达以产生重组多肽。

“蛋白质表达”是指基因表达后发生的蛋白质产生。所述蛋白质表达由DNA已被转录为信使RNA(mRNA)之后的阶段组成。然后mRNA被翻译成多肽链，所述多肽链最终折叠成蛋白质。DNA通过转染，即将核酸有意地引入到细胞中的过程，而存在于细胞中。所述术语通常用于真核细胞中的非病毒方法。此术语还可以指其它方法和细胞类型，但其它术语是优选的：“转化”更常用于描述细菌、包含植物细胞在内的非动物真核细胞中的非病毒DNA转移。在动物细胞中，转染是优选的术语，因为转化还用于指在这些细胞中发展成癌性状态(致癌作用)。转导通常用于描述病毒介导的DNA转移。转化、转导和病毒感染包含在本申请的转染定义中。

术语“质粒”、“载体”和“盒”将被赋予对于本领域的普通技术人员来说其相应的普通和惯用的含义，并且不受限制地用于指通常携带基因的额外染色体元件，所述基因是不是细胞的中央代谢的一部分，并且通常呈环状双链DNA分子的形式。此类元件可以是源自任何来源的单链或双链DNA或RNA的线性的或环状的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经连接或重组成能够将选定基因产物的启动子片段和DNA序列连同适当的3'非翻译的序列引入到细胞中的独特构造。“转化盒”是指含有外来基因并具有除了外来基因外促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”是指含有外来基因并且具有除了外来基因外允许增强所述基因在外来宿主中的表达的元件的特定载体。

如本文所用，“序列同一性”是指两个最佳比对的多核苷酸或肽序列在组分，例如核苷酸或氨基酸的整个比对窗口中不变的程度。测试序列和参考序列的所比对区段的“同一性分数”是两个所比对序列共享的相同组分的数量除以参考序列区段，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分中的组分总数。

如本文所使用的，术语“序列同一性百分比”或“同一性百分比”是指在两个序列进行最佳比对(在比较窗口上，适合的核苷酸插入、缺失或间隙总计小于参考序列的20％)时参考(“查询”)多核苷酸分子(或其互补链)与测试(“受试者”)多核苷酸分子(或其互补链)相比线性多核苷酸序列中相同的核苷酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域的技术人员众所周知的，并且可以通过工具，如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法来进行，并且优选地通过这些算法的计算机化实施方案，如可作为Wisconsin/>(马萨诸塞州柏林顿的Accelrys公司(Accelrys Inc.,Burlington,MA))的一部分获得的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA来进行。测试序列和参考序列的所比对区段的“同一性分数”是两个所比对序列共享的相同组分的数量除以参考序列区段，即整个参考序列或参考序列的较小定义部分中的组分的总数。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个多核苷酸序列的比较可以是与全长多核苷酸序列或其一部分，或与更长的多核苷酸序列的比较。出于本发明的目的，“同一性百分比”也可以使用用于翻译的核苷酸序列的BLASTX 2.0版和用于多核苷酸序列的BLASTN 2.0版来确定。/>

序列同一性百分比优选地使用序列分析软件包^TM(10版；威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机集团公司(Genetics Computer Group,Inc.,Madison,WI))的“Best Fit”或“Gap”程序来确定。“Gap”利用Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,《分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)》,48:443-453,1970)以找到两个序列的将匹配数最大化并将间隙数最小化的比对。“Best Fit”使用Smith和Waterman的局部同源性算法(Smith和Waterman,《应用数学进展(Advances in Applied Mathematics)》,2:482-489,1981；Smith等人,《核酸研究(Nucleic Acids Research)》,11:2205-2220,1983)来进行在两个序列之间具有相似性的最佳区段的最佳比对，并且插入间隙以使匹配数最大化。同一性百分比最优选地使用“Best Fit”程序来确定。

用于确定序列同一性的有用方法还公开在基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中，所述基本局部比对搜索工具程序可从马里兰州贝塞斯的美国国立卫生研究院美国国家医学图书馆(National Library of Medicine,National Institute of Health,Bethesda,Md.)的国家生物技术信息中心(National Center BiotechnologyInformation，NCBI)20894获得；参见《BLAST手册(BLAST Manual)》,Altschul等人,NCBI,NLM,NIH；Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-410(1990)；2.0版或更高版本的BLAST程序允许向比对中引入间隙(缺失和插入)；对于肽序列，BLASTX可以用于确定序列同一性；并且，对于多核苷酸序列，BLASTN可以用于确定序列同一性。

如本文所使用的，术语“相当大的序列同一性百分比”是指序列同一性百分比为至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、或甚至更大的序列同一性，如约98％或约99％序列同一性。因此，本发明的一个实施例是与本文所述的多核苷酸序列具有至少约70％序列同一性、至少约80％序列同一性、至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性或甚至更高的序列同一性，如约98％或约99％序列同一性的多核苷酸分子。具有本发明的活性基因的多核苷酸分子能够指导香草醛的产生并且与本文提供的多核苷酸序列具有相当大的序列同一性百分比并且涵盖在本发明的范围内。

同一性是在序列比对(所述比对可以使用仅序列信息或结构信息或其它某个信息来完成，但其通常基于单独的序列信息)后一对序列之间相同的氨基酸的分数，并且相似性是基于使用某个相似性矩阵的比对分配的评分。相似性指数可以是以下中的任一者：BLOSUM62、PAM250或GONNET，或本领域的技术人员用于蛋白质的序列比对的任何矩阵。

同一性是两个子序列之间的对应程度(序列之间没有间隙)。25％或更高的同一性意味着功能的相似性，而18-25％意味着结构或功能的相似性。请记住，两个完全不相关的或随机的序列(大于100个残基)的同一性可能高于20％。相似性是两个序列进行比较时的相似程度。这取决于序列同一性。

本领域的普通技术人员将了解可用于制备表达载体的分子生物学技术。用于并入到主题技术的表达载体中的多核苷酸，如上所述，可以通过常规技术，如聚合酶链反应(PCR)来制备。在分子克隆中，载体是用作媒剂以将外来遗传物质人工地携带到另一个细胞中，在所述另一个细胞中，其可以进行复制和/或表达的DNA分子(例如质粒、粘粒、λ噬菌体)。含有外来DNA的载体被视为是重组DNA。载体的四种主要类型是质粒、病毒载体、粘粒和人工染色体。其中，最常用的载体是质粒。所有经工程化的载体的共同点是复制起点、多克隆位点和可选择标志物。

已经开发了许多分子生物学技术以将DNA与载体通过互补粘性末端可操作地连接。在一个实施例中，可以将互补均聚物束添加到要插入到载体DNA中的核酸分子中。然后载体和核酸分子通过互补均聚物尾之间的氢键合连接，以形成重组DNA分子。

在一替代性实施例中，使用含有所提供的一个或多个限制性位点的合成接头以将主题技术的多核苷酸与表达载体可操作地连接。在一实施例中，多核苷酸通过限制性核酸内切酶消化产生。在一实施例中，核酸分子用噬菌体T4 DNA聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶I处理，这些酶是去除具有其3'-5'外切核酸酶活性的突出的3'单链末端，并且填充具有其聚合活性的凹陷的3'末端，由此产生平末端DNA区段的酶。然后，在存在能够催化平末端DNA分子连接的酶，如噬菌体T4 DNA连接酶的情况下，将平末端区段与大量摩尔过量的接头分子一起温育。因此，反应的产物是在其末端处携带聚合物接头序列的多核苷酸。然后将这些多核苷酸用适当的限制性酶切割并且与表达载体连接，所述表达载体已经用产生可与多核苷酸的末端相容的末端的酶切割。

可替代地，可以采用具有不依赖连接的克隆(LIC)位点的载体。然后可以在不进行限制性消化或连接的情况下，将所需的PCR扩增的多核苷酸克隆到LIC载体中(Aslanidis和de Jong,《核酸研究》18 6069-74,(1990)；Haun等人,《生物技术(Biotechniques)》13,515-18(1992)，所述文献中的每一个通过引用并入本文)。

在一实施例中，为了分离和/或修饰所关注的多核苷酸以插入到所选质粒中，使用PCR是合适的。用于序列的PCR制备的适当引物可以被设计成分离核酸分子的所需编码区，添加限制性核酸内切酶或LIC位点，并且将编码区放置在期望的阅读框中。

在一实施例中，使用适合于PCR的寡核苷酸引物制备用于并入到主题技术的表达载体中的多核苷酸。将编码区扩增，同时将引物本身并入到经扩增的序列产物中。在一实施例中，扩增引物含有限制性核酸内切酶识别位点，所述限制性核酸内切酶识别位点允许将经扩增的序列产物克隆到适当的载体中。

表达载体可以通过常规转化或转染技术引入到微生物宿主细胞中。用主题技术的表达载体转化合适的细胞是通过本领域已知的方法完成的，并且通常取决于载体和细胞的类型两者。合适的技术包含磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、化学穿孔或电穿孔。

成功转化的细胞，即含有表达载体的那些细胞，可以通过本领域众所周知的技术来鉴定。例如，可以培养用主题技术的表达载体转染的细胞以产生本文所述的多肽。可以通过本领域熟知的技术检查细胞中表达载体DNA的存在。

宿主细胞可以含有先前描述的表达载体的单个拷贝，或者可替代地，表达载体的多个拷贝。

香草醛的发酵产生

阿魏酸在拟无枝酸菌内通过由两种酶，即由fcs基因编码的阿魏酰辅酶A(CoA)合成酶和由ech基因编码的烯酰CoA水合酶/醛缩酶介导的非氧化脱乙酰通路代谢成香草醛。两种基因(ech和fcs)位于单个操纵子内。野生型和突变型拟无枝酸菌菌株已在生物转化过程中用于使用阿魏酸作为原料来产生香草醛。

与拟无枝酸菌ATCC 39116用于将阿魏酸生物转化为香草醛的用途相关的一个主要挑战是同时由vdh基因编码的香草醛脱氢酶Vdh将香草醛降解为香草酸。由于香草醛脱氢酶对香草醛的作用，使用阿魏酸作为原料的生物转化过程中的香草醛的产率显着降低。已经努力通过vdh基因的基因操纵使香草醛脱氢酶在功能上失活。本发明提供了新型突变型拟无枝酸菌菌株，所述新型突变型菌株表现出在不直接缺失或灭活vdh基因的情况下，香草醛向香草酸的降解显著减少。本发明的突变型拟无枝酸菌菌株是使用化学诱变获得的，并且通过使用全基因组测序鉴定了赋予香草醛降解为香草酸减少的表型的基因突变的性质。

本发明提供了一种涉及用于提高编码参与香草酸利用通路的蛋白质(例如，酶和调节蛋白)的基因中的诱变频率的诱变化学品的方案。

许多不同的化学诱变剂是本领域众所周知的。这些化学诱变剂中的任何一种化学诱变剂都可以在本发明中使用以提高编码参与香草酸利用通路的蛋白质(例如，酶和/或调节蛋白)的一种或多种基因的突变频率。化学诱变剂的一种类别包含类似于DNA的四种碱基之一的碱基类似物。掺入这种碱基类似物将引起稳定突变。氧化亚氮，即另一种诱变化学品，可以通过氧化脱氨将碱基的氨基转化为酮基。脱氨(去除氨基)的频率的顺序是腺嘌呤>胞嘧啶>鸟嘌呤。烷化剂是可用于将烷基添加到DNA的鸟嘌呤和腺嘌呤残基的氢键合氧中的另一组诱变剂。由于烷化，电离的可能性随着配对错误的引入而增加。烷化剂的一些广泛使用的实例包含硫酸二甲酯、甲磺酸乙酯、乙磺酸乙酯和甲磺酸甲酯。还可以使用某些染料，如吖啶橙、原黄素和吖啶黄素，所述染料是尺寸与嘌呤嘧啶对的尺寸相似的三环分子。在水溶液中，这些染料可以将其自身通过被称为嵌入的过程在相邻对中的碱基之间插入到DNA中。这些嵌入剂使DNA扭曲，从而在DNA分子复制后产生缺失或插入。由于嵌入剂引起的此类缺失或插入，可能发生移码突变。任何前述类别的诱变剂都可以用于本发明。

一方面，具有期望的表型(在这种情况下，香草醛降解减少)的突变型菌株可以按照本领域众所周知的程序通过使产生香草醛的生物体，如拟无枝酸菌的孢子经受化学突变原来获得。选择具有影响香草醛降解通路的基因突变的突变体。具体地，选定突变体显示出缺陷型香草酸利用通路。因为香草醛的降解产生了用于拟无枝酸菌细胞的能量源，因此筛选当香草醛是唯一碳源时不再可以生长的突变体将揭示影响香草醛降解通路的突变。另外，由于香草醇被拟无枝酸菌细胞转化为香草醛，并且相比于香草醛，香草醇对拟无枝酸菌细胞的毒性较小，因此筛选还可以通过使用香草醇代替香草醛作为唯一碳源来进行。另外，本发明的筛选方法还包括将抗生素，如盘尼西林添加到液体培养基中(这被称为盘尼西林富集技术)。盘尼西林富集技术利用了这样的事实，即盘尼西林可以通过抑制对细胞壁的结构完整性来说至关重要的肽聚糖聚合物的交联来仅杀死生长中的细胞。因为具有位于香草酸利用通路中的突变的拟无枝酸菌细胞将不能够在含有香草醛或香草醇作为唯一能量源的生长培养基中生长并经历细胞分裂，因此所述拟无枝酸菌细胞将在盘尼西林处理后存活下来。同时，正在生长并且以香草醛或香草醇为进料的野生型拟无枝酸菌细胞被盘尼西林杀死。将盘尼西林处理后存活的细胞铺板，并且提取来自单独菌落的样品并且使用阿魏酸生物转化测定对所述样品进行筛选，以鉴定具有期望的表型；即，与野生型菌株相比，香草醛与香草酸的比率相对增加的突变型菌株。在优选实施例中，将存活的细胞铺板在含有盘尼西林和香草醛或香草醇的同一培养基中，以避免营养缺陷型突变体。种

在选择了具有缺陷香草酸利用通路的突变型菌株后，使用全基因组测序鉴定导致观察到的表型的突变的性质。在本发明中，发现位于gltBD操纵子中的突变与观察到的表型相关。更具体地，发现位于包括SEQ ID NO:1的核酸序列的gltB基因中的突变和/或位于包括SEQ ID NO:3的核酸序列的gltD基因中的突变与观察到的香草醛向香草酸的降解减少的表型相关。位于gltB基因和/或gltD基因中的一个或多个突变可以选自由以下组成的组：缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变及其任何组合，其中所述突变能够引起香草酸利用通路的功能性失活，从而使香草醛向香草酸的降解减少。

可以通过将经鉴定的突变引入到野生型拟无枝酸菌细胞中并证明所引入的突变确实赋予了期望的表型来验证经鉴定的突变在诱导观察到的表型中的作用。将经鉴定的突变引入到野生型拟无枝酸菌细胞中可以使用微生物遗传学领域中众所周知的一种或多种技术进行。在本发明的一优选方面，将位于gltBD操纵子中的经鉴定的突变引入到野生型拟无枝酸菌细胞中是使用使得出于维持非GMO的状态的目的未将外源核酸引入到拟无枝酸菌细胞中的技术进行的。

在选择用于减少香草醛向香草酸的降解的突变型拟无枝酸菌菌株后，通过提高使用阿魏酸作为底物来产生香草醛的生物转化效率可以进一步提高此菌株的性能。野生型拟无枝酸菌菌株中的阿魏酸向香草醛的生物转化通常表现出4-5小时的滞后时间段。此滞后时间段是由于对由fcs基因编码的阿魏酰辅酶A(CoA)合成酶和由ech基因编码的烯酰CoA水合酶醛缩酶的表达的抑制造成的。这两种基因的受抑制的表达受由echR基因(SEQ ID NO:5)编码的阻遏蛋白EchR(SEQ ID NO:6)调节的。对ech和fcs基因的表达的抑制可以通过引入位于echR基因中的适当突变，从而引起EchR阻遏蛋白的功能性失活来克服。使用本领域众所周知的技术，可以引入可以用于功能性灭活EchR阻遏蛋白的一个或多个突变，所述一个或多个突变包含但不限于缺失、插入、移码突变、启动子突变、错义突变、无义突变、切片突变、点突变或其任何组合。在一优选实施例中，导致EchR阻遏蛋白的功能性失活的echR基因的突变是使用微生物遗传学领域众所周知的一种或多种技术进行的，所述一种或多种技术将引起位于echR基因中的期望的突变，而不会不将任何外源核酸序列引入到选定突变型拟无枝酸菌菌株中，使得非GMO的状态得以维持。

已经报告了，大肠杆菌中参与将苯甲醛转化为苯甲醇的酶还负责将香草醛还原为香草醇。从大肠杆菌中缺失yeaE、dkgA、yqhC、yqhD、yahK和yjgB消除了香草醛的进一步还原。可以鉴定突变型拟无枝酸菌菌株中的这些基因的同源物。这些基因中的一种或多种基因的失活将导致香草醇产生减少或消除，从而使香草醛产率提高增加。

在本发明的一优选实施例中，对本发明的突变型拟无枝酸菌细胞的任何进一步基因修饰可以使用微生物遗传学领域中众所周知的CRISPAR/CAS系统完成(参见例如美国专利申请公开2016/0298096–CRISPR-CAS系统(US Patent Application Publication 2016/0298096–CRISPR-CAS System),《材料和方法(Materials and Methods)》,Wang等人(2016),利用CRISPR-Cas9进行的细菌基因组编辑：以拜氏梭菌中的缺失、整合、单核苷酸修饰和期望的“干净”突变体选择为例(Bacterial Genome Editing with CRISPR-Cas9:Deletion,Integration,Single Nucleotide Modification,and Desirable“Clean”Mutant Selection in Clostridium beijerinckii as an Example),《ACS合成生物学(ACS Synth.Biol.)》DOI:10.1021/acssynbio.6b00060；Huang等人(2016),对藻青菌蓝藻PCC 7942中的基因调节和琥珀酸盐产生的CRISPR干扰(CRISPRi)(CRISPR interference(CRISPRi)for gene regulation and succinate production in cyanobacteriumS.elongatus PCC 7942),《微生物细胞工厂(Microb Cell Fact)》,15:196；Kuivanen等人(2016),针对半乳糖二酸产生对黑曲霉进行工程化：通过使用RNA测序和CRISPR/Cas9消除半乳糖二酸代谢(Engineering Aspergillus niger for galactaric acid production:elimination of galactaric acid catabolism by using RNAsequencing and CRISPR/Cas9),《微生物细胞工厂》,15:210；Peng等人(2017),使用CRISPR/Cas9系统在谷氨酸棒状杆菌中进行高效基因编辑(Efficient gene editing in Corynebacterium glutamicumusing the CRISPR/Cas9 system),《微生物细胞工厂》,16:201；Gorter de Vries等人(2017),较大酵母巴斯德酵母中的CRISPR-Cas9介导的基因缺失(CRISPR-Cas9 mediatedgene deletions in lager yeast Saccharomyces pastorianus),《微生物细胞工厂》,16:222；Wu等人(2019),用于开发细菌中的基于CRISPR的基因编辑方法的策略(Strategiesfor Developing CRISPR-Based Gene Editing Methods in Bacteria),《小方法(SmallMethods)》,DOI:10.1002/smtd.201900560；Ramachandran G和Bikard D(2019),编辑微生物组：CRISPR方式(Editing the microbiome the CRISPR way),《英国皇家学会哲学学报B(Phil.Trans.R.Soc.B)》,374:20180103http://dx.doi.org/10.1098/rstb.2018.0103)。

在本发明的一些实施例中，可以使用反义RNA技术或RNAi技术使功能酶失活(参见例如Xu等人(2018),反义RNA：基因研究的新宠(Antisense RNA:the new favorite ingenetic research),《生物医学与生物技术(Biomed&Biotechnol.)》,19(10):739-749；Zheng等人(2019),用于代谢工程化的微生物CRISPRi和CRISPRa系统(Microbial CRISPRiand CRISPRa Systems for Metabolic Engineering),《生物技术与生物过程工程(Biotechnology and Bioprocess Engineering)》,24:579–591。然而，本着本发明精神，对于在阿魏酸向香草醛的生物转化中使用非GMO菌株，需要确保使用反义RNA技术和RNAi技术以灭活功能蛋白不将任何外源核酸引入到针对由阿魏酸以商业规模产生香草醛并且维持非GMO状态选择的突变型拟无枝酸菌菌株中。

可以在生物反应器中制备和灭菌培养物肉汤。然后可以将根据本发明的经工程化的宿主菌株接种到培养物肉汤中以启动生长期。生长期的适当持续时间可以为约5-40小时，优选地为约10-35小时，并且最优选地为约10-20小时。

生长期结束后，可以将底物阿魏酸进料到培养物。底物进料的合适的量可以为0.1-40g/L发酵肉汤，优选地为约0.3-30g/L。底物可以以固体材料或以水溶液或悬浮液的形式进料。底物的总量可以在一个步骤中进料、在两个或更多个进料步骤中进料或连续地进料。

使用本发明中开发的拟无枝酸菌菌株的生物转化期开始于底物进料的开始，并且可以持续约5-50小时，优选地10-40小时，并且最优选地15-30小时，直到所有底物都转化为产物和副产物位置。与显示出香草醛向香草酸的降解显著的野生型拟无枝酸菌细胞不同，本发明中开发的拟无枝酸菌菌株在整个香草醛产生过程中几乎没有显示出香草酸积累。例如，根据本发明的突变型拟无枝酸菌菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到突变型菌株后超过24小时，积累少于0.5g香草酸/升生长培养基。在另一实施例中，根据本发明的突变型拟无枝酸菌菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时，积累少于0.25g香草酸/升生长培养基。在又另一实施例中，根据本发明的突变型拟无枝酸菌菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时，积累少于0.5g香草酸/升生长培养基。在另一实施例中，本发明的突变型菌株可以显示出，在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时，积累少于0.25g香草酸/升生长培养基。在其中突变型菌株进一步包括位于echR基因中的突变的实施例中，突变型菌株还将能够在引入阿魏酸的情况下在不显示任何滞后时间段的情况立即产生香草醛。

在终止的生物转化期之后，可以通过任何众所周知的方法，如离心或膜过滤等将生物质与发酵肉汤分离以获得不含细胞的发酵肉汤。

可以使用例如与水不混溶的有机溶剂、植物油或任何固体萃取剂，例如树脂，优选地，中性树脂，将萃取相添加到发酵肉汤中。发酵肉汤可以进一步灭菌或巴氏杀菌。在一些实施例中，发酵肉汤可以浓缩。从发酵肉汤中，可以使用例如连续液-液萃取工艺或分批萃取工艺选择性地萃取香草醛。

本发明的优点包含，除其它外，本发明中开发的拟无枝酸菌菌株启动阿魏酸向香草醛的生物转化，没有任何滞后时间段，以缩短生产时间段的能力。这高度简化了生产过程，使过程高效且经济，由此允许扩大到工业生产水平。

本领域的技术人员将认识到，通过本文所述的方法产生的香草醛组合物可以进一步纯化并且与如上所述的芳香和/或调味可消耗产品以及营养用膳食补充剂、药物组合物和药妆品混合以及在医药产品中混合。

在考虑以下非限制性实例后将更充分地理解本公开。应当理解，这些实例虽然指示了主题技术的优选实施例，但仅以说明的方式给出。通过以上讨论和这些实例，本领域的技术人员可以确定主题技术的必要特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对主题技术进行各种改变和修改，以使本发明适于各种用途和条件。

实例

细菌菌株、质粒和培养条件。

从英杰公司(Invitrogen)购买大肠杆菌菌株DH5a和BL21(DE3)。从EMD密理博公司(EMD Millipore，美国马萨诸塞州比尔里卡(Billerica,MA,USA))购买质粒pET28a，并且将其用于基因克隆。

DNA操纵。

所有DNA操纵根据标准程序进行。从纽英伦生物技术公司(New England Biolabs)购买限制性酶，即T4 DNA连接酶。根据制造商的指导，使用纽英伦生物技术公司的PhusionPCR系统进行所有PCR反应。

实例1

突变型菌株的化学诱变和筛选

将拟无枝酸菌ATCC 39116的单细胞化孢子用突变原甲磺酸甲酯处理，然后在具有作为唯一能量源的香草醇和300微克/毫升(μg/ml)盘尼西林的液体培养基中生长24小时，并且铺板在同一培养基上以避免营养缺陷型突变体。挑选单个菌落并且在阿魏酸生物转化测定中使用HPLC对其进行测试，以评估香草醛水平。在测试的1414个菌落中，两种突变型菌株(6-E11和12-H11)具有期望的香草醛降解减少的表型(图2)。对突变型菌株6-E11的进一步分析确立了用于产生香草醛、香草酸和香草醇的动力学谱。突变型菌株6-E11的香草醛产生没有显示出任何滞后时间段，如在野生型拟无枝酸菌菌株中观察到的。如图3所示，突变型菌株6-E11在野生型拟无枝酸菌菌株之前大约4-5小时开始将阿魏酸转化为香草醛。与先前报告的没有表现出没有任何滞后时间段的香草醛产生的vdh突变型菌株相比，根据本发明的突变型菌株由此赋予香草醛向香草酸的降解减少的优点以及没有滞后时间段的香草醛产生的优点两者。

实例4

突变型基因的鉴定

利用两种选定的突变型菌株进行了全基因组测序，以鉴定引起观察到的香草醛向香草酸降解减少的表型的突变。全基因组测序揭示了，这两种突变型菌株具有独立的突变，但两者都位于gltBD操纵子中的编码NADPH依赖性谷氨酸合酶复合物的基因中(基因座标签AMY39116_RS0321350和AMY39116_RS0321345)。这些突变位于NADPH依赖性谷氨酸合酶复合物的两个亚基中，所述复合物催化以下反应：L-谷氨酰胺+2-酮戊二酸+NADPH+H⁺→L-谷氨酸+NADP⁺。突变型菌株6-E11在gltD基因中在bp 1161后含有2bp插入，从而产生移码并且截断45个另外的氨基酸残基后的蛋白质。突变型菌株12-H11在gltB基因中在bp 3148之后含有2bp插入，从而产生移码并且截断七个另外的氨基酸后的蛋白质。

实例5

HPLC分析

使用Vanquish Ultimate 3000系统对香草醛进行HPLC分析。所述化合物是通过其保留时间以及对应的谱鉴定的，所述谱是用系统中的二极管阵列检测器鉴定的。

实例6

阿魏酸生物转化为香草醛

使野生型和突变型拟无枝酸菌菌株在10mL种子培养基(酵母萃取物12g/L、葡萄糖10g/L、MgSO₄ 0.2g/L、K₂HPO₄ 7.5g/L、KH₂PO₄ 1g/L，pH 7.2)中生长至饱和在37℃下持续24小时，1:20稀释到10mL转化培养基(酵母萃取物5g/L、葡萄糖8g/L、麦芽萃取物10g/L、MgSO₄0.2g/L)中，在37℃下持续24小时，并且用阿魏酸作为底物进料。在指定时间通过将细菌培养物收集到甲醇中提取样品以供HPLC分析。

参考图2，可以看出，即使在44小时的转化时间之后，与没有保留任何香草醛的野生型(WT)菌株相比，根据本发明的突变型菌株6-E11和12-H11显示出非常少的香草醛降解。44小时的转化时间之后，似乎野生型菌株中的所有香草醛都已降解为香草酸。更具体地，在44小时的转化时间后，野生型菌株中的香草酸的积累为大约3g/L。相比之下，突变型菌株6-E11保留了>3.5g/L香草醛，并且积累了<0.25g/L香草酸。类似地，突变型菌株12-H11保留了>3.0g/L香草醛，并且积累了<0.25g/L香草酸。

参考图3，可以看出，13g/L阿魏酸在2mL细胞中转化24小时后，突变型菌株6-E11比WT菌株产生多得多的香草醛(2.93g/L对0g/L)和更少的香草酸(0.130g/L对1.16g/L)。另外，突变型菌株6-E11也比WT菌株早4-5小时开始香草醛产生。

本申请涉及各种已颁发的专利、已公布的专利申请、期刊文章和其它出版物，所有这些都通过引用并入本文。本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题通过参考而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。如果任何并入的参考文献与本说明书之间存在冲突，则以本说明书为准。此外，落入现有技术范围内的本公开的任何特定实施例可被明确排除在权利要求中的任何一项或多项权利要求之外。因为这样的实施例被视为是本领域的普通技术人员已知的，所以即使没有在本文中明确阐述排除，其也可以被排除。本公开的任何特定实施例可以出于任何原因从任何权利要求中排除，无论是否与现有技术的存在相关。

仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或者能够确定本文描述的具体实施例的许多等效物。本文描述的本实施例的范围无意限于以上描述，而是如所附权利要求所述。本领域的普通技术人员将理解，在不背离如以下权利要求所限定的本公开的精神或范围的情况下，可以对此描述作出各种改变和修改。

所关注的序列

SEQ ID NO: 1：DNA；gltB的核酸序列

ATGATCTTCTCCGCCAACCCGGGCAAGCAGGGCCTGTACGACCCTGCCATGGAGCAGGATTCCTGCGGTGTGGCGATGGTGGCCGACATTCAGGGCCGGCGCACGCACGCCATCGTCACGGACGGGCTGACGGCGCTGATCAACCTGGACCACCGGGGCGCCGCGGGCGCCGAACCGACTTCCGGCGACGGCGCCGGGATCCTCGTGCAGCTGCCCGACCAGCTGCTCCGCGAGGAAGCCGGCTTCGAGCTGCCCGAACCCGACGCGCAGGGCCACCACCGCTACGCGGCCGGCATCGCGTTCCTGCCCGCCGAGGAGGAGGCGCGCGGCAAGGCCGTGGCGCTGATCGAACGCCTCGCCGACGAGGAGAGCCTCGAGGTGCTGGGCTGGCGCGAGGTCCCGGTCGACGCCGACGGGGCGGACATCGGCCCCACCGCGCGTTCGGTGATGCCGCACTTCGCCATGCTGTTCGTGGCGGGCAGGCCGGACGCCGAGGGCGTGCGGCCCTCCGGCCTCGCGCTGGACCGGCTCACCTTCTGCCTGCGCAAGCGCGTCGAGCACGAGAGCGTCGTGGCCGAGTGCGGCACGTACTTCCCGTCGCTGTCCTCGCGCACCTTGGTCTACAAGGGAATGCTCACGCCCGAGCAGCTCCCCGCGTTCTTCGGCGACCTGCGCGACCCGCGGCTCACCAGCGCGATCGCACTGGTGCACAGCCGCTTTTCCACCAACACGTTCCCGTCGTGGCCGCTGGCGCACCCGTTCCGGTTCGTCGCGCACAACGGTGAGATCAACACGATCCGCGGCAACCGCAACCGCATGCGGGCCCGCGAGGCGCTGCTCGAATCGGGCCTGATCCCGGGCGACCTGACCCGGCTGTACCCGATCTGCTCGCCGGAGGCGTCCGACTCGGCGTCCTTCGACGAGGTGCTCGAACTGCTGCACCTGGGCGGTCGCAGCCTGCCGCACGCGGTGCTGATGATGATCCCGGAGGCGTGGGAGAACCACTCGACCATGGACGCGCAGCGCCGCGCGTTCTACCAGTTCCACGCCAGCCTGATGGAGCCGTGGGACGGCCCCGCGTGCGTCACCTTCACCGACGGCACGCTCGTCGGCGCGGTGCTGGACCGCAACGGCCTGCGCCCGTGCCGCTGGTGGCGCACCGCCGACGACCGCGTCGTGCTGGCCAGCGAGGCCGGCGTCCTGGACGTGCCGCCGGACCAGGTGGTCGCCAAGGGCCGCCTCAAGCCGGGCCGCATGTTCCTGGTGGACACCGAGGCAGGCCGCATCGTCGCCGACGACGAGGTCAAGTCGGAGCTGGCGAAGCAGCACCCGTACGAGGAGTGGCTGCACGCCGGCCTGCTGCAGCTGGCCGACCTGCAGGACCGCGACCACGTCACGCAGAGCCACGACTCGGTGCTGCGCCGCCAGCTCGCCTTCGGCTACTCCGAGGAGGAGCTGAAGATCCTGCTCGCGCCGATGGCCGAGAAGGGCGCCGAGCCGCTGGGCTCGATGGGCACCGACACCCCGCCCGCCGTGCTGTCCAAGCGCTCGCGGCAGCTCTACGACTACTTCAAACAGGCCTTCGCCCAGGTGACCAACCCGCCGCTGGACGCGATCCGCGAGGAGCTGGTCACCTCGATGAGCCGGATCATGGGTCCCGAGCGCAACCTGCTCGACCCTGGCCCGGCCTCGTGCCGGCACATCCAGCTGCCGTACCCGGTCATCGACAACGACGAGCTGGCCAAGCTCATCCACATCAACGACGACGGTGACCTGCCCGGCTTCGCCTGCACCGTCCTGTCCGGACTGTTCGAAGTGGACGGCGGCGGCAAGGCGCTGGCGGAGGCGATCGAGCGGGTGCGCCGCGAGGCGTCCGAGGCGATCGCGGCGGGCGCGCGCACGCTCGTGCTGTCCGACCGGGACTCCGACCACAAGATGGCGCCGATCCCGTCGCTGCTGCTGGTTTCCGCGGTGCACCACCACCTGGTGCGCACCAAGGAGCGGCTGCGCGTCGCGCTCGTCGTCGAGACCGGTGACGCCCGCGAGGTGCACCACATCGCGCTGCTGCTCGGTTACGGCGCGGCCGCGGTGAACCCGTACCTGGCCTTCGAGACGATCGAGGACATGATCGCGCAGGGCGCGATCACCGGCATCGAGCCGCGCAAGGCCGTGCGCAACTACGTCAACGCGCTCGTCAAGGGCGTCCTGAAGATCATGTCCAAGATGGGCATCTCGACCGTCGGCGCCTACACCGCGGCGCAGGTGTTCGAGTCCTTCGGGCTGTCGCAGGAACTGCTCGACGAGTACTTCACCGGCACGGTGTCCAAGCTCGGCGGCGTCGGTCTCGACGTGCTCGCCGAGGAGGTCGCCGTCCGGCACCGCCGGGCGTACCCGGACAACCCCACCGACCGGGTGCACCGCCGCCTGGACAGCGGCGGCGAGTACGCCTACCGCCGCGAGGGCGAGCTGCACCTGTTCACCCCGGAGACCGTGTTCCTGCTGCAGCACGCCAGCAAGACGCGCCGCGACGAGGTGTACCGCAAGTACACCGAAGAGGTGCACCGCCTGTCCCGCGAGGGCGGTGCGCTGCGCGGGTTGTTCAAGTTCCGCAAGGAAGGCCGCGCCCCGGTGCCGATCGACGAGGTCGAGTCGGTCGAGTCGATCTGCAAGCGGTTCAACACCGGCGCGATGTCCTACGGTTCGATCTCGGCCGAGGCGCACCAGACGCTCGCGATCGCGATGAACCGCATCGGCGGCCGCTCCAACACCGGTGAGGGCGGCGAGGACCCGGAGCGGCTCTACGACCCCGAGCGGCGCAGCGCGATCAAGCAGGTCGCCAGCGGCTGGTTCGGCGTGACGAGCGAGTACCTGGTCAACGCCGACGACATCCAGATCAAGATGGCGCAGGGCGCCAAGCCCGGCGAGGGCGGCCAGCTGCCGCCGAACAAGGTGTACCCGTGGATCGCGCGCACCCGGCACTCCACGCCGGGCGTCGGCCTCATCTCGCCGCCGCCGCACCACGACATCTACTCGATCGAGGACCTGGCGCAGCTGATCCACGACCTGAAGAACGCCAACGAGCAGGCCCGCATCCACGTGAAGCTGGTCAGCTCGCTCGGCGTCGGCACGGTCGCGGCCGGCGTGTCCAAGGCGCACGCGGACGTCGTGCTGATCTCCGGCCACGACGGCGGCACCGGCGCCTCGCCGCTGAACTCGCTCAAGCACGCGGGCACGCCGTGGGAGATCGGCCTTGCCGAGACCCAGCAGACCCTGATGCTGAACGGGCTGCGCGACCGCATCACCGTGCAGGTCGACGGCGCGATGAAGACCGGCCGCGACGTCGTGGTCGCCGCGCTGCTCGGCGCCGAGGAGTACGGCTTCGCGACCGCGCCGCTGATCGTGGCCGGCTGCATCATGATGCGCGTCTGCCACCTCGACACCTGCCCCGTCGGTGTCGCCACCCAGAGCCCGGAGCTGCGCAAGCGCTACACCGGGCAGGCCGAGCACGTGGTGAACTACTTCCGGTTCGTCGCGCAGGAGGTCCGGGAACTGCTGGCGGAGCTGGGTTTCCGCACCCTGGACGAGGCGATCGGCCGGGCCGACGTGCTGGACACCGACGACGCCGTCGACCACTGGAAGGCCAGCGGCCTGGACCTGTCGCCGATCTTCCAGATGCCGACCGACACCCCGTACGGCGGCGCCCGGCGCAAGATCCGCGAGCAGGACCACGGCCTCGAGCACGCTCTGGACCGCACGCTGATCCAGTTGTCCGAGGCGGCGCTGGAGGACGCGCACCCGGTCCGGCTGGAACTGCCGGTGCGCAACGTCAATCGCACCGTCGGCACACTGCTGGGCTCGGAGATCACCCGCCGCTACGGCGGGGAGGGCCTGCCCGACGGCACGATCCACATCCGGCTCACCGGGTCGGCGGGGCAGTCGCTGGGCGCGTTCCTGCCGCGCGGCGTCACGCTGGAGATGGTGGGCGACGCCAACGACTACGTCGGCAAGGGCCTGTCCGGCGGCCGCATCATCGTGCGGCCGCACCCGGACGCGACGTTCGCCGCTGAACGTCAGGTCATCGCCGGCAACACGCTGGCCTACGGCGCCACCGCGGGGGAGATGTTCCTGCGCGGGCATGTGGGCGAGCGGTTCTGCGTACGCAACTCGGGCGCCACCGTCGTCGCCGAGGGCGTGGGCGACCACGCCTTCGAATACATGACCGGTGGCCGTGCCGTGGTGCTCGGTCCGACCGGCCGCAACCTCGCCGCGGGCATGTCCGGCGGTATCGGCTACGTCCTCGACCTCGACCAGGGCAGCGTCAACCGCGAGATGGTCGAGCTGCTCCCGCTCGAGCCCGAGGATCTGAACTGGTTGAAGGACATCGTGACCCGTCACCACGAACTCACCCGCTCGGCGGTCGCCGCCTCGCTGCTCGGCGATTGGCCGCGCCGGTCGGCGAGCTTCACGAAGGTCATGCCGCGCGACTACAAGCGCGTGCTGGAGGCGACCAAGGCCGCGAAGGCCGCGGGCCGCGACGTCGACGAGGCGATCATGGAGGTGGCGTCTCGTGGCTGA

SEQ ID NO: 2：PRT；GltB的氨基酸序列

MIFSANPGKQGLYDPAMEQDSCGVAMVADIQGRRTHAIVTDGLTALINLDHRGAAGAEPTSGDGAGILVQLPDQLLREEAGFELPEPDAQGHHRYAAGIAFLPAEEEARGKAVALIERLADEESLEVLGWREVPVDADGADIGPTARSVMPHFAMLFVAGRPDAEGVRPSGLALDRLTFCLRKRVEHESVVAECGTYFPSLSSRTLVYKGMLTPEQLPAFFGDLRDPRLTSAIALVHSRFSTNTFPSWPLAHPFRFVAHNGEINTIRGNRNRMRAREALLESGLIPGDLTRLYPICSPEASDSASFDEVLELLHLGGRSLPHAVLMMIPEAWENHSTMDAQRRAFYQFHASLMEPWDGPACVTFTDGTLVGAVLDRNGLRPCRWWRTADDRVVLASEAGVLDVPPDQVVAKGRLKPGRMFLVDTEAGRIVADDEVKSELAKQHPYEEWLHAGLLQLADLQDRDHVTQSHDSVLRRQLAFGYSEEELKILLAPMAEKGAEPLGSMGTDTPPAVLSKRSRQLYDYFKQAFAQVTNPPLDAIREELVTSMSRIMGPERNLLDPGPASCRHIQLPYPVIDNDELAKLIHINDDGDLPGFACTVLSGLFEVDGGGKALAEAIERVRREASEAIAAGARTLVLSDRDSDHKMAPIPSLLLVSAVHHHLVRTKERLRVALVVETGDAREVHHIALLLGYGAAAVNPYLAFETIEDMIAQGAITGIEPRKAVRNYVNALVKGVLKIMSKMGISTVGAYTAAQVFESFGLSQELLDEYFTGTVSKLGGVGLDVLAEEVAVRHRRAYPDNPTDRVHRRLDSGGEYAYRREGELHLFTPETVFLLQHASKTRRDEVYRKYTEEVHRLSREGGALRGLFKFRKEGRAPVPIDEVESVESICKRFNTGAMSYGSISAEAHQTLAIAMNRIGGRSNTGEGGEDPERLYDPERRSAIKQVASGWFGVTSEYLVNADDIQIKMAQGAKPGEGGQLPPNKVYPWIARTRHSTPGVGLISPPPHHDIYSIEDLAQLIHDLKNANEQARIHVKLVSSLGVGTVAAGVSKAHADVVLISGHDGGTGASPLNSLKHAGTPWEIGLAETQQTLMLNGLRDRITVQVDGAMKTGRDVVVAALLGAEEYGFATAPLIVAGCIMMRVCHLDTCPVGVATQSPELRKRYTGQAEHVVNYFRFVAQEVRELLAELGFRTLDEAIGRADVLDTDDAVDHWKASGLDLSPIFQMPTDTPYGGARRKIREQDHGLEHALDRTLIQLSEAALEDAHPVRLELPVRNVNRTVGTLLGSEITRRYGGEGLPDGTIHIRLTGSAGQSLGAFLPRGVTLEMVGDANDYVGKGLSGGRIIVRPHPDATFAAERQVIAGNTLAYGATAGEMFLRGHVGERFCVRNSGATVVAEGVGDHAFEYMTGGRAVVLGPTGRNLAAGMSGGIGYVLDLDQGSVNREMVELLPLEPEDLNWLKDIVTRHHELTRSAVAASLLGDWPRRSASFTKVMPRDYKRVLEATKAAKAAGRDVDEAIMEVASRG

SEQ ID NO: 3：DNA；gltD的核酸序列

GTGGCTGACCCCAAGGGCTTCCTGAAGTACGAGCGGGTCGAGCCGCCCAAGCGCCCCAAGGAGCACCGCGCCGAGGACTGGCGCGAGGTCTACGTCGACCTCGAACCGGCCGAGCGCGACCAGCAGGTGCGCACCCAGGCCACCCGCTGCATGGACTGCGGCATCCCGTTCTGCCACTCGGCCGGTTCCGGCTGCCCGCTCGGCAACCTGATCCCGGAGTGGAACGACCTGGTGCGCCGCGGTGACTGGACCGCGGCCAGCGACCGGCTGCACGCCACCAACAACTTCCCGGAGTTCACCGGGAAGCTGTGCCCGGCGCCGTGCGAGGCGGGCTGCACGCTGTCCATCTCGCCGCTGTCCGGCGGCCCGGTCGCGATCAAGCGCGTCGAGGCGACGATCGCGGAGAAGTCGTGGGAGCTGGGCCTGGCCCAGCCGCAGGTCGCCGAGGTGGCCAGCGGTCAGCGCGTCGCCGTGGTCGGGTCCGGCCCGGCCGGTCTCGCCGCCGCCCAGCAGCTCACCCGCGCCGGGCACGACGTGACCGTCTTCGAGCGGGACGACCGGCTCGGCGGGCTGCTCCGATACGGCATCCCCGAGTTCAAGATGGAGAAGAAGCACCTCGACAAGCGCCTGGCCCAGCTCAAGAAGGAGGGCACGCAGTTCGTCACGGGCTGCGAGGTGGGCGTCGACATCACCGTCGAGGAGCTGCGGGCCCGCTACGACGCGGTCGTGCTCGCCGTCGGCGCGCTGCGCGGCCGCGACGACACCACCACGCCCGGCCGGGAGCTCAAGGGCATCCACCTGGCGATGGAGCACCTGGTGCCGGCCAACAAGCAGTGCGAGGGCGACGGCCCGTCGCCGGTCCACGCGCACGGCAAGCACGTGGTGATCATCGGCGGTGGTGACACCGGCGCCGACTCCTACGGCACCGCGATCCGCCAGGGCGCGGCCTCGGTGGTCCAGCTGGACCAGTACCCGATGCCGCCGACGACCCGCGACGACGAGCGGTCGCCGTGGCCGACCTGGCCGTACGTGCTGCGCACCTACCCGGCGCACGAGGAGGGCGGCGAGCGGAAGTTCGGTGTCGCCGTGCGGCGGTTCGTGGGCGACGAGAACGGGCACGTCCGCGCGATCGAGCTGCAGCAGGTCAAGGTCGTCAAGGACCCGGAGACCGGGCGCCGCGAGGTGCTGCCGGTGTCGGACGAGATCGAGGAGATCCCGGCCGACCTGGTGCTCTTCGCCATCGGGTTCGAGGGCGTGGAGCACATGCGGCTGCTCGACGACCTGGGCATCCGGCTGACCCGGCGCGGCACCATCTCGTGCGGCCCGGACTGGCAGACCGAGGCCCCGGGCGTGTTCGTCTGCGGTGACGCCCACCGCGGCGCGTCGCTGGTCGTGTGGGCGATCGCGGAGGGCCGCTCGGTGGCCAACGCCGTCGACGCCTACCTGACCGGCGCGTCGGACCTGCCGGCCCCGGTGCATCCGACGGCTCTGCCGCTCGCTGTGGTGTAA

SEQ ID NO: 4：PRT；GltD的氨基酸序列

MADPKGFLKYERVEPPKRPKEHRAEDWREVYVDLEPAERDQQVRTQATRCMDCGIPFCHSAGSGCPLGNLIPEWNDLVRRGDWTAASDRLHATNNFPEFTGKLCPAPCEAGCTLSISPLSGGPVAIKRVEATIAEKSWELGLAQPQVAEVASGQRVAVVGSGPAGLAAAQQLTRAGHDVTVFERDDRLGGLLRYGIPEFKMEKKHLDKRLAQLKKEGTQFVTGCEVGVDITVEELRARYDAVVLAVGALRGRDDTTTPGRELKGIHLAMEHLVPANKQCEGDGPSPVHAHGKHVVIIGGGDTGADSYGTAIRQGAASVVQLDQYPMPPTTRDDERSPWPTWPYVLRTYPAHEEGGERKFGVAVRRFVGDENGHVRAIELQQVKVVKDPETGRREVLPVSDEIEEIPADLVLFAIGFEGVEHMRLLDDLGIRLTRRGTISCGPDWQTEAPGVFVCGDAHRGASLVVWAIAEGRSVANAVDAYLTGASDLPAPVHPTALPLAVV

SEQ ID NO: 5：DNA；echR(ech-fcs操纵子的阻遏子)的核酸序列

SEQ ID NO:6：PRT；EchR(ech-fcs操纵子的阻遏子)的氨基酸序列

MVTESRAEDAPLTLYLVKRLELVIRSLMDDALRPFGLTTLQYTALTALRHRNGLSSAQLARRSFVRPQTMHTMVLTLEKYGLIERAEDPANRRVLLATLTERGKQVLDECTPLVRELEDRMLSGMDDDRRAGFRRDLEDGYGMLASHANAQRALTNGGGE

序列表

<110> 巴斯夫欧洲公司（BASF SE）

<120> 用于在抑制香草酸形成的情况下产生香草醛的拟无枝酸菌属菌株

<130> 074008-2039-00-WO-000325

<150> US 63/127,519

<151> 2020-12-18

<160> 6

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 4575

<212> DNA

<213> 拟无枝酸菌属ATCC 39116（Amycolatopsis sp. ATCC 39116）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4575)

<223> gltB的核酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (4573)..(4575)

<223> 终止密码子

<400> 1

atgatcttct ccgccaaccc gggcaagcag ggcctgtacg accctgccat ggagcaggat 60

tcctgcggtg tggcgatggt ggccgacatt cagggccggc gcacgcacgc catcgtcacg 120

gacgggctga cggcgctgat caacctggac caccggggcg ccgcgggcgc cgaaccgact 180

tccggcgacg gcgccgggat cctcgtgcag ctgcccgacc agctgctccg cgaggaagcc 240

ggcttcgagc tgcccgaacc cgacgcgcag ggccaccacc gctacgcggc cggcatcgcg 300

ttcctgcccg ccgaggagga ggcgcgcggc aaggccgtgg cgctgatcga acgcctcgcc 360

gacgaggaga gcctcgaggt gctgggctgg cgcgaggtcc cggtcgacgc cgacggggcg 420

gacatcggcc ccaccgcgcg ttcggtgatg ccgcacttcg ccatgctgtt cgtggcgggc 480

aggccggacg ccgagggcgt gcggccctcc ggcctcgcgc tggaccggct caccttctgc 540

ctgcgcaagc gcgtcgagca cgagagcgtc gtggccgagt gcggcacgta cttcccgtcg 600

ctgtcctcgc gcaccttggt ctacaaggga atgctcacgc ccgagcagct ccccgcgttc 660

ttcggcgacc tgcgcgaccc gcggctcacc agcgcgatcg cactggtgca cagccgcttt 720

tccaccaaca cgttcccgtc gtggccgctg gcgcacccgt tccggttcgt cgcgcacaac 780

ggtgagatca acacgatccg cggcaaccgc aaccgcatgc gggcccgcga ggcgctgctc 840

gaatcgggcc tgatcccggg cgacctgacc cggctgtacc cgatctgctc gccggaggcg 900

tccgactcgg cgtccttcga cgaggtgctc gaactgctgc acctgggcgg tcgcagcctg 960

ccgcacgcgg tgctgatgat gatcccggag gcgtgggaga accactcgac catggacgcg 1020

cagcgccgcg cgttctacca gttccacgcc agcctgatgg agccgtggga cggccccgcg 1080

tgcgtcacct tcaccgacgg cacgctcgtc ggcgcggtgc tggaccgcaa cggcctgcgc 1140

ccgtgccgct ggtggcgcac cgccgacgac cgcgtcgtgc tggccagcga ggccggcgtc 1200

ctggacgtgc cgccggacca ggtggtcgcc aagggccgcc tcaagccggg ccgcatgttc 1260

ctggtggaca ccgaggcagg ccgcatcgtc gccgacgacg aggtcaagtc ggagctggcg 1320

aagcagcacc cgtacgagga gtggctgcac gccggcctgc tgcagctggc cgacctgcag 1380

gaccgcgacc acgtcacgca gagccacgac tcggtgctgc gccgccagct cgccttcggc 1440

tactccgagg aggagctgaa gatcctgctc gcgccgatgg ccgagaaggg cgccgagccg 1500

ctgggctcga tgggcaccga caccccgccc gccgtgctgt ccaagcgctc gcggcagctc 1560

tacgactact tcaaacaggc cttcgcccag gtgaccaacc cgccgctgga cgcgatccgc 1620

gaggagctgg tcacctcgat gagccggatc atgggtcccg agcgcaacct gctcgaccct 1680

ggcccggcct cgtgccggca catccagctg ccgtacccgg tcatcgacaa cgacgagctg 1740

gccaagctca tccacatcaa cgacgacggt gacctgcccg gcttcgcctg caccgtcctg 1800

tccggactgt tcgaagtgga cggcggcggc aaggcgctgg cggaggcgat cgagcgggtg 1860

cgccgcgagg cgtccgaggc gatcgcggcg ggcgcgcgca cgctcgtgct gtccgaccgg 1920

gactccgacc acaagatggc gccgatcccg tcgctgctgc tggtttccgc ggtgcaccac 1980

cacctggtgc gcaccaagga gcggctgcgc gtcgcgctcg tcgtcgagac cggtgacgcc 2040

cgcgaggtgc accacatcgc gctgctgctc ggttacggcg cggccgcggt gaacccgtac 2100

ctggccttcg agacgatcga ggacatgatc gcgcagggcg cgatcaccgg catcgagccg 2160

cgcaaggccg tgcgcaacta cgtcaacgcg ctcgtcaagg gcgtcctgaa gatcatgtcc 2220

aagatgggca tctcgaccgt cggcgcctac accgcggcgc aggtgttcga gtccttcggg 2280

ctgtcgcagg aactgctcga cgagtacttc accggcacgg tgtccaagct cggcggcgtc 2340

ggtctcgacg tgctcgccga ggaggtcgcc gtccggcacc gccgggcgta cccggacaac 2400

cccaccgacc gggtgcaccg ccgcctggac agcggcggcg agtacgccta ccgccgcgag 2460

ggcgagctgc acctgttcac cccggagacc gtgttcctgc tgcagcacgc cagcaagacg 2520

cgccgcgacg aggtgtaccg caagtacacc gaagaggtgc accgcctgtc ccgcgagggc 2580

ggtgcgctgc gcgggttgtt caagttccgc aaggaaggcc gcgccccggt gccgatcgac 2640

gaggtcgagt cggtcgagtc gatctgcaag cggttcaaca ccggcgcgat gtcctacggt 2700

tcgatctcgg ccgaggcgca ccagacgctc gcgatcgcga tgaaccgcat cggcggccgc 2760

tccaacaccg gtgagggcgg cgaggacccg gagcggctct acgaccccga gcggcgcagc 2820

gcgatcaagc aggtcgccag cggctggttc ggcgtgacga gcgagtacct ggtcaacgcc 2880

gacgacatcc agatcaagat ggcgcagggc gccaagcccg gcgagggcgg ccagctgccg 2940

ccgaacaagg tgtacccgtg gatcgcgcgc acccggcact ccacgccggg cgtcggcctc 3000

atctcgccgc cgccgcacca cgacatctac tcgatcgagg acctggcgca gctgatccac 3060

gacctgaaga acgccaacga gcaggcccgc atccacgtga agctggtcag ctcgctcggc 3120

gtcggcacgg tcgcggccgg cgtgtccaag gcgcacgcgg acgtcgtgct gatctccggc 3180

cacgacggcg gcaccggcgc ctcgccgctg aactcgctca agcacgcggg cacgccgtgg 3240

gagatcggcc ttgccgagac ccagcagacc ctgatgctga acgggctgcg cgaccgcatc 3300

accgtgcagg tcgacggcgc gatgaagacc ggccgcgacg tcgtggtcgc cgcgctgctc 3360

ggcgccgagg agtacggctt cgcgaccgcg ccgctgatcg tggccggctg catcatgatg 3420

cgcgtctgcc acctcgacac ctgccccgtc ggtgtcgcca cccagagccc ggagctgcgc 3480

aagcgctaca ccgggcaggc cgagcacgtg gtgaactact tccggttcgt cgcgcaggag 3540

gtccgggaac tgctggcgga gctgggtttc cgcaccctgg acgaggcgat cggccgggcc 3600

gacgtgctgg acaccgacga cgccgtcgac cactggaagg ccagcggcct ggacctgtcg 3660

ccgatcttcc agatgccgac cgacaccccg tacggcggcg cccggcgcaa gatccgcgag 3720

caggaccacg gcctcgagca cgctctggac cgcacgctga tccagttgtc cgaggcggcg 3780

ctggaggacg cgcacccggt ccggctggaa ctgccggtgc gcaacgtcaa tcgcaccgtc 3840

ggcacactgc tgggctcgga gatcacccgc cgctacggcg gggagggcct gcccgacggc 3900

acgatccaca tccggctcac cgggtcggcg gggcagtcgc tgggcgcgtt cctgccgcgc 3960

ggcgtcacgc tggagatggt gggcgacgcc aacgactacg tcggcaaggg cctgtccggc 4020

ggccgcatca tcgtgcggcc gcacccggac gcgacgttcg ccgctgaacg tcaggtcatc 4080

gccggcaaca cgctggccta cggcgccacc gcgggggaga tgttcctgcg cgggcatgtg 4140

ggcgagcggt tctgcgtacg caactcgggc gccaccgtcg tcgccgaggg cgtgggcgac 4200

cacgccttcg aatacatgac cggtggccgt gccgtggtgc tcggtccgac cggccgcaac 4260

ctcgccgcgg gcatgtccgg cggtatcggc tacgtcctcg acctcgacca gggcagcgtc 4320

aaccgcgaga tggtcgagct gctcccgctc gagcccgagg atctgaactg gttgaaggac 4380

atcgtgaccc gtcaccacga actcacccgc tcggcggtcg ccgcctcgct gctcggcgat 4440

tggccgcgcc ggtcggcgag cttcacgaag gtcatgccgc gcgactacaa gcgcgtgctg 4500

gaggcgacca aggccgcgaa ggccgcgggc cgcgacgtcg acgaggcgat catggaggtg 4560

gcgtctcgtg gctga 4575

<210> 2

<211> 1524

<212> PRT

<213> 拟无枝酸菌属ATCC 39116（Amycolatopsis sp. ATCC 39116）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1524)

<223> GltB的氨基酸序列

<400> 2

Met Ile Phe Ser Ala Asn Pro Gly Lys Gln Gly Leu Tyr Asp Pro Ala

1 5 10 15

Met Glu Gln Asp Ser Cys Gly Val Ala Met Val Ala Asp Ile Gln Gly

20 25 30

Arg Arg Thr His Ala Ile Val Thr Asp Gly Leu Thr Ala Leu Ile Asn

35 40 45

Leu Asp His Arg Gly Ala Ala Gly Ala Glu Pro Thr Ser Gly Asp Gly

50 55 60

Ala Gly Ile Leu Val Gln Leu Pro Asp Gln Leu Leu Arg Glu Glu Ala

65 70 75 80

Gly Phe Glu Leu Pro Glu Pro Asp Ala Gln Gly His His Arg Tyr Ala

85 90 95

Ala Gly Ile Ala Phe Leu Pro Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gly Lys Ala

100 105 110

Val Ala Leu Ile Glu Arg Leu Ala Asp Glu Glu Ser Leu Glu Val Leu

115 120 125

Gly Trp Arg Glu Val Pro Val Asp Ala Asp Gly Ala Asp Ile Gly Pro

130 135 140

Thr Ala Arg Ser Val Met Pro His Phe Ala Met Leu Phe Val Ala Gly

145 150 155 160

Arg Pro Asp Ala Glu Gly Val Arg Pro Ser Gly Leu Ala Leu Asp Arg

165 170 175

Leu Thr Phe Cys Leu Arg Lys Arg Val Glu His Glu Ser Val Val Ala

180 185 190

Glu Cys Gly Thr Tyr Phe Pro Ser Leu Ser Ser Arg Thr Leu Val Tyr

195 200 205

Lys Gly Met Leu Thr Pro Glu Gln Leu Pro Ala Phe Phe Gly Asp Leu

210 215 220

Arg Asp Pro Arg Leu Thr Ser Ala Ile Ala Leu Val His Ser Arg Phe

225 230 235 240

Ser Thr Asn Thr Phe Pro Ser Trp Pro Leu Ala His Pro Phe Arg Phe

245 250 255

Val Ala His Asn Gly Glu Ile Asn Thr Ile Arg Gly Asn Arg Asn Arg

260 265 270

Met Arg Ala Arg Glu Ala Leu Leu Glu Ser Gly Leu Ile Pro Gly Asp

275 280 285

Leu Thr Arg Leu Tyr Pro Ile Cys Ser Pro Glu Ala Ser Asp Ser Ala

290 295 300

Ser Phe Asp Glu Val Leu Glu Leu Leu His Leu Gly Gly Arg Ser Leu

305 310 315 320

Pro His Ala Val Leu Met Met Ile Pro Glu Ala Trp Glu Asn His Ser

325 330 335

Thr Met Asp Ala Gln Arg Arg Ala Phe Tyr Gln Phe His Ala Ser Leu

340 345 350

Met Glu Pro Trp Asp Gly Pro Ala Cys Val Thr Phe Thr Asp Gly Thr

355 360 365

Leu Val Gly Ala Val Leu Asp Arg Asn Gly Leu Arg Pro Cys Arg Trp

370 375 380

Trp Arg Thr Ala Asp Asp Arg Val Val Leu Ala Ser Glu Ala Gly Val

385 390 395 400

Leu Asp Val Pro Pro Asp Gln Val Val Ala Lys Gly Arg Leu Lys Pro

405 410 415

Gly Arg Met Phe Leu Val Asp Thr Glu Ala Gly Arg Ile Val Ala Asp

420 425 430

Asp Glu Val Lys Ser Glu Leu Ala Lys Gln His Pro Tyr Glu Glu Trp

435 440 445

Leu His Ala Gly Leu Leu Gln Leu Ala Asp Leu Gln Asp Arg Asp His

450 455 460

Val Thr Gln Ser His Asp Ser Val Leu Arg Arg Gln Leu Ala Phe Gly

465 470 475 480

Tyr Ser Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Leu Ala Pro Met Ala Glu Lys

485 490 495

Gly Ala Glu Pro Leu Gly Ser Met Gly Thr Asp Thr Pro Pro Ala Val

500 505 510

Leu Ser Lys Arg Ser Arg Gln Leu Tyr Asp Tyr Phe Lys Gln Ala Phe

515 520 525

Ala Gln Val Thr Asn Pro Pro Leu Asp Ala Ile Arg Glu Glu Leu Val

530 535 540

Thr Ser Met Ser Arg Ile Met Gly Pro Glu Arg Asn Leu Leu Asp Pro

545 550 555 560

Gly Pro Ala Ser Cys Arg His Ile Gln Leu Pro Tyr Pro Val Ile Asp

565 570 575

Asn Asp Glu Leu Ala Lys Leu Ile His Ile Asn Asp Asp Gly Asp Leu

580 585 590

Pro Gly Phe Ala Cys Thr Val Leu Ser Gly Leu Phe Glu Val Asp Gly

595 600 605

Gly Gly Lys Ala Leu Ala Glu Ala Ile Glu Arg Val Arg Arg Glu Ala

610 615 620

Ser Glu Ala Ile Ala Ala Gly Ala Arg Thr Leu Val Leu Ser Asp Arg

625 630 635 640

Asp Ser Asp His Lys Met Ala Pro Ile Pro Ser Leu Leu Leu Val Ser

645 650 655

Ala Val His His His Leu Val Arg Thr Lys Glu Arg Leu Arg Val Ala

660 665 670

Leu Val Val Glu Thr Gly Asp Ala Arg Glu Val His His Ile Ala Leu

675 680 685

Leu Leu Gly Tyr Gly Ala Ala Ala Val Asn Pro Tyr Leu Ala Phe Glu

690 695 700

Thr Ile Glu Asp Met Ile Ala Gln Gly Ala Ile Thr Gly Ile Glu Pro

705 710 715 720

Arg Lys Ala Val Arg Asn Tyr Val Asn Ala Leu Val Lys Gly Val Leu

725 730 735

Lys Ile Met Ser Lys Met Gly Ile Ser Thr Val Gly Ala Tyr Thr Ala

740 745 750

Ala Gln Val Phe Glu Ser Phe Gly Leu Ser Gln Glu Leu Leu Asp Glu

755 760 765

Tyr Phe Thr Gly Thr Val Ser Lys Leu Gly Gly Val Gly Leu Asp Val

770 775 780

Leu Ala Glu Glu Val Ala Val Arg His Arg Arg Ala Tyr Pro Asp Asn

785 790 795 800

Pro Thr Asp Arg Val His Arg Arg Leu Asp Ser Gly Gly Glu Tyr Ala

805 810 815

Tyr Arg Arg Glu Gly Glu Leu His Leu Phe Thr Pro Glu Thr Val Phe

820 825 830

Leu Leu Gln His Ala Ser Lys Thr Arg Arg Asp Glu Val Tyr Arg Lys

835 840 845

Tyr Thr Glu Glu Val His Arg Leu Ser Arg Glu Gly Gly Ala Leu Arg

850 855 860

Gly Leu Phe Lys Phe Arg Lys Glu Gly Arg Ala Pro Val Pro Ile Asp

865 870 875 880

Glu Val Glu Ser Val Glu Ser Ile Cys Lys Arg Phe Asn Thr Gly Ala

885 890 895

Met Ser Tyr Gly Ser Ile Ser Ala Glu Ala His Gln Thr Leu Ala Ile

900 905 910

Ala Met Asn Arg Ile Gly Gly Arg Ser Asn Thr Gly Glu Gly Gly Glu

915 920 925

Asp Pro Glu Arg Leu Tyr Asp Pro Glu Arg Arg Ser Ala Ile Lys Gln

930 935 940

Val Ala Ser Gly Trp Phe Gly Val Thr Ser Glu Tyr Leu Val Asn Ala

945 950 955 960

Asp Asp Ile Gln Ile Lys Met Ala Gln Gly Ala Lys Pro Gly Glu Gly

965 970 975

Gly Gln Leu Pro Pro Asn Lys Val Tyr Pro Trp Ile Ala Arg Thr Arg

980 985 990

His Ser Thr Pro Gly Val Gly Leu Ile Ser Pro Pro Pro His His Asp

995 1000 1005

Ile Tyr Ser Ile Glu Asp Leu Ala Gln Leu Ile His Asp Leu Lys

1010 1015 1020

Asn Ala Asn Glu Gln Ala Arg Ile His Val Lys Leu Val Ser Ser

1025 1030 1035

Leu Gly Val Gly Thr Val Ala Ala Gly Val Ser Lys Ala His Ala

1040 1045 1050

Asp Val Val Leu Ile Ser Gly His Asp Gly Gly Thr Gly Ala Ser

1055 1060 1065

Pro Leu Asn Ser Leu Lys His Ala Gly Thr Pro Trp Glu Ile Gly

1070 1075 1080

Leu Ala Glu Thr Gln Gln Thr Leu Met Leu Asn Gly Leu Arg Asp

1085 1090 1095

Arg Ile Thr Val Gln Val Asp Gly Ala Met Lys Thr Gly Arg Asp

1100 1105 1110

Val Val Val Ala Ala Leu Leu Gly Ala Glu Glu Tyr Gly Phe Ala

1115 1120 1125

Thr Ala Pro Leu Ile Val Ala Gly Cys Ile Met Met Arg Val Cys

1130 1135 1140

His Leu Asp Thr Cys Pro Val Gly Val Ala Thr Gln Ser Pro Glu

1145 1150 1155

Leu Arg Lys Arg Tyr Thr Gly Gln Ala Glu His Val Val Asn Tyr

1160 1165 1170

Phe Arg Phe Val Ala Gln Glu Val Arg Glu Leu Leu Ala Glu Leu

1175 1180 1185

Gly Phe Arg Thr Leu Asp Glu Ala Ile Gly Arg Ala Asp Val Leu

1190 1195 1200

Asp Thr Asp Asp Ala Val Asp His Trp Lys Ala Ser Gly Leu Asp

1205 1210 1215

Leu Ser Pro Ile Phe Gln Met Pro Thr Asp Thr Pro Tyr Gly Gly

1220 1225 1230

Ala Arg Arg Lys Ile Arg Glu Gln Asp His Gly Leu Glu His Ala

1235 1240 1245

Leu Asp Arg Thr Leu Ile Gln Leu Ser Glu Ala Ala Leu Glu Asp

1250 1255 1260

Ala His Pro Val Arg Leu Glu Leu Pro Val Arg Asn Val Asn Arg

1265 1270 1275

Thr Val Gly Thr Leu Leu Gly Ser Glu Ile Thr Arg Arg Tyr Gly

1280 1285 1290

Gly Glu Gly Leu Pro Asp Gly Thr Ile His Ile Arg Leu Thr Gly

1295 1300 1305

Ser Ala Gly Gln Ser Leu Gly Ala Phe Leu Pro Arg Gly Val Thr

1310 1315 1320

Leu Glu Met Val Gly Asp Ala Asn Asp Tyr Val Gly Lys Gly Leu

1325 1330 1335

Ser Gly Gly Arg Ile Ile Val Arg Pro His Pro Asp Ala Thr Phe

1340 1345 1350

Ala Ala Glu Arg Gln Val Ile Ala Gly Asn Thr Leu Ala Tyr Gly

1355 1360 1365

Ala Thr Ala Gly Glu Met Phe Leu Arg Gly His Val Gly Glu Arg

1370 1375 1380

Phe Cys Val Arg Asn Ser Gly Ala Thr Val Val Ala Glu Gly Val

1385 1390 1395

Gly Asp His Ala Phe Glu Tyr Met Thr Gly Gly Arg Ala Val Val

1400 1405 1410

Leu Gly Pro Thr Gly Arg Asn Leu Ala Ala Gly Met Ser Gly Gly

1415 1420 1425

Ile Gly Tyr Val Leu Asp Leu Asp Gln Gly Ser Val Asn Arg Glu

1430 1435 1440

Met Val Glu Leu Leu Pro Leu Glu Pro Glu Asp Leu Asn Trp Leu

1445 1450 1455

Lys Asp Ile Val Thr Arg His His Glu Leu Thr Arg Ser Ala Val

1460 1465 1470

Ala Ala Ser Leu Leu Gly Asp Trp Pro Arg Arg Ser Ala Ser Phe

1475 1480 1485

Thr Lys Val Met Pro Arg Asp Tyr Lys Arg Val Leu Glu Ala Thr

1490 1495 1500

Lys Ala Ala Lys Ala Ala Gly Arg Asp Val Asp Glu Ala Ile Met

1505 1510 1515

Glu Val Ala Ser Arg Gly

1520

<210> 3

<211> 1509

<212> DNA

<213> 拟无枝酸菌属ATCC 39116（Amycolatopsis sp. ATCC 39116）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1509)

<223> gltD的核酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1507)..(1509)

<223> 终止密码子

<400> 3

gtggctgacc ccaagggctt cctgaagtac gagcgggtcg agccgcccaa gcgccccaag 60

gagcaccgcg ccgaggactg gcgcgaggtc tacgtcgacc tcgaaccggc cgagcgcgac 120

cagcaggtgc gcacccaggc cacccgctgc atggactgcg gcatcccgtt ctgccactcg 180

gccggttccg gctgcccgct cggcaacctg atcccggagt ggaacgacct ggtgcgccgc 240

ggtgactgga ccgcggccag cgaccggctg cacgccacca acaacttccc ggagttcacc 300

gggaagctgt gcccggcgcc gtgcgaggcg ggctgcacgc tgtccatctc gccgctgtcc 360

ggcggcccgg tcgcgatcaa gcgcgtcgag gcgacgatcg cggagaagtc gtgggagctg 420

ggcctggccc agccgcaggt cgccgaggtg gccagcggtc agcgcgtcgc cgtggtcggg 480

tccggcccgg ccggtctcgc cgccgcccag cagctcaccc gcgccgggca cgacgtgacc 540

gtcttcgagc gggacgaccg gctcggcggg ctgctccgat acggcatccc cgagttcaag 600

atggagaaga agcacctcga caagcgcctg gcccagctca agaaggaggg cacgcagttc 660

gtcacgggct gcgaggtggg cgtcgacatc accgtcgagg agctgcgggc ccgctacgac 720

gcggtcgtgc tcgccgtcgg cgcgctgcgc ggccgcgacg acaccaccac gcccggccgg 780

gagctcaagg gcatccacct ggcgatggag cacctggtgc cggccaacaa gcagtgcgag 840

ggcgacggcc cgtcgccggt ccacgcgcac ggcaagcacg tggtgatcat cggcggtggt 900

gacaccggcg ccgactccta cggcaccgcg atccgccagg gcgcggcctc ggtggtccag 960

ctggaccagt acccgatgcc gccgacgacc cgcgacgacg agcggtcgcc gtggccgacc 1020

tggccgtacg tgctgcgcac ctacccggcg cacgaggagg gcggcgagcg gaagttcggt 1080

gtcgccgtgc ggcggttcgt gggcgacgag aacgggcacg tccgcgcgat cgagctgcag 1140

caggtcaagg tcgtcaagga cccggagacc gggcgccgcg aggtgctgcc ggtgtcggac 1200

gagatcgagg agatcccggc cgacctggtg ctcttcgcca tcgggttcga gggcgtggag 1260

cacatgcggc tgctcgacga cctgggcatc cggctgaccc ggcgcggcac catctcgtgc 1320

ggcccggact ggcagaccga ggccccgggc gtgttcgtct gcggtgacgc ccaccgcggc 1380

gcgtcgctgg tcgtgtgggc gatcgcggag ggccgctcgg tggccaacgc cgtcgacgcc 1440

tacctgaccg gcgcgtcgga cctgccggcc ccggtgcatc cgacggctct gccgctcgct 1500

gtggtgtaa 1509

<210> 4

<211> 502

<212> PRT

<213> 拟无枝酸菌属ATCC 39116（Amycolatopsis sp. ATCC 39116）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(502)

<223> GltD的氨基酸序列

<400> 4

Met Ala Asp Pro Lys Gly Phe Leu Lys Tyr Glu Arg Val Glu Pro Pro

1 5 10 15

Lys Arg Pro Lys Glu His Arg Ala Glu Asp Trp Arg Glu Val Tyr Val

20 25 30

Asp Leu Glu Pro Ala Glu Arg Asp Gln Gln Val Arg Thr Gln Ala Thr

35 40 45

Arg Cys Met Asp Cys Gly Ile Pro Phe Cys His Ser Ala Gly Ser Gly

50 55 60

Cys Pro Leu Gly Asn Leu Ile Pro Glu Trp Asn Asp Leu Val Arg Arg

65 70 75 80

Gly Asp Trp Thr Ala Ala Ser Asp Arg Leu His Ala Thr Asn Asn Phe

85 90 95

Pro Glu Phe Thr Gly Lys Leu Cys Pro Ala Pro Cys Glu Ala Gly Cys

100 105 110

Thr Leu Ser Ile Ser Pro Leu Ser Gly Gly Pro Val Ala Ile Lys Arg

115 120 125

Val Glu Ala Thr Ile Ala Glu Lys Ser Trp Glu Leu Gly Leu Ala Gln

130 135 140

Pro Gln Val Ala Glu Val Ala Ser Gly Gln Arg Val Ala Val Val Gly

145 150 155 160

Ser Gly Pro Ala Gly Leu Ala Ala Ala Gln Gln Leu Thr Arg Ala Gly

165 170 175

His Asp Val Thr Val Phe Glu Arg Asp Asp Arg Leu Gly Gly Leu Leu

180 185 190

Arg Tyr Gly Ile Pro Glu Phe Lys Met Glu Lys Lys His Leu Asp Lys

195 200 205

Arg Leu Ala Gln Leu Lys Lys Glu Gly Thr Gln Phe Val Thr Gly Cys

210 215 220

Glu Val Gly Val Asp Ile Thr Val Glu Glu Leu Arg Ala Arg Tyr Asp

225 230 235 240

Ala Val Val Leu Ala Val Gly Ala Leu Arg Gly Arg Asp Asp Thr Thr

245 250 255

Thr Pro Gly Arg Glu Leu Lys Gly Ile His Leu Ala Met Glu His Leu

260 265 270

Val Pro Ala Asn Lys Gln Cys Glu Gly Asp Gly Pro Ser Pro Val His

275 280 285

Ala His Gly Lys His Val Val Ile Ile Gly Gly Gly Asp Thr Gly Ala

290 295 300

Asp Ser Tyr Gly Thr Ala Ile Arg Gln Gly Ala Ala Ser Val Val Gln

305 310 315 320

Leu Asp Gln Tyr Pro Met Pro Pro Thr Thr Arg Asp Asp Glu Arg Ser

325 330 335

Pro Trp Pro Thr Trp Pro Tyr Val Leu Arg Thr Tyr Pro Ala His Glu

340 345 350

Glu Gly Gly Glu Arg Lys Phe Gly Val Ala Val Arg Arg Phe Val Gly

355 360 365

Asp Glu Asn Gly His Val Arg Ala Ile Glu Leu Gln Gln Val Lys Val

370 375 380

Val Lys Asp Pro Glu Thr Gly Arg Arg Glu Val Leu Pro Val Ser Asp

385 390 395 400

Glu Ile Glu Glu Ile Pro Ala Asp Leu Val Leu Phe Ala Ile Gly Phe

405 410 415

Glu Gly Val Glu His Met Arg Leu Leu Asp Asp Leu Gly Ile Arg Leu

420 425 430

Thr Arg Arg Gly Thr Ile Ser Cys Gly Pro Asp Trp Gln Thr Glu Ala

435 440 445

Pro Gly Val Phe Val Cys Gly Asp Ala His Arg Gly Ala Ser Leu Val

450 455 460

Val Trp Ala Ile Ala Glu Gly Arg Ser Val Ala Asn Ala Val Asp Ala

465 470 475 480

Tyr Leu Thr Gly Ala Ser Asp Leu Pro Ala Pro Val His Pro Thr Ala

485 490 495

Leu Pro Leu Ala Val Val

500

<210> 5

<211> 483

<212> DNA

<213> 拟无枝酸菌属ATCC 39116（Amycolatopsis sp. ATCC 39116）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(483)

<223> echR（ech-fcs操纵子的阻遏蛋白）的核酸序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (481)..(483)

<223> 终止密码子

<400> 5

gtggtgaccg aatcccgcgc cgaggacgcc ccgctgaccc tctacctggt caagcggctg 60

gagctggtga tccgctcgct gatggacgac gcgctgcgcc cgttcgggct gaccaccctg 120

cagtacaccg cgctgaccgc gctgcggcac cgcaacgggc tgtcgtccgc gcagctcgcg 180

cgccgctcgt tcgtccggcc ccagaccatg cacaccatgg tgctcacgct ggagaagtac 240

gggctcatcg agcgcgcgga ggacccggcc aaccgccggg tcctgctcgc caccctcacc 300

gagcgcggca agcaggtcct cgacgagtgc acgccgctgg tccgggagct cgaagaccgg 360

atgctctccg gcatggacga cgaccgccgc gccgggttcc gccgggacct ggaggacggc 420

tacggcatgc tcgcctcgca cgccaacgct cagcgcgcgt tgacgaacgg cggcggcgag 480

taa 483

<210> 6

<211> 160

<212> PRT

<213> 拟无枝酸菌属ATCC 39116（Amycolatopsis sp. ATCC 39116）

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(160)

<223> EchR（ech-fcs操纵子的阻遏蛋白）的氨基酸序列

<400> 6

Met Val Thr Glu Ser Arg Ala Glu Asp Ala Pro Leu Thr Leu Tyr Leu

1 5 10 15

Val Lys Arg Leu Glu Leu Val Ile Arg Ser Leu Met Asp Asp Ala Leu

20 25 30

Arg Pro Phe Gly Leu Thr Thr Leu Gln Tyr Thr Ala Leu Thr Ala Leu

35 40 45

Arg His Arg Asn Gly Leu Ser Ser Ala Gln Leu Ala Arg Arg Ser Phe

50 55 60

Val Arg Pro Gln Thr Met His Thr Met Val Leu Thr Leu Glu Lys Tyr

65 70 75 80

Gly Leu Ile Glu Arg Ala Glu Asp Pro Ala Asn Arg Arg Val Leu Leu

85 90 95

Ala Thr Leu Thr Glu Arg Gly Lys Gln Val Leu Asp Glu Cys Thr Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Leu Glu Asp Arg Met Leu Ser Gly Met Asp Asp Asp

115 120 125

Arg Arg Ala Gly Phe Arg Arg Asp Leu Glu Asp Gly Tyr Gly Met Leu

130 135 140

Ala Ser His Ala Asn Ala Gln Arg Ala Leu Thr Asn Gly Gly Gly Glu

145 150 155 160

Claims

1.一种非GMO突变型拟无枝酸菌属(Amycolaptosis sp.)菌株，其包括：通过将能够产生香草醛并且能够将香草醛代谢成香草酸的拟无枝酸菌属菌株暴露于至少一种突变原形成的存在的突变型拟无枝酸菌属菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株能够产生香草醛，并且相较于所述菌株进行的降解表现出更少的香草醛向香草酸的降解，如通过所述突变型菌株相对于所述菌株中的香草酸的积累水平所测量。

2.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株是ATCC39116的突变体。

3.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株在将阿魏酸(ferulic acid)初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时积累少于0.5克香草酸/升培养基。

4.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过24小时积累少于0.25克香草酸/升培养基。

5.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时积累少于0.5克香草酸/升培养基。

6.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株在将阿魏酸初始地进料到所述突变型菌株后超过44小时积累少于0.25克香草酸/升培养基。

7.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型拟无枝酸菌属菌株的基因组包括位于gltBD操纵子中的一个或多个突变。

8.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变包含位于gltB基因中的至少一个突变。

9.根据权利要求8所述的突变型菌株，其中所述一个或多个突变位于gltB基因中，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核酸序列。

10.根据权利要求8所述的突变型菌株，其中所述一个或多个突变位于gltB基因中，所述gltB基因包括SEQ ID NO:1。

11.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变位于gltD基因中，所述gltD基因包括与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核酸序列。

12.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变位于gltD基因中，所述gltD基因包括核酸序列SEQ ID NO:3。

13.根据权利要求7所述的突变型菌株，其进一步包含位于内源基因echR中的突变，所述内源基因echR包括核酸序列SEQ ID NO:5。

14.根据权利要求7所述的突变型菌株，其中所述一个或多个突变为至少一个选自由以下组成的组的突变：缺失、插入、移码突变、错义突变、无义突变、切片突变和点突变。

15.根据权利要求14所述的突变型菌株，其中所述突变是包括2bp插入的移码突变。

16.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株是在不通过引入任何外源遗传物质对所述突变型菌株进行永久修饰的情况下获得的。

17.根据权利要求1所述的突变型菌株，其中所述突变型菌株是通过使菌株与突变原甲磺酸甲酯接触而获得的。

18.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括以下步骤：

a.在包括底物的适当培养基中培养根据权利要求1所述的突变型菌株；以及

b.回收所产生的香草醛。

19.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括：

c.在含有碳源的培养基中培养根据权利要求1所述的突变型拟无枝酸菌属菌株；以及

d.将阿魏酸进料到所述突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间。

20.一种拟无枝酸菌属菌株，其包括：

e.非天然存在的拟无枝酸菌属菌株，所述非天然存在的拟无枝酸菌属菌株包含编码香草醛脱氢酶的基因和位于gltBD操纵子中的至少一个突变，其中相比于不具有所述位于gltBD操纵子中的至少一个突变的拟无枝酸菌属菌株进行的转化，所述拟无枝酸菌属菌株将较少香草醛转化为香草酸，其中所述gltBD操纵子包含gltB基因和gltD基因。

21.根据权利要求20所述的菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的一个或多个突变包含位于所述gltB基因中的至少一个突变。

22.根据权利要求21所述的菌株，其中所述一个或多个突变位于所述gltB基因中，包括与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的核酸序列。

23.根据权利要求21所述的菌株，其中所述一个或多个突变位于所述gltB基因中，所述gltB基因包括SEQ ID NO:1。

24.根据权利要求20所述的菌株，其中位于所述gltBD操纵子中的所述一个或多个突变位于所述gltD基因中。

25.根据权利要求24所述的菌株，其中位于所述gltD基因中的所述一个或多个突变包括与SEQ ID NO:3具有至少90％同一性的核酸序列。

26.根据权利要求24所述的菌株，其中位于所述gltD基因中的所述一个或多个突变包括核酸序列SEQ ID NO:3。

27.根据权利要求20所述的菌株，其进一步包含位于内源基因echR中的突变，所述内源基因echR包括核酸序列SEQ ID NO:5。

28.根据权利要求20所述的菌株，其中所述非天然存在的拟无枝酸菌属菌株是重组菌株。

29.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括培养权利要求20中任一项所述的非天然存在的菌株，所述方法包含以下步骤：

a.在包括底物的适当培养基中培养所述非天然存在的拟无枝酸菌属菌株，其中所述底物的至少一部分通过所述非天然存在的拟无枝酸菌属菌株的活性转化为香草醛；以及

b.回收所产生的香草醛。

30.一种用于产生香草醛的方法，所述方法包括：

f.在包含碳源的培养基中培养根据权利要求20中任一项所述的非天然存在的拟无枝酸菌属菌株；以及

g.将阿魏酸进料到突变型菌株，持续足以允许阿魏酸转化为香草醛的时间。