JP2024503213A - バニリン酸形成が抑制されたバニリン生産のためのアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）株 - Google Patents

Abstract

本発明は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株を開示する。ＡＴＣＣ ３９１１６は、供給原料としてフェルラ酸を使用する天然バニリンの生産に適している。より具体的には、本発明は、バニリンのバニリン酸への分解を減少させる変異を有する変異株を開示する。【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２０年１２月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／１２７，５１９号の利益を主張する。

配列表
本出願は、その全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０２１年１２月１４日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０７４００８＿２０３９＿００＿ＷＯ＿０００３２５＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは２９，１６７バイトである。

本開示は、一般に、再生可能な供給原料を使用した天然バニリンの生産に適した非遺伝子改変微生物に関する。より具体的には、本発明は、バニリン分解経路に影響を与える変異を有するアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）株を開示し、このような株はバニリンを高い収量で産生することができる。

バニラフレーバーは、世界中で最も頻繁に使用されているフレーバーのひとつである。これらは、アイスクリーム、乳製品、デザート、菓子、ベーカリー製品、蒸留酒など、数多くの食品の風味付けに使用されている。これらはまた香水、医薬品、及び個人衛生製品にも使用されている。

天然バニラフレーバーは、伝統的にバニラ蘭（バニラ・プラニフォリア（Ｖａｎｉｌｌａ ｐｌａｎｉｆｏｌｉａ））の発酵した鞘から得られてきた。これは主に収穫後の数週間にわたる豆の乾燥及び発酵過程中に、豆に存在するバニリングルコシドの加水分解によって形成される。バニラフレーバーの必須芳香物質は、バニリン（４－ヒドロキシ３－メトキシベンズアルデヒド）である。

年間約１２，０００トンのバニリンが消費されるが、そのうちバニラ豆から抽出されるのはわずか２０～５０トンである。残りは合成的に、主に石油化学由来のグアヤコールから生産される。近年、米糠由来のフェルラ酸、トウヒ木のリグニン由来のコニフェリルアルコール、トウモロコシ糖、丁子油由来のオイゲノールなど、再生可能原料を使用した生物学的発酵を通じて、バニリンを生産することへの関心が高まっている。生物学的発酵を使用した再生可能原料に由来するバニリンは、規制及び立法当局によって「天然バニリン」として認められており、「天然産物」として市販され得る。

放線菌類アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種のＡＴＣＣ ３９１１６株は、フェルラ酸からバニリンへの生物変換に使用されている。この微生物は、初期反応によって区別される４つの主要な経路、すなわち、非酸化的脱炭酸、側鎖還元、コエンザイムＡ非依存性脱アセチル化、及びコエンザイムＡ依存性脱アセチル化を用いて、フェルラ酸を代謝することが知られている。アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種のＡＴＣＣ ３９１１６株におけるフェルラ酸代謝のコエンザイムＡ依存性脱アセチル化経路には２つのステップがある。第１のステップでは、フェルラ酸が非酸化的脱アセチル化されてバニリンを生じる（図１）。このステップは、２つの酵素、すなわち、ｆｃｓ遺伝子によってコード化されるフェルロイルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）シンセターゼと、ｅｃｈ遺伝子によってコード化されるエノイルＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼによって媒介される。これらの遺伝子（ｅｃｈ及びｆｃｓ）は、どちらも１つのオペロン内にあり、炭素源としてグルコースを含有する培養培地中でアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種が増殖すると、これら２つの遺伝子の発現が抑制される。これらの遺伝子の転写は、フェルラ酸の添加後に初めて誘導される。その結果、フェルラ酸を培養培地に添加すると、バニリン合成が検出できるまでに約５時間以上の遅滞期間が生じる。典型的には、遅滞期間は少なくとも４時間であり、最大で８時間である。ひとたびバニリンが蓄積し始めると、フェルラ酸代謝の第２段階が始まる。第２段階では、バニリンはβ－酸化を受けてバニリン酸が生成する。バニリンからバニリン酸への変換は、ｖｄｈ遺伝子によってコード化されるバニリンデヒドロゲナーゼ酵素によって媒介される。バニリンの生産量を増加させるためには、バニリンをバニリン酸に分解する役割を担う経路を遮断するように、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種を遺伝子的に操作する必要がある。

本発明は、バニリン分解経路に影響を与える変異を有する微生物を提供する。本発明の好ましい実施形態では、微生物は、放線菌目（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）及びアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）のものであり得る。例えば、微生物は、ＡＴＣＣ ３９１１６の下に入手可能なアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株であり得る。フェルラ酸からバニリンへの生物変換のために、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種ＡＴＣＣ ３９１１６を使用する上での１つの大きな課題は、ｖｄｈ遺伝子によってコード化されるバニリンデヒドロゲナーゼＶｄｈによるバニリンからバニリン酸への同時分解である。バニリンに対するバニリンデヒドロゲナーゼの作用の結果として、野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種ＡＴＣＣ ３９１１６から得られるバニリンの収量は限られている。野生型の対応物とは異なり、本発明に従って開発されたアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株は、バニリンからバニリン酸への分解が著しく減少していることを示す。本発明の変異体アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種ＡＴＣＣ ３９１１６株は化学変異誘発を使用して得られ、バニラからバニリン酸への分解が減少している表現型を与える遺伝子変異の性質は、全ゲノム配列決定を使用して同定された。重要なことに、本発明による変異株は、バニリンをバニリン酸に変換するバニリンデヒドロゲナーゼをコードする役割を担うｖｄｈ遺伝子を欠失又は不活性化することなく得られる。

本発明の１つの目的は、バニリン分解経路に影響を与える遺伝子変異を有する変異株を同定することである。バニリンの分解はアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞のエネルギー源を生成するので、バニリンを唯一の炭素源とする場合に増殖できなくなる変異体をスクリーニングすることで、バニリン分解経路に影響を与える変異を発見できるであろう。さらに、バニリルアルコールはアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞によってバニリンに変換され、バニリルアルコールはバニリンよりもアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞に対する毒性が低いので、バニリンの代わりにバニリルアルコールを唯一の炭素源として使用しても、スクリーニングが実行され得る。

したがって、一態様では、本発明は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生型株と比較して、バニリンからバニリン酸への分解が減少していることを示すアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株を選択する方法を提供する。本発明の方法に従って、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種ＡＴＣＣ ３９１１６の胞子は、化学変異誘発剤（例えば、メタンスルホン酸メチル）に曝露され、バニリン又はバニリルアルコールのどちらかを唯一の炭素源として含有する液体培地中で増殖される。さらに、本発明のスクリーニング法は、液体培地にペニシリンなどの抗生物質を添加するステップ（ペニシリン濃縮技術としても知られている）もまた含む。ペニシリン濃縮技術は、ペニシリンが、細胞壁の構造的完全性に不可欠なペプチドグリカンポリマーの架橋を阻害することにより、増殖細胞のみを死滅させ得るという事実を活用する。バニリン酸利用経路に変異を有するアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞は、バニリン又はバニリルアルコールを唯一のエネルギー源として含有する増殖培地では増殖できず、細胞分裂も起こさないので、ペニシリン処理に耐えるであろう。その一方で、バニリン又はバニリルアルコールを食して増殖している野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞は、ペニシリンによって死滅する。

本発明に従って同定された変異株は、野生型株と比較して顕著に減少したバニリン酸の蓄積を示す。一実施形態では、本発明によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。別の実施形態では、本発明によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．２５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。なおも別の実施形態では、本発明によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。別の実施形態では、本変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．２５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。

別の態様では、本発明は、ｇｌｔＢＤオペロンにおける変異を有するアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株を提供する。本発明者らは、全ゲノム配列決定を通じて、ｇｌｔＢＤオペロンにおける変異がバニリン酸利用経路の欠陥、したがってバニリンからバニリン酸への分解が減少している表現型をもたらし得ることを予想外に見いだした。いくつかの実施形態では、本教示によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、配列番号１の核酸配列を含むｇｌｔＢ遺伝子における、１つ又は複数の変異を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号３の核酸配列を含むｇｌｔＤ遺伝子中に１つ又は複数の変異を有する、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株を提供する。ｇｌｔＢＤオペロン又はｇｌｔＢ遺伝子又はｇｌｔＤ遺伝子における１つ又は複数の変異は、欠失、挿入、フレームシフト変異、プロモーター変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、点変異、及びあらゆるそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。本発明によれば、ｇｌｔＢＤオペロン又はｇｌｔＢ遺伝子又はｇｌｔＤ遺伝子における、欠失、挿入、フレームシフト変異、プロモーター変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、点変異、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つの変異はバニリン酸利用経路の機能的不活性化を引き起こし得て、それはバニリンからバニリン酸への分解の減少をもたらす。

別の態様では、本発明は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種のＡＴＣＣ ３９１１６株における供給原料としてフェルラ酸を使用する、バニリン生産を改善するための方法を提供する。方法は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種のＡＴＣＣ ３９１１６株に、具体的には、バニリンのバニリン酸への分解を制御する役割を担う内因性遺伝子に、１つ又は複数の変異を引き起こすことを含む。１つ又は複数の変異は、内在性ｇｌｔＢＤオペロン、配列番号１の核酸配列を含むｇｌｔＢ遺伝子、配列番号３の核酸配列を含むｇｌｔＤ遺伝子、又はそれらの任意の組み合わせ内に位置し得る。好ましい実施形態では、方法はまた、フェルラ酸のバニリンへの異化を制御する役割を担う内因性遺伝子に１つ又は複数の変異を引き起こすことを含み得る。例えば、１つ又は複数の変異は、配列番号５の核酸配列を含む内因性遺伝子（ｅｃｈＲ遺伝子）中に位置し得る。同時係属出願に記載されるように、本発明者らは、配列番号５の核酸配列を含む内因性遺伝子における１つ又は複数の変異が、ｅｃｈ－ｆｃｓオペロンのリプレッサーとして機能する配列番号６のアミノ酸配列を含むタンパク質（ＥｃｈＲタンパク質）の機能的不活化をもたらし得ることを予想外に見いだした。ｅｃｈ－ｆｃｓオペロンは、フェルラ酸からバニリンへの生物変換する役割を担う、フェルロイル－コエンザイムＡ（ＣｏＡ）合成酵素とエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼ酵素をコードする遺伝子を制御する。ＥｃｈＲタンパク質を不活性化することによって、Ｅｃｈ及びＦｃｓタンパク質をコードする遺伝子の転写はもはや抑制されなくなる。その結果、フェルラ酸が菌株に供給されると、通常観察される４時間以上の遅滞期間なしに、ほぼ即座にバニリンが産生される。したがって、一態様では、本発明は、ｇｌｔＢＤオペロンにおける第１の変異と、配列番号５の核酸配列を含むｅｃｈＲ遺伝子における第２の変異とを有する、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株をさらに提供する。ｇｌｔＢＤオペロン及びｅｃｈＲ遺伝子の変異は、欠失、挿入、フレームシフト変異、プロモーター変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、点変異、及びそれらの組み合わせからなる群から独立して選択され得る。前述の実施形態のいずれにおいても、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種のＡＴＣＣ ３９１１６株の胞子を化学変異誘発に供することによって、記載された変異のいずれかが引き起こされ得る。代案の実施形態では、ｇｌｔＢＤオペロン及びｅｃｈＲ遺伝子における変異の少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲ技術又は他の任意の適切な組換えＤＮＡ技術を使用したマーカーレス遺伝子修飾によって引き起こされ得て、その結果、ｌｔＢ遺伝子、ｇｌｔＤ遺伝子及び／又はｅｃｈＲ遺伝子は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞内で機能しなくなる。特定の実施形態では、ｇｌｔＢ遺伝子、ｇｌｔＤ遺伝子及び／又はｅｃｈＲ遺伝子の変異の少なくとも１つは、化学変異誘発によって引き起こされ得て、ｇｌｔＢ遺伝子、ｇｌｔＤ遺伝子及び／又はｅｃｈＲ遺伝子の変異の少なくとも１つは、遺伝子編集によって引き起こされ得る。

一態様では、本開示は、本明細書に記載のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株を使用して、バニリンを生産する方法に関する。好ましい実施形態では、使用される変異株は、ｇｌｔＢＤオペロン中の１つ又は複数の変異と、ｅｃｈＲ遺伝子中の１つ又は複数の変異とを含む。特定の実施形態では、供給原料としてフェルラ酸を使用するバニリンを生産するための本方法で使用される変異株は、外因性の核酸分子を有していないため、非遺伝子改変生物（非ＧＭＯ）として認定され得る。いくつかの実施形態では、フェルラ酸からバニリンを生産する方法は、（ｉ）変異株を培地中で培養するステップと；（ｉｉ）フェルラ酸を培地に添加して、フェルラ酸からバニリンへの生物変換を開始するステップと、（ｉｉｉ）培地からバニリンを抽出するステップとを含み得る。

本明細書に記載の生物変換方法は、混合物からバニリンを回収することを含み得る。バニリンの回収は、当該技術分野で知られている任意の従来の単離又は精製方法に従って実行され得る。バニリンの回収に先立って、方法はまた、発酵混合物からバイオマス（酵素、細胞物質など）を除去することを含み得る。

本明細書に記載の方法及び／又は単離された組換え宿主細胞を使用して生産されたバニリンは、収集され、精製され、いくつかの消費可能な製品に組み込まれ得る。例えば、バニリンは、消費可能な製品と混合され得る。いくつかの実施形態では、バニリンは、望ましい味、風味、又は感覚を付与し、修正し、増強し、又は強化するのに十分な量で、或いは望ましくない味、風味、又は感覚を隠蔽し、修正し、又は最小化するのに十分な量で、消費可能な製品に組み込まれ得る。消費可能な製品は、例えば、食品、食品成分、食品添加物、飲料、薬物、及びタバコからなる群から選択され得る。消費可能な製品は、例えば、香水、化粧品、洗面用化粧品、ホームケア及びボディケア、洗剤、忌避剤、肥料、芳香剤、及び石鹸からなる群から選択され得る。

第１の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非ＧＭＯ変異株は、バニリンを産生し、バニリンをバニリン酸に代謝することができるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株を少なくとも１つの変異原に曝露することによって形成される、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株を含み、前記株と対比した前記変異株におけるバニリン酸の蓄積レベルによって測定されるように、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株は、バニリンを産生することができ、前記株よりもバニリンからバニリン酸へのより少ない分解を示し、いくつかの実施形態では、変異株は非天然である。

第２の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株がＡＴＣＣ ３９１１６の変異体である、第１の実施形態に記載の株。

第３の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、第１及び第２の実施形態に記載の株。

第４の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．２５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、第１及び第２の実施形態に記載の株。

第５の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、第１及び第２の実施形態に記載の株。

第６の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．２５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、第１及び第２の実施形態に記載の株。

第７の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株のゲノムが、ｇｌｔＢＤオペロン中に１つ又は複数の変異を含む、第１～６の実施形態に記載の変異株。

第８の実施形態：ｇｌｔＢＤオペロンにおける１つ又は複数の変異が、ｇｌｔＢ遺伝子中に少なくとも１つの変異を含む、第７の実施形態に記載の変異株。

第９の実施形態：ｇｌｔＢ遺伝子における１つ又は複数の変異が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、第８の実施形態に記載の変異株。

第１０の実施形態：１つ又は複数の変異が、配列番号１を含むｇｌｔＢ遺伝子中にある、第８の実施形態に記載の変異株。

第１１の実施形態：ｇｌｔＢＤオペロンにおける１つ又は複数の変異が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むｇｌｔＤ遺伝子中にある、第７～１０の実施形態に記載の変異株。

第１２の実施形態：ｇｌｔＢＤオペロンにおける１つ又は複数の変異が、核酸配列番号３を含むｇｌｔＤ遺伝子中にある、第７～１０の実施形態に記載の変異株。

第１３の実施形態：核酸配列番号５を含む内因性遺伝子ｅｃｈＲ中に変異をさらに含む、第７～１２の実施形態に記載の変異株。

第１４の実施形態：前記１つ又は複数の変異が、欠失、挿入、フレームシフト変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、及び点変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異である、第７～１３の実施形態のいずれか１つに記載の変異株。

第１５の実施形態：前記変異が、２ｂｐの挿入を含むフレームシフト変異である、第１４の実施形態に記載の変異株。

第１６の実施形態：任意の外因性遺伝物質の導入によって変異株を恒久的に修飾することなく、変異株が得られる、第１～１５の実施形態に記載の変異株。

第１７の実施形態：変異株は、株を変異原メタンスルホン酸メチルと接触させることによって得られる。

第１８の実施形態：第１～１６の実施形態のいずれか１つに記載の変異株を、基質を含む適切な培地中で培養するステップと；産生されたバニリンを回収するステップとを含む、バニリンを生産するための方法。

第１９の実施形態：第１～第１８の実施形態のいずれか１つに記載のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株を、炭素源を含有する培地中で培養するステップと；フェルラ酸がバニリンに変換されるのに十分な時間、フェルラ酸を変異株に供給するステップとを含む、バニリンを生産するための方法。

第２０の実施形態：バニリンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子と、ｇｌｔＢＤオペロンにおける少なくとも１つの変異とを含む、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非天然株を含み、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記株が、ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記少なくとも１つの変異がないアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株よりも少ないバニリンをバニリン酸に変換する、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株。

第２１の実施形態：ｇｌｔＢＤオペロンにおける１つ又は複数の変異が、ｇｌｔＢ遺伝子中に少なくとも１つの変異を含む、第２０の実施形態に記載の株。

第２２の実施形態：１つ又は複数の変異が、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含むｇｌｔＢ遺伝子中にある、第２１の実施形態に記載の株。

第２３の実施形態：１つ又は複数の変異が、配列番号１を含むｇｌｔＢ遺伝子中にある、第２１の実施形態に記載の株。

第２４の実施形態：ｇｌｔＢＤオペロンにおける１つ又は複数の変異が、ｇｌｔＤ遺伝子中にある、第２０の実施形態に記載の株。

第２５の実施形態：ｇｌｔＤ遺伝子における１つ又は複数の変異が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、第２４の実施形態に記載の株。

第２６の実施形態：ｇｌｔＤ遺伝子における１つ又は複数の変異が、核酸配列番号３を含む、第２４の実施形態に記載の株。

第２７の実施形態：核酸配列番号５を含む内因性遺伝子ｅｃｈＲ中に変異をさらに含む、第２０～２６の実施形態に記載の株。

第２８の実施形態：アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非天然株が組換え株である、第２０～２７の実施形態の１つに記載の株。

第２９の実施形態：
ａ．アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記非天然株を、基質を含み、その中でアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記非天然株の活動によって、基質の少なくとも一部がバニリンに変換される、適切な培地中で培養するステップと；
ｂ．産生されたバニリンを回収するステップと
を含む、第２０～２８の実施形態のいずれか１つに記載の非天然株を培養するステップを含むバニリンを生産するための方法。

第３０の実施形態：第２０～２８の実施形態のいずれか１つに記載のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非天然株を、炭素源を含む培地中で培養するステップと；フェルラ酸がバニリンに変換されるのに十分な時間、フェルラ酸を変異株に供給するステップとを含む、バニリンを生産するための方法。

本発明のその他の特徴及び利点は、添付図面を参照した以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

配列の簡単な説明
表１は、本明細書及び添付の配列表で開示される配列を簡単に説明する。当業者には知られているように、原核生物はホルミルメチオニンとして翻訳される代替開始コドン、主にＧＵＧ及びＵＵＧを使用することに留意されたい。

本開示をより良く理解するために、添付図面を参照されたい。

アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種におけるバニリンの代謝経路である。 供給原料としてフェルラ酸を使用する、４４時間の生物変換プロセスの終了時のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生株及び変異株における、バニリン、バニリン酸、バニリルアルコールのレベルである。２つの変異株６－Ｅ１１及び１２－Ｈ１１は、ｇｌｔＢＤオペロンに変異を有し、バニリン酸利用経路に欠陥を有する。 アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生型及び６－Ｅ１１株における、フェルラ酸の利用とバニリン、バニリン酸、及びバニリルアルコールの産生の動態である。変異株６－Ｅ１１は、ｇｌｔＢＤオペロンにおける変異と、欠陥のあるバニリン酸利用経路とを有する。

本明細書の用法では、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、内容上例外が明記されていない限り、複数の指示対象が含まれる。

「含む」、「有する」などの用語が説明又は特許請求の範囲で使用される限りでは、このような用語は、請求項における転換語として使用される場合に解釈される「含む」と同様の様式で、「含む」を包含することが意図される。

「例示的な」という語は、本明細書では、例、実例、又は例示として機能することを意味するために使用される。本明細書で「例示的」として記載されるあらゆる実施形態は、必ずしもその他の実施形態よりも好ましい、又は有利であると解釈されるべきではない。

「細胞系」は、異所性タンパク質の発現を提供する任意の細胞である。これには、細菌、酵母、植物細胞、及び動物細胞が含まれる。これには、原核細胞と真核細胞の双方が含まれる。これには、リボソームなどの細胞構成要素に基づくタンパク質の生体外発現もまた含まれる。

「コード配列」には、当業者にとってその通常の慣用的な意味が与えられ、特定のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を指すために、限定されることなく使用される。

細胞系の「増殖」又は「培養」には、細胞の増殖と分裂を可能にする適切な培地を提供することが含まれる。これには、細胞又は細胞構成要素が変換されて、組換えタンパク質が作成され得るようにリソースを提供することもまた含まれる。

「相補的」という用語には、当業者にとってその通常の慣用的な意味が与えられ、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために限定されることなく使用される。例えば、ＤＮＡに関しては、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、主題技術には、添付の配列表に報告される完全な配列に相補的な単離核酸断片、並びにそれらの実質的に類似した核酸配列もまた含まれる。

「核酸」及び「ヌクレオチド」という用語には、当業者にとってそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられ、一本鎖又は二本鎖の形態のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指すために、限定されることなく使用される。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の指示がない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列と並んで、その保存的修飾又は縮重変異型（例えば、縮重コドン置換）及び相補配列もまた暗黙的に包含する。

「単離」という用語には、当業者にとってその通常の慣用的な意味が与えられ、単離核酸又は単離ポリペプチドの文脈で使用される場合、人の手によって本来の環境から離れて存在し、したがって天然産物ではない核酸又はポリペプチドを指すために、限定されることなく使用される。単離核酸又は単離ポリペプチドは、精製形態で存在し得て、又は例えば、遺伝子組換え宿主細胞などの非天然環境で存在し得る。

「インキュベートする」及び「インキュベーション」という用語は、本明細書の用法では、２つ以上の化学的又は生物学的実体（化合物及び酵素など）を混合し、バニリンの生成に好ましい条件下でそれらを相互作用させるプロセスを意味する。

「縮重変異型」という用語は、１つ又は複数の縮重コドン置換によって参照核酸配列とは異なる残基配列を有する核酸配列を指す。縮重コドン置換は、その中で１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る。核酸配列及びその全ての縮重変異型は、同じアミノ酸又はポリペプチドを発現するであろう。

「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語には、当業者にとってそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられ；３つの用語は時に同義的に使用され、そのサイズ又は機能に関係なく、アミノ酸のポリマー又はアミノ酸類似体を指すために、限定されることなく使用される。「タンパク質」は比較的大型のポリペプチドに関して使用されることが多く、「ペプチド」は小型のポリペプチドに関して使用されることが多いが、当該技術分野におけるこれらの用語の使用は重複しており様々である。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、本明細書の用法では、特に明記されない限り、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、ポリヌクレオチド産物を指す場合、本明細書で同義的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドとしては、ポリヌクレオチド産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、及び前述のもののその他の等価物、変異型、及び類似体が挙げられる。

「ポリペプチド断片」及び「断片」という用語には、参照ポリペプチドに関して使用される場合、当業者にとってその通常の慣用的な意味が与えられ、参照ポリペプチド自体と比較してアミノ酸残基が欠失しているが、残りのアミノ酸配列は通常、参照ポリペプチド内の対応する位置と同一であるポリペプチドを指すために、限定されることなく使用される。このような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端、又はその双方で起こり得る。

ポリペプチド又はタンパク質の「機能的断片」は、全長ポリペプチド又はタンパク質の一部であり、全長ポリペプチド又はタンパク質と実質的に同じ生物学的活性を有するか、又は実質的に同じ機能を遂行する（例えば、同じ酵素反応を遂行する）ペプチド断片を指す。

同義的に使用される「変異型ポリペプチド」、「修飾アミノ酸配列」又は「修飾ポリペプチド」という用語は、例えば、１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は付加など、参照ポリペプチドと１つ又は複数のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を指す。一態様では、変異型は、参照ポリペプチドの能力の一部又は全部を保持する「機能的変異型」である。

「機能的変異型」という用語には、保存的に置換された変異体もさらに含まれる。「保存的置換変異型」という用語は、１つ又は複数の保存的アミノ酸置換によって参照ペプチドと異なり、参照ペプチドの活性の一部又は全部を維持するアミノ酸配列を有するペプチドを指す。「保存的アミノ酸置換」は、機能的に類似した残基によるアミノ酸残基の置換である。保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基の別の非極性残基への置換；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、スレオニンとセリンの間など、１つの荷電又は極性（親水性）残基の別の極性残基への置換；リジン又はアルギニンなどの１つの塩基性残基の別の塩基性残基への置換；又は、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの酸性残基の別の酸性残基への置換；又はフェニルアラニン、チロシン、又はトリプトファンなどの芳香族残基の別の芳香族残基への置換が挙げられる。このような置換は、タンパク質又はポリペプチドの見かけの分子量又は等電点に、ほとんど又は全く影響を及ぼさないと予想される。「保存的置換変異型」という語句には、得られたペプチドが本明細書に記載の参照ペプチドの活性の一部又は全部を維持するという条件で、残基が、化学的に誘導体化された残基で置換されたペプチドもまた含まれる。

主題技術のポリペプチドに関連する「変異型」という用語には、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらには１００％同一のアミノ酸配列を有する、機能的に活性なポリペプチドがさらに含まれる。

「相同」という用語は、全てのその文法的形態や綴りのバリエーションにおいて、「共通の進化的起源」を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の関係を指し、スーパーファミリーからのポリヌクレオチド又はポリペプチド、異なる種からの相同ポリヌクレオチド又はタンパク質が含まれる（Ｒｅｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，ＣＥＬＬ ５０：６６７，１９８７）。このようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは、同一性百分率又は保存された位置での特定のアミノ酸又はモチーフの存在のいずれに関しても、それらの配列類似性に反映されるように、配列相同性を有する。例えば、２つの相同ポリペプチドは、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、及びさらには１００％同一のアミノ酸配列を有し得る。

「適切な制御配列」には、当業者にとって通常の慣用的な意味が与えられ、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内、又はコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連コード配列の転写、ＲＮＡプロセシング又は安定性、又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指すために、限定されることなく使用される。制御配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、及びポリアデニル化認識配列が挙げられてもよい。

「プロモーター」には、当業者にとってその通常の慣用的な意味が与えられ、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を指すために、限定されることなく使用される。一般に、コード配列はプロモーター配列の３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよく、又は自然界で見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよく、又は合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが、異なる組織又は細胞型において、又は発生の異なる段階において、又は異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を誘導してもよいことは、当業者には理解される。ほとんどの細胞型でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全には定義されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいことがさらに認識されている。

「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の核酸配列が結合していることを指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と作動可能に連結されている。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向で、制御配列と作動可能に連結し得る。

「発現」という用語には、本明細書の用法では、当業者にとってその通常の慣例的な意味が与えられ、主題技術の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）又はアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積を指すために、限定されることなく使用される。「過剰発現」とは、正常な生物又は非形質転換生物における産生レベルを超える、遺伝子組換え生物又は組換え生物における遺伝子産物の産生を指す。

「形質転換」には、当業者にとってその通常の慣例的な意味が与えられ、標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を指すために、限定されることなく使用される。移入されたポリヌクレオチドは、標的細胞のゲノム又は染色体ＤＮＡに組み込まれ得て、遺伝的に安定した遺伝をもたらし、又はそれは宿主染色体とは独立して複製され得る。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子組換え」又は「形質転換」又は「組換え」と称される。

「形質転換」、「遺伝子組換え」、及び「組換え」という用語には、宿主細胞と関連して本明細書で使用される場合、当業者にとってそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられ、その中に異種核酸分子が導入されている植物又は微生物細胞などの宿主生物の細胞を指すために、限定されることなく使用される。核酸分子は宿主細胞のゲノムに安定して組み込まれ得て、又は核酸分子は染色体外分子として存在し得る。このような染色体外分子は自動複製し得る。形質転換された細胞、組織、又は対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、その遺伝子組換え子孫もまた包含するものと理解される。

「組換え」、「異種」、及び「外因性」という用語には、ポリヌクレオチドと関連して本明細書で使用される場合、当業者にとって通常の慣用的な意味が与えられ、特定の宿主細胞にとって外来性の起源に由来するか、又は同じ起源に由来する場合はその元の形態から修飾されているポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列又は遺伝子）を指すために、限定されることなく使用される。したがって、宿主細胞における異種遺伝子には、特定の宿主細胞にとって内因性であるが、例えば、部位特異的変異誘発又はその他の組換え技術の使用を通じて修飾された遺伝子が含まれる。この用語には、天然に存在するＤＮＡ配列の非天然の複数コピーもまた含まれる。したがって、この用語は、細胞にとって外来又は異種であるＤＮＡセグメント、又は細胞にとって相同であるが、宿主細胞内で通常その要素が見いだされない位置又は形態にあるＤＮＡセグメントを指す。

本発明で定義されるように、別の生物に由来する外因性核酸を含む生物は、遺伝子改変生物（ＧＭＯ）と見なされる。外因性核酸分子の導入なしに生物が遺伝子改変されている場合、その生物は非遺伝子改変生物（非ＧＭＯ）と見なされ得る。非ＧＭＯは、いかなる外因性核酸配列も有することなく、遺伝子のコード配列における点変異又は遺伝子のコード領域全体の欠失など、内因性核酸に１つ以上の遺伝的修飾を有してもよい。

同様に、「組換え」、「異種」、及び「外因性」という用語は、ポリペプチド又はアミノ酸配列と関連して本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞にとって外来性の起源に由来するか、又は同じ起源に由来する場合はその元の形態から修飾されているポリペプチド又はアミノ酸配列を意味する。したがって、組換えＤＮＡセグメントが宿主細胞内で発現されて、組換えポリペプチドが産生され得る。

「タンパク質発現」は、遺伝子発現後に起こるタンパク質産生を指す。それは、ＤＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写された後の段階からなる。次に、ｍＲＮＡはポリペプチド鎖に翻訳され、最終的にタンパク質に折り畳まれる。ＤＮＡは、核酸を細胞に意図的に導入するプロセスである形質移入によって細胞内に存在する。この用語は、真核細胞における非ウイルス性の方法に対して使用されることが多い。これはまた、その他の方法及び細胞型を指してもよいが、別の用語が好ましい：細菌、植物細胞をはじめとする非動物性真核細胞における非ウイルス性ＤＮＡ移入を記述するためには、「形質転換」がより頻繁に使用される。動物細胞においては、形質転換は、これらの細胞におけるがん状態への進行（発がん）を指すのにもまた使用されるため、形質移入が推奨用語である。形質導入は、ウイルスを介したＤＮＡ移入を記述するために使用されることが多い。形質転換、形質導入、及びウイルス感染は、本出願における形質移入の定義に含まれる。

「プラスミド」、「ベクター」、及び「カセット」という用語には、当業者にとってそれぞれの通常の慣用的な意味が与えられ、細胞の中枢代謝の一部ではない遺伝子をしばしば保有し、通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態である、染色体外要素を指すために、限定されることなく使用される。このような要素は、任意の起源に由来する、自律複製配列、ゲノム組み込み配列、直線状又は環状の一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡのファージ配列又はヌクレオチド配列であってもよく、その中ではいくつかのヌクレオチド配列が結合又は組み換えられて、選択された遺伝子産物のプロモーター断片及びＤＮＡ配列が適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入できる、独自の構造になっている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する、特定のベクターを指す。「発現カセット」は、外来遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて異種宿主におけるその遺伝子の発現の増強を可能にする要素を有する、特定のベクターを指す。

本明細書の用法では、「配列同一性」は、最適に整列された２つのポリヌクレオチド又はペプチド配列が、例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸などの構成要素のアライメントのウィンドウ全体を通じて不変である程度を指す。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性率」は、２つの整列された配列によって共有される同一構成成分の数を、参照配列セグメント、すなわち、参照配列全体又は参照配列のより小さな定義された部分の構成成分の総数で除したものである。

本明細書の用法では、「配列同一性百分率」又は「同一性百分率」という用語は、２つの配列が最適に整列されている場合（適切なヌクレオチドの挿入、欠失又はギャップの合計が、比較ウィンドウ全体にわたって参照配列の２０％未満）における、試験（「クエリー」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）の直鎖ポリヌクレオチド配列における、試験（「対象」）ポリヌクレオチド分子（又はその相補鎖）と比較した同一ヌクレオチドの百分率を指す。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適なアライメントは、当業者には周知であり、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎの類似性検索法などのツールによって、好ましくは、ＧＣＧ（登録商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージ（登録商標）（Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）の一部として利用可能なＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのこれらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装によって、実施されてもよい。試験配列と参照配列の整列されたセグメントの「同一性率」は、２つの整列された配列によって共有される同一構成成分の数を、参照配列セグメント、すなわち、参照配列全体又は参照配列のより小さな定義された部分の構成成分の総数で除したものである。配列同一性百分率は、同一性の割合に１００を乗じたものとして表される。１つ又は複数のポリヌクレオチド配列の比較は、全長ポリヌクレオチド配列又はその一部、或いはより長いポリヌクレオチド配列に対するものであってもよい。本発明の目的のために、「同一性百分率」はまた、翻訳されたヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を使用し、ポリヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を使用して、判定されてもよい。

配列同一性の百分率は、好ましくは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（商標）（Ｖｅｒｓｉｏｎ １０；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」又は「Ｇａｐ」ログラムを使用して判定される。「Ｇａｐ」は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ４８：４４３－４５３，１９７０）を利用して、マッチの数を最大化してギャップの数を最小化する、２つの配列のアライメントを見つける。「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，ＡＤＶＡＮＣＥＳ ＩＮ ＡＰＰＬＩＥＤ ＭＡＴＨＥＭＡＴＩＣＳ，２：４８２－４８９，１９８１；Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １１：２２０５－２２２０，１９８３）を使用して、２つの配列間の類似性が最も高いセグメントの最適なアライメントを実施し、ギャップを挿入して一致数を最大化する。同一性百分率は、最も好ましくは「Ｂｅｓｔ Ｆｉｔ」プログラムを使用して判定される。

配列同一性を判定するための有用な方法はまた、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４から公的に入手可能な基本的局所アライメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）プログラムでも開示され；ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，ＮＣＢＩ，ＮＬＭ，ＮＩＨ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＭＯＬ．ＢＩＯＬ．２１５：４０３－４１０（１９９０）を参照されたい；ＢＬＡＳＴプログラムのバージョン２．０以降では、アライメントへのギャップ（欠失と挿入）の導入が可能であり；ペプチド配列の場合、ＢＬＡＳＴＸを使用して配列同一性が判定され得て；ポリヌクレオチド配列の場合、ＢＬＡＳＴＮを使用して配列同一性が判定され得る。

本明細書の用法では、「実質的な配列同一性百分率」という用語は、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は例えば、約９８％又は約９９％の配列同一性などのさらに大きな配列同一性百分率を指す。したがって、本発明の一実施形態は、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、又は例えば、約９８％又は約９９％の配列同一性などのさらに大きな配列同一性を有するポリヌクレオチド分子である。本発明の活性遺伝子を有するポリヌクレオチド分子は、バニリンの産生を誘導でき、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性百分率を有し、本発明の範囲内に包含される。

同一性とは、配列のアライメント後の１対の配列間で同一であるアミノ酸の割合（これは配列情報、構造情報、又はその他の情報のみを使用して実行され得るが、通常は配列情報のみに基づく）であり、類似性は、何らかの類似性マトリックスを使用したアライメントに基づいて割り当てられたスコアである。類似性指標は、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、又はＧＯＮＮＥＴ、又はタンパク質の配列アライメントのために当業者によって使用される任意のマトリックスのいずれか１つであり得る。

同一性は、２つのサブ配列間の一致度（配列間にギャップがない）である。２５％以上の同一性が機能の類似性を意味する一方、１８～２５％は構造又は機能の類似性を意味する。２つの完全に無関係な配列又はランダムな配列（１００残基を超える配列）は、２０％を超える同一性を有し得ることに留意されたい。類似性は、２つの配列を比較した場合の類似度である。これはそれらの同一性に依存する。

当業者であれば、発現ベクターの調製に利用可能な分子生物学技術を承知しているであろう。上述のように、主題技術の発現ベクターに組み込むために使用されるポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの日常的技術によって調製され得る。分子クローニングにおいて、ベクターは、外来の遺伝物質を人為的に別の細胞に運び、そこで複製及び／又は発現させるためのビヒクルとして使用されるＤＮＡ分子のことである（例えば、プラスミド、コスミド、λファージ）。外来ＤＮＡを含有するベクターは、組換えＤＮＡと見なされる。ベクターの主な４つの種類は、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、及び人工染色体である。このうち、最も一般的に使用されるベクターはプラスミドである。全ての操作されたベクターに共通するのは、複製起点、マルチクローニング部位、及び選択マーカーである。

相補的付着端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結するための、いくつかの分子生物学技術が開発されてきた。一実施形態では、相補的ホモポリマートラクトが、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に付加され得る。次に、ベクターと核酸分子が相補的ホモポリマー尾部間の水素結合によって連結され、組換えＤＮＡ分子が形成される。

代案の実施形態では、提供される１つ又は複数の制限部位を含有する合成リンカーを使用して、主題技術のポリヌクレオチドを発現ベクターに作動可能に連結する。一実施形態では、ポリヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼ消化によって生産される。一実施形態では、核酸分子は、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩで処理され、これらの酵素は、それらの３’－５’－エキソヌクレオチド分解活性によって突出した３’一本鎖末端を除去し、それらの重合活性によって陥凹３’末端を埋めることで、平滑末端化ＤＮＡセグメントを生成する。次に、平滑末端化セグメントは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの平滑末端化ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒できる酵素の存在下で、モル過剰量のリンカー分子と共にインキュベートされる。したがって、反応の生成物は、その末端にポリマーリンカー配列を有するポリヌクレオチドである。次に、これらのポリヌクレオチドは適切な制限酵素で切断され、ポリヌクレオチドの末端と適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターにライゲートされる。

代案としては、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を有するベクターが採用され得る。次に必要なＰＣＲ増幅ポリヌクレオチドが、制限消化又はライゲーションなしにＬＩＣベクターにクローン化され得る（そのそれぞれが参照により本明細書に援用される、Ａｓｌａｎｉｄｉｓ ａｎｄ ｄｅ Ｊｏｎｇ，ＮＵＣＬ．ＡＣＩＤ ＲＥＳ．１８ ６０６９－７４，（１９９０）；Ｈａｕｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ １３，５１５－１８（１９９２））。

一実施形態では、選択されたプラスミドに挿入するための目的のポリヌクレオチドを単離及び／又は修飾するために、ＰＣＲを使用することが適切である。配列のＰＣＲ調製で使用するための適切なプライマーが設計され、核酸分子の必要なコード領域が単離され、制限エンドヌクレアーゼ又はＬＩＣ部位が付加されて、コード領域が所望のリーディングフレーム内に配置され得る。

一実施形態では、主題技術の発現ベクターに組み込むためのポリヌクレオチドは、ＰＣＲに適したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して調製される。コード領域が増幅される一方で、プライマー自体は増幅された配列産物に組み込まれる。一実施形態では、増幅プライマーは、増幅された配列産物を適切なベクターにクローン化できるようにする、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有する。

発現ベクターは、従来の形質転換又は形質移入技術によって、微生物宿主細胞に導入され得る。主題技術の発現ベクターによる適切な細胞の形質転換は、当該技術分野で既知の方法によって達成され、典型的にはベクターと細胞の双方方の種類に依存する。適切な技術としては、リン酸カルシウム又は塩化カルシウムの共沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介形質移入、リポフェクション、ケモポレーション又は電気穿孔が挙げられる。

成功裏に形質転換された細胞、すなわち、発現ベクターを含有する細胞は、当該技術分野で周知の技術によって同定され得る。例えば、主題技術の発現ベクターで形質移入された細胞が培養され、本明細書に記載のポリペプチドが産生され得る。細胞は、当該技術分野で周知の技術によって発現ベクターＤＮＡの存在について調べられ得る。

宿主細胞は、以前記載されている発現ベクターの単一コピー、又は発現ベクターの複数コピーを含有し得る。

バニリンの発酵生産
フェルラ酸は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種内で、２つの酵素、すなわち、ｆｃｓ遺伝子によってコード化されるフェルロイル－コエンザイムＡ（ＣｏＡ）シンセターゼと、ｅｃｈ遺伝子によってコード化されるエノイル－ＣｏＡヒドラターゼ／アルドラーゼとによって媒介される、非酸化的脱アセチル化経路を経て、バニリンに代謝される。どちらの遺伝子（ｅｃｈ及びｆｃｓ）も単一のオペロン内にある。アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生型及び変異株は、供給原料としてフェルラ酸を使用してバニリンを生産するための生物変換プロセスに使用されている。

フェルラ酸からバニリンへの生物変換のために、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種ＡＴＣＣ ３９１１６を使用する上での１つの大きな課題は、ｖｄｈ遺伝子によってコードされるバニリンデヒドロゲナーゼＶｄｈによるバニリンからバニリン酸への同時分解である。バニリンに対するバニリンデヒドロゲナーゼの作用の結果として、供給原料としてフェルラ酸を使用した生物変換プロセスにおけるバニリン収量が大幅に減少する。ｖｄｈ遺伝子の遺伝子操作によって、バニリンデヒドロゲナーゼを機能的に不活化する努力がなされてきた。本発明は、ｖｄｈ遺伝子を直接欠失させるか又は不活性化することなく、著しく減少したバニリンからバニリン酸への分解を示す、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の新規変異株を提供する。本発明のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は化学変異誘発を使用して得られ、バニラからバニリン酸への分解が減少している表現型を与える遺伝子変異の性質は、全ゲノム配列決定を使用して同定された。

本発明は、バニリン酸利用経路に関与するタンパク質（例えば、酵素及び調節タンパク質）をコードする遺伝子における変異誘発頻度を高めるための、変異誘発性化学物質が関与するプロトコルを提供する。

いくつかの異なる化学的変異誘発剤が、当該技術分野で良く知られている。それらのいずれか１つが本発明で使用されて、バニリン酸利用経路に関与するタンパク質（例えば、酵素及び／又は調節タンパク質）をコードする１つ又は複数の遺伝子における変異の頻度を高め得る。化学的変異誘発剤の１つのクラスとしては、ＤＮＡの４つの塩基の１つに類似した塩基類似体が挙げられる。このような塩基類似体の組み込みは、安定した変異を引き起こす。別の変異誘発性化学物質である亜酸化窒素は、酸化的脱アミノ化によって塩基のアミノ基をケト基に変換し得る。脱アミノ化（アミノ基の除去）の頻度は、アデニン＞シトシン＞グアニンの順である。アルキル化剤は、ＤＮＡのグアニン及びアデニン残基の水素結合酸素にアルキル基を付加するのに有用な、変異誘発剤の別のグループである。アルキル化の結果として、誤対合が導入され、イオン化の可能性が高まる。いくつかの広く使用されているアルキル化剤の例としては、硫酸ジメチル、メタンスルホン酸エチル、エタンスルホン酸エチル、及びメタンスルホン酸メチルが挙げられる。プリン・ピリミジン対と同程度の寸法の３環分子である、アクリジンオレンジ、プロフラビン、及びアクリフラビンなどの特定の色素もまた使用され得る。水溶液中では、これらの色素は、インターカレーションと称されるプロセスによって、ＤＮＡの隣接する塩基対の塩基間に挿入され得る。これらの挿入剤はＤＮＡを歪め、ＤＮＡ分子の自己複製後に欠失又は挿入が生じる。挿入剤によって引き起こされるこのような欠失又は挿入により、フレームシフト変異が起こり得る。前述のカテゴリーの変異誘発剤のいずれでも、本発明で使用され得る。

一態様では、所望の表現型（この場合、バニリン分解の減少）を有する変異株は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）などのバニリン産生生物の胞子を、当該技術分野で周知の手順に従って化学的変異原に供することによって得られ得る。バニリン分解経路に影響を与える遺伝子変異を有する変異体が選択される。具体的には、選択された変異体は欠陥のあるバニリン酸利用経路を示す。バニリンの分解はアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞のエネルギー源を生成するので、バニリンを唯一の炭素源とする場合に増殖できなくなる変異体をスクリーニングすることで、バニリン分解経路に影響を与える変異を発見できるであろう。さらに、バニリルアルコールはアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞によってバニリンに変換され、バニリルアルコールはバニリンよりもアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞に対する毒性が低いので、バニリンの代わりにバニリルアルコールを唯一の炭素源として使用しても、スクリーニングが実行され得る。さらに、本発明のスクリーニング法は、液体培地にペニシリンなどの抗生物質を添加するステップ（ペニシリン濃縮技術としても知られている）もまた含む。ペニシリン濃縮技術は、ペニシリンが、細胞壁の構造的完全性に不可欠なペプチドグリカンポリマーの架橋を阻害することにより、増殖細胞のみを死滅させ得るという事実を活用する。バニリン酸利用経路に変異を有するアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞は、バニリン又はバニリルアルコールを唯一のエネルギー源として含有する増殖培地では増殖できず、細胞分裂も起こさないので、ペニシリン処理に耐えるであろう。その一方で、バニリン又はバニリルアルコールを摂食して増殖している野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞は、ペニシリンによって死滅する。ペニシリン処理に続いて生き残った細胞は播種され、個々のコロニーからサンプルが採取され、フェルラ酸生物変換アッセイを使用してスクリーニングされて、所望の表現型、すなわち、野生型株と比較したバニリンとバニリン酸の比率の相対的な増加を有する変異株が同定される。好ましい実施形態では、栄養要求性変異体種を避けるため、生き残った細胞が、ペニシリンと、バニリン又はバニリルアルコールとを含む同じ培地に播種される。

欠陥のあるバニリン酸利用経路を有する変異株がひとたび選択されると、全ゲノム配列決定を使用して、観察された表現型を引き起こす変異の性質が同定される。本発明では、ｇｌｔＢＤオペロンにおける変異が観察された表現型に関連していることが分かった。より具体的には、配列番号１の核酸配列を含むｇｌｔＢ遺伝子の変異、及び／又は配列番号３の核酸配列を含むｇｌｔＤ遺伝子の変異が、バニリンからバニリン酸への分解が減少している観察された表現型に関連することが見いだされた。ｇｌｔＢ遺伝子及び／又はｇｌｔＤ遺伝子における１つ又は複数の変異は、欠失、挿入、フレームシフト変異、プロモーター変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、点変異、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され得て、ここで変異は、バニリン酸利用経路の機能的不活性化を引き起こすことができ、バニリンからバニリン酸への分解の減少をもたらす。

観察された表現型の誘導における同定された変異の役割は、同定された変異を野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞に導入し、導入された変異が所望の表現型を付与することを実証することによって検証され得る。野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞への同定された変異の導入は、微生物遺伝学の分野で周知の１つ又は複数の技術を使用して実施され得る。本発明の好ましい態様では、ｇｌｔＢＤオペロンにおける同定された変異の野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞への導入は、非ＧＭＯ状態を維持する目的で、外因性核酸がアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞に導入されないようにする技術を使用して実施される。

バニリンからバニリン酸への分解が減少しているアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株がひとたび選択されると、基質としてフェルラ酸を使用するバニリン生産の生物変換効率を改善することによって、この株の性能がさらに改善され得る。野生型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株におけるフェルラ酸からバニリンへの生物変換は、通常４～５時間の遅滞期間を示す。この遅滞期間は、ｆｃｓ遺伝子によってコード化されるフェルロイルコエンザイムＡ（ＣｏＡ）シンセターゼ及びｅｃｈ遺伝子によってコードされるエノイルＣｏＡヒドラターゼアルドラーゼの発現の抑制に起因する。これら２つの遺伝子の発現抑制は、ｅｃｈＲ遺伝子（配列番号５）によってコード化されるリプレッサータンパク質ＥｃｈＲ（配列番号６）によって制御される。ｅｃｈ及びｆｃｓ遺伝子の発現の抑制は、ＥｃｈＲリプレッサータンパク質の機能的不活化をもたらす適切な変異をｅｃｈＲ遺伝子に導入することによって克服され得る。当該技術分野で周知の技術を使用して、欠失、挿入、フレームシフト変異、プロモーター変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、点変異、又はそれらの任意の組み合わせをはじめとするがこれらに限定されるものではない、１つ又は複数の変異が導入され得て、これらを使用してＥｃｈＲリプレッサータンパク質が機能的に不活性化され得る。好ましい実施形態では、ＥｃｈＲリプレッサータンパク質の機能的不活性化をもたらすｅｃｈＲ遺伝子の変異は、非ＧＭＯの状態が維持されるように、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の選択された変異株に外因性の核酸配列を導入することなく、ｅｃｈＲ遺伝子に所望の変異を引き起こす微生物遺伝学の分野で周知の１つ又は複数の技術を使用して実施される。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）におけるベンズアルデヒドからベンジルアルコールへの変換に関与する酵素はまた、バニリンからバニリルアルコールへの還元する役割を担うことが報告されている。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのｙｅａＥ、ｄｋｇＡ、ｙｑｈＣ、ｙｑｈＤ、ｙａｈＫ、及びｙｊｇＢの欠失は、バニリンのさらなる減少を排除した。アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株では、これらの遺伝子のホモログが同定され得る。これらの遺伝子の１つ又は複数が不活性化されると、バニリルアルコールの生成が減少し又は排除され、バニリン収量が増加する。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の変異体アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞に対するさらなる遺伝子修飾は、微生物遺伝学の分野で周知のＣＲＩＳＰＡＲ／ＣＡＳシステムを使用して実行され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１６／０２９８０９６号明細書のＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム、材料と方法；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９：Ｄｅｌｅｔｉｏｎ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｄｅｓｉｒａｂｌｅ”Ｃｌｅａｎ”Ｍｕｔａｎｔ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ａｓ ａｎ Ｅｘａｍｐｌｅ，ＡＣＳ Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓｓｙｎｂｉｏ．６ｂ０００６０；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６），ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＣＲＩＳＰＲｉ）ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｓ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ ＰＣＣ ７９４２，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，１５：１９６；Ｋｕｉｖａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｆｏｒ ｇａｌａｃｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌａｃｔａｒｉｃ ａｃｉｄ ｃａｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，１５：２１０；Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，１６：２０１；Ｇｏｒｔｅｒ ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７），ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌａｇｅｒ ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ，Ｍｉｃｒｏｂ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔ，１６：２２２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｂａｓｅｄ Ｇｅｎｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｓｍａｌｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＤＯＩ：１０．１００２／ｓｍｔｄ．２０１９００５６０；Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ Ｇ ａｎｄ Ｂｉｋａｒｄ Ｄ（２０１９），Ｅｄｉｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｗａｙ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ，３７４：２０１８０１０３ ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９８／ｒｓｔｂ．２０１８．０１０３）．ｓｐ．を参照されたい）。

本発明のいくつかの実施形態では、機能的酵素は、アンチセンスＲＮＡ技術又はＲＮＡｉ技術を使用して不活化され得る（例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８），Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡ：ｔｈｅ ｎｅｗ ｆａｖｏｒｉｔｅ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｉｏｍｅｄ ＆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９（１０）：７３９－７４９；Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＣＲＩＳＰＲｉ ａｎｄ ＣＲＩＳＰＲａ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２４：５７９－５９１を参照されたい）。しかしながら、フェルラ酸からバニリンへの生物変換において非ＧＭＯ株を使用する本発明の精神において、機能性タンパク質を不活化するためのアンチセンスＲＮＡ技術及びＲＮＡｉ技術の使用が、商業規模でフェルラ酸からバニリンを生産するために選択された変異体アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株に、いかなる外因性遺伝物質も導入せず、非ＧＭＯ状態を維持することを確認する必要がある。

培養ブロスは、バイオリアクター内で調製され滅菌され得る。次に、本発明による遺伝子操作宿主株が培養ブロスに接種され、増殖期が開始され得る。増殖期の適切な持続時間は、約５～４０時間、好ましくは約１０～３５時間、最も好ましくは約１０～２０時間であり得る。

増殖期の終了後、基質フェルラ酸が培養物に供給され得る。基質供給物の適切な量は、発酵ブロス１Ｌ当たり０．１～４０ｇ、好ましくは約０．３～３０ｇ／Ｌであり得る。基質は固体材料として、又は水溶液又は懸濁液として供給され得る。基質の総量は、１つのステップで、２つ以上の供給ステップで、又は連続的に供給され得る。

本発明で開発されたアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株を使用した生物変換段階は、基質の供給開始と共に始まり、全ての基質が生成物及び副生成物に変換されるまで、約５～５０時間、好ましくは１０～４０時間、最も好ましくは１５～３０時間持続し得る。バニリンからバニリン酸への顕著な分解を示す野性型アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の細胞とは異なり、本発明で開発されたアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株は、バニリン生産プロセス全体を通じてバニリン酸の蓄積をほとんど示さない。例えば、本発明によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。別の実施形態では、本発明によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．２５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。なおも別の実施形態では、本発明によるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。別の実施形態では、本変異株は、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、増殖培地１リットルあたり０．２５ｇ未満のバニリン酸の蓄積を示し得る。変異株がｅｃｈＲ遺伝子に変異をさらに含む実施形態では、変異株はまた、フェルラ酸の導入により、遅滞期間を示さずにすぐにバニリンを産生することができるであろう。

終了した生物変換段階の後、バイオマスは、遠心分離又は膜濾過などの任意の周知の方法によって発酵ブロスから分離され、無細胞の発酵ブロスが得られ得る。

抽出相は、例えば、水と混和しない有機溶媒、植物油、又は例えば樹脂などの任意の固体抽出剤、好ましくは中性樹脂を使用して、発酵ブロスに添加され得る。発酵ブロスは、さらに滅菌又は低温殺菌され得る。いくつかの実施形態では、発酵ブロスは濃縮され得る。発酵ブロスからバニリンは、例えば、連続的な液－液抽出プロセス、又はバッチ式抽出プロセスを用いて選択的に抽出され得る。

本発明の利点としては、とりわけ、本発明で開発されたアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株が、遅滞期間なしにフェルラ酸からバニリンへの生物変換を開始し、生産期間を短縮する能力が挙げられる。これによって生産プロセスが大幅に簡素化され、プロセスが効率的且つ経済的になり、したがって工業生産レベルへのスケールアップが可能になる。

当業者であれば、本明細書に記載の方法によって生産されたバニリン組成物をさらに精製し、上記のような香り付け及び／又は風味付けされた消費可能な製品、並びに栄養補助食品、医療用組成物、及び美容医薬品（栄養用）、並びに医薬製品と混合され得ることを認識するであろう。

本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮することで、より完全に理解されるであろう。これらの実施例は、主題技術の好ましい実施形態を示しながら、例証としてのみ提供されるものと理解すべきである。上の考察及びこれらの実施例から、当業者は、主題技術の本質的特性を見極め得て、その精神と範囲を逸脱することなく、主題技術に様々な変更と修正を加えて、それを様々な用途と条件に適応させ得る。

細菌株、プラスミド、及び培養条件。
ＤＨ５ａ及びＢＬ２１（ＤＥ３）の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。プラスミドｐＥＴ２８ａはＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入し、遺伝子クローニングに使用した。

ＤＮＡ操作。
全てのＤＮＡ操作は、標準手順に従って実行した。制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。全てのＰＣＲ反応は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＰｈｕｓｉｏｎ ＰＣＲシステムを使用して、製造業者のガイダンスに従って実行した。

実施例１
化学変異誘発及び変異株のスクリーニング
アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種ＡＴＣＣ ３９１１６の単細胞胞子を変異原メタンスルホン酸メチルで処理し、次に唯一のエネルギー源としてのバニリルアルコールと３００マイクログラム／ミリリットル（μｇ／ｍｌ）のペニシリンで２４時間培養し、栄養要求性変異体を避けるために同じ培地に播種した。単一コロニーを採取し、ＨＰＬＣを使用してフェルラ酸の生物変換アッセイで試験し、バニリンレベルを評価した。試験した１４１４個のコロニーのうち、２つの変異株（６－Ｅ１１及び１２－Ｈ１１）は、バニリンの分解が減少している所望の表現型を示した（図２）。変異株６－Ｅ１１を用いたさらなる分析により、バニリン、バニリン酸、バニリルアルコールの生産に関する速度論的プロファイルが確立された。変異株６－Ｅ１１によるバニリン生産は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生株で観察されたような遅滞期間を示さなかった。図３に示すように、変異株６－Ｅ１１は、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生型株よりも約４～５時間早く、フェルラ酸からバニリンへの変換を開始した。したがって、遅滞期間なしのバニリン産生を示さなかった以前報告されたｖｄｈ変異株と比較して、本発明による変異株は、バニリンのバニリン酸への分解の減少と、遅滞期間なしのバニリン産生の双方の利点を与える。

実施例４
変異遺伝子の同定
選択された２つの変異株を使用して全ゲノム配列決定を実行し、バニリンからバニリン酸への分解が減少している観察された表現型を引き起こす変異を同定した。全ゲノム配列決定により、２つの変異株が独立した変異を有することが明らかになったが、どちらの変異もＮＡＤＰＨ依存性グルタミン酸シンターゼ酵素複合体をコードするｇｌｔＢＤオペロン内の遺伝子内にある（遺伝子座タグＡＭＹ３９１１６＿ＲＳ０３２１３５０及びＡＭＹ３９１１６＿ＲＳ０３２１３４５）。これらの変異は、反応を触媒するＮＡＤＰＨ依存性グルタミン酸シンターゼ酵素複合体の２つのサブユニット内にある：Ｌ－グルタミン＋２－オキソグルタル酸＋ＮＡＤＰＨ＋Ｈ^＋→Ｌ－グルタミン酸＋ＮＡＤＰ^＋。変異株６－Ｅ１１は、ｇｌｔＤ遺伝子のｂｐ１１６１の後に２ｂｐの挿入を含み、フレームシフトが生じて、追加の４５アミノ酸残基の後のタンパク質がトランケートされる。変異株１２－Ｈ１１は、ｇｌｔＢ遺伝子のｂｐ３１４８の後に２ｂｐの挿入を含み、フレームシフトが生じて、追加の７アミノ酸の後のタンパク質がトランケートされる。

実施例５
ＨＰＬＣ分析
バニリンのＨＰＬＣ分析は、Ｖａｎｑｕｉｓｈ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００システムを使用して実施した。化合物は、その保持時間と、システム内のダイオードアレイ検出器で同定された対応するスペクトルによって同定した。

実施例６
フェルラ酸からバニリンへの生物変換
アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の野生型及び変異株は、１０ｍＬの種培地（１２ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのグルコース、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４、７．５ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、１ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．２）中、３７℃で２４時間飽和まで増殖させ、１０ｍＬの変換培地（５ｇ／Ｌの酵母エキス、８ｇ／Ｌのグルコース、１０ｇ／Ｌの麦芽エキス、０．２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４）中に１：２０で希釈し、３７℃で２４時間培養して、基質としてフェルラ酸を供給した。ＨＰＬＣ分析のために、細菌培養物をメタノール中に収集することによって、表示される時点でサンプルを採取した。

図２を参照すると、変換時間４４時間後でさえも、本発明による変異株６－Ｅ１１及び１２－Ｈ１１は、バニリンを全く保持しない野生型（ＷＴ）株と比較して、バニリンの分解を非常にわずかしか示さなかった。４４時間の変換時間後、野生型株の全てのバニリンは、バニリン酸に分解されたように見える。より具体的には、野生型株におけるバニリン酸の蓄積は、４４時間の変換時間後に約３ｇ／Ｌであった。比較すると、変異株６－Ｅ１１は、３．５ｇ／Ｌを超えるバニリンを保持し、０．２５ｇ／Ｌ未満のバニリン酸を蓄積した。同様に、変異株１２－Ｈ１１は３．０ｇ／Ｌを超えるバニリンを保持し、０．２５ｇ／Ｌ未満のバニリン酸を蓄積した。

図３を参照すると、２ｍＬの細胞で１３ｇ／Ｌのフェルラ酸を２４時間変換した後に、変異株６－Ｅ１１はＷＴ株よりもはるかに多くのバニリンを産生し（０ｇ／Ｌに対して２．９３ｇ／Ｌ）、より少ないバニリン酸（１．１６ｇ／Ｌに対して０．１３０ｇ／Ｌ）を産生した。さらに、変異株６－Ｅ１１もまたＷＴ株より４～５時間早く、バニリン産生を開始した。

本出願は、様々な発行済み特許、公開された特許出願、学術誌記事、及びその他の刊行物を参照し、それらの全ては参照により本明細書に援用される。本明細書で開示される全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により援用され、場合によっては文書全体を包含してもよい。組み込まれた参考文献のいずれかと本明細書との間に矛盾がある場合には、明細書が効力を持つものとする。さらに、従来技術に該当する本開示の特定の実施形態は、請求項のいずれか１つ又は複数から明示的に除外されてもよい。このような実施形態は当業者には既知であると見なされるので、本明細書で明示的に除外が記載されていない場合でさえも、除外されてもよい。本開示のいかなる特定の実施形態も、先行技術の存在に関連するか否かを問わず、理由の如何を問わず、任意の請求項から除外され得る。

当業者であれば、本明細書に記載される特定の実施形態の多くの等価物を、日常的な実験以上のことを行わずに認識するか、又は確認できるであろう。本明細書に記載される本実施形態の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されるとおりである。当業者であれば、以下の特許請求の範囲で定義される本開示の精神又は範囲から逸脱することなく、この記載に対する様々な変更及び修正が行われてもよいことを理解するであろう。

関心のある配列
配列番号１：ＤＮＡ；ｇｌｔＢの核酸配列
配列番号２：ＰＲＴ；ＧｌｔＢのアミノ酸配列
配列番号３：ＤＮＡ；ｇｌｔＤの核酸配列
配列番号４：ＰＲＴ；ＧｌｔＤのアミノ酸配列
配列番号５：ＤＮＡ；ｅｃｈＲ（ｅｃｈ－ｆｃｓオペロンのリプレッサー）の核酸配列
配列番号６：ＰＲＴ；ＥｃｈＲ（ｅｃｈ－ｆｃｓオペロンのリプレッサー）のアミノ酸配列

Claims (30)

1. バニリンを産生し、バニリンをバニリン酸に代謝することができるアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株を少なくとも１つの変異原に曝露することによって形成される、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の発生変異株を含む、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非ＧＭＯ変異株であって、前記株と対比した前記変異株におけるバニリン酸の蓄積レベルによって測定されるように、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、バニリンを産生することができ、前記株よりもバニリンからバニリン酸へのより少ない分解を示す、非ＧＭＯ変異株。
2. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株がＡＴＣＣ ３９１１６の変異株である、請求項１に記載の変異株。
3. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、請求項１に記載の変異株。
4. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから２４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．２５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、請求項１に記載の変異株。
5. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、請求項１に記載の変異株。
6. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株が、最初にフェルラ酸を変異株に供給してから４４時間を超えた時点で、培養培地１リットル当たり０．２５グラム未満のバニリン酸を蓄積する、請求項１に記載の変異株。
7. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記変異株のゲノムが、ｇｌｔＢＤオペロンにおける１つ又は複数の変異を含む、請求項１に記載の変異株。
8. 前記ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記１つ又は複数の変異が、前記ｇｌｔＢ遺伝子における少なくとも１つの変異を含む、請求項７に記載の変異株。
9. 前記１つ又は複数の変異が、前記ｇｌｔＢ遺伝子中にあり、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項８に記載の変異株。
10. 前記１つ又は複数の変異が、配列番号１を含む前記ｇｌｔＢ遺伝子中にある、請求項８に記載の変異株。
11. 前記ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記１つ又は複数の変異が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む前記ｇｌｔＤ遺伝子中にある、請求項７に記載の変異株。
12. 前記ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記１つ又は複数の変異が、核酸配列番号３を含む前記ｇｌｔＤ遺伝子中にある、請求項７に記載の変異株。
13. 核酸配列番号５を含む内因性遺伝子ｅｃｈＲにおける変異をさらに含む、請求項７に記載の変異株。
14. 前記１つ又は複数の変異が、欠失、挿入、フレームシフト変異、ミスセンス変異、ナンセンス変異、スライシング変異、及び点変異からなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項７に記載の変異株。
15. 前記変異が、２ｂｐの挿入を含むフレームシフト変異である、請求項１４に記載の変異株。
16. 前記変異株が、任意の外因性遺伝物質の導入によって前記変異株を恒久的に修飾することなく得られる、請求項１に記載の変異株。
17. 前記変異株が、前記株を変異原メタンスルホン酸メチルと接触させることによって得られる、請求項１に記載の変異株。
18. ａ．基質を含む適切な培地中で請求項１に記載の変異株を培養するステップと；
    ｂ．産生されたバニリンを回収するステップと
    を含む、バニリンを生産するための方法。
19. ｃ．請求項１に記載のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の変異株を炭素源を含有する培地中で培養するステップと；
    ｄ．フェルラ酸がバニリンに変換されるのに十分な時間、フェルラ酸を前記変異株に供給するステップと
    を含む、バニリンを生産するための方法。
20. ｅ．バニリンデヒドロゲナーゼをコード化する遺伝子と、ｇｌｔＢＤオペロンにおける少なくとも１つの変異とを含む、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非天然株を含む、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株であって、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記株が、ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記少なくとも１つの変異がないアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株よりも少ないバニリンをバニリン酸に変換し、前記ｇｌｔＢＤオペロンがｇｌｔＢ遺伝子及びｇｌｔＤ遺伝子を含む、アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の株。
21. 前記ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記１つ以上の変異が、前記ｇｌｔＢ遺伝子における少なくとも１つの変異を含む、請求項２０に記載の株。
22. 前記１つ又は複数の変異が、前記ｇｌｔＢ遺伝子中にあり、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２１に記載の株。
23. 前記１つ又は複数の変異が、配列番号１を含む前記ｇｌｔＢ遺伝子中にある、請求項２１に記載の株。
24. 前記ｇｌｔＢＤオペロンにおける前記１つ又は複数の変異が、前記ｇｌｔＤ遺伝子中にある、請求項２０に記載の株。
25. 前記ｇｌｔＤ遺伝子における前記１つ又は複数の変異が、配列番号３と少なくとも９０％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項２４に記載の株。
26. 前記ｇｌｔＤ遺伝子における前記１つ又は複数の変異が、核酸配列番号３を含む、請求項２４に記載の株。
27. 核酸配列番号５を含む内因性遺伝子ｅｃｈＲにおける変異をさらに含む、請求項２０に記載の株。
28. アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記非天然株が組換え株である、請求項２０に記載の株。
29. 請求項２０のいずれか一項に記載の非天然株を培養するステップを含む、バニリンを生産するための方法であって、
    ａ．アミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記非天然株を、基質を含み、その中でアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の前記非天然株の活動によって、前記基質の少なくとも一部がバニリンに変換される、適切な培地中で培養するステップと；
    ｂ．産生されたバニリンを回収するステップと
    を含む方法。
30. ｆ．請求項２０のいずれか一項に記載のアミコラトプシス属（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）種の非天然株を、炭素源を含む培地中で培養するステップと；
    ｇ．フェルラ酸がバニリンに変換されるのに十分な時間、フェルラ酸を前記変異株に供給するステップと
    を含む、バニリンを生産するための方法。

Images