CN115873880A - 重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌。其中，所述重组核酸序列包括串联启动子、赖氨酸脱羧酶基因以及增强细胞耐受压力的基因，所述串联启动子包括piclR启动子和稳定期特异性启动子。本发明通过使用piclR‑稳定期特异性启动子串联后控制L‑赖氨酸脱羧酶的表达时间和表达量，降低1,5‑戊二胺耐受过程中的能耗，促进菌株的生产能力，进而提高1,5‑戊二胺的产量。并且通过增加促进1,5‑戊二胺排出细胞外的基因表达量，降低胞内1,5‑戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，增加菌株的耐受能力，进一步提高1,5‑戊二胺的产量。

Description

重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体地说，涉及用于发酵生产1,5-戊二胺的重组核酸序列、重组表达载体、基因工程菌及其用途。

背景技术

1,5-戊二胺的用途相当广泛且在工业生产中具有很高的经济价值，例如可以与二元酸进行聚合反应合成新型尼龙。目前，1,5-戊二胺的生物合成主要利用两种策略进行：发酵生产或体外酶催化。对于发酵生产，1,5-戊二胺通过赖氨酸脱羧酶(L-lysinedecarboxylase,简称LDC,EC 4.1.1.18)将L-赖氨酸脱去一个羧基而生成。具体的，可以将赖氨酸脱羧酶基因添加至产赖氨酸的微生物例如谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌中，从而将赖氨酸生物合成途径延长至1,5-戊二胺生物合成途径。

目前已有通过DNA重组技术改造的具有L-赖氨酸生产能力的棒杆菌属和埃希杆菌属的细菌，其效率的提高是通过过表达L-赖氨酸合成途径的相关基因和反馈抑制脱敏的相关基因，或者强化从葡萄糖代谢开始的能量供应途径而实现的。反馈抑制脱敏的相关基因，例如天冬氨酸激酶Ⅲ(LysC)是赖氨酸合成途径中的特异关键酶。然而，由于菌体本身耐受的1,5-戊二胺浓度有限，如果在发酵体系中前期表达了赖氨酸脱羧酶转化生成的1,5-戊二胺过多，就会对菌体造成毒害，从而抑制菌体生长及利用葡萄糖生产L-赖氨酸的过程(Qian,et al.,Biotechnol.Bioeng.2011；108:93–103)。

例如：公开号为WO2019006723A1，公开日为2019年1月19日，名称为“HETEROLOGOUSEXPRESSION OF THERMOPHILIC LYSINE DEC-ARBOXYLASE AND USES THEREOF”的专利文献公开了一种嗜热赖氨酸脱羧酶的异源表达及其用途。在该专利文献所公开的技术方案中，先使用嗜热赖氨酸脱羧酶，通过高温控制酶活性。

又例如：公开号为CN105368766A，公开日为2016年3月2日，名称为“一株生产戊二胺的基因工程菌及其制备戊二胺的方法”的中国专利文献公开了一种戊二胺生产菌株及其高效生产戊二胺的工艺。在该专利文献所公开的技术方案中，通过使用温控型启动子表达赖氨酸脱羧酶，一定程度上解决了稳定性问题，但使用高温进行催化又额外增加了能耗和生产成本。

因此，需要开发更经济、稳定、高效的1,5-戊二胺生产工艺。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于一种重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌，以实现1,5-戊二胺的稳定、高效、低成本生产。

为了实现上述目的，本发明通过以下几个方面实现：

第一方面，本发明提出了一种重组核酸序列，所述重组核酸序列包括串联启动子、赖氨酸脱羧酶基因以及增强细胞耐受压力的基因，其中，所述串联启动子包括piclR启动子和稳定期特异性启动子，所述稳定期特异性启动子选自下述的一种或多种：pcsiE、pbolA、posmY、pkatE、p21、p22、p23和p24。

耐渗透胁迫是细胞生理性能的重要方面。对于分泌到胞外的大宗化学品，产量越高，渗透胁迫越大，细胞需具备耐渗透胁迫能力才能获得高产量。

串联启动子一方面具有强启动子的启动能力，另一方面IclR是一个局部调控转录抑制因子，IclR蛋白能够抑制自身和乙醛酸途径中的arcABC操纵子的转录。IclR启动子的启动还受到FadR的激活。

本发明通过将包括piclR启动子和稳定期特异性启动子的串联启动子，及其控制之下的赖氨酸脱羧酶基因重组插入到细菌染色体中，增强启动子强度，保证L-赖氨酸脱羧酶的足量、稳定表达，大大降低宿主细胞耐受1,5-戊二胺毒害而导致的能耗，从而促进1,5-戊二胺的生产，而整个过程无需使用抗性基因、诱导元件等等。

本领域技术人员理解，为了提高目的基因在宿主细胞中的表达，可以根据该宿主细胞的密码子偏好对目的基因的编码序列进行优化。例如，可以将目的基因的稀有密码子进行同义替换，使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式。通过这种方法，提高外源基因在宿主细胞中表达量的报道已有很多。

优选地，所述piclR启动子来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)以及蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)中的任意一种或几种。

更优选地，所述piclR启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:83-85任意一项所示；所述稳定期特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示；和/或，所述赖氨酸脱羧酶基因选自来自大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、蜂房哈夫尼菌中的任意一种的cadA基因或ldcC基因。

进一步更优选地，所述cadA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在一些实施方案中，所述赖氨酸脱羧酶(简称LDC,EC 4.1.1.18)的基因可以来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)等。

在一些实施方案中，赖氨酸脱羧酶基因是来自于大肠杆菌的cadA基因或ldcC基因，例如cadA基因的序列可以是SEQ ID NO:9，CadA蛋白的序列可以是SEQ ID NO:10。另外，赖氨酸脱羧酶也可以来自于上述菌株经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。赖氨酸脱羧酶还可以是上述来源的赖氨酸脱羧酶的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段(保留了赖氨酸脱羧酶活性的截短形式的蛋白片段)。

在一些实施方案中，所述串联启动子中的稳定期特异性启动子选自pcsiE、pbolA、posmY、pkatE、p21、p22、p23和p24中的任意一种或几种。

所述稳定期特异性启动子可以来自微生物、动物或植物的细胞，包括但不局限于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)等。

所述pcsiE的序列可以是SEQ ID NO:1；pbolA的序列可以是SEQ ID NO:2；posmY的序列可以是SEQ ID NO:3；pkatE的序列可以是SEQ ID NO:4；p21的序列可以是SEQ ID NO:5；p22的序列可以是SEQ ID NO:6；p23的序列可以是SEQ ID NO:7；p24的序列可以是SEQ IDNO:8。

在本文中，促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因是指，其表达产物促进微生物细胞将1,5-戊二胺排出到细胞外，从而降低胞内1,5-戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，促进1,5-戊二胺的生产。在一些实施方案中，所述促进戊二胺排出的基因包括外膜孔蛋白的基因或增加细胞耐压能力的基因。更具体地，所述促进戊二胺排出的外膜孔蛋白或增加细胞耐压能力的蛋白还可以是上述蛋白的突变体(包括天然突变体和人工重组突变体)或者活性片段。可选地，结合增加细胞耐受压力的基因(如rpoS、crp、puuR、pepA以及soxS)和/或外膜孔蛋白基因(如ompA、ompC、ompF、ompW和ompX)，以进一步降低胞内1,5-戊二胺浓度，提高1,5-戊二胺的产量。

优选地，所述重组核酸序列还包括组成型启动子。

更优选地，所述组成型启动子选自plac、trp、tac、trc和PL中的任意一种或几种。

进一步更优选地，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示。

在本文中所使用的组成型启动子是本领域技术人员所熟知的，其可以使促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或增加细胞耐压能力的基因在宿主细胞中表达，例如可以使用plac、trp、tac、trc或PL启动子。例如，plac的序列可以是SEQ ID NO:60。

优选地，所述增强细胞耐受压力的基因与组成型启动子可操作地连接，所述增强细胞耐受压力的基因选自：rpoS、crp、puuR、pepA以及soxS中的任意一种或几种。

更优选地，所述增强细胞耐受压力的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11-15任意一项所示。其中，rpoS基因的序列可以是SEQ ID NO:11，其蛋白序列如SEQ ID NO:16所示，crp基因的序列可以是SEQ ID NO:12，其蛋白序列如SEQ ID NO:17所示，puuR基因的序列可以是SEQ ID NO:13的编码序列，其蛋白序列如SEQ ID NO:18所示，pepA基因的序列可以是SEQ ID NO:14，其蛋白序列如SEQ ID NO:19所示，soxS基因的序列可以是SEQ ID NO:15，其蛋白序列如SEQ ID NO:20所示。

优选地，所述重组核酸序列还包括编码外膜孔蛋白的基因。

更优选地，所述编码外膜孔蛋白的基因与组成型启动子可操作性地连接，和/或，所述编码外膜孔蛋白的基因选自：ompA、ompC、ompF、ompW和ompX中的任意一种或几种；更优选地，所述编码外膜孔蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:62-66任意一项所示。其中，ompA基因的序列可以是SEQ ID NO:62，其蛋白序列如SEQ ID NO:67所示，ompC基因的序列可以是SEQ ID NO:63，其蛋白序列如SEQ ID NO:68所示，ompF基因的序列可以是SEQ IDNO:64的编码序列，其蛋白序列如SEQ ID NO:69所示，ompW基因的序列可以是SEQ ID NO:65，其蛋白序列如SEQ ID NO:70所示，ompX基因的序列可以是SEQ ID NO:66，其蛋白序列如SEQ ID NO:71所示。

在本文所述的重组DNA中，所述串联启动子(元件a)和赖氨酸脱羧酶基因(元件b)可操作地连接(表示为a-b)，使得赖氨酸脱羧酶的转录和表达在戊二胺诱导型启动子的控制之下。优选地，所连接的a-b可以实现在宿主细胞中表达受戊二胺浓度的调控，通过所述串联启动子控制L-赖氨酸脱羧酶的生产，提高1,5-戊二胺的产量。

在本文所述的重组DNA中，组成型启动子(元件c)和促进戊二胺排出的基因(元件d)可操作的连接(表示为c-d)，使得促进戊二胺排出的基因的转录和表达在组成型启动子的控制之下；组成型启动子(元件e)和增加细胞耐压能力的基因(元件f)可操作的连接(表示为e-f)。可选地，前述所连接的a-b、c-d和e-f可以进行可操作的连接或者独立存在。

优选地，所述重组核酸序列选自以下组：

(1)piclR-p24-cadA-plac-rpoS、piclR-p24-cadA-plac-crp、piclR-p24-cadA-plac-puuR、piclR-p24-cadA-plac-pepA或piclR-p24-cadA-plac-soxS；和，

(2)piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompA、piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompC、piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompF、piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompW或piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompX。

第二方面，本发明提出了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括上述的重组核酸序列。

优选地，所述重组表达载体的骨架质粒包括pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101以及它们的衍生质粒。

或，优选地，在本发明所述的技术方案中，采用pKD46进行大肠杆菌染色体重组。

在本文中，赖氨酸脱羧酶基因可以包含在一个质粒中。

在本文中，促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或增加细胞耐压能力的基因可以包含在与赖氨酸脱羧酶基因相同的质粒中。或者，其也可以包含在不同的质粒中，独立于宿主染色体而在宿主细胞内表达。

第三方面，本发明提出了一种生产1,5-戊二胺的基因工程菌，所述基因工程菌包含上述的重组核酸序列。

在本文中，所述基因工程菌的染色体中包含在所述串联启动子控制之下的赖氨酸脱羧酶基因。由此，通过使用piclR-稳定期特异性启动子串联启动子调控L-赖氨酸脱羧酶的表达，降低1,5-戊二胺耐受过程中的能耗，促进L-赖氨酸的生产，进而提高1,5-戊二胺的产量。进一步地，所述基因工程菌还可以通过重组在染色体中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因或在所转化的表达质粒中包含所述促进1,5-戊二胺从细胞排出的基因，由此通过表达促进1,5-戊二胺从细胞排出的蛋白而降低胞内1,5-戊二胺浓度及其对胞内赖氨酸脱羧酶活性的抑制，进而提高1,5-戊二胺的产量。

作为出发菌株，可以使用可生产L-赖氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)M11A3菌株，该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M2018456，保藏日期2018年7月6日。

优选地，所述重组核酸序列位于游离的重组表达载体或整合到染色体中。

更优选地，所述基因工程菌的宿主菌来源于埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、栖热菌属(Thermus)、短杆菌属(Brevibacterium)或哈夫尼菌属(Hafnia)的菌种。

进一步更优选地，所述基因工程菌的宿主菌来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)、嗜热菌(Thermus.thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

第四方面，本发明提出了一种生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括步骤：在发酵培养基中对含有上述的基因工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

在一些实施方案中，基因工程菌培养温度为20-50℃。

在本文中，将所述重组DNA构建到具有生产L-赖氨酸能力的工程菌中，发酵培养重组菌并进行赖氨酸积累，发酵培养温度控制在20-50℃，进行菌体的快速生长以及赖氨酸积累，进入发酵稳定期后，使赖氨酸脱羧酶大量表达，转化生产1,5-戊二胺。

如本文所用，术语“约”在用于修改温度范围内的数值时表示该数值与该值的合理偏差，例如，在该范围内所述的值之下或之上1℃或2℃以内，是在所述值或范围的预期含义内。

在一些实施方案中，培养在约25℃至约45℃的温度下进行。在其他实施方案中，培养在约30℃至约40℃的温度下进行。在进一步的实施方案中，培养在约35℃至约39℃的温度下进行。

第五方面，本发明提出了生产1,5-戊二胺的方法，所述方法包括步骤：在发酵培养基中对含有上述的基因工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

第六方面，本发明提出了上述的重组核酸序列、重组表达载体或基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明使用了包括piclR启动子和稳定期特异性启动子的串联启动子，当菌体生长到稳定期后才会启动赖氨酸脱羧酶基因的足量表达。与表达嗜热赖氨酸脱羧酶或温控启动子表达赖氨酸脱羧酶相比，本发明可以通过在染色体上插入所述串联启动子-赖氨酸脱羧酶基因序列，实现赖氨酸脱羧酶稳定和足量的表达，另外，该菌株去除了抗生素、特殊环境条件或其他诱导剂的使用，整个发酵培养过程自调控。

将其应用于1,5-戊二胺生产，可以显著降低细胞生长及L-赖氨酸生产阶段产生的1,5-戊二胺的细胞毒性，提高L-赖氨酸产量；发酵结束后，可以将L-赖氨酸几乎全部转化为1,5-戊二胺，从而实现了1,5-戊二胺产量的增加。同时使用了增加细胞耐受能力的蛋白和或促进戊二胺排出的蛋白，转化的同时将1,5-戊二胺输出胞外，综合显著地提高重组菌株发酵生产1,5-戊二胺的产量，实现了1,5-戊二胺的稳定、高效、低成本生产。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。应当理解，尽管本文示例了实施本发明的一些实施方案，根据本公开，本领域技术人员会认识到，可以进行众多修改而不脱离本发明的精神和预期范围。还应当理解，本文所用的术语用于仅描述具体实施方案并且不意在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求及其等同物限定。

若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中涉及到的PCR扩增、纯化、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化等的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司

引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司(INVITROGEN)。

以下实施例中涉及到的质粒转化方法如下：将连接产物加至100μl的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴30min后，42℃热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB。涂布至相对应的抗性平板上。

本发明中，培养基中L-赖氨酸和1,5-戊二胺的量可以通过核磁共振方法检测。

本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。

实施例中使用的宿主、过表达的蛋白质及质粒汇总如下表1所示。

表1.

/>

实施例1pBU质粒骨架的构建

以市售大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对upp-UF(SEQ ID NO:21)和upp-UR(SEQ ID NO:22)扩增出Upp-U片段(SEQ ID NO:23)，引物对upp-DF(SEQ ID NO:24)和upp-DR(SEQ ID NO:25)扩增出Upp-500bp-D(SEQ ID NO:26)片段，引物对upp-F(SEQ IDNO:27)和upp-R(SEQ ID NO:28)扩增出Pupp-Upp-D片段(SEQ ID NO:29)。

以市售质粒pBR322为模板，引物对P1P2-tetA-F(SEQ ID NO:30)和P1P2-tetA-R(SEQ ID NO:31)扩增出质粒上包含P1P2启动子和tetA序列(即带抗性标记)的片段P1P2-tetA(SEQ ID NO:32)。将upp-U、upp-500bp-D、P1P2-tetA和Pupp-Upp-D片段PCR产物切胶回收后，与EcoRI和NaeI双酶切后的pBR322载体进行连接，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到包含Upp-U、Upp-500bp-D、P1P2-tetA和Pupp-Upp-D四个片段的质粒，该质粒命名为pBU载体。

实施例2赖氨酸脱羧酶CadA基因的克隆

以市售大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对cadA-F(序列如SEQ ID NO:33所示)和cadA-R(序列如SEQ ID NO:34所示)扩增出cadA基因片段(序列如SEQ ID NO:9所示)，将cadA基因片段和EcoRI单酶切后的实施例1获得的pBU载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组，产生的质粒名为pBU-cadA。

以市售大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对piclR-F(序列如SEQ ID NO:35所示)和piclR-R(序列如SEQ ID NO:36所示)扩增出piclR启动子，序列如SEQ ID NO:83所示，当然在一些其他的实施方式中，根据来源的不同，pirclR序列还可以来源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的如SEQ ID NO:84所示的piclR-Cg，或来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的如SEQ ID NO:85所示的piclR-Ha。将piclR启动子片段和sacI单酶切后的pBU-cadA载体进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接。重组连接后的混合物转化至E.coli JM109(购自宝生物工程(大连)有限公司)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上进行筛选，获得多个单菌落。通过菌落PCR和测序验证正确后，抽提质粒即得到pBU-piclR-cadA质粒，该质粒包含了piclR启动子控制下的cadA基因。

实施例3构建pBU-piclR-稳定期特异性启动子-cadA和pBU-稳定期特异性启动子-cadA质粒

以市售大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，分别利用引物pcsiE-F(序列如SEQID No:37所示)/pcsiE-R(序列如SEQ ID No:38所示)，pbolA-F(序列如SEQ ID No:39所示)/pbolA-R(序列如SEQ ID No:40所示)，posmY-F(序列如SEQ ID No:41所示)/posmY-R(序列如SEQ ID No:42所示)，pkatE-F(序列如SEQ ID No:43所示)/pkatE-R(序列如SEQ IDNo:44所示)，pcsiE-F2(序列如SEQ ID No:45所示)/pcsiE-R(序列如SEQ ID No:38所示)，pbolA-F2(序列如SEQ ID No:46所示)/pbolA-R(序列如SEQ ID No:40所示)，posmY-F2(序列如SEQ ID No:47所示)/posmY-R(序列如SEQ ID No:42所示)，pkatE-F2(序列如SEQ IDNo:48所示)/pkatE-R(序列如SEQ ID No:44所示)；扩增稳定期特异性启动子pcsiE(序列如SEQ ID No:1所示)，pbolA(序列如SEQ ID NO:2所示)，posmY(序列如SEQ ID No:3所示)，pkatE(序列如SEQ ID No:4所示)，将PCR产物进行切胶回收后，分别与SacI酶切的实施例2获得的pBU-piclR-cadA和pBU-cadA质粒连接，得到含有4个串联启动子的质粒：pBU-piclR-pcsiE-cadA，pBU-piclR-pbolA-cadA，pBU-piclR-posmY-cadA，pBU-piclR-pkatE-cadA；和只含有4个稳定期特异性启动子的质粒：pBU-pcsiE-cadA，pBU-pbolA-cadA，pBU-posmY-cadA，和pBU-pkatE-cadA。

使用本领域常用基因序列合成方法分别合成p21、p22、p23、p24条启动子的双链DNA序列(5’-3’)，然后分别连接至SacI酶切的实施例2获得的pBU-piclR-cadA和pBU-cadA质粒中。得到含有4个串联启动子的质粒pBU-piclR-p21-cadA，pBU-piclR-p22-cadA，pBU-piclR-p23-cadA，pBU-piclR-p24-cadA；和只含有4个稳定期特异性启动子的质粒：pBU-p21-cadA，pBU-p22-cadA，pBU-p23-cadA，pBU-p24-cadA。

实施例4构建1,5-戊二胺生产菌株并检测1,5-戊二胺产量

本发明中出发菌株采用可生产L-赖氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli)M11-A3菌株，该菌株现已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC No：M2018456，保藏日期2018年7月6日。

首先，制备电转感受态，通过热激法转化市售pKD46质粒至M11-A3菌株感受态，含有100μg/ml氨苄青霉素的LB抗性平板中筛选培养后，挑取单菌落于5mL的LB液体培养基中，30℃，200rpm，培养8h；以1％的接种量转接到50mL含的LB液体培养基中培养至OD600约为0.15，加入1mL 2mM的L-阿拉伯糖溶液，继续培养至OD600为0.4～0.5；随即转入50mL离心管中冰浴20min，使其停止生长；4℃，4000rpm，离心10min，收集菌体；再用40mL预冷的无菌水洗涤菌体，离心收集细胞；重复上述步骤；用20mL预冷的10％甘油洗涤菌体，离心收集细胞；最后用500μL预冷的10％甘油重悬菌体，将得到的M11-A3/pKD46感受态进行分装备用。

以实施例3构建得到的16个质粒(如下表2所示)作为模板，使用引物对upp-UF/upp-R分别扩增获得可用于染色体上同源重组的片段，并进行切胶回收。每个片段分别转入受体菌M11A3/pKD46菌株中。涂布在含有10μg/ml四环素的LB抗性平板中进行筛选。针对每个质粒转化挑取3个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养8h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选出正确的重组菌株，并甘油保种。

将甘油保种的16株菌株接种至含有0.1ug/mL 5-FU(5-氟尿嘧啶)的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养8h；取菌液分别划线至含有和不含有5-氟尿嘧啶的LB培养基平板，过夜培养。平板分析显示在含有5-氟尿嘧啶的平板上不能生长的菌株，从对应的不含5-氟尿嘧啶的平板上随机选取6个单克隆，取1μl菌体作为模板再次进行PCR验证，如果P1P2-tetA和Pupp-Upp片段已同时被移除，表明获得正确的重组株，将正确的重组株进行甘油保种。

上述重组株各选取3个转化子，与和出发株M11A3一同分别涂布不含抗生素的种子培养基(含有4wt％葡萄糖,0.1wt％KH₂PO₄,0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO₄,0.2％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后，分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有4wt％葡萄糖,0.1wt％KH₂PO₄,0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO₄,0.2wt％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基(30g/L葡萄糖,0.7wt％Ca(HCO₃)₂，0.1wt％KH₂PO₄，0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO₄,0.2％酵母提取物的培养基)于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的1,5-戊二胺的含量(表2)。

表2核磁检测重组株与出发菌株相比的1,5-戊二胺产量及OD600

从表2可以看出，使用稳定期特异性启动子直接表达CadA的重组菌株pcsiE-cadA/M11A3，pbolA-cadA/M11A3，posmY-cadA/M11A3，pkatE-cadA/M11A3，p21-cadA/M11A3，p22-cadA/M11A3，p23-cadA/M11A3，p24-cadA/M11A3，发酵48h后，检测到0.88～2.23g/kg的L-赖氨酸和1.14～2.12g/kg的1,5-戊二胺，说明赖氨酸脱羧酶表达量偏少，仅将部分L-赖氨酸转化为1,5-戊二胺。

相比之下，使用串联启动子表达cadA的重组菌株piclR-pcsiE-cadA/M11A3，piclR-pbolA-cadA/M11A3，piclR-posmY-cadA/M11A3，piclR-pkatE-cadA/M11A3，piclR-p21-cadA/M11A3，piclR-p22-cadA/M11A3，piclR-p23-cadA/M11A3，piclR-p24-cadA/M11A3，通过测试发现在发酵48h的时候，使用了串联启动子表达cadA的各重组菌株与使用稳定期特异性启动子直接表达cadA的8个重组菌株相比，生成的1,5-戊二胺的产量有进一步的提高，同时L-赖氨酸近乎全部转化为1,5-戊二胺，其中piclR-p24-cadA/M11A3菌株的1,5戊二胺产量最高，最后积累了2.93g/kg以上的1,5-戊二胺，且几乎没有L-赖氨酸残留。

实施例5构建pBU-piclR-p24-plac-rpoS、pBU-piclR-p24-cadA-plac-crp、pBU-piclR-p24-cadA-plac-puuR、pBU-piclR-p24-plac-pepA、pBU-piclR-p24-cadA-plac-soxS质粒

以市售大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对rpoS-F(序列如SEQ ID NO:49所示)和rpoS-R(序列如SEQ ID NO:50所示)扩增出rpoS基因(序列如SEQ ID NO:11所示)，引物对crp-F(序列如SEQ ID NO:51所示)和crp-R(序列如SEQ ID NO:52所示)扩增出crp基因(序列如SEQ ID NO:12所示)。引物对puuR-F(序列如SEQ ID NO:53所示)和puuR-R(序列如SEQ ID NO:54所示)扩增出puuR基因(序列如SEQ ID NO:13所示)。引物对pepA-F(序列如SEQ ID NO:55所示)和pepA-R(序列如SEQ ID NO:56所示)扩增出pepA基因(序列如SEQ ID NO:14所示)。引物对soxS-F(序列如SEQ ID NO:57所示)和soxS-R(序列如SEQ IDNO:58所示)扩增出soxS基因(序列如SEQ ID NO:15所示)。以市售pUC18质粒DNA为模板，引物对plac-F(序列如SEQ ID NO:59示)和plac-R(序列如SEQ ID NO:60所示)扩增出plac启动子(SEQ ID NO:61)；

将plac启动子片段、rpos基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA和pBU-p24-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpos和pBU-p24-cadA-plac-rpos。

将plac启动子片段、crp基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA和pBU-p24-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-crp和pBU-p24-cadA-plac-crp。

将plac启动子片段、puuR基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA和pBU-p24-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-puuR和pBU-p24-cadA-plac-puuR。

将plac启动子片段、pepA基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA和pBU-p24-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为Pbu-piclR-p24-cadA-plac-pepA和pBU-p24-cadA-plac-pepA。

将plac启动子片段、soxS基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA和pBU-p24-cadA质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-soxS和pBU-p24-cadA-plac-soxS。

实施例6构建1,5-戊二胺生产菌株

以实施例5构建得到的5对质粒作为模板，使用引物对upp-UF/upp-R分别扩增获得可用于染色体上同源重组的片段，并进行切胶回收。每个片段分别转入受体菌M11-A3/pKD46菌株中。涂布在含有10μg/ml四环素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养8h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的重组株，并甘油保种。

将甘油保种的菌株接种至含有0.1ug/mL 5-FU(5-氟尿嘧啶)的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养8h；取菌液分别划线至含有和不含有5-氟尿嘧啶的LB培养基平板，过夜培养。平板分析显示在含有5-氟尿嘧啶的平板上不能生长的菌株，从对应的不含5-氟尿嘧啶的平板上选取6个单克隆，取1μl菌体作为模板再次进行PCR验证，如果P1P2-tetA和Pupp-Upp片段已同时被移除，表明获得正确的重组株，将正确的重组株进行甘油保种。

实施例7检测菌株1,5-戊二胺产量

自实施例6中获得的重组株各选取3个转化子，出发株M11A3、piclR-p24--cadA/M11A3和p24-cadA/M11A3作为对照菌株，分别涂布不含抗生素的种子培养基(含有4wt％葡萄糖,0.1wt％KH₂PO₄,0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO4,0.2％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有4wt％葡萄糖,0.1wt％KH₂PO₄,0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO₄,0.2wt％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基(30g/L葡萄糖,0.7％Ca(HCO₃)₂，0.1％KH₂PO₄，0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO_4,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物的培养基，此外一组摇瓶添加30g/kg的戊二胺)中于37℃、170rpm继续培养48h，取样测定添加或不添加戊二胺条件下每个菌株的OD600。未添加戊二胺的一组样品，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量(结果参见表3)。

如表3所示，添加戊二胺的摇瓶，稀释20倍后测定菌株的OD600，与M11-A3,pcilR-p24-cadA/M11A3,p24-cadA/M11A3重组菌株相比，表达增加细胞压力耐受能力的基因rpoS,crp,puuR，pepA以及soxS的10个新菌株，OD600受影响显著减少(即菌株OD600下降少)，其中picR-p24-cadA-plac-rpoS/M11A3菌株OD600最高，说明其耐受戊二胺的能力最强。

如表4所示，表达促进1,5-戊二胺排出蛋白的菌株piclR-p24-cadA-plac-rpoS/M11A3，piclR-p24-cadA-plac-crp/M11A3，piclR-p24-cadA-plac-puuR/M11A3,piclR-p24-cadA-plac-pepA/M11A3,piclR-p24-cadA-plac-soxS/M11A3与piclR-p24-cadA/M11A3重组菌株相比，生成的1,5-戊二胺的产量有进一步的提高，同时L-赖氨酸近乎全部转化为1,5-戊二胺，其中piclR-p24-cadA-plac-rpoS/M11A3菌株1,5戊二胺产量最高，最后积累了3.68g/kg以上的1,5-戊二胺，且几乎没有L-赖氨酸残留。

表3添加及未添加戊二胺条件下测定菌株的OD600

菌株	OD600-未添加戊二胺	OD600-添加戊二胺
			M11A3	0.826±0.007	0.521±0.008
piclR-cadA/M11A3	0.842±0.005	0.507±0.003
			piclR-p24-cadA/M11A3	0.863±0.003	0.516±0.004
p24-cadA/M11A3	0.856±0.014	0.497±0.001
			piclR-p24-cadA-plac-rpoS/M11A3	0.889±0.004	0.794±0.007
p24-cadA-plac-rpoS/M11A3	0.878±0.002	0.743±0.006
			piclR-p24-cadA-plac-crp/M11A3	0.841±0.004	0.693±0.003
p24-cadA-plac-crp/M11A3	0.854±0.009	0.634±0.005
			piclR-p24-cadA-plac-puuR/M11A3	0.839±0.005	0.675±0.005
p24-cadA-plac-puuR11A3	0.849±0.006	0.615±0.006
			piclR-p24-cadA-plac-pepA/M11A3	0.875±0.009	0.733±0.008
p24-cadA-plac-pepA/M11A3	0.859±0.003	0.671±0.003
			piclR-p24-cadA-plac-soxS/M11A3	0.847±0.002	0.690±0.007
p24-cadA-plac-soxS/M11A3	0.818±0.004	0.686±0.006

表4核磁检测重组株与出发菌株相比的戊二胺产量

实施例8构建pBU-piclR-p24-plac-rpoS-plac-ompA、pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompC、pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompF、pBU-piclR-p24-plac-rpoS-plac-ompW、pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompX质粒

以市售大肠杆菌K12 MG1655的基因组为模板，引物对ompA-F(序列如SEQ ID NO:73所示)和ompA-R(序列如SEQ ID NO:74所示)扩增出ompA基因(序列如SEQ ID NO:62所示)，引物对ompC-F(序列如SEQ ID NO:75所示)和ompC-R(序列如SEQ ID NO:76所示)扩增出ompC基因(序列如SEQ ID NO:63所示)。引物对ompF-F(序列如SEQ ID NO:77所示)和ompF-R(序列如SEQ ID NO:78所示)扩增出ompF基因(序列如SEQ ID NO:64所示)。引物对ompW-F(序列如SEQ ID NO:79所示)和ompW-R(序列如SEQ ID NO:80所示)扩增出ompW基因(序列如SEQ ID NO:65所示)。引物对ompX-F(序列如SEQ ID NO:81所示)和ompX-R(序列如SEQ ID NO:82所示)扩增出ompX基因(序列如SEQ ID NO:66)所示。以市售pUC18质粒DNA为模板，引物对plac-F2(序列如SEQ ID NO:72)和plac-R(序列如SEQ ID NO:59所示)扩增出plac启动子(序列如SEQ ID NO:61所示)；将plac启动子片段、ompA基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompA。

将plac启动子片段、ompC基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompC。

将plac启动子片段、ompF基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompF。

将plac启动子片段、ompW基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompW。

将plac启动子片段、ompX基因片段和XbaI单酶切后的pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS质粒进行切胶回收纯化，使用多片段一步法克隆试剂盒将基因片段和载体进行重组连接，产生的质粒名为pBU-piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompX。

实施例9构建1,5-戊二胺生产菌株

以实施例8构建得到的5个质粒作为模板，使用引物对upp-UF/upp-R分别扩增获得可用于染色体上同源重组的片段，并进行切胶回收。每个片段分别转入受体菌M11-A3/pKD46菌株中。涂布在含有10μg/ml四环素的LB抗性平板中进行筛选。挑取12个单菌落至添加有氨苄青霉素的600μl LB培养基中，37℃培养8h后，取1μl菌体作为模板进行PCR验证筛选正确的重组株，并甘油保种。

将甘油保种的菌株接种至含有0.1ug/mL 5-FU(5-氟尿嘧啶)的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养8h；取菌液分别划线至含有和不含有5-氟尿嘧啶的LB培养基平板，过夜培养。平板分析显示在含有5-氟尿嘧啶的平板上不能生长的菌株，从对应的不含5-氟尿嘧啶的平板上选取6个单克隆，取1μl菌体作为模板再次进行PCR验证，如果P1P2-tetA和Pupp-Upp片段已同时被移除，表明获得正确的重组株，将正确的重组株进行甘油保种。

实施例10检测菌株1,5-戊二胺产量

自实施例9中获得的重组株各选取3个转化子，出发株M11A3、piclR-p24--cadA/M11A3和piclR-p24-cadA-plac-rpoS/M11A3作为对照菌株，分别涂布不含抗生素的种子培养基(含有4wt％葡萄糖,0.1wt％KH₂PO₄,0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO4,0.2wt％酵母提取物)，于37℃培养过夜。然后分别各挑取3个单克隆，利用5ml种子培养基(含有4wt％葡萄糖,0.1wt％KH₂PO₄,0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO₄,0.2％酵母提取物)进行培养，37℃、225rpm过夜。然后将每个菌株再分别转接至50ml新鲜的发酵培养基(30g/L葡萄糖,0.7wt％Ca(HCO₃)₂，0.1wt％KH₂PO₄，0.1wt％MgSO₄,1.6wt％(NH₄)₂SO₄,0.001wt％FeSO₄,0.001wt％MnSO₄,0.2wt％酵母提取物的培养基)中于37℃、170rpm继续培养48h，利用核磁检测并计算各培养基中的戊二胺的含量。

如表5所示，表达促进1,5-戊二胺排出蛋白的菌株piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompA/M11A3，piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompC/M11A3，piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompF/M11A3,piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompW/M11A3,piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompX/M11A3与piclR-p24-cadA-plac-rpoS/M11A3重组菌株相比，生成的1,5-戊二胺的产量有进一步的提高，同时L-赖氨酸近乎全部转化为1,5-戊二胺，其中piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompA/M11A3菌株1,5戊二胺产量最高，最后积累了4.18g/kg以上的1,5-戊二胺，且几乎没有L-赖氨酸残留。

表5核磁检测重组株与出发菌株相比的戊二胺产量

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司

CIBT美国公司（CIBT America Inc.）

凯赛（乌苏）生物材料有限公司

<120> 重组核酸序列、重组表达载体以及基因工程菌

<130> P21015902C

<160> 85

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 235

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 1

tgctttttcc gatcgtcacg gcgatgttta tcgcgaacag atggtggact ttatccttag 60

cgcgttgaat ccgcagaact aacccatgat cgctagcacg ataatcattc acaaaaccac 120

cttaagacat gctaatccac tggtcagaac agtttaagat gagaaaaatt ctgtgacgct 180

tgccaacatt tctgatgatt agcattccct tcgccatttc cttgagcaaa cttta 235

<210> 2

<211> 238

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 2

tgtttggtaa aaattcccgc catcataaca ttgccaacgg cgaggggaag tgggtaaggc 60

atgtaaattc atcatgttga cgaaataatc gcccctggta aaagaaacac tgatgcgagg 120

cctgtgtttc aatctttaaa tcagtaaact tcatacgctt gacggaaaaa ccaggacgaa 180

acctaaatat ttgttgttaa gctgcaatgg aaacggtaaa agcggctagt atttaaag 238

<210> 3

<211> 233

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 3

ctcgcttaca tcgctaccag catggtcaac ctgcgcctgg cacaggaacg ttatccggac 60

gttcagttcc accagacccg cgagcattaa ttcttgcctc cagggcgcgg tagccgctgc 120

gccctgtcaa tttcccttcc ttattagccg cttacggaat gttcttaaaa cattcacttt 180

tgcttatgtt ttcgctgata tcccgagcgg tttcaaaatt gtgatctata ttt 233

<210> 4

<211> 237

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

gcagaaatga ctctcccatc agtacaaacg caacatattt gccacgcagc atccagacat 60

cacgaaacga atccatcttt atcgcatgtt ctggcggcgc gggttccgtg cgtgggacat 120

agctaataat ctggcggttt tgctggcgga gcggtttctt cattactggc ttcactaaac 180

gcatattaaa aatcagaaaa actgtagttt agccgattta gcccctgtac gtcccgc 237

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> p21

<400> 5

cactcccgcc tttaggggtc aaaattgttc tatactgtat tg 42

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> p22

<400> 6

tcccgccaaa ttcccaattt tgttctatac tgtattg 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> p23

<400> 7

tcccgccttt aggggtgaat tgttctatac tgaattg 37

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> p24

<400> 8

tcccgccttt aggggctaat tgttctatac tgaaatg 37

<210> 9

<211> 2148

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA基因序列

<400> 9

atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacatg ggggtttatt ttaaagaaga acccatccgt 60

gaacttcatc gcgcgcttga acgtctgaac ttccagattg tttacccgaa cgaccgtgac 120

gacttattaa aactgatcga aaacaatgcg cgtctgtgcg gcgttatttt tgactgggat 180

aaatataatc tcgagctgtg cgaagaaatt agcaaaatga acgagaacct gccgttgtac 240

gcgttcgcta atacgtattc cactctcgat gtaagcctga atgacctgcg tttacagatt 300

agcttctttg aatatgcgct gggtgctgct gaagatattg ctaataagat caagcagacc 360

actgacgaat atatcaacac tattctgcct ccgctgacta aagcactgtt taaatatgtt 420

cgtgaaggta aatatacttt ctgtactcct ggtcacatgg gcggtactgc attccagaaa 480

agcccggtag gtagcctgtt ctatgatttc tttggtccga ataccatgaa atctgatatt 540

tccatttcag tatctgaact gggttctctg ctggatcaca gtggtccaca caaagaagca 600

gaacagtata tcgctcgcgt ctttaacgca gaccgcagct acatggtgac caacggtact 660

tccactgcga acaaaattgt tggtatgtac tctgctccag caggcagcac cattctgatt 720

gaccgtaact gccacaaatc gctgacccac ctgatgatga tgagcgatgt tacgccaatc 780

tatttccgcc cgacccgtaa cgcttacggt attcttggtg gtatcccaca gagtgaattc 840

cagcacgcta ccattgctaa gcgcgtgaaa gaaacaccaa acgcaacctg gccggtacat 900

gctgtaatta ccaactctac ctatgatggt ctgctgtaca acaccgactt catcaagaaa 960

acactggatg tgaaatccat ccactttgac tccgcgtggg tgccttacac caacttctca 1020

ccgatttacg aaggtaaatg cggtatgagc ggtggccgtg tagaagggaa agtgatttac 1080

gaaacccagt ccactcacaa actgctggcg gcgttctctc aggcttccat gatccacgtt 1140

aaaggtgacg taaacgaaga aacctttaac gaagcctaca tgatgcacac caccacttct 1200

ccgcactacg gtatcgtggc gtccactgaa accgctgcgg cgatgatgaa aggcaatgca 1260

ggtaagcgtc tgatcaacgg ttctattgaa cgtgcgatca aattccgtaa agagatcaaa 1320

cgtctgagaa cggaatctga tggctggttc tttgatgtat ggcagccgga tcatatcgat 1380

acgactgaat gctggccgct gcgttctgac agcacctggc acggcttcaa aaacatcgat 1440

aacgagcaca tgtatcttga cccgatcaaa gtcaccctgc tgactccggg gatggaaaaa 1500

gacggcacca tgagcgactt tggtattccg gccagcatcg tggcgaaata cctcgacgaa 1560

catggcatcg ttgttgagaa aaccggtccg tataacctgc tgttcctgtt cagcatcggt 1620

atcgataaga ccaaagcact gagcctgctg cgtgctctga ctgactttaa acgtgcgttc 1680

gacctgaacc tgcgtgtgaa aaacatgctg ccgtctctgt atcgtgaaga tcctgaattc 1740

tatgaaaaca tgcgtattca ggaactggct cagaatatcc acaaactgat tgttcaccac 1800

aatctgccgg atctgatgta tcgcgcattt gaagtgctgc cgacgatggt aatgactccg 1860

tatgctgcat tccagaaaga gctgcacggt atgaccgaag aagtttacct cgacgaaatg 1920

gtaggtcgta ttaacgccaa tatgatcctt ccgtacccgc cgggagttcc tctggtaatg 1980

ccgggtgaaa tgatcaccga agaaagccgt ccggttctgg agttcctgca gatgctgtgt 2040

gaaatcggcg ctcactatcc gggctttgaa accgatattc acggtgcata ccgtcaggct 2100

gatggccgct ataccgttaa ggtattgaaa gaagaaagca aaaaataa 2148

<210> 10

<211> 715

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA蛋白序列

<400> 10

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 11

<211> 993

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rpoS的基因序列

<400> 11

atgagtcaga atacgctgaa agttcatgat ttaaatgaag atgcggaatt tgatgagaac 60

ggagttgagg tttttgacga aaaggcctta gtagaacagg aacccagtga taacgatttg 120

gccgaagagg aactgttatc gcagggagcc acacagcgtg tgttggacgc gactcagctt 180

taccttggtg agattggtta ttcaccactg ttaacggccg aagaagaagt ttattttgcg 240

cgtcgcgcac tgcgtggaga tgtcgcctct cgccgccgga tgatcgagag taacttgcgt 300

ctggtggtaa aaattgcccg ccgttatggc aatcgtggtc tggcgttgct ggaccttatc 360

gaagagggca acctggggct gatccgcgcg gtagagaagt ttgacccgga acgtggtttc 420

cgcttctcaa catacgcaac ctggtggatt cgccagacga ttgaacgggc gattatgaac 480

caaacccgta ctattcgttt gccgattcac atcgtaaagg agctgaacgt ttacctgcga 540

accgcacgtg agttgtccca taagctggac catgaaccaa gtgcggaaga gatcgcagag 600

caactggata agccagttga tgacgtcagc cgtatgcttc gtcttaacga gcgcattacc 660

tcggtagaca ccccgctggg tggtgattcc gaaaaagcgt tgctggacat cctggccgat 720

gaaaaagaga acggtccgga agataccacg caagatgacg atatgaagca gagcatcgtc 780

aaatggctgt tcgagctgaa cgccaaacag cgtgaagtgc tggcacgtcg attcggtttg 840

ctggggtacg aagcggcaac actggaagat gtaggtcgtg aaattggcct cacccgtgaa 900

cgtgttcgcc agattcaggt tgaaggcctg cgccgtttgc gcgaaatcct gcaaacgcag 960

gggctgaata tcgaagcgct gttccgcgag taa 993

<210> 12

<211> 633

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crp的基因序列

<400> 12

atggtgcttg gcaaaccgca aacagacccg actctcgaat ggttcttgtc tcattgccac 60

attcataagt acccatccaa gagcacgctt attcaccagg gtgaaaaagc ggaaacgctg 120

tactacatcg ttaaaggctc tgtggcagtg ctgatcaaag acgaagaggg taaagaaatg 180

atcctctcct atctgaatca gggtgatttt attggcgaac tgggcctgtt tgaagagggc 240

caggaacgta gcgcatgggt acgtgcgaaa accgcctgtg aagtggctga aatttcgtac 300

aaaaaatttc gccaattgat tcaggtaaac ccggacattc tgatgcgttt gtctgcacag 360

atggcgcgtc gtctgcaagt cacttcagag aaagtgggca acctggcgtt cctcgacgtg 420

acgggccgca ttgcacagac tctgctgaat ctggcaaaac aaccagacgc tatgactcac 480

ccggacggta tgcaaatcaa aattacccgt caggaaattg gtcagattgt cggctgttct 540

cgtgaaaccg tgggacgcat tctgaagatg ctggaagatc agaacctgat ctccgcacac 600

ggtaaaacca tcgtcgttta cggcactcgt taa 633

<210> 13

<211> 558

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> puuR的基因序列

<400> 13

atgagtgatg agggactggc gccaggaaaa cgcttgtcgg aaatccgcca gcagcagggg 60

ctttcacaac gtcgtgccgc cgaactctcc gggctgactc acagtgctat cagtacgata 120

gaacaagata aagtcagccc tgccatcagt acgctgcaaa agctgctgaa ggtgtatggt 180

ctgtcactct cggaattctt ttccgagccg gaaaaacctg atgagccgca ggtcgtcatt 240

aatcaggacg acttaattga gatgggtagt cagggtgtgt caatgaagct ggttcataac 300

ggtaacccga atcgcacgct ggcgatgatc tttgaaacgt accagccggg cacaaccact 360

ggggaaagaa ttaagcatca gggtgaggaa ataggcactg tactggaagg tgaaattgtt 420

ctgacgatta atggtcagga ttaccacctc gtcgcggggc aaagttatgc cattaatacc 480

ggcatcccgc acagtttcag taatacgtcg gcaggtattt gccgaattat cagcgcccat 540

acgcccacca cgttttaa 558

<210> 14

<211> 1512

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pepA的基因序列

<400> 14

atggagttta gtgtaaaaag cggtagcccg gagaaacagc ggagtgcctg catcgtcgtg 60

ggcgtcttcg aaccacgtcg cctttctccg attgcagaac agctcgataa aatcagcgat 120

gggtacatca gcgccctgct acgtcggggc gaactggaag gaaaaccggg gcagacattg 180

ttgctgcacc atgttccgaa tgtactttcc gagcgaattc tccttattgg ttgcggcaaa 240

gaacgtgagc tggatgagcg tcagtacaag caggttattc agaaaaccat taatacgctg 300

aatgatactg gctcaatgga agcggtctgc tttctgactg agctgcacgt taaaggccgt 360

aacaactact ggaaagtgcg tcaggctgtc gagacggcaa aagagacgct ctacagtttc 420

gatcagctga aaacgaacaa gagcgaaccg cgtcgtccgc tgcgtaagat ggtgttcaac 480

gtgccgaccc gccgtgaact gaccagcggt gagcgcgcga tccagcacgg tctggcgatt 540

gccgccggga ttaaagcagc aaaagatctc ggcaatatgc cgccgaatat ctgtaacgcc 600

gcttacctcg cttcacaagc gcgccagctg gctgacagct acagcaagaa tgtcatcacc 660

cgcgttatcg gcgaacagca gatgaaagag ctggggatgc attcctatct ggcggtcggt 720

cagggttcgc aaaacgaatc gctgatgtcg gtgattgagt acaaaggcaa cgcgtcggaa 780

gatgcacgcc caatcgtgct ggtgggtaaa ggtttaacct tcgactccgg cggtatctcg 840

atcaagcctt cagaaggcat ggatgagatg aagtacgata tgtgcggtgc ggcagcggtt 900

tacggcgtga tgcggatggt cgcggagcta caactgccga ttaacgttat cggcgtgttg 960

gcaggctgcg aaaacatgcc tggcggacga gcctatcgtc cgggcgatgt gttaaccacc 1020

atgtccggtc aaaccgttga agtgctgaac accgacgctg aaggccgcct ggtactgtgc 1080

gacgtgttaa cttacgttga gcgttttgag ccggaagcgg tgattgacgt ggcgacgctg 1140

accggtgcct gcgtgatcgc gctgggtcat catattactg gtctgatggc gaaccataat 1200

ccgctggccc atgaactgat tgccgcgtct gaacaatccg gtgaccgcgc atggcgctta 1260

ccgctgggtg acgagtatca ggaacaactg gagtccaatt ttgccgatat ggcgaacatt 1320

ggcggtcgtc ctggtggggc gattaccgca ggttgcttcc tgtcacgctt tacccgtaag 1380

tacaactggg cgcacctgga tatcgccggt accgcctggc gttctggtaa agcaaaaggc 1440

gccaccggtc gtccggtagc gttgctggca cagttcctgt taaaccgcgc tgggtttaac 1500

ggcgaagagt aa 1512

<210> 15

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> soxS的基因序列

<400> 15

atgtcccatc agaaaattat tcaggatctt atcgcatgga ttgacgagca tattgaccag 60

ccgcttaaca ttgatgtagt cgcaaaaaaa tcaggctatt caaagtggta cttgcaacga 120

atgttccgca cggtgacgca tcagacgctt ggcgattaca ttcgccaacg ccgcctgtta 180

ctggccgccg ttgagttgcg caccaccgag cgtccgattt ttgatatcgc aatggacctg 240

ggttatgtct cgcagcagac cttctcccgc gttttccgtc ggcagtttga tcgcactccc 300

agcgattatc gccaccgcct gtaa 324

<210> 16

<211> 330

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> RpoS

<400> 16

Met Ser Gln Asn Thr Leu Lys Val His Asp Leu Asn Glu Asp Ala Glu

1 5 10 15

Phe Asp Glu Asn Gly Val Glu Val Phe Asp Glu Lys Ala Leu Val Glu

20 25 30

Gln Glu Pro Ser Asp Asn Asp Leu Ala Glu Glu Glu Leu Leu Ser Gln

35 40 45

Gly Ala Thr Gln Arg Val Leu Asp Ala Thr Gln Leu Tyr Leu Gly Glu

50 55 60

Ile Gly Tyr Ser Pro Leu Leu Thr Ala Glu Glu Glu Val Tyr Phe Ala

65 70 75 80

Arg Arg Ala Leu Arg Gly Asp Val Ala Ser Arg Arg Arg Met Ile Glu

85 90 95

Ser Asn Leu Arg Leu Val Val Lys Ile Ala Arg Arg Tyr Gly Asn Arg

100 105 110

Gly Leu Ala Leu Leu Asp Leu Ile Glu Glu Gly Asn Leu Gly Leu Ile

115 120 125

Arg Ala Val Glu Lys Phe Asp Pro Glu Arg Gly Phe Arg Phe Ser Thr

130 135 140

Tyr Ala Thr Trp Trp Ile Arg Gln Thr Ile Glu Arg Ala Ile Met Asn

145 150 155 160

Gln Thr Arg Thr Ile Arg Leu Pro Ile His Ile Val Lys Glu Leu Asn

165 170 175

Val Tyr Leu Arg Thr Ala Arg Glu Leu Ser His Lys Leu Asp His Glu

180 185 190

Pro Ser Ala Glu Glu Ile Ala Glu Gln Leu Asp Lys Pro Val Asp Asp

195 200 205

Val Ser Arg Met Leu Arg Leu Asn Glu Arg Ile Thr Ser Val Asp Thr

210 215 220

Pro Leu Gly Gly Asp Ser Glu Lys Ala Leu Leu Asp Ile Leu Ala Asp

225 230 235 240

Glu Lys Glu Asn Gly Pro Glu Asp Thr Thr Gln Asp Asp Asp Met Lys

245 250 255

Gln Ser Ile Val Lys Trp Leu Phe Glu Leu Asn Ala Lys Gln Arg Glu

260 265 270

Val Leu Ala Arg Arg Phe Gly Leu Leu Gly Tyr Glu Ala Ala Thr Leu

275 280 285

Glu Asp Val Gly Arg Glu Ile Gly Leu Thr Arg Glu Arg Val Arg Gln

290 295 300

Ile Gln Val Glu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ile Leu Gln Thr Gln

305 310 315 320

Gly Leu Asn Ile Glu Ala Leu Phe Arg Glu

325 330

<210> 17

<211> 210

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CRP

<400> 17

Met Val Leu Gly Lys Pro Gln Thr Asp Pro Thr Leu Glu Trp Phe Leu

1 5 10 15

Ser His Cys His Ile His Lys Tyr Pro Ser Lys Ser Thr Leu Ile His

20 25 30

Gln Gly Glu Lys Ala Glu Thr Leu Tyr Tyr Ile Val Lys Gly Ser Val

35 40 45

Ala Val Leu Ile Lys Asp Glu Glu Gly Lys Glu Met Ile Leu Ser Tyr

50 55 60

Leu Asn Gln Gly Asp Phe Ile Gly Glu Leu Gly Leu Phe Glu Glu Gly

65 70 75 80

Gln Glu Arg Ser Ala Trp Val Arg Ala Lys Thr Ala Cys Glu Val Ala

85 90 95

Glu Ile Ser Tyr Lys Lys Phe Arg Gln Leu Ile Gln Val Asn Pro Asp

100 105 110

Ile Leu Met Arg Leu Ser Ala Gln Met Ala Arg Arg Leu Gln Val Thr

115 120 125

Ser Glu Lys Val Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asp Val Thr Gly Arg Ile

130 135 140

Ala Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ala Lys Gln Pro Asp Ala Met Thr His

145 150 155 160

Pro Asp Gly Met Gln Ile Lys Ile Thr Arg Gln Glu Ile Gly Gln Ile

165 170 175

Val Gly Cys Ser Arg Glu Thr Val Gly Arg Ile Leu Lys Met Leu Glu

180 185 190

Asp Gln Asn Leu Ile Ser Ala His Gly Lys Thr Ile Val Val Tyr Gly

195 200 205

Thr Arg

210

<210> 18

<211> 185

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PuuR

<400> 18

Met Ser Asp Glu Gly Leu Ala Pro Gly Lys Arg Leu Ser Glu Ile Arg

1 5 10 15

Gln Gln Gln Gly Leu Ser Gln Arg Arg Ala Ala Glu Leu Ser Gly Leu

20 25 30

Thr His Ser Ala Ile Ser Thr Ile Glu Gln Asp Lys Val Ser Pro Ala

35 40 45

Ile Ser Thr Leu Gln Lys Leu Leu Lys Val Tyr Gly Leu Ser Leu Ser

50 55 60

Glu Phe Phe Ser Glu Pro Glu Lys Pro Asp Glu Pro Gln Val Val Ile

65 70 75 80

Asn Gln Asp Asp Leu Ile Glu Met Gly Ser Gln Gly Val Ser Met Lys

85 90 95

Leu Val His Asn Gly Asn Pro Asn Arg Thr Leu Ala Met Ile Phe Glu

100 105 110

Thr Tyr Gln Pro Gly Thr Thr Thr Gly Glu Arg Ile Lys His Gln Gly

115 120 125

Glu Glu Ile Gly Thr Val Leu Glu Gly Glu Ile Val Leu Thr Ile Asn

130 135 140

Gly Gln Asp Tyr His Leu Val Ala Gly Gln Ser Tyr Ala Ile Asn Thr

145 150 155 160

Gly Ile Pro His Ser Phe Ser Asn Thr Ser Ala Gly Ile Cys Arg Ile

165 170 175

Ile Ser Ala His Thr Pro Thr Thr Phe

180 185

<210> 19

<211> 503

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PepA

<400> 19

Met Glu Phe Ser Val Lys Ser Gly Ser Pro Glu Lys Gln Arg Ser Ala

1 5 10 15

Cys Ile Val Val Gly Val Phe Glu Pro Arg Arg Leu Ser Pro Ile Ala

20 25 30

Glu Gln Leu Asp Lys Ile Ser Asp Gly Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Arg

35 40 45

Arg Gly Glu Leu Glu Gly Lys Pro Gly Gln Thr Leu Leu Leu His His

50 55 60

Val Pro Asn Val Leu Ser Glu Arg Ile Leu Leu Ile Gly Cys Gly Lys

65 70 75 80

Glu Arg Glu Leu Asp Glu Arg Gln Tyr Lys Gln Val Ile Gln Lys Thr

85 90 95

Ile Asn Thr Leu Asn Asp Thr Gly Ser Met Glu Ala Val Cys Phe Leu

100 105 110

Thr Glu Leu His Val Lys Gly Arg Asn Asn Tyr Trp Lys Val Arg Gln

115 120 125

Ala Val Glu Thr Ala Lys Glu Thr Leu Tyr Ser Phe Asp Gln Leu Lys

130 135 140

Thr Asn Lys Ser Glu Pro Arg Arg Pro Leu Arg Lys Met Val Phe Asn

145 150 155 160

Val Pro Thr Arg Arg Glu Leu Thr Ser Gly Glu Arg Ala Ile Gln His

165 170 175

Gly Leu Ala Ile Ala Ala Gly Ile Lys Ala Ala Lys Asp Leu Gly Asn

180 185 190

Met Pro Pro Asn Ile Cys Asn Ala Ala Tyr Leu Ala Ser Gln Ala Arg

195 200 205

Gln Leu Ala Asp Ser Tyr Ser Lys Asn Val Ile Thr Arg Val Ile Gly

210 215 220

Glu Gln Gln Met Lys Glu Leu Gly Met His Ser Tyr Leu Ala Val Gly

225 230 235 240

Gln Gly Ser Gln Asn Glu Ser Leu Met Ser Val Ile Glu Tyr Lys Gly

245 250 255

Asn Ala Ser Glu Asp Ala Arg Pro Ile Val Leu Val Gly Lys Gly Leu

260 265 270

Thr Phe Asp Ser Gly Gly Ile Ser Ile Lys Pro Ser Glu Gly Met Asp

275 280 285

Glu Met Lys Tyr Asp Met Cys Gly Ala Ala Ala Val Tyr Gly Val Met

290 295 300

Arg Met Val Ala Glu Leu Gln Leu Pro Ile Asn Val Ile Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Gly Cys Glu Asn Met Pro Gly Gly Arg Ala Tyr Arg Pro Gly Asp

325 330 335

Val Leu Thr Thr Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu Asn Thr Asp

340 345 350

Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Cys Asp Val Leu Thr Tyr Val Glu Arg

355 360 365

Phe Glu Pro Glu Ala Val Ile Asp Val Ala Thr Leu Thr Gly Ala Cys

370 375 380

Val Ile Ala Leu Gly His His Ile Thr Gly Leu Met Ala Asn His Asn

385 390 395 400

Pro Leu Ala His Glu Leu Ile Ala Ala Ser Glu Gln Ser Gly Asp Arg

405 410 415

Ala Trp Arg Leu Pro Leu Gly Asp Glu Tyr Gln Glu Gln Leu Glu Ser

420 425 430

Asn Phe Ala Asp Met Ala Asn Ile Gly Gly Arg Pro Gly Gly Ala Ile

435 440 445

Thr Ala Gly Cys Phe Leu Ser Arg Phe Thr Arg Lys Tyr Asn Trp Ala

450 455 460

His Leu Asp Ile Ala Gly Thr Ala Trp Arg Ser Gly Lys Ala Lys Gly

465 470 475 480

Ala Thr Gly Arg Pro Val Ala Leu Leu Ala Gln Phe Leu Leu Asn Arg

485 490 495

Ala Gly Phe Asn Gly Glu Glu

500

<210> 20

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SoxS

<400> 20

Met Ser His Gln Lys Ile Ile Gln Asp Leu Ile Ala Trp Ile Asp Glu

1 5 10 15

His Ile Asp Gln Pro Leu Asn Ile Asp Val Val Ala Lys Lys Ser Gly

20 25 30

Tyr Ser Lys Trp Tyr Leu Gln Arg Met Phe Arg Thr Val Thr His Gln

35 40 45

Thr Leu Gly Asp Tyr Ile Arg Gln Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Val

50 55 60

Glu Leu Arg Thr Thr Glu Arg Pro Ile Phe Asp Ile Ala Met Asp Leu

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ser Gln Gln Thr Phe Ser Arg Val Phe Arg Arg Gln Phe

85 90 95

Asp Arg Thr Pro Ser Asp Tyr Arg His Arg Leu

100 105

<210> 21

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> upp-UF

<400> 21

aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa aaacccgcga catcgtaatc 50

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> upp-UR

<400> 22

ggattatacc tcctttcttc aaggcg 26

<210> 23

<211> 790

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Upp-U

<400> 23

aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa aaacccgcga catcgtaatc ctcaccgtga 60

tacatccccg gcatttctgc cgtttcgcca cccaccagtg aacagcctga ttgcagacaa 120

ccttccgcaa tgccgctgat caccgctgaa gcggtatcaa catccagttt tccggttgcg 180

taatagtcga ggaaaaacag cggctctgca ccttgcacca ccaggtcatt aacgcacatg 240

gcgaccagat caataccaat ggtgtcgtga cgttttaagt ccattgccag acgcagcttg 300

gtacctacgc cgtcagtgcc agaaaccagc acgggttcac gatatttttg cggcaatgca 360

cacagcgcac cgaagccgcc cagaccgccc atcacttccg gacgacgcgt tttcttcact 420

acgcctttga ttcttccaac cagagcatta cccgcgtcaa tatcaacacc ggcatctttg 480

tagctaagag aggttttatc ggtcactgct tgggtcccca cgcgttactt gcggtagaaa 540

aataaaattc ggcgcaattc taacagggaa agcaaacgtt tgcgagactg ctttacacaa 600

cctttttgca cgtcttttcc ccaggcgcgc ggcgaaagaa gacttgtgcc agggtaaagg 660

ttagttttcg gatggaataa tcttctttca taaccatctg aatataaaat aactttatct 720

caaaccgtta tcattttgac taaagtcaac gaaaagaata ttgccgcctt gaagaaagga 780

ggtataatcc 790

<210> 24

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> upp-DF

<400> 24

tgccgccttg aagaaaggag gtataatccg aattcagtcg gctttttttt gagtaaagcg 60

<210> 25

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> upp-DR

<400> 25

ccgcattaaa gcttatcgat gataagctgt caaacatgac cgggagtaaa cccgccata 59

<210> 26

<211> 574

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Upp-500bp-D

<400> 26

tgccgccttg aagaaaggag gtataatccg aattcagtcg gctttttttt gagtaaagcg 60

cctataacac ataatacaga ggataatact atgacgcgcc gtgctatcgg ggtgagtgaa 120

agaccgccac ttttacagac aatcccgctt agtttgcaac atttgttcgc catgtttggt 180

gcaaccgtcc tggtgcccgt cttatttcat attaacccgg cgactgtact gttatttaac 240

ggtattggaa cgctgctgta tctcttcatc tgtaaaggga aaattccggc ttatcttggt 300

tccagctttg cctttatttc accggtattg ttactgttgc cgttagggta tgaagtcgcg 360

ctgggcggct ttattatgtg cggcgtgctg ttctgcctgg tttcttttat cgtgaagaaa 420

gcggggaccg gctggctgga cgtgctgttt ccacctgcgg caatgggcgc aatcgttgcc 480

gtcatcggtc tggagctggc gggcgtagct gccggtatgg cgggtttact cccggtcatg 540

tttgacagct tatcatcgat aagctttaat gcgg 574

<210> 27

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> upp-F

<400> 27

tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcgtcg attttttttg tggctgccc 59

<210> 28

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> upp-R

<400> 28

tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ctttgttgta atccactttc g 51

<210> 29

<211> 1905

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Pupp-UPP-D

<400> 29

tggagccggg ccacctcgac ctgaatggaa gccggcgtcg attttttttg tggctgcccc 60

tcaaaggaga aagagtatga agatcgtgga agtcaaacac ccactcgtca aacacaagct 120

gggactgatg cgtgagcaag atatcagcac caagcgcttt cgcgaactcg cttccgaagt 180

gggtagcctg ctgacttacg aagcgaccgc cgacctcgaa acggaaaaag taactatcga 240

aggctggaac ggcccggtag aaatcgacca gatcaaaggt aagaaaatta ccgttgtgcc 300

aattctgcgt gcgggtcttg gtatgatgga cggtgtgctg gaaaacgttc cgagcgcgcg 360

catcagcgtt gtcggtatgt accgtaatga agaaacgctg gagccggtac cgtacttcca 420

gaaactggtt tctaacatcg atgagcgtat ggcgctgatc gttgacccaa tgctggcaac 480

cggtggttcc gttatcgcga ccatcgacct gctgaaaaaa gcgggctgca gcagcatcaa 540

agttctggtg ctggtagctg cgccagaagg tatcgctgcg ctggaaaaag cgcacccgga 600

cgtcgaactg tataccgcat cgattgatca gggactgaac gagcacggat acattattcc 660

gggcctcggc gatgccggtg acaaaatctt tggtacgaaa taaagaataa aaataattaa 720

agccgacttt aagagtcggc ttttttttga gtaaagcgcc tataacacat aatacagagg 780

ataatactat gacgcgccgt gctatcgggg tgagtgaaag accgccactt ttacagacaa 840

tcccgcttag tttgcaacat ttgttcgcca tgtttggtgc aaccgtcctg gtgcccgtct 900

tatttcatat taacccggcg actgtactgt tatttaacgg tattggaacg ctgctgtatc 960

tcttcatctg taaagggaaa attccggctt atcttggttc cagctttgcc tttatttcac 1020

cggtattgtt actgttgccg ttagggtatg aagtcgcgct gggcggcttt attatgtgcg 1080

gcgtgctgtt ctgcctggtt tcttttatcg tgaagaaagc ggggaccggc tggctggacg 1140

tgctgtttcc acctgcggca atgggcgcaa tcgttgccgt catcggtctg gagctggcgg 1200

gcgtagctgc cggtatggcg ggtttactcc cggctgaagg gcaaacgcca gactccaaaa 1260

ccatcatcat ctctattacc accctggcgg tcacggtttt aggttccgtg ctgtttcgtg 1320

gtttcctggc aattatcccg attttaattg gcgtgctggt ggggtacgcg ctctctttcg 1380

caatgggaat tgtcgatacc acgccgatta ttaatgctca ctggtttgcg ctgccaaccc 1440

tctatacgcc gcgcttcgag tggtttgcca ttctgactat tctgccagcg gcgttagtgg 1500

ttattgccga acacgtaggg cacctggtag taacggctaa tatcgtcaaa aaagatctgc 1560

tgcgcgatcc aggtctgcac cgttcgatgt ttgctaatgg cttgtcgacc gtgatttccg 1620

gcttctttgg ctctacgcca aatactactt acggagaaaa cattggcgtg atggcgatca 1680

cccgtgttta cagtacctgg gttatcggcg gggcggcgat tttcgctatc ctgctttcct 1740

gcgtcggtaa actggctgcc gctatccaga tgatcccatt gccggtgatg ggcggcgttt 1800

cgctgctgct ttatggtgtc atcggtgctt ccggtattcg tgttttgatc gaatcgaaag 1860

tggattacaa caaagcggca cctcgctaac ggattcacca ctcca 1905

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1P2-tetA-F

<400> 30

tcatgtttga cagcttatca tcgataagc 29

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1P2-tetA-R

<400> 31

gccggcttcc attcaggtcg 20

<210> 32

<211> 1285

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1P2-tetA

<400> 32

tcatgtttga cagcttatca tcgataagct ttaatgcggt agtttatcac agttaaattg 60

ctaacgcagt caggcaccgt gtatgaaatc taacaatgcg ctcatcgtca tcctcggcac 120

cgtcaccctg gatgctgtag gcataggctt ggttatgccg gtactgccgg gcctcttgcg 180

ggatatcgtc cattccgaca gcatcgccag tcactatggc gtgctgctag cgctatatgc 240

gttgatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg 300

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgac tacgcgatca tggcgaccac 360

acccgtcctg tggatcctct acgccggacg catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg 420

tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt 480

cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact 540

gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa 600

cctactactg ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc 660

cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc 720

cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg 780

ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc 840

ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg 900

tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt 960

gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg 1020

cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca 1080

gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct 1140

gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt 1200

aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc 1260

cacctcgacc tgaatggaag ccggc 1285

<210> 33

<211> 62

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA-F

<400> 33

cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcatgaacgt tattgcaata ttgaatcaca 60

tg 62

<210> 34

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cadA-R

<400> 34

ggcgctttac tcaaaaaaaa gccgacttct agaccacttc ccttgtacga gctaa 55

<210> 35

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> piclR-F

<400> 35

ccttgaagaa aggaggtata atccatttgt tcaacattaa ctcatcggat 50

<210> 36

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> piclR-R

<400> 36

attcaatatt gcaataacgt tcatgagctc ctgaacctgt ccagtcgctg 50

<210> 37

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pcsiE-F

<400> 37

cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tctgcttttt ccgatcgtca cg 52

<210> 38

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pcsiE-R

<400> 38

aatattgcaa taacgttcat gagctctaaa gtttgctcaa ggaaatggc 49

<210> 39

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pbolA-F

<400> 39

cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tctgtttggt aaaaattccc g 51

<210> 40

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pbolA-R

<400> 40

aatattgcaa taacgttcat gagctccttt aaatactagc cgcttttac 49

<210> 41

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> posmY-F

<400> 41

cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcctcgctta catcgctacc agc 53

<210> 42

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> posmY-R

<400> 42

aatattgcaa taacgttcat gagctcaaat atagatcaca attttgaa 48

<210> 43

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pkatE-F

<400> 43

cgccttgaag aaaggaggta taatccgagc tcgcagaaat gactctccca tc 52

<210> 44

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pkatE-R

<400> 44

aatattgcaa taacgttcat gagctcgcgg gacgtacagg ggc 43

<210> 45

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pcsiE-F2

<400> 45

cgcaccagcg actggacagg ttcagtgctt tttccgatcg tcacg 45

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pbolA-F2

<400> 46

cgcaccagcg actggacagg ttcagtgttt ggtaaaaatt cccg 44

<210> 47

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> posmY-F2

<400> 47

cgcaccagcg actggacagg ttcagctcgc ttacatcgct accagc 46

<210> 48

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pkatE-F2

<400> 48

cgcaccagcg actggacagg ttcaggcaga aatgactctc ccatc 45

<210> 49

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rpoS-F

<400> 49

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgagtcagaa tacgctgaaa gtt 53

<210> 50

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rpoS-R

<400> 50

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttactcgcgg aacagcgctt 50

<210> 51

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crp-F

<400> 51

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tggtgcttgg caaaccgca 49

<210> 52

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> crp-R

<400> 52

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttaacgagtg ccgtaaacga 50

<210> 53

<211> 49

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> puuR-F

<400> 53

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgagtgatga gggactggc 49

<210> 54

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> puuR-R

<400> 54

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttaaaacgtg gtgggcgtat 50

<210> 55

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pepA-F

<400> 55

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tggagtttag tgtaaaaagc gg 52

<210> 56

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pepA-R

<400> 56

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttactcttcg ccgttaaacc ca 52

<210> 57

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> soxS-F

<400> 57

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgtcccatca gaaaattatt cagg 54

<210> 58

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> soxS-R

<400> 58

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttacaggcgg tggcgataat c 51

<210> 59

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> plac-F

<400> 59

gagctcctcc tgtgtgaaat tgttatc 27

<210> 60

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> plac-R

<400> 60

aaaaataatt agctcgtaca agggaagtgg ggataaccgt attaccgcct ttgag 55

<210> 61

<211> 308

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 包含有plac启动子的序列

<400> 61

ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga 60

gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc 120

cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg 180

cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 240

ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 300

aggagctc 308

<210> 62

<211> 1041

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompA的基因序列

<400> 62

atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtagcgcag 60

gccgctccga aagataacac ctggtacact ggtgctaaac tgggctggtc ccagtaccat 120

gacactggtt tcatcaacaa caatggcccg acccatgaaa accaactggg cgctggtgct 180

tttggtggtt accaggttaa cccgtatgtt ggctttgaaa tgggttacga ctggttaggt 240

cgtatgccgt acaaaggcag cgttgaaaac ggtgcataca aagctcaggg cgttcaactg 300

accgctaaac tgggttaccc aatcactgac gacctggaca tctacactcg tctgggtggc 360

atggtatggc gtgcagacac taaatccaac gtttatggta aaaaccacga caccggcgtt 420

tctccggtct tcgctggcgg tgttgagtac gcgatcactc ctgaaatcgc tacccgtctg 480

gaataccagt ggaccaacaa catcggtgac gcacacacca tcggcactcg tccggacaac 540

ggcatgctga gcctgggtgt ttcctaccgt ttcggtcagg gcgaagcagc tccagtagtt 600

gctccggctc cagctccggc accggaagta cagaccaagc acttcactct gaagtctgac 660

gttctgttca acttcaacaa agcaaccctg aaaccggaag gtcaggctgc tctggatcag 720

ctgtacagcc agctgagcaa cctggatccg aaagacggtt ccgtagttgt tctgggttac 780

accgaccgca tcggttctga cgcttacaac cagggtctgt ccgagcgccg tgctcagtct 840

gttgttgatt acctgatctc caaaggtatc ccggcagaca agatctccgc acgtggtatg 900

ggcgaatcca acccggttac tggcaacacc tgtgacaacg tgaaacagcg tgctgcactg 960

atcgactgcc tggctccgga tcgtcgcgta gagatcgaag ttaaaggtat caaagacgtt 1020

gtaactcagc cgcaggctta a 1041

<210> 63

<211> 1104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompC的基因序列

<400> 63

atgaaagtta aagtactgtc cctcctggtc ccagctctgc tggtagcagg cgcagcaaac 60

gctgctgaag tttacaacaa agacggcaac aaattagatc tgtacggtaa agtagacggc 120

ctgcactatt tctctgacaa caaagatgta gatggcgacc agacctacat gcgtcttggc 180

ttcaaaggtg aaactcaggt tactgaccag ctgaccggtt acggccagtg ggaatatcag 240

atccagggca acagcgctga aaacgaaaac aactcctgga cccgtgtggc attcgcaggt 300

ctgaaattcc aggatgtggg ttctttcgac tacggtcgta actacggcgt tgtttatgac 360

gtaacttcct ggaccgacgt actgccagaa ttcggtggtg acacctacgg ttctgacaac 420

ttcatgcagc agcgtggtaa cggcttcgcg acctaccgta acactgactt cttcggtctg 480

gttgacggcc tgaactttgc tgttcagtac cagggtaaaa acggcaaccc atctggtgaa 540

ggctttacta gtggcgtaac taacaacggt cgtgacgcac tgcgtcaaaa cggcgacggc 600

gtcggcggtt ctatcactta tgattacgaa ggtttcggta tcggtggtgc gatctccagc 660

tccaaacgta ctgatgctca gaacaccgct gcttacatcg gtaacggcga ccgtgctgaa 720

acctacactg gtggtctgaa atacgacgct aacaacatct acctggctgc tcagtacacc 780

cagacctaca acgcaactcg cgtaggttcc ctgggttggg cgaacaaagc acagaacttc 840

gaagctgttg ctcagtacca gttcgacttc ggtctgcgtc cgtccctggc ttacctgcag 900

tctaaaggta aaaacctggg tcgtggctac gacgacgaag atatcctgaa atatgttgat 960

gttggtgcta cctactactt caacaaaaac atgtccacct acgttgacta caaaatcaac 1020

ctgctggacg acaaccagtt cactcgtgac gctggcatca acactgataa catcgtagct 1080

ctgggtctgg tttaccagtt ctaa 1104

<210> 64

<211> 1089

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompF的基因序列

<400> 64

atgatgaagc gcaatattct ggcagtgatc gtccctgctc tgttagtagc aggtactgca 60

aacgctgcag aaatctataa caaagatggc aacaaagtag atctgtacgg taaagctgtt 120

ggtctgcatt atttttccaa gggtaacggt gaaaacagtt acggtggcaa tggcgacatg 180

acctatgccc gtcttggttt taaaggggaa actcaaatca attccgatct gaccggttat 240

ggtcagtggg aatataactt ccagggtaac aactctgaag gcgctgacgc tcaaactggt 300

aacaaaacgc gtctggcatt cgcgggtctt aaatacgctg acgttggttc tttcgattac 360

ggccgtaact acggtgtggt ttatgatgca ctgggttaca ccgatatgct gccagaattt 420

ggtggtgata ctgcatacag cgatgacttc ttcgttggtc gtgttggcgg cgttgctacc 480

tatcgtaact ccaacttctt tggtctggtt gatggcctga acttcgctgt tcagtacctg 540

ggtaaaaacg agcgtgacac tgcacgccgt tctaacggcg acggtgttgg cggttctatc 600

agctacgaat acgaaggctt tggtatcgtt ggtgcttatg gtgcagctga ccgtaccaac 660

ctgcaagaag ctcaacctct tggcaacggt aaaaaagctg aacagtgggc tactggtctg 720

aagtacgacg cgaacaacat ctacctggca gcgaactacg gtgaaacccg taacgctacg 780

ccgatcacta ataaatttac aaacaccagc ggcttcgcca acaaaacgca agacgttctg 840

ttagttgcgc aataccagtt cgatttcggt ctgcgtccgt ccatcgctta caccaaatct 900

aaagcgaaag acgtagaagg tatcggtgat gttgatctgg tgaactactt tgaagtgggc 960

gcaacctact acttcaacaa aaacatgtcc acctatgttg actacatcat caaccagatc 1020

gattctgaca acaaactggg cgtaggttca gacgacaccg ttgctgtggg tatcgtttac 1080

cagttctaa 1089

<210> 65

<211> 639

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompW的基因序列

<400> 65

atgaaaaagt taacagtggc ggctttggca gtaacaactc ttctctctgg cagtgccttt 60

gcgcatgaag caggcgaatt ttttatgcgt gcaggttctg caaccgtacg tccaacagaa 120

ggtgctggtg gtacgttagg aagtctgggt ggattcagcg tgaccaataa cacgcaactg 180

ggccttacgt ttacttatat ggcgaccgac aacattggtg tggaattact ggcagcgacg 240

ccgttccgcc ataaaatcgg cacccgggcg accggcgata ttgcaaccgt tcatcatctg 300

ccaccaacac tgatggcgca gtggtatttt ggtgatgcca gcagcaaatt ccgtccttac 360

gttggggcag gtattaacta caccaccttc tttgataatg gatttaacga tcatggcaaa 420

gaggcagggc tttccgatct cagtctgaaa gattcctggg gagctgccgg gcaggtgggg 480

gttgattatc tgattaaccg tgactggttg gttaacatgt cagtgtggta catggatatc 540

gataccaccg ccaattataa gctgggcggt gcacagcaac acgatagcgt acgcctcgat 600

ccgtgggtgt ttatgttctc agcaggatat cgtttttaa 639

<210> 66

<211> 516

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompX的基因序列

<400> 66

atgaaaaaaa ttgcatgtct ttcagcactg gccgcagttc tggctttcac cgcaggtact 60

tccgtagctg cgacttctac tgtaactggc ggttacgcac agagcgacgc tcagggccaa 120

atgaacaaaa tgggcggttt caacctgaaa taccgctatg aagaagacaa cagcccgctg 180

ggtgtgatcg gttctttcac ttacaccgag aaaagccgta ctgcaagctc tggtgactac 240

aacaaaaacc agtactacgg catcactgct ggtccggctt accgcattaa cgactgggca 300

agcatctacg gtgtagtggg tgtgggttat ggtaaattcc agaccactga atacccgacc 360

tacaaacacg acaccagcga ctacggtttc tcctacggtg cgggtctgca gttcaacccg 420

atggaaaacg ttgctctgga cttctcttac gagcagagcc gtattcgtag cgttgacgta 480

ggcacctgga ttgccggtgt tggttaccgc ttctaa 516

<210> 67

<211> 346

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmpA

<400> 67

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala

1 5 10 15

Thr Val Ala Gln Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Thr Gly Ala

20 25 30

Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Ile Asn Asn Asn

35 40 45

Gly Pro Thr His Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr

50 55 60

Gln Val Asn Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly

65 70 75 80

Arg Met Pro Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln

85 90 95

Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu

100 105 110

Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys

115 120 125

Ser Asn Val Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe

130 135 140

Ala Gly Gly Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg Leu

145 150 155 160

Glu Tyr Gln Trp Thr Asn Asn Ile Gly Asp Ala His Thr Ile Gly Thr

165 170 175

Arg Pro Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly

180 185 190

Gln Gly Glu Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro

195 200 205

Glu Val Gln Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Ala Ala Leu Asp Gln

225 230 235 240

Leu Tyr Ser Gln Leu Ser Asn Leu Asp Pro Lys Asp Gly Ser Val Val

245 250 255

Val Leu Gly Tyr Thr Asp Arg Ile Gly Ser Asp Ala Tyr Asn Gln Gly

260 265 270

Leu Ser Glu Arg Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Ile Ser Lys

275 280 285

Gly Ile Pro Ala Asp Lys Ile Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn

290 295 300

Pro Val Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Gln Arg Ala Ala Leu

305 310 315 320

Ile Asp Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu Ile Glu Val Lys Gly

325 330 335

Ile Lys Asp Val Val Thr Gln Pro Gln Ala

340 345

<210> 68

<211> 367

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmpC

<400> 68

Met Lys Val Lys Val Leu Ser Leu Leu Val Pro Ala Leu Leu Val Ala

1 5 10 15

Gly Ala Ala Asn Ala Ala Glu Val Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys Leu

20 25 30

Asp Leu Tyr Gly Lys Val Asp Gly Leu His Tyr Phe Ser Asp Asn Lys

35 40 45

Asp Val Asp Gly Asp Gln Thr Tyr Met Arg Leu Gly Phe Lys Gly Glu

50 55 60

Thr Gln Val Thr Asp Gln Leu Thr Gly Tyr Gly Gln Trp Glu Tyr Gln

65 70 75 80

Ile Gln Gly Asn Ser Ala Glu Asn Glu Asn Asn Ser Trp Thr Arg Val

85 90 95

Ala Phe Ala Gly Leu Lys Phe Gln Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly

100 105 110

Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr Asp Val Thr Ser Trp Thr Asp Val Leu

115 120 125

Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr Tyr Gly Ser Asp Asn Phe Met Gln Gln

130 135 140

Arg Gly Asn Gly Phe Ala Thr Tyr Arg Asn Thr Asp Phe Phe Gly Leu

145 150 155 160

Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala Val Gln Tyr Gln Gly Lys Asn Gly Asn

165 170 175

Pro Ser Gly Glu Gly Phe Thr Ser Gly Val Thr Asn Asn Gly Arg Asp

180 185 190

Ala Leu Arg Gln Asn Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Thr Tyr Asp

195 200 205

Tyr Glu Gly Phe Gly Ile Gly Gly Ala Ile Ser Ser Ser Lys Arg Thr

210 215 220

Asp Ala Gln Asn Thr Ala Ala Tyr Ile Gly Asn Gly Asp Arg Ala Glu

225 230 235 240

Thr Tyr Thr Gly Gly Leu Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala

245 250 255

Ala Gln Tyr Thr Gln Thr Tyr Asn Ala Thr Arg Val Gly Ser Leu Gly

260 265 270

Trp Ala Asn Lys Ala Gln Asn Phe Glu Ala Val Ala Gln Tyr Gln Phe

275 280 285

Asp Phe Gly Leu Arg Pro Ser Leu Ala Tyr Leu Gln Ser Lys Gly Lys

290 295 300

Asn Leu Gly Arg Gly Tyr Asp Asp Glu Asp Ile Leu Lys Tyr Val Asp

305 310 315 320

Val Gly Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp

325 330 335

Tyr Lys Ile Asn Leu Leu Asp Asp Asn Gln Phe Thr Arg Asp Ala Gly

340 345 350

Ile Asn Thr Asp Asn Ile Val Ala Leu Gly Leu Val Tyr Gln Phe

355 360 365

<210> 69

<211> 362

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmpF

<400> 69

Met Met Lys Arg Asn Ile Leu Ala Val Ile Val Pro Ala Leu Leu Val

1 5 10 15

Ala Gly Thr Ala Asn Ala Ala Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Gly Asn Lys

20 25 30

Val Asp Leu Tyr Gly Lys Ala Val Gly Leu His Tyr Phe Ser Lys Gly

35 40 45

Asn Gly Glu Asn Ser Tyr Gly Gly Asn Gly Asp Met Thr Tyr Ala Arg

50 55 60

Leu Gly Phe Lys Gly Glu Thr Gln Ile Asn Ser Asp Leu Thr Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Gln Trp Glu Tyr Asn Phe Gln Gly Asn Asn Ser Glu Gly Ala Asp

85 90 95

Ala Gln Thr Gly Asn Lys Thr Arg Leu Ala Phe Ala Gly Leu Lys Tyr

100 105 110

Ala Asp Val Gly Ser Phe Asp Tyr Gly Arg Asn Tyr Gly Val Val Tyr

115 120 125

Asp Ala Leu Gly Tyr Thr Asp Met Leu Pro Glu Phe Gly Gly Asp Thr

130 135 140

Ala Tyr Ser Asp Asp Phe Phe Val Gly Arg Val Gly Gly Val Ala Thr

145 150 155 160

Tyr Arg Asn Ser Asn Phe Phe Gly Leu Val Asp Gly Leu Asn Phe Ala

165 170 175

Val Gln Tyr Leu Gly Lys Asn Glu Arg Asp Thr Ala Arg Arg Ser Asn

180 185 190

Gly Asp Gly Val Gly Gly Ser Ile Ser Tyr Glu Tyr Glu Gly Phe Gly

195 200 205

Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ala Ala Asp Arg Thr Asn Leu Gln Glu Ala

210 215 220

Gln Pro Leu Gly Asn Gly Lys Lys Ala Glu Gln Trp Ala Thr Gly Leu

225 230 235 240

Lys Tyr Asp Ala Asn Asn Ile Tyr Leu Ala Ala Asn Tyr Gly Glu Thr

245 250 255

Arg Asn Ala Thr Pro Ile Thr Asn Lys Phe Thr Asn Thr Ser Gly Phe

260 265 270

Ala Asn Lys Thr Gln Asp Val Leu Leu Val Ala Gln Tyr Gln Phe Asp

275 280 285

Phe Gly Leu Arg Pro Ser Ile Ala Tyr Thr Lys Ser Lys Ala Lys Asp

290 295 300

Val Glu Gly Ile Gly Asp Val Asp Leu Val Asn Tyr Phe Glu Val Gly

305 310 315 320

Ala Thr Tyr Tyr Phe Asn Lys Asn Met Ser Thr Tyr Val Asp Tyr Ile

325 330 335

Ile Asn Gln Ile Asp Ser Asp Asn Lys Leu Gly Val Gly Ser Asp Asp

340 345 350

Thr Val Ala Val Gly Ile Val Tyr Gln Phe

355 360

<210> 70

<211> 212

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmpW

<400> 70

Met Lys Lys Leu Thr Val Ala Ala Leu Ala Val Thr Thr Leu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ala Phe Ala His Glu Ala Gly Glu Phe Phe Met Arg Ala Gly

20 25 30

Ser Ala Thr Val Arg Pro Thr Glu Gly Ala Gly Gly Thr Leu Gly Ser

35 40 45

Leu Gly Gly Phe Ser Val Thr Asn Asn Thr Gln Leu Gly Leu Thr Phe

50 55 60

Thr Tyr Met Ala Thr Asp Asn Ile Gly Val Glu Leu Leu Ala Ala Thr

65 70 75 80

Pro Phe Arg His Lys Ile Gly Thr Arg Ala Thr Gly Asp Ile Ala Thr

85 90 95

Val His His Leu Pro Pro Thr Leu Met Ala Gln Trp Tyr Phe Gly Asp

100 105 110

Ala Ser Ser Lys Phe Arg Pro Tyr Val Gly Ala Gly Ile Asn Tyr Thr

115 120 125

Thr Phe Phe Asp Asn Gly Phe Asn Asp His Gly Lys Glu Ala Gly Leu

130 135 140

Ser Asp Leu Ser Leu Lys Asp Ser Trp Gly Ala Ala Gly Gln Val Gly

145 150 155 160

Val Asp Tyr Leu Ile Asn Arg Asp Trp Leu Val Asn Met Ser Val Trp

165 170 175

Tyr Met Asp Ile Asp Thr Thr Ala Asn Tyr Lys Leu Gly Gly Ala Gln

180 185 190

Gln His Asp Ser Val Arg Leu Asp Pro Trp Val Phe Met Phe Ser Ala

195 200 205

Gly Tyr Arg Phe

210

<210> 71

<211> 171

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OmpX

<400> 71

Met Lys Lys Ile Ala Cys Leu Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Thr Ala Gly Thr Ser Val Ala Ala Thr Ser Thr Val Thr Gly Gly Tyr

20 25 30

Ala Gln Ser Asp Ala Gln Gly Gln Met Asn Lys Met Gly Gly Phe Asn

35 40 45

Leu Lys Tyr Arg Tyr Glu Glu Asp Asn Ser Pro Leu Gly Val Ile Gly

50 55 60

Ser Phe Thr Tyr Thr Glu Lys Ser Arg Thr Ala Ser Ser Gly Asp Tyr

65 70 75 80

Asn Lys Asn Gln Tyr Tyr Gly Ile Thr Ala Gly Pro Ala Tyr Arg Ile

85 90 95

Asn Asp Trp Ala Ser Ile Tyr Gly Val Val Gly Val Gly Tyr Gly Lys

100 105 110

Phe Gln Thr Thr Glu Tyr Pro Thr Tyr Lys His Asp Thr Ser Asp Tyr

115 120 125

Gly Phe Ser Tyr Gly Ala Gly Leu Gln Phe Asn Pro Met Glu Asn Val

130 135 140

Ala Leu Asp Phe Ser Tyr Glu Gln Ser Arg Ile Arg Ser Val Asp Val

145 150 155 160

Gly Thr Trp Ile Ala Gly Val Gly Tyr Arg Phe

165 170

<210> 72

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> plac-F2

<400> 72

ctgaatatcg aagcgctgtt ccgcgagtaa ggataaccgt attaccgcct ttgag 55

<210> 73

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompA-F

<400> 73

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgaaaaagac agctatcgcg 50

<210> 74

<211> 50

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompA-R

<400> 74

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttaagcctgc ggctgagtta 50

<210> 75

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompC-F

<400> 75

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgaaagttaa agtactgtcc ctcc 54

<210> 76

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompC-R

<400> 76

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttagaactgg taaaccagac cc 52

<210> 77

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompF-F

<400> 77

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgatgaagcg caatattctg g 51

<210> 78

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompF-R

<400> 78

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttagaactgg taaacgatac cca 53

<210> 79

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompW-F

<400> 79

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgaaaaagtt aacagtggcg g 51

<210> 80

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompW-R

<400> 80

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttaaaaacga tatcctgctg agaac 55

<210> 81

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompX-F

<400> 81

cggataacaa tttcacacag gaggagctca tgaaaaaaat tgcatgtctt tcagc 55

<210> 82

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ompX-R

<400> 82

gctttactca aaaaaaagcc gacttctaga ttagaagcgg taaccaacac c 51

<210> 83

<211> 175

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> piclR启动子序列

<400> 83

atttgttcaa cattaactca tcggatcagt tcagtaacta ttgcattagc taacaataaa 60

aatgaaaatg atttccacga tacagaaaaa agagactgtc atggtcgcac ccattcccgc 120

gaaacgcggc agaaaacccg ccgttgccac cgcaccagcg actggacagg ttcag 175

<210> 84

<211> 113

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来源谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium

glutamicum）piclR启动子piclR-Cg

<400> 84

acagtatagc tattaagagg cgtaaatgtc acctcccgcc caaaatcttc ttataccccc 60

acacagtgaa tcccttcacc acgtctcatt gggtgaaatg ctaaattcaa ggt 113

<210> 85

<211> 71

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 来源蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的piclR启动子piclR-Ha

<400> 85

gagcagttaa aaaccacgat cgcatccata atgtcgaaaa cgaaaataga ttccattttt 60

ataacatttt t 71

Claims (10)

1.一种重组核酸序列，其特征在于，所述重组核酸序列包括串联启动子、赖氨酸脱羧酶基因以及增强细胞耐受压力的基因，其中，所述串联启动子包括piclR启动子和稳定期特异性启动子，所述稳定期特异性启动子选自下述的一种或多种：pcsiE、pbolA、posmY、pkatE、p21、p22、p23和p24。

2.根据权利要求1所述的重组核酸序列，其特征在于，所述piclR启动子来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)以及蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)中的任意一种或几种；

优选地，所述piclR启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:83-85任意一项所示；所述稳定期特异性启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-8任意一项所示；和/或，所述赖氨酸脱羧酶基因选自来自大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌、蜂房哈夫尼菌中的任意一种的cadA基因或ldcC基因；

更优选地，所述cadA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。

3.根据权利要求1所述的重组核酸序列，其特征在于，所述重组核酸序列还包括组成型启动子；

优选地，所述组成型启动子选自plac、trp、tac、trc和PL中的任意一种或几种；

更优选地，所述组成型启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:60所示。

4.根据权利要求1所述的重组核酸序列，其特征在于，所述增强细胞耐受压力的基因与组成型启动子可操作地连接，所述增强细胞耐受压力的基因选自：rpoS、crp、puuR、pepA以及soxS中的任意一种或几种；

优选地，所述增强细胞耐受压力的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:11-15任意一项所示。

5.根据权利要求1所述的重组核酸序列，其特征在于，所述重组核酸序列还包括编码外膜孔蛋白的基因；

优选地，所述编码外膜孔蛋白的基因与组成型启动子可操作性地连接，和/或，所述编码外膜孔蛋白的基因选自：ompA、ompC、ompF、ompW和ompX中的任意一种或几种；更优选地，所述编码外膜孔蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:62-66任意一项所示。

6.根据权利要求1～5任一项所述的重组核酸序列，其特征在于，所述重组核酸序列选自以下组：

(1)piclR-p24-cadA-plac-rpoS、piclR-p24-cadA-plac-crp、piclR-p24-cadA-plac-puuR、piclR-p24-cadA-plac-pepA或piclR-p24-cadA-plac-soxS；和，

(2)piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompA、piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompC、piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompF、piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompW或piclR-p24-cadA-plac-rpoS-plac-ompX。

7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括如权利要求1-6中任意一项所述的重组核酸序列；

优选地，所述重组表达载体的骨架质粒包括pUC18、pUC19、pBR322、pACYC、pET、pSC101以及它们的衍生质粒。

8.一种生产1,5-戊二胺的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包含权利要求1-6中任意一项所述的重组核酸序列；

优选地，所述重组核酸序列位于游离的重组表达载体或整合到染色体中；

更优选地，所述基因工程菌的宿主菌来源于埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、栖热菌属(Thermus)、短杆菌属(Brevibacterium)或哈夫尼菌属(Hafnia)的菌种；

进一步更优选地，所述基因工程菌的宿主菌来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热菌(Thermus thermophilus)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。

9.一种生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：在发酵培养基中对含有如权利要求8所述的基因工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

10.如权利要求1-6中任意一项所述的重组核酸序列、权利要求7所述的重组表达载体或如权利要求8所述的基因工程菌在生产1,5-戊二胺中的应用。