CN101273054A

CN101273054A - 产生l-氨基酸的细菌和用于产生l-氨基酸的方法

Info

Publication number: CN101273054A
Application number: CNA2006800357084A
Authority: CN
Inventors: 岩谷真太郎; 今泉明; 臼田佳弘; 松井和彦
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2005-09-27
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2008-09-24
Anticipated expiration: 2026-09-27
Also published as: US9644009B2; CN101273054B; US20090246835A1; BRPI0616419A2; BRPI0616419B1; JP2007117082A

Abstract

通过以下方法产生L－氨基酸：在培养基中培养肠杆菌科的微生物，所述微生物具有产生L－氨基酸的能力，并且经修饰而将选自evgA基因、gadE基因或ydeO基因的一种或多种基因的表达量增加，所述基因编码EvgAS双组分体系调节子中涉及的转录因子，从而在培养基或细胞中产生和积累L－氨基酸；和从所述培养基或细胞中收集L－氨基酸。

Description

产生L-氨基酸的细菌和用于产生L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及使用微生物产生L-氨基酸的方法，更具体地，涉及用于产生L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸等的方法。L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸在工业中用作动物饲料添加剂、保健食品(health food)成分、氨基酸浸剂(infusion)。

背景技术

为了通过使用微生物的发酵来产生目标物质，例如L-氨基酸等，存在使用以下菌株的方法：野生型微生物(野生型菌株)、源自野生型菌株的营养缺陷菌株、代谢调节突变体菌株如源自野生型菌株的各种类型的药物抗性突变体菌株之一、同时具有营养缺陷菌株和代谢调节突变体菌株特征的菌株等。

在最近几年，已将重组DNA技术用于通过发酵来产生目标物质。例如，通过增强编码L-氨基酸生物合成酶的基因的表达(美国专利No.5168056、美国专利No.5776736)，或通过增强碳源向L-氨基酸生物合成系统的输入(influx)(美国专利No.5906925)来改进微生物产生L-氨基酸的能力。

就存在于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌如大肠杆菌等中的双组分系统EvgAS而言，传感激酶(sensor kinase)EvgS的功能是未知的，但是已知应答调节转录因子EvgA调节许多基因的转录(Masuda，N.and Church，G.M.，J.Bacteriol.2002.184(22)：6225-6234.Escherichia coli gene expression responsiveto levels of the response regulator EvgA.)。还已知转录因子EvgA正调节编码两种转录因子YdeO和GadE的ydeO和gadE基因的转录，并且YdeO正调节gadE基因的转录(Masuda，N.and Church，G.M.，Mol.Microbiol.2003.48(3)：699-712.Regulatory network of acid resistance genes in Escherichia coli.；Ma，Z.，Masuda，N.，and Foster，J.W，J.Bacteriol.2004.186(21)：7378-7389.Characterization of EvgAS-YdeO-GadE branched regulatory circuit governingglutamate-dependent acid resistance in Escherichia coli.)。然而，先前尚未报导使用将evgA、gadE或ydeO基因的表达增加的微生物来产生氨基酸。

发明内容

本发明的目的是提供能够有效地产生L-氨基酸的肠杆菌科(familyEnterobacteriaceae)的细菌菌株，并且还提供使用所述细菌菌株有效地产生L-氨基酸的方法。

本发明的发明人为了解决上述问题进行了广泛的研究，结果发现能够通过修饰微生物以增加evgA基因、gadE基因或ydeO基因中一种或多种的表达来改进产生L-氨基酸的能力。这些基因编码EvgAS双组分系统中涉及的转录因子。

本发明的目的是提供用于产生L-氨基酸的方法，其包括：在培养基中培养肠杆菌科的细菌，所述细菌具有产生L-氨基酸的能力并且经修饰以使选自evgA基因、gadE基因或ydeO基因的一种或多种基因的表达增加，所述基因编码EvgAS双组分体系中涉及的转录因子；在所述培养基中产生和积累L-氨基酸；和从培养基中收集L-氨基酸。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中通过增加每种基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达调节序列来增加一种或多种基因的表达。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中通过修饰细菌以使编码传感激酶的evgS基因的表达增加来增加所述一种或多种基因的表达量。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述evgA基因是以下(a)或(b)中描述的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列的DNA，

(b)在严紧条件下与SEQ ID NO：23的核苷酸序列的互补核苷酸序列，或与能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录因子活性的蛋白质。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述gadE基因是以下(c)或(d)中描述的DNA：

(c)包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的DNA，

(d)在严紧条件下与SEQ ID NO：27的核苷酸序列的互补核苷酸序列，或与能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录因子活性的蛋白质。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述ydeO基因是以下(e)或(f)中描述的DNA：

(e)包含SEQ ID NO：29的核苷酸序列的DNA，

(f)在严紧条件下与SEQ ID NO：29的核苷酸序列的互补核苷酸序列，或与能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录因子活性的蛋白质。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述evgS基因是以下(g)或(h)中描述的DNA：

(g)包含SEQ ID NO：25的核苷酸序列的DNA，

(h)在严紧条件下与SEQ ID NO：25的核苷酸序列的互补核苷酸序列，或与能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有磷酸转移活性(phosphotransfer activity)的蛋白质。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述evgA基因编码以下(A)或(B)中描述的蛋白质：

(A)由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成的蛋白质，

(B)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的蛋白质，其包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有转录因子活性。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述gadE基因编码以下(C)或(D)中描述的蛋白质：

(C)由SEQ ID NO：28的氨基酸序列组成的蛋白质，

(D)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的蛋白质，其包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有转录因子活性。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述ydeO基因编码以下(E)或(F)中描述的蛋白质：

(E)由SEQ ID NO：30的氨基酸序列组成的蛋白质，

(F)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白质，其包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有转录因子活性。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述evgS基因编码以下(G)或(H)中描述的蛋白质：

(G)由SEQ ID NO：26的氨基酸序列组成的蛋白质，

(H)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的蛋白质，其包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有磷酸转移酶活性。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于选自下组的肠杆菌科：埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)和沙雷氏菌属(Serratia)。

本发明进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是选自下组的一种或多种氨基酸：L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸。

附图简述

图1显示具有温度敏感复制起点的质粒载体pTS1的构建。

优选实施方式详述

在下文中，将对本发明进行详细说明。

1.本发明的微生物

本发明的微生物是肠杆菌科的微生物，其具有产生L-氨基酸的能力，并且经修饰以使evgA、gadE或ydeO基因中一种或多种的表达增加，所述基因编码EvgAS双组分体系调节子(EvgAS two-component system regulon)中涉及的转录因子。在本文中，“产生L-氨基酸的能力”的意思是当在培养基中培养本发明的微生物时，产生L-氨基酸并且以能够从培养基或所述微生物的细胞中收集的水平引起L-氨基酸积累的能力。本发明的微生物可具有产生多种L-氨基酸的能力。所述微生物可天然具有产生L-氨基酸的能力，或可通过诱变或重组DNA技术进行修饰以赋予产生L-氨基酸的能力，例如下文所述。

同样，短语“增加基因的表达”的意思是将基因的转录和/或翻译增加。

L-氨基酸的类型无具体限制。实例包括：碱性L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸(L-citrulline)；脂肪族L-氨基酸例如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；为羟基单氨基羧酸的L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫L-氨基酸例如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸和L-天冬氨酸；酸性L-氨基酸的酰胺例如L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺等。具体而言，L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸是优选的。本发明的微生物可能能够产生两种或更多种氨基酸。

1-1.赋予产生L-氨基酸的能力

以下包括将产生L-氨基酸的能力赋予微生物的方法的描述，以及能够用于本发明的被赋予产生L-氨基酸能力的微生物的实例，但是本发明不限于这些，只要它们具有产生L-氨基酸的能力。

对用于本发明的微生物无具体限制，只要其属于肠杆菌科，例如埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等，并且其具有产生L-氨基酸的能力。具体地，可以使用属于NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)数据库中所述分类的肠杆菌科的任何微生物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg？mode＝Tree&id＝1236&1v1＝3&keep＝1&srchmode＝1&unlock)。作为能够用于衍生本发明微生物的肠杆菌科的亲本菌株，特别期望使用属于埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。

没有特定的为了获得本发明的细菌而必须使用的埃希氏菌属细菌的亲本菌株，但是可以使用Neidhardt等所列的那些菌株(Backmann，B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12，p.2460-2488.Table 1.In F.D.Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology/Second Edition，American Society forMicrobiology Press，Washington，D.C.)。一个实例是大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例是大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等，其是源自K12的野生型菌株的原型(prototype)。

这些可以从例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection(地址：P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，United States of America))获得。通过该组织的网站(参见http:/www.atcc.org)，通过使用给予各细菌菌株的登录号可以获得它们。相应于每个细菌菌株的登录号在美国典型培养物保藏中心的目录中提供。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。泛菌属细菌的实例包括Pantoea ananatis。在近几年中，基于16S rRNA核苷酸序列分析，有时将成团肠杆菌重分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis和斯氏泛菌(Pantoeastewartii)。对于本发明，可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的任何细菌，只要所述细菌归类在肠杆菌科中。当通过基因工程培育Pantoea ananatis时，可以使用菌株Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)、AJ13356(FERMBP-6615)、AJ13601(FERM BP-7207)或它们的任何衍生物。在分离时，将这些菌株鉴定并且保藏为成团肠杆菌。如上所述，通过16S rRNA核苷酸序列的分析使得它们被重分类为Pantoea ananatis。

下文将描述赋予属于肠杆菌科的微生物产生L-氨基酸的能力的方法，和用于增加这些微生物中产生L-氨基酸的能力的方法。

为了赋予产生L-氨基酸的能力，可使用在棒状杆菌型细菌(coryneformbacteria)或埃希氏菌属细菌的培育中常规使用的方法(参见“Amino AcidFermentation”，Gakkai Shuppan Center(Ltd.)，1st Edition，published May 30，1986，pp.77-100)。这些方法包括获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌株或代谢调节突变体，或构建将L-氨基酸生物合成酶的表达增强的重组菌株。在本文中，在产生L-氨基酸的细菌的培育中，可赋予一种或多种性质，例如营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变。可将一种或多种L-氨基酸生物合成酶的表达单独增强，或以两种或更多种的组合来增强。另外，可以将赋予性质的技术与增强生物合成酶的技术组合，所述性质例如营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变。

具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体菌株可如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以常规突变处理，例如曝露于X-射线或UV照射，或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)处理等；其后选择显示营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有产生L-氨基酸的能力的那些菌株。

以下是产生L-赖氨酸的细菌的实例和它们的构建方法。

例如，具有产生L-赖氨酸的能力的细菌包括L-赖氨酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体菌株。L-赖氨酸类似物的实例包括但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等。可通过对属于埃希氏菌属的细菌施以常规人工诱变处理，来获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体菌株。产生L-赖氨酸的细菌的实例包括大肠杆菌AJ11442菌株(FERMBP-1543、NRRL B-12185；参见JP56-18596A和美国专利No.4,346,170)、大肠杆菌VL611菌株(EP1016710A)等。也可以使用大肠杆菌WC196菌株(WO96/17930)作为产生L-赖氨酸的细菌。通过将AEC抗性赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌株来培育WC196菌株。将这种菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并且在1994年12月6日以登录号FERM P-14690保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(the National Institute of Bioscience and Human--Technology of the Agency of Industrial Science and Technology)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International PatentOrganism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)；Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)。之后根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)在1995年9月29日转为国际保藏，并给予登录号FERM BP-5252。

也可通过增加L-赖氨酸生物合成酶活性来构建产生L-赖氨酸的细菌。能够通过增加细胞中编码所述酶的基因的拷贝数，或通过修饰表达调节序列，来实现这些酶活性的增加。

编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的实例包括但不限于：编码二氢吡啶二羧酸合酶的基因(dapA)、编码天冬氨酸激酶的基因(lysC)、编码二氢吡啶二羧酸还原酶的基因(dapB)、编码二氨基庚二酸脱羧酶的基因(lysA)、编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因(ddh)(WO96/40934、美国专利No.6,040,160)、编码磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的基因(ppc)(60-87788A)、编码天冬氨酸氨基转移酶的基因(aspC)(JP6-102028B)、编码二氨基庚二酸差向异构酶的基因(dapF)(JP2003-135066A)、编码天冬氨酸半醛脱氢酶的基因(asd)(WO00/61723)和编码二氨基庚二酸途径酶的其它基因；以及编码高乌头酸水合酶的基因(JP2000-157276A)和编码氨基己二酸途径酶的其它基因。

此外，已知野生型二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)和天冬氨酸激酶(AK)受L-赖氨酸反馈抑制的阻抑；因此，当使用dapA和lysC时，优选分别使用编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的二氢吡啶二羧酸合酶和天冬氨酸激酶的突变基因(EP 0733710、US5,932,453)。

编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的突变二氢吡啶二羧酸合酶的DNA的实例包括编码具有以下氨基酸序列的DDPS的DNA，在所述氨基酸序列中用酪氨酸取代第118位的组氨酸残基(U.S.5,661,012和6,040,160)。另外，编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的突变AK的DNA的实例包括编码具有以下氨基酸序列的AK的DNA，在所述氨基酸序列中用异亮氨酸取代352-苏氨酸残基(U.S.5,661,012和6,040,160)。能够通过使用PCR的定点诱变等获得这些突变DNA。

以下是通过将编码L-赖氨酸生物合成酶的基因引入宿主中来赋予产生L-赖氨酸能力的技术的实例。即，通过将编码L-赖氨酸生物合成基因的基因片段与在选择的宿主微生物中发挥功能的载体(优选多拷贝载体)连接，并且用所述重组载体来转化该宿主来制备重组DNA。由于所述转化，宿主细胞中编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的拷贝数增加，使表达增加并且从而增加酶活性。

不具体指定编码L-赖氨酸生物合成酶的基因，只要它们能够在宿主微生物中表达。实例包括源自大肠杆菌的基因，和源自棒状杆菌型细菌组(coryneform group of bacteria)的基因。因为已经报导了大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的全基因组序列，所以能够基于这些基因的核苷酸序列合成引物，并且通过PCR方法获得这些基因，在所述PCR方法中将微生物(例如大肠杆菌K12等)的基因组DNA用作模板。

为了克隆所述基因，可以使用在肠杆菌科中自主复制的质粒。实例包括pBR322、pTWV228(Takara Bio Inc.)、pMW119(Nippon Gene Co.，Ltd.)、pUC19、pSTV29(Takara Bio Inc.)、RSF1010(Gene，75：271-288(1989))等。除这些之外，还可以使用噬菌体载体。

为了将靶基因连接至上述载体，将载体用限制酶消化，所述限制酶与含有靶基因的DNA片段的末端匹配。连接通常用连接酶(例如T4DNA连接酶)进行。靶基因可分别位于不同的载体上，或位于相同的载体上。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来消化和连接DNA，以及制备染色体DNA、进行PCR、制备质粒DNA、转化、设计寡核苷酸引物等。这些方法在Sambrook，J.，and Russell，D.W.Molecular Cloning A Laboratory Manual/Third Edition.NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等中描述。可以使用达到充分转化效率的任何方法将如上所述制备的重组DNA引入宿主微生物。实例包括电穿孔(Can.J.Microbiol.43：197-201(1997))。使用这种方法制备的质粒的实例包括产生Lys的质粒pCABD2，所述质粒含有dapA、dapB和LysC基因(WO01/53459)。

也可通过将靶基因的多拷贝引入微生物的基因组DNA来实现增强编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达。可通过使用以多拷贝存在于所述基因组DNA上的序列作为同源重组中的靶来将靶基因的多拷贝引入微生物的基因组DNA中。对这种以使用同源重组的基因取代为基础的位点特异性地引入突变已有描述。在这些方法中可使用线性DNA或含有温度敏感复制起点的质粒(美国专利6,303,383和JP05-007491A)。可以使用重复DNA和存在于可转座元件末端的反向重复序列作为以多拷贝存在于基因组DNA上的序列。可将L-赖氨酸生物合成基因与基因组的天然基因串联(in tandem)连接，或可将其引入基因组上的非必需区或引入如果缺失将使L-赖氨酸产率得到改进的基因区。或者，如U.S.Patent 5,595,889中披露，还可将靶基因定位于转座子上，其后转移所述转座子以将多拷贝引入基因组DNA。用任一方法，将转化体中靶基因的拷贝数增加，从而使L-赖氨酸生物合成的酶活性增加。

除了上述基因扩增外，能够通过将靶基因的表达调节序列(如启动子等)用较强的取代来实现L-赖氨酸生物合成酶活性的增加(参见JP1-215280A)。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、

10启动子等是已知的强启动子。使用这些启动子取代使靶基因的表达增强，由此增加酶活性。强启动子的实例和用于评估启动子强度的方法的实例描述于Goldstein等(Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128，(1995)Prokaryotic promoters inbiotechnology.)，等等。

也可通过修饰在编码目标酶的基因的表达调节中涉及的元件来实现目标酶活性的增加，所述元件例如操纵基因或阻抑物(Hamilton et al，J.Bacteriol.171：4617-4622(1989))。如WO 00/18935中披露，能够在靶基因的启动子区中取代几个碱基以修饰和增强所述基因。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中，特别在起始密码子的紧邻上游序列中取代几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有强烈的影响。因此，可以修饰这些区来增加转录效率。能够通过启动子探针载体和基因分析软件例如GENETYX(GENETYX CORPORATION)等确定靶基因的表达调节区例如启动子等。能够通过取代或修饰这些启动子来增加靶基因的表达。例如，能够以与上述使用温度敏感质粒的基因取代相同的方式进行表达调节序列的取代。也可使用Red-驱动整合方法(Red-driven integration method)(WO2005/010175)。

此外，在产生L-氨基酸的细菌中，可将下述酶的活性减少或缺失：催化从L-氨基酸生物合成途径分支的产生目标L-氨基酸之外化合物的反应的酶，或对L-氨基酸的合成或积累具有负效应的酶。在L-赖氨酸的产生中，这些酶包括高丝氨酸脱氢酶(thrA)、赖氨酸脱羧酶(cadA、ldcC)和苹果酸酶(sfcA、b2463)。在WO 95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等中公开所述酶活性减少或缺陷的菌株。

为了减少或缺失这些酶的活性，可使用常规诱变方法或遗传重组技术，将减少或缺失细胞中所述酶活性的突变体引入基因组中上述酶的基因中。引入突变体的这种方法能够通过下述实现：例如通过遗传重组来缺失在基因组上编码酶的基因，或修饰表达调节序列例如启动子或Shine-Dalgarno(SD)序列等。这也可通过如下方法实现：在基因组上编码酶的区中引入氨基酸取代(错义突变)或终止密码子(无义突变)，引入添加或缺失1-2个碱基的移码突变，或缺失基因的部分或完整区(J.Biol.Chem.272：8611-8617(1997))。同样，通过如下方法能够将酶活性减少或缺失：构建已将部分或完整编码区缺失的编码突变酶的基因，其后通过同源重组等用所述基因取代基因组上的正常基因，或将转座子或IS元件引入所述基因。可以使用以下方法通过遗传重组来引入使上述酶活性减少或缺失的突变。将含有靶基因的分离的DNA突变，以使所得突变基因不产生正常发挥功能的酶。随后用含有突变基因的DNA转化属于肠杆菌科的微生物，以引起在所述突变基因和基因组上靶基因之间的重组。由此，可以用突变基因取代基因组上的靶基因。对于使用这种同源重组的基因取代，存在使用线性DNA的方法，例如称为“Red-驱动整合”的方法(Datsenko，K.A，and Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、将Red-驱动整合方法与λ噬菌体切除系统(λphage excisive system)组合的方法(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))(参见WO2005/010175)等；还存在使用含有温度敏感复制起点的质粒的方法(美国专利No.6,303,383；美国专利No.5,616,480)。这种如上所述使用同源重组通过基因取代来位点特异性地引入突变也可使用在选择的宿主中不具有复制能力的质粒进行。

上述用于增加L-赖氨酸生物合成中涉及的酶活性的方法和用于减少酶活性的方法可同样用于培育其它产生L-氨基酸的细菌。以下将描述用来培育其它L-氨基酸细菌的方法。

在本发明中优选使用的产生L-色氨酸的细菌包括将邻氨基苯甲酸合酶、磷酸甘油酸脱氢酶或色氨酸合酶中一种或多种的活性增强的细菌。由于邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶均受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，能够通过保留(retain)脱敏的突变酶来增加这些酶的活性。例如，通过引起邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)的突变以防止反馈抑制，再将所述突变基因引入属于肠杆菌科的微生物，可获得具有脱敏的酶的细菌(美国专利No.5,618,716、美国专利No.6,180,373)。这种细菌的具体实例包括如下获得的转化体：将具有突变serA的质粒pGH5引入保留脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164，所述突变serA编码脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶(WO94/08301)。通过在大肠杆菌KB862的trpE缺陷型菌株(DSM7196)中引入编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因来获得菌株SV164(参见WO94/08031)。

用含有色氨酸操纵子的重组DNA转化的细菌也是优选的。具体实例包括用含有编码脱敏邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子转化的大肠杆菌(JP57-71397A、JP62-244382A、美国专利No.4,371,614)。另外，能够通过增强编码色氨酸合酶的基因(trpBA)的表达来增强或赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由trpA和trpB分别编码的α和β亚基组成。trpA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：13，而trpB的核苷酸序列示于SEQ ID NO：15。

具有缺陷型trpR(色氨酸操纵子阻抑物)的菌株，和具有突变trpR的菌株也是优选的。(美国专利No.4,371,614、WO2005/056776)。

其它优选的产生L-色氨酸的细菌是结构性表达苹果酸合酶、异柠檬酸裂合酶和异柠檬酸脱氢酶/磷酸酶操纵子(ace操纵子)的细菌，或将所述操纵子的表达增强的细菌(WO2005/103275)。具体地，优选ace操纵子的启动子不受阻抑物iclR的阻抑或去除了iclR的阻抑。能够通过破坏iclR基因或修饰ace操纵子的表达调节序列来获得这种细菌。大肠杆菌的iclR基因示于SEQ ID NO：5。ace操纵子的表达增强的细菌能够如下获得：将含有ace操纵子的DNA与强启动子连接，并且使用质粒或通过同源重组将所述重组DNA引入细胞；或通过使用转座子来扩增ace操纵子的拷贝数。ace操纵子中包含的基因包括aceB、aceA和aceK。aceB、aceA和aceK的核苷酸序列分别示于SEQ ID NOS：9、7和11。

产生L-色氨酸的细菌的实例包括：大肠杆菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263]，其是L-苯丙氨酸和L-酪氨酸营养缺陷型；和AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264]，其包含含有色氨酸操纵子的质粒pGX50(二者均参见美国专利No.4,371,614)。这些菌株可以从农业研究机构保藏中心(AgriculturalResearch Service Culture Collection，National Center for Agricultural UtilizationResearch)(地址：Peoria，Illinois 61604，USA)获得。

L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，并且共享共同的生物合成途径。编码这些芳族氨基酸生物合成酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(aroC)(EP763127)。因此，通过将编码这些酶的基因多重拷贝(multi-copy)至质粒或基因组上，能够改进产生芳族氨基酸的能力。已知这些基因由酪氨酸阻抑物(tyrR)调控，所以也可通过缺失tyrR基因来增加芳族氨基酸生物合成的酶活性(参见EP763127)。

产生L-苯丙氨酸的细菌的实例包括tyrA、tyrR缺陷的AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)，和具有扩增的编码苯丙氨酸分泌蛋白的基因例如yddG和yedA的菌株(WO03/044192；US2003/0148473A1)。

在本发明中使用的产生L-苏氨酸的细菌优选是属于肠杆菌科的微生物，在所述微生物中将L-苏氨酸生物合成酶增强。这些基因的实例包括编码以下酶的基因：天冬氨酸激酶III(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、天冬氨酸激酶I(thr操纵子中包含的thrA)、高丝氨酸激酶(thrB)和苏氨酸合酶(thrC)。可引入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合成基因引入已将苏氨酸降解阻抑的埃希氏菌属的细菌。已将苏氨酸降解阻抑的埃希氏菌属的细菌实例包括将苏氨酸脱氢酶活性缺失的TDH6菌株(美国专利No.6,960,455)等等。

L-苏氨酸生物合成途径中某些酶的活性受L-苏氨酸的抑制。因此，为了构建产生L-苏氨酸的细菌，优选对L-苏氨酸生物合成酶进行修饰以使所述酶不受L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，所述操纵子含有弱化子(attenuator)结构。它们的表达受到这种弱化作用的阻抑。此外，苏氨酸操纵子的表达受到培养期间存在的异亮氨酸和苏氨酸的抑制。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现所述对苏氨酸操纵子的修饰(参见Lynn，S.P.，Burton，W.S.，Donohue，T.J.，Gould，R.M.，Gumport，R.I.，and Gardner，J.F.J.Mol.Biol.194：59-69(1987)；WO02/26993；WO2005/049808)。

在苏氨酸操纵子的上游存在天然启动子。可以用非天然启动子取代所述启动子(参见WO 98/04715)。或者，可构建苏氨酸操纵子而使苏氨酸生物合成中涉及的基因的表达受到λ噬菌体的阻抑物和启动子的调控(参见EP0593792)。同样，为了防止L-苏氨酸的反馈抑制，也可通过选择α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)抗性的菌株来修饰埃希氏菌属的细菌。

优选将经修饰以防止L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子在宿主中的拷贝数增加，或连接至强启动子，从而增强所述操纵子的表达。除了使用质粒扩增拷贝数之外，还可通过使用转座子、Mu噬菌体等在基因组上引入苏氨酸操纵子来增加拷贝数。

对于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，期望的是使用经修饰以防止L-赖氨酸反馈抑制的基因。能够使用在美国专利No.5,932,453中描述的方法获得经修饰以防止反馈抑制的lysC基因。

除了L-苏氨酸生物合成酶，期望的是增强涉及糖酵解系统、TCA循环和呼吸链的基因、调控这些基因表达的基因和诱导糖摄取的基因。在L-苏氨酸产生中有效的这些基因的实例包括编码转氢酶(pntAB)(EP733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)(WO95/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)(EP877090)的基因，和编码棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属(genus Bacillus)细菌中的丙酮酸羧化酶的基因(WO99/18228、EP1092776)。

还优选增强赋予对L-苏氨酸的抗性的基因和/或赋予对L-高丝氨酸的抗性的基因的表达，或将L-苏氨酸抗性和/或L-高丝氨酸抗性赋予宿主。这些基因的实例包括rhtA基因(Res.Microbiol.154：123-135(2003))、rhtB基因(EP0994190)、rhtC基因(EP1013765)和yfiK、yeaS基因(EP1016710)。对于将L-苏氨酸抗性赋予宿主的方法，参见EP0994190、WO90/04636。

产生L-苏氨酸的细菌另外的实例是大肠杆菌VKPM B-3996菌株(参见美国专利No.5,175,107)。这种VKPM B-3996菌株在1987年4月7日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(the Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM)，GNII Genetika(地址：Russia，117545 Moscow，1 Dorozhny proezd.1)。此外，VKPM B-3996菌株含有质粒pVIC40(WO90/04636)，所述质粒pVIC40通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入包含链霉素抗性标记的广宿主范围(wide host-range)载体质粒pAY32中而获得(参见Chistorerdov，A.Y.，and Tsygankov，Y.D.Plasmid，16，161-167(1986))。thrA基因在pVIC40上，并且已将L-苏氨酸对天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制脱敏。

进一步优选的产生L-苏氨酸的细菌实例是大肠杆菌VKPM B-5318菌株(参见EP0593792)。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日以登录号VKPMB-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(地址：Russia，117545 Moscow，1Dorozhny proezd.1)。这种VKPM B-5318菌株是异亮氨酸非营养缺陷型，并且含有重组质粒DNA，将所述重组质粒DNA构建成使苏氨酸生物合成中涉及的基因(即，将弱化子和天然转录调节区缺失的苏氨酸操纵子)位于温度敏感CI阻抑物、PR启动子和λ噬菌体的Cro蛋白N末端的下游，并且苏氨酸生物合成中涉及的所述基因的表达由所述λ噬菌体阻抑物和启动子调控。

在本发明中使用的产生L-谷氨酸的细菌的实例包括属于肠杆菌科的微生物，所述微生物经修饰而将编码L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表达增加。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脱氢酶(在下文中，也称作“GDH”)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(在下文中，也称作“CS”)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(在下文中，也称作“PEPC”)、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸变位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸果糖激酶、葡糖磷酸异构酶等。在这些酶之中，CS、PEPC和GDH的一种或多种是优选的，并且全部三种是更优选的。

使用上述方法修饰而将柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的属于肠杆菌科的微生物的实例在美国专利Nos.6,197,559 & 6,331,419、EP0999282中披露。

此外，还可以使用经修饰而将6-磷酸葡糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶中任一的活性增加或将二者的活性都增加的属于肠杆菌科的微生物(EP1352966)。

作为具有产生L-谷氨酸能力的肠杆菌科的微生物，还可以使用如下细菌，在所述细菌中，将催化产生L-谷氨酸之外化合物的反应的酶活性缺失或减少，而所述反应从L-谷氨酸的生物合成途径分支。这些酶的实例包括2-酮戊二酸脱氢酶、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶(1-pyrroline dehydrogenase)等。在这些之中，特别优选减少或缺失2-酮戊二酸脱氢酶的活性。

用于在属于肠杆菌科的微生物中缺失或减少2-酮戊二酸脱氢酶的活性的方法在美国专利No.5,573,945、美国专利No.6,197,559和美国专利No.6,331,419中描述。具体地，将2-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或减少的属于肠杆菌科的微生物实例包括以下：

Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)

植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)AJ13410菌株(FERM BP-6617)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)

在本发明中使用的优选的产生L-组氨酸的细菌实例包括大肠杆菌FERMP-5038和FERM P-5048。这些菌株含有载体，所述载体含有L-组氨酸生物合成中涉及的遗传信息(JP56-005099A)。其它实例包括用氨基酸输出基因Rht转化的细菌菌株(EP1016710)，和使其对磺胺胍(sulfaguanidine)、D，L-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素有抗性的大肠杆菌80(VKPM B-7270，Russian PatentPublication No.2119536)等。

可以使用表达L-组氨酸生物合成途径酶的编码基因的微生物。这些基因的实例包括编码以下酶的基因：ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、磷酸核糖AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、磷酸组氨醇氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)和组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

优选的本发明产生L-半胱氨酸的细菌包括将胱硫醚β-裂合酶活性减少的细菌(JP2003-169668A)，和保留丝氨酸乙酰转移酶但具有减少或消除的L-半胱氨酸反馈抑制的埃希氏菌属细菌(JP11-155571A)。

优选的本发明产生L-脯氨酸的细菌包括大肠杆菌702(VKPMB-8011)，其对3，4-脱羟基脯氨酸和氮杂环丁烷-2-羧酸(azetidine-2-carboxylate)有抗性，和702 ilvA菌株(VKPMB-8012菌株)，其缺乏ilvA并且源自菌株702(JP2002-300874A)。

产生L-精氨酸的细菌的实例包括对α-甲基甲硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸(α-methyleserine)、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍有抗性的大肠杆菌突变体菌株(参见JP56-106598A)等。大肠杆菌237菌株是产生L-精氨酸的细菌，所述细菌具有对L-精氨酸的反馈抑制有抗性的突变体并且保留高活性的N-乙酰谷氨酸合酶，并且其也是优选的产生L-精氨酸的菌株(Russian Patent Application No.2000117677)。所述编号为VKPM B-7925的菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，并且根据布达佩斯条约在2001年5月18日转为国际保藏。也可以使用大肠杆菌382菌株，其是237菌株的衍生物并且是产生L-精氨酸的细菌，所述细菌具有改进的乙酸同化能力(JP2002-017342A)。编号为VKPM B-7926的大肠杆菌382菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。

同样，作为具有产生L-精氨酸能力的微生物，可以使用具有改进的基因表达的微生物，所述基因编码L-精氨酸生物合成中涉及的酶。L-精氨酸生物合成酶的实例是以下酶的一种或多种：N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰-谷氨酰-磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合酶(carAB)。在每种酶名称之后，在圆括号内提供编码该酶的基因的名称。期望的是使用N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)的突变，其中通过取代对应于野生型中位置15-19的氨基酸序列而将L-精氨酸反馈抑制去除(EP1170361)。

可以使用的产生L-亮氨酸的细菌包括：大肠杆菌属的细菌，在所述细菌中将由ilvE基因编码的支链氨基酸氨基转移酶失活，并且将由tyrB基因编码的芳族氨基酸氨基转移酶的活性增强(EP1375655A)；大肠杆菌H-9068菌株(ATCC21530)，所述菌株对4-氮亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸有抗性；大肠杆菌H-9070菌株(FERM BP-4704)；大肠杆菌H-9072菌株(FERM BP-4706)(美国专利No.5,744,331)；大肠杆菌菌株，在所述菌株中将L-亮氨酸对异丙基苹果酸合酶的反馈抑制脱敏(EP 1067191)；大肠杆菌AJ11478菌株，所述菌株对β-2噻吩丙氨酸和β-羟亮氨酸有抗性(美国专利No.5,763,231)，等等。

产生L-异亮氨酸的细菌包括：6-二甲基氨基嘌呤抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-304969A)、L-异亮氨酸氧肟酸抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)、硫代异亮氨酸抗性的(thiaisoleucine-resistant)大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)、DL-乙基硫氨酸抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)和精氨酸氧肟酸抗性的突变菌株(JP5-130882A)。重组埃希氏菌属细菌的实例是以下细菌菌株，在所述菌株中通过用质粒转化将编码L-异亮氨酸生物合成酶苏氨酸脱氨基酶或乙酰羟酸合酶的基因增强(JP2-458A、JP2-42988A、JP8-47397)，等等。

产生L-缬氨酸的细菌实例包括大肠杆菌VL1970菌株(美国专利No.5,658,766)等。产生L-缬氨酸的细菌实例进一步包括生长需要硫辛酸(1ipoicacid)和/或缺乏H+-ATP酶的突变体(WO96/06926)，和用含有ilvGMEDA操纵子的DNA片段转化的埃希氏菌属细菌，并且所述细菌至少表达ilvG、ilvM、ilvE和ilvD基因。由于ilvGMEDA操纵子的表达受L-缬氨酸和/或L-异亮氨酸和/或L-亮氨酸的调节(弱化)，期望的是将弱化作用所需的区去除或突变，从而去除L-缬氨酸对表达的抑制(美国专利No.5,998,178)。同样期望的是ilvGMEDA操纵子不表达由ilvA基因编码的苏氨酸脱氨基酶活性。大肠杆菌VL1970具有如上所述已将弱化作用去除的ileS17突变，将所述菌株以登录号VKPM B-4411保藏在GNIIgenetika(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(VKPM)Depositary，GNIIgenetika)(地址：1，Dorozhny Proezd.，1，113545，Moscow，Russia)。

在本发明中使用的产生L-氨基酸的细菌中，除了编码天然生物合成酶的基因外，可将糖摄取、糖代谢(糖酵解系统)和能量代谢中涉及的基因增强。

糖代谢中涉及的基因的实例是编码摄取糖的糖酵解酶或蛋白的基因，例如编码下述酶的基因：葡糖-6-磷酸异构酶(pgi；WO01/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps；EP877090)、磷酸葡糖变位酶(pgm；WO03/04598)、果糖二磷酸醛缩酶(fba；WO03/04664)、丙酮酸激酶(pyyF；WO03/008609)、转醛醇酶(transaldolase)(talB；WO03/008611)、延胡索酸酶(fum；WO01/02545)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps；EP877090)、非-PTS蔗糖摄取系统(csc；EP149911)，和蔗糖同化基因(scrAB操纵子；WO90/04636)。

能量代谢中涉及的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB；美国专利No.5,830,716)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoABCD；EP1070376)。

能够通过修饰如上所述具有产生L-氨基酸的能力的微生物，以增加选自evgA基因、gadE基因或ydeO基因的一种或多种基因(其是编码EvgAS双组分体系中涉及的转录因子的基因)的表达，从而获得本发明的微生物。可以在增加evgA基因、gadE基因或ydeO基因的表达量的修饰之后赋予产生目标物质的能力。增加evgA基因、gadE基因或ydeO基因的表达可以是通过修饰表达调节区(包括如下文所述的启动子修饰)来增加内源的evgA基因、gadE基因或ydeO基因的表达；或这可以是通过引入含有evgA基因、gadE基因或ydeO基因的质粒，或通过扩增细菌染色体上的这些基因等使evgA基因、gadR基因或ydeO基因的拷贝数增加。另外，可以采用这些技术的组合。

本发明中的“EvgAS双组分系统”的意思是通过EvgS-EvgA组氨酸-天冬氨酸磷酸化调节(histidine-aspartate phosphorelay regulation)来激活转录因子的途径。更具体地，EvgS蛋白(SEQ ID NO：26)是传感激酶，将所述蛋白的组氨酸残基自磷酸化(autophosphorylate)，然后将磷酸基团转移至EvgA蛋白(SEQ ID NO：24)特异性的天冬氨酸残基，所述EvgA蛋白是应答调节子(response regulator)和转录因子。应答调节转录因子EvgA由这种磷酸化激活从而调节许多基因的转录，并且激活编码转录因子YdeO蛋白(SEQ ID NO：30)的ydeO基因(SEQ ID NO：29)和/或编码转录因子GadE蛋白(SEQ ID NO：28)的gadE基因(SEQ ID NO：27)的转录(J.Bacteriol.184：6225-6234，2002；Mol.Microbiol.48：699-712，2003)。YdeO蛋白还激活gadE基因的转录。作为gadE基因的转录被已激活的EvgA蛋白和YdeO蛋白激活的结果，GadE蛋白的表达增加，而GadE蛋白作为正转录因子扩大其它基因的转录(Microbiology.150：61-72，2004；J Bacteriol.186：7378-89，2004)。因此，本发明中的“EvgAS双组分调节子中涉及的转录因子”指EvgA蛋白、GadE蛋白或YdeO蛋白。

在本发明中，“传感激酶”是发挥如下功能的蛋白：感应环境因子作为配体，使用ATP将自身的组氨酸残基磷酸化，其后将该磷酸基团递送至应答调节子。在本发明中，“应答调节子”是发挥以下功能的蛋白：在通过从传感激酶接收到特异天冬氨酸的磷酸化而被激活之后，在细胞内传输信息；并且在许多情况下其为转录因子。

当与亲本菌株例如野生型菌株或未经修饰的菌株比较时，能够通过与野生型或未经修饰的菌株比较mRNA的量来确认编码EvgA蛋白、GadE蛋白或YdeO蛋白的基因(下文中的evgA、gadE或ydeO基因)表达的改进。Northern杂交和Reverse-Transcriptase PCR(逆转录酶PCR；RT-PCR)也可用来确认表达的量(Sambrook，J.，and Russell，D.W.Molecular Cloning A LaboratoryManual/Third Edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))。只要活性与野生型或未经修饰的菌株相比增加，对酶活性的增加程度不进行限制，但是期望的是，例如是野生或未经修饰的菌株的1.5或更多倍，优选2或更多倍，或更优选3或更多倍。如果靶蛋白量相对于未经修饰的或野生型菌株增加，则能够确认酶活性的增加。这能够通过例如使用抗体的Western印迹来检测(Sambrook，J.，and Russell，D.W.Molecular Cloning A LaboratoryManual/Third Edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))。

本发明中的“转录因子”的意思是基因的转录因子，所述基因中的表达受EvgSA双组分调节子的调控，并且所述转录因子对应于EvgA蛋白、GadE蛋白和YdeO蛋白。EvgA蛋白、GadE蛋白和YdeO蛋白正调节编码多种代谢酶的基因的转录，所述代谢酶受EvgSA双组分调节子的调控。例如，编码6-磷酸葡糖酸脱氢酶(GND)的gnd基因或编码腺苷酸琥珀酸合酶的purA基因的转录由EvgSA双组分调节子的转录因子激活。即，通过改进与野生型菌株或未经修饰菌株相比的EvgA蛋白、GadE蛋白和YdeO蛋白的产生量，使表达受EvgAS双组分调节子调控的基因的转录量增加。能够使用测量与DNA的连接的电泳迁移率变动分析，或使用转录活性的体外测量来测量转录因子的活性(Sambrook，J.，and Russell，D.W.Molecular Cloning A LaboratoryManual/Third Edition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))。

本发明的evgA基因来自埃希氏菌属的细菌及其同源物。例如，大肠杆菌的evgA基因是编码具有SEQ ID NO：24的氨基酸序列的蛋白质的基因(SEQID NO：23)。(GenBank登录号NP_416870[gi：16130301])。

evgA基因的同源物源自其它微生物，其在结构上与埃希氏菌属细菌的evgA基因具有高相似性，当引入宿主时改进产生L-氨基酸的能力并且显示转录因子活性。evgA同源物的实例是在GenBank登录的沙门氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属的evgA基因等。另外，基于与上述实例中给出的基因的同源性，可以从以下细菌克隆evgA基因：棒状杆菌型细菌例如谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等；假单孢菌属(genusPseudomonas)的细菌，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等；分枝杆菌属(genus Mycobacterium)的细菌，例如结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)等；和芽孢杆菌属的细菌。可以接受具有不同基因名的基因，只要它们与埃希氏菌属细菌的evgA高度同源。例如，evgA基因同源物包括能够使用SEQ ID NOS：17和18的合成寡核苷酸来克隆的基因。

基于上述序列信息，能够通过从已知的数据库搜索具有高同源性的基因来获得evgA基因同源物的核苷酸序列。能够使用例如Karlin和Altschul的BLAST算法(Pro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或FASTA(MethodsEnzymol.，183，63(1990))来测定氨基酸序列和核苷酸序列的同源性。基于这种BLAST算法，已经开发了称为BLASTN或BLASTX的程序(参见http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/)。

本发明的gadE基因的意思是埃希氏菌属细菌的gadE基因及其同源物。大肠杆菌gadE基因的实例包括编码具有SEQ ID NO：28的氨基酸序列的蛋白质的基因(SEQ ID NO：27)。(GenBank登录号NP_417969[gi：16131384])。

如上述的evgA基因同源物，gadE基因的同源物是源自其它微生物的基因，其与埃希氏菌属细菌的gadE基因在结构上具有高相似性，当引入宿主时其改进产生L-氨基酸的能力并且显示转录因子活性。gadE基因同源物包括能够使用SEQ ID NOS：19和20的合成寡核苷酸克隆的基因。

本发明的ydeO基因的意思是埃希氏菌属细菌的ydeO基因及其同源物。大肠杆菌ydeO基因的实例包括编码具有SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白质的基因(SEQ ID NO：29)。(GenBank登录号NP_416016[gi：16129458])。

如上述的ydeO基因同源物，ydeO基因的同源物是源自其它微生物的基因，其与埃希氏菌属细菌的ydeO基因在结构上具有高相似性，当引入宿主时其改进产生L-氨基酸的能力并且显示转录因子活性。ydeO基因同源物包括能够使用SEQ ID NOS：21和22的合成寡核苷酸克隆的基因。

本发明中使用的evgA基因、gadE基因或ydeO基因不限于野生型基因；只要由其编码的蛋白质的功能(即，转录因子活性)不受损，其还可以是编码蛋白质的突变体或人工修饰的产物，所述蛋白质具有的序列在SEQ ID NO：24、28或30的氨基酸序列中的一个或多个位置包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等。在本文中，术语“几个”根据蛋白质立体结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的类型而变化；具体地，几个的意思是1-20，优选地1-10，并且更优选地1-5。以上一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加是保留转录因子活性的保守突变。在保守突变中，如果取代位置是芳族氨基酸，则取代相互发生在Phe、Trp、Tyr之间；如果取代位置是疏水氨基酸，则在Leu、Ile、Val之间；如果是极性氨基酸，则在Gln、Asn之间；如果是碱性氨基酸，则在Lys、Arg、His之间；如果是酸性氨基酸，则在Asp、Glu之间；并且如果是具有羟基的氨基酸，则在Ser、Thr之间。常规的保守突变是保守取代。被认为是保守的取代的具体实例包括：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括依赖于保留evgA、gadE和ydeO基因的微生物的种间差异或个体差异而天然存在的突变(突变体或变体)。能够通过如下方法获得这些基因：使用例如定点诱变来修饰SEQ ID NOS：23、25和29中显示的核苷酸序列，从而使编码的蛋白质中位点特异性的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加。

此外，作为evgA、gadE或ydeO基因，是编码蛋白质的序列，所述蛋白质是转录因子，并且所述蛋白质与SEQ NOS.26，30，或32的完整氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，或甚至更优选至少97％的同源性。另外，在分别引入evgA、gadE或ydeO基因的宿主中，用该宿主更容易使用的其它等同密码子取代这些基因中的密码子。同样，只要evgA、gadE或ydeO基因产物保留转录因子的功能，可以将其N末端或C末端延伸或去除。例如，延伸或去除的长度可以是50或更少，优选20或更少，更优选10或更少，并且甚至更优选5或更少的氨基酸残基。更具体地，可以使用编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质具有从N末端延伸或去除50-5个氨基酸的SEQ ID No.24、18或30，和/或从C末端延伸或去除50-5个氨基酸的SEQ IDNo.24、18或30。

同样，能够通过以下常规突变处理获得基因的变体。突变处理方法之一是使用羟胺等，体外突变evgA、gadE或ydeO基因。另一种方法使用紫外线或突变处理中通常使用的突变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EMS)来处理具有所述基因的微生物，例如，埃希氏菌属的细菌。这些基因是否编码具有转录因子活性的蛋白质能够通过如下方法确认：例如在适当的细胞中表达这些基因，并且研究是否存在转录因子活性。

evgA、gadE或ydeO基因还可以是在严紧条件下分别与SEQ ID No.23、27或29的核苷酸序列的互补核苷酸序列或与由这些序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录活性的蛋白质。在本文中，术语“严紧条件”指形成所谓的特异性杂合体(hybrid)，并且不形成非特异性杂合体的条件。尽管难以以数字清楚地表述这些条件，但是可将这些条件例举为如下条件：在该条件下高度同源的DNA片段，例如，具有不少于70％同源性的DNA相互杂交，并且具有低于以上同源性的DNA不相互杂交。或者，严紧条件的示例是以常规Southern杂交的洗涤条件，即，在相应于60℃、1xSSC、0.1％SDS，优选0.1xSSC、0.1％SDS，并且更优选68℃、0.1xSSC、0.1％SDS的温度和盐浓度，进行一次或优选2-3次洗涤。

作为探针，还可以使用SEQ ID NO：23、27或29的核苷酸序列或这些序列的一部分。可以使用PCR制备这样的探针，在所述PCR中使用包含这些核苷酸序列之一的DNA片段作为模板，用基于SEQ ID NO：23、27或29的核苷酸序列制备的寡核苷酸作为引物。例如，当使用长度为大约300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件是50℃、2xSSC和0.1％SDS。

能够通过使用例如遗传重组技术以增加细胞中evgA、gadE或ydeO基因的拷贝数来进行增强所述基因表达的修饰。例如，将含有evgA、gadE或ydeO基因的DNA片段与在宿主微生物中发挥功能的载体(优选多拷贝型载体)连接以制备重组DNA，其后将所述重组DNA引入该微生物以将其转化。

当使用大肠杆菌的evgA、gadE或ydeO基因时，能够通过PCR(PCR：聚合酶链式反应；参见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))来获得这些基因，在所述PCR中使用大肠杆菌的基因组DNA作为模板，并且使用基于SEQ ID No.23、27或29的核苷酸序列制备的引物，例如，用于evgA基因的SEQ ID Nos.17和18中所示的引物，用于gadE基因的SEQ ID Nos.19和20中所示的引物，或用于ydeO基因的SEQ ID Nos.21和22中所示的引物。使用将基于转录因子其它序列信息制备的寡核苷酸用作引物的PCR，或使用将基于上述序列信息制备的寡核苷酸用作探针的杂交方法，也能够从那些微生物中已知的evgA、gadE或ydeO基因或其它种微生物中的evgA、gadE或ydeO基因，或从微生物的基因组DNA或基因组DNA文库获得属于肠杆菌科的其它微生物的evgA、gadE或ydeO基因。另外，基因组DNA可从DNA供体微生物制备。例如，可以使用Saito和Miura的方法等(参见H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Seibutsu Kogaku Jikkensho[Bioengineering Experiments]，edited by The Society of Biotechnology，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)。

其后，通过将由PCR扩增的evgA、gadE或ydeO基因与能够在宿主微生物的细胞中发挥功能的DNA载体连接来制备重组DNA。能够在宿主微生物的细胞中发挥功能的载体是在所述宿主微生物的细胞中可自主复制的载体。在大肠杆菌的细胞中可自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可从Takara BioInc.获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可从Nippon Gene Co.，Ltd.获得)、pSTV29(可从Takara Bio Inc.获得)等。

可将如上所述制备的重组DNA依照迄今已经报导的任何转化方法引入微生物。例如，一种方法是通过用氯化钙处理受体细菌来增加DNA的透过性，如关于大肠杆菌K-12所报导的(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。另一种方法是在从生长期的细胞制备感受态细胞之后引入DNA，如关于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所报导的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.andYoung，F.E.，Gene，1，153(1977))。同样，另一种可以使用的方法是将DNA受体微生物(如已知涉及枯草芽孢杆菌、放线菌类(actinomycetes)和酵母的DNA受体微生物)改变为能够容易地摄取重组DNA的原生质体或原生质球状态，随后将所述重组DNA引入该宿主中(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929(1978))。

能够通过将如上所述的evgA、gadE或ydeO基因的多拷贝整合在微生物的基因组DNA上来增加evgA、gadE或ydeO基因的拷贝数。使用以多拷贝存在于所述基因组DNA上的序列作为靶，通过同源重组将evgA、gadE或ydeO基因的多拷贝引入微生物的基因组DNA。可以使用重复DNA和存在于可转座元件末端的反向重复序列作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。同样，可以将这些基因与存在于基因组上的evgA、gadE或ydeO基因串联连接，或可以将这些基因以多拷贝并入基因组上的非必需基因中。可以使用温度敏感载体或整合载体来引入这些基因。

如JP2-109985A所披露，也可以将evgA、gadE或ydeO基因并入转座子，再转移所述转座子以将所述基因的多拷贝整合至染色体DNA中。可通过使用具有evgA、gadE或ydeO基因的一部分作为探针的Southern杂交来确认evgA、gadE或ydeO基因整合至基因组中。

除了上述的增加拷贝数，还可使用WO00/18935中描述的方法来增强evgA、gadE或ydeO基因的表达，例如：将基因组DNA或质粒上的表达调节序列(如evgA、gadE或ydeO基因的启动子等)用更强的取代；使各基因的-35、-10区接近共有序列；扩增能够增强evgA、gadE或ydeO基因表达的调节基因；和缺失或减弱将会减少evgA、gadE或ydeO基因表达的调节基因。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、

10启动子等是公知的强启动子。还可将核苷酸取代等引入evgA、gadE或ydeO基因的启动子区或SD区以增加启动子强度。用于评估启动子强度的方法的实例和强启动子的实例在Goldstein等的文章(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1，105-128(1995))等中描述。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中取代几个核苷酸，尤其是在起始密码子的紧邻上游的序列中取代几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有强烈影响。可通过启动子-探针载体和基因分析软件如GENETYX等鉴定evgA、gadE或ydeO基因的表达调节区(如启动子等)。能够通过取代或修饰这些启动子来增强evgA、gadE或ydeO基因的表达。能够例如使用温度敏感质粒或Red-驱动整合方法来进行表达调节序列的取代(WO2005/010175)。

也可以将增加下述基因转录的突变引入evgA、gadE或ydeO基因，所述基因的表达由evgA、gadE或ydeO基因调节。增加由evgA、gadE或ydeO基因编码的蛋白质活性的突变的实例是：启动子序列的突变，其增加evgA、gadE或ydeO基因的转录量；和在所述基因的编码区中的突变，其增加转录的比活性。

由evgA、gadE或ydeO基因编码的蛋白质由组氨酸激酶EvgS激活。因此，本发明的微生物可以是下述微生物，在所述微生物中通过增加编码EvgS的evgS基因的表达量而增加evgA、gadE或ydeO基因的表达量。在本文中，本发明的evgS基因是指埃希氏菌属细菌的evgS基因及其同源物。例如，大肠杆菌的evgS基因的示例是编码具有SEQ ID NO：26的氨基酸序列的蛋白质的基因(SEQ ID NO：25)。(GenBank Accession No.NP_417969[gi：16131384])。

evgS基因的同源物的意思是源自其它微生物的基因，其在结构上与埃希氏菌属细菌的evgS基因具有高相似性，当引入宿主时改进产生L-氨基酸的能力并且显示转录因子活性。evgS同源物的实例包括在GenBank登录的沙门氏菌属、志贺氏菌属和耶尔森氏菌属的evgS基因。另外，基于与上述实例中给出的基因的同源性，可以从以下细菌克隆evgS基因：棒状杆菌型细菌例如谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌等；假单孢菌属的细菌，例如铜绿假单胞菌等；分枝杆菌属的细菌，例如结核分枝杆菌等；和芽孢杆菌属的细菌。可以接受具有不同基因名的基因，只要它们与埃希氏菌属细菌的evgS高度同源。例如，在大肠杆菌中，evgS基因与evgA基因形成操纵子，并且能够使用SEQ ID NOS：17和18的合成寡核苷酸通过PCR与evgA基因一起获得。对于其它微生物，期望的是同样能够使用SEQ ID NOS：17和18的寡核苷酸获得这些基因。

本发明中使用的evgS基因不限于野生型基因；并且只要蛋白质的功能(即，转录因子活性)不受损，其还可以是编码蛋白质的突变体或人工修饰的变体，所述蛋白质具有的序列在SEQ ID NO：26的氨基酸序列中的一个或多个位置包含一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等，即具有保守突变的蛋白质。术语“几个”和“保守突变”与上文关于evgA基因、gadE基因和ydeO基因所述的相同。

可使用与如上所述用来增加evgA、gadE或ydeO基因表达量相同的方法增加evgS的表达量。可对全部基因使用上述方法之一或对每个基因使用不同的方法来增加evgA、gadE或ydeO基因的表达量。

2.产生L-氨基酸的方法

本发明的用于产生L-氨基酸的方法包括在培养基中培养本发明的微生物，在所述培养基或微生物的细胞中产生和积累L-氨基酸，和从所述培养基或细胞中收集L-氨基酸。

在使用微生物的发酵和L-氨基酸的产生中通常使用的培养基可用于本发明。即，可以使用含有碳源、氮源、无机离子和所需的其它有机组分的普通培养基。碳源包括糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等；醇，例如甘油、山梨糖醇(solbitol)等；有机酸，例如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸等。在这些中，可优选使用葡萄糖、果糖和蔗糖。氮源包括无机铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等；有机氮，例如大豆水解物等；氨气；氨水等。作为有机微量营养物源，优选培养基中存在适当量的所需物质，例如维生素B1、L-高丝氨酸等，或酵母提取物等。除这些之外，根据需要，可添加小量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。本发明中使用的培养基可以是天然的或合成的培养基，只要其含有碳源、氮源、无机离子和需要的其它有机微量营养物。

可以将改进微生物的生长或目标物质的生产力的氨基酸添加至培养基。例如，对于L-赖氨酸发酵优选添加L-苏氨酸、L-高丝氨酸或L-异亮氨酸。对于L-苏氨酸发酵添加L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-谷氨酸或L-高丝氨酸，而对于L-色氨酸发酵添加L-苯丙氨酸或L-酪氨酸等。添加的L-氨基酸的浓度是大约0.01-10g/L。

建议在需氧条件下，在24℃-37℃的培养温度进行1-7天培养，培养期间的pH为5-9。可以使用无机或有机酸或碱物质和氨气等来调节pH。可使用常规离子交换树脂方法、沉淀方法和其它已知方法的组合从发酵液中收集L-氨基酸。如果L-氨基酸积累在细胞内，可通过超声处理等破坏细胞。随后通过离心分离去除细胞碎片以获得上清，使用离子交换树脂方法等可从所述上清中再收集L-氨基酸。

实施例

在下文中将参考以下非限定性实施例对本发明进行更具体的说明。

参考实施例1：构建产生L-色氨酸的细菌

1-1引入serA基因

磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)存在于质粒pGH5中(WO9408031)，并且使用转座子Mud将其插入细菌的基因组。将含有MudII1734的质粒pCE1134(JP2-109985A)，用BamHI消化以去除含有lac操纵子的DNA片段，再将末端平端化，并且插入SmaI接头。将这种质粒用SmaI重消化，再自身闭合形成环状质粒并命名为pMu1134。通过用ScaI和SalI切割将含有serA的DNA片段从质粒pGH5中切除，并且将所述片段的末端平端化。随后将该片段插入上述pMu1134的SmaI位点。由此，构建了含有Mud的质粒pMudserA，在所述Mud中插入了源自pGH5的serA基因(名为MudserA)。

根据常规方法，通过使用卡那霉素抗性的获得作为指标，使用具有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的产生L-色氨酸的细菌菌株SV164(WO9408031)作为受体细菌，获得将MudserA转移至基因组上的细菌菌株L1。由Southern杂交实验的结果推断，在L1菌株中仅存在一个插入了MudserA的位置。同样，通过PCR克隆含有MudserA的基因组DNA片段并且测定其核苷酸序列，确定所述插入处于大肠杆菌K-12基因组(GenBank登录号U00096)上的位置No.240,950。

1-2.引入trp操纵子

其后，通过使用转座子将trp操纵子插入基因组中来增加trp操纵子的拷贝数。将trp操纵子基因从质粒pGX100中切除。pGX100通过如下方法构建：将源自大肠杆菌MTR#2菌株(美国专利No.4,371,614)的DNA片段插入质粒pBR313中，所述大肠杆菌MTR#2菌株具有脱敏的trpE基因。可通过用XhoI和SmaI切割将含有大约7.6kb trp操纵子的DNA片段从所述质粒中切除。通过用XhoI和SmaI切割从pGX100切除含有trp操纵子的DNA片段，并且将所述片段的末端平端化。其后，将所述片段插入上述pCE1134的SmaI位点。也可使用序列表中的SEQ ID NOS：1和2所示的引物，采用PCR，直接从大肠杆菌MTR#2菌株基因组DNA克隆相同的含有trp操纵子的DNA片段。如上所述，构建了含有Mud的质粒pMudtrpG’lac，在所述Mud中插入了源自MTR#2菌株的trp操纵子基因(名为MudtrpG′lac)。

为了使用乳糖同化能力的互补作用作为菌株的选择标记，在通过将MudtrpG′lac插入基因组来增加MudtrpG′lac的拷贝数之前，将乳糖同化缺陷性赋予宿主菌株。将产生L-苏氨酸的细菌VKPM B-3996(美国专利No.5,175,107)的ilvG基因P1转导至L1菌株以赋予该L1菌株L-缬氨酸抗性(参见WO2005/103228)。根据常规方法进行所述P1转导，将转导物铺在M9基本培养基(4g/L葡萄糖、12.8g/L Na₂HPO₄·7H₂O、3g/L KH₂PO₄、0.5g/L NaCl、1g/L NH₄Cl、5mM MgSO₄、0.1mM CaCl₂、1mg/L硫胺素、20mg/l L-Phe、20mg/L L-Tyr、20mg/L L-Met、3mg/L吡哆醇、20mg/L L-Val、20mg/L四环素)上，获得了Val抗性菌落，并命名为L1 ValR。

根据常规方法，用源自Tn10的四环素抗性作为指示剂，将lacZ98::Tn10从ME8581菌株(HfrH(valS←uxuAB)：lacZ98::Tn10 relA1 thi-1，保藏于National Institute of Genetics)P1-转导至L1 ValR。同预期一样，获得的菌株是乳糖同化缺陷型。其后，为了获得缺乏乳糖同化能力但是无Tn10的菌株，通过复制法从转导的菌株获得四环素敏感菌株14-1-lac-tets。在所述14-1-lac-tets菌株中仍然缺乏乳糖同化能力。当通过Southern杂交确认所述菌株的Tn10状态之后，未检测出与tet基因杂交的条带，但是检测出与Tn10的IS10区杂交的条带，由此确信IS10保留在lacZ基因上。

依据常规方法，用乳糖同化能力的互补作用作为指示剂，使用pMudtrpG′lac，以14-1-lac-tets菌株作为受体细菌，获得在基因组中转入了MudtrpG′lac的细菌菌株No.202。如果插入的转座子或转座子上的基因趋于从插入转座子的菌株中脱离(drop off)，可以在营养培养基上进行传代培养以选择稳定保留卡那霉素抗性、乳糖同化能力等的细菌菌株。作为Southern杂交的结果推定在No.202菌株中仅存在一个插入了MudtrpG′lac的位置。同样，通过PCR克隆含有MudtrpG′lac的基因组DNA片段并且测定其核苷酸序列，确定所述插入处于大肠杆菌K-12基因组(GenBank登录号U00096)上的位置No.530,249。

其后，通过P1转导将蔗糖同化特性中涉及的scrK、scrY、scrA、scrB和scrR基因引入No.202，并且将所得细菌菌株命名为No.202scr(参见WO90/04636)。

1-3.构建用于破坏iclR的质粒

使用Pyrobest DNA Polymerase(Takara Shuzo)根据所附说明手册采用PCR扩增iclR片段。对于所述PCR反应，使用SEQ ID NOS：3和4的寡核苷酸作为引物，以使用RNA/DNA maxi Kit(QIAGEN)提取的W3110基因组作为模板。在PCR之后，使用Wizard PCR Preps(Promega)纯化扩增的DNA片段。用限制性内切核酸酶EcoRI和HindIII(Takara Shuzo)消化经纯化的DNA片段，其后进行酚氯仿处理和乙醇沉淀以获得纯化的DNA。使用DNA ligationKit Ver.2(Takara Shuzo)将这种片段和用相同的酶消化然后纯化的pUC18(Takara Shuzo)连接。用这种连接反应溶液转化JM109感受态细胞(TakaraShuzo)，随后将其铺至含有50μg/mL氨苄青霉素(Amp)(Meiji Seika)的LB琼脂平板(LB+Amp平板)，并且在37℃选择菌落。使用含有50μg/mL Amp的LB培养基在37℃在试管中培养所述菌落，并且使用自动质粒提取器(automatic plasmid extractor)PI-50(Kurabo)提取质粒。

将获得的质粒pUCiclR用限制性内切核酸酶EcoO65I(Takara Shuzo)消化，将其平端化并使用BKL试剂盒(Takara Shuzo)连接。用所述连接反应溶液转化JM109，如上所述选择菌落，并且提取质粒。将获得的质粒用EcoRI和HindIII消化然后纯化，并且与已经用相同的酶消化并纯化的温度敏感质粒pTS1连接。pTS1通过用pBR322(Takara Shuzo)的PstI-HindIII片段取代pMAN031(参见J.Bacteriol.162，1196-1202(1985)，图1)的PstI-HindIII片段获得。用所述连接反应溶液转化JM109，并且在30℃在LB+Amp平板上选择菌落。使用含有50μg/mL Amp的LB培养基在试管中在30℃培养所述菌落，并且如上所述提取质粒。通过用EcoRI和HindIII消化所述质粒产生具有期望长度的片段，将该质粒命名为iclR破坏质粒pTSΔiclR。

1-4.获得iclR-破坏型菌株

用pTSΔiclR转化No.202scr，并且在30℃在LB+Amp平板上选择菌落。在30℃过夜进行液体培养之后，将培养物稀释10^-3并且铺在LB+Amp平板上，在42℃选择菌落。具体地，将培养物铺在LB+Amp平板上，并且在30℃培养，将覆盖平板1/8的细胞悬浮在2mL LB培养基中，并且伴随摇动在42℃培养4-5小时。将10^-5稀释的细胞铺在LB平板上并且获得菌落，将其中约一百个菌落分别铺在LB平板和LB+Amp平板上，并且通过确认它们的生长确定了Amp敏感性和抗性。通过使用SEQ ID NOS：3和4的寡核苷酸作为引物的集落PCR检验Amp敏感的菌株。结果获得了iclR缺陷型菌株(No.202ΔiclR)，在所述菌株中扩增的片段不能用EcoO65I切割。

实施例1：构建用于增强evgAS、gadE和ydeO基因的质粒

1-1.构建用于增强evgA和evgS基因的质粒

已经报导了大肠杆菌(大肠杆菌K-12菌株)基因组的完整核苷酸序列(Science，277，1453-1474(1997))，并且已知evgAS形成操纵子结构。基于在上述报导中报导的evgAS基因的核苷酸序列(GenBank登录号AAC75428和AAC75429)，合成具有HindIII位点的SEQ ID NO：17中所示寡核苷酸作为5’引物，和具有EcoRI位点的SEQ ID NO：18中所示寡核苷酸作为3’引物。使用这些引物，用大肠杆菌W3110菌株的基因组DNA作为模板进行PCR，并且将扩增的产物用限制性核酸内切酶HindIII和EcoRI处理以获得含有evgAS基因的片段。将纯化的PCR产物连接至已经用HindIII和EcoRI消化的载体pMW118(Nippon Gene Co.，Ltd.)，由此构建用于扩增evgAS操纵子的质粒pMW-evgAS。

1-2.构建用于增强gadE的质粒

已经报导了大肠杆菌(大肠杆菌K-12菌株)基因组的完整核苷酸序列(Science，277，1453-1474(1997))。基于在上述报导中报导的gadE基因的核苷酸序列(GenBank登录号AAC76537)，合成具有BamHI位点的SEQ ID NO：19中所示寡核苷酸作为5’引物，和具有HindIII位点的SEQ ID NO：20中所示寡核苷酸作为3’引物。使用这些引物，用大肠杆菌W3110菌株的基因组DNA作为模板进行PCR，并且将扩增的产物用限制性核酸内切酶HindIII和BamHI处理以获得含有gadE基因的片段。将纯化的PCR产物连接至已经用HindIII和BamHI消化的载体pMW118(Nippon Gene Co.，Ltd.)，由此构建用于扩增gadE的质粒pMW-gadE。

1-3.构建用于增强ydeO的质粒

已经报导了大肠杆菌(大肠杆菌K-12菌株)基因组的完整核苷酸序列(Science，277，1453-1474(1997))。基于在上述报导中报导的ydeO基因的核苷酸序列(GenBank登录号AAC74572)，合成具有HindIII位点的SEQ ID NO：21中所示寡核苷酸作为5’引物，和具有EcoRI位点的SEQ ID NO：22中所示寡核苷酸作为3’引物。使用这些引物，用大肠杆菌W3110菌株的基因组DNA作为模板进行PCR，并且将扩增的产物用限制性核酸内切酶HindIII和EcoRI处理以获得含有ydeO基因的片段。将纯化的PCR产物连接至已经用HindIII和EcoRI消化的载体pMW118(Nippon Gene Co.，Ltd.)，由此构建用于扩增ydeO的质粒pMW-ydeO。

实施例2：evgAS、ydeO和gadE基因扩增对产生L-色氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

用实施例1中产生的gadE-扩增质粒pMW-gadE、evgAS-扩增质粒pMW-evgAS和ydeO-扩增质粒pMW-ydeO转化参考实施例1中构建的产生L-色氨酸的菌株No.202ΔiclR，由此获得氨苄青霉素抗性菌株。在确认已经引入这些质粒之后，将引入gadE-扩增质粒pMW-gadE的菌株命名为No.202ΔiclR/gadE菌株；将引入evgAS-扩增质粒pMW-evgAS的菌株命名为No.202ΔiclR/evgAS菌株；并且将引入ydeO-扩增质粒pMW-ydeO的菌株命名为No.202ΔiclR/ydeO菌株。

可以使用除No.202ΔiclR之外的已知产生L-色氨酸的细菌以相同的方式来扩增evgAS、ydeO和gadE基因。

将如上产生的菌株在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在37℃培养直至OD600成为大约0.6。其后，将等体积的40％甘油溶液添加至培养液并且搅拌，再将适量分装并且贮藏在-80℃以制成甘油原种(glycerol stock)。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100mL均匀地铺在含有50mg/L氨苄青霉素的L平板上，并且将所述平板在37℃培养24小时。将平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi烧瓶中具有50mg/L氨苄青霉素的20mL发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养48小时。培养之后，使用氨基酸分析仪L-8500(Hitachi)测量培养基中积累的L-色氨酸的量。用于所述培养的培养基组成如下。

产生L-色氨酸的培养基：

葡萄糖 40g/L

(NH₄)₂SO₄ 15g/L

KH₂PO₄ 1.5g/L

MgSO₄·7H₂O 0.3g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

酵母提取物 2.0g/L

盐酸硫胺素(thiaminHCl) 0.005g/L

吡哆醇 0.03g/L

L-Met 0.05g/L

L-Phe 0.1g/L

L-Tyr 0.1g/L

CaCO₃ 30g/L

用KOH调节至pH 7.0，在120℃高压灭菌20分钟。将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O混合，并且与其它成分分开灭菌。CaCO₃在干热灭菌之后添加。

在第48小时的OD600和L-色氨酸积累示于表1。

表1：evgAS、ydeO和gadE扩增对产生Trp的细菌No.202ΔiclR的影响

No.202ΔiclR/evgAS、No.202ΔiclR/ydeO和No.202ΔiclR/gadE是evgAS、ydeO和gadE基因扩增的菌株，与对照No.202ΔiclR相比各自显示出L-色氨酸积累的增加。

实施例3：evgAS、ydeO和gadE扩增对产生L-苏氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

使用大肠杆菌VKPM B-5318菌株(参见EP0593792)作为产生L-苏氨酸的埃希氏菌属细菌菌株。

用实施例1中构建的gadE-扩增质粒pMW-gadE、evgAS-扩增质粒pMW-evgAS和ydeO-扩增质粒pMW-ydeO转化VKPM B-5318菌株，由此获得氨苄青霉素抗性菌株。在确认已经引入这些质粒之后，将引入gadE-扩增质粒pMW-gadE的菌株命名为B5318/gadE菌株；将引入evgAS-扩增质粒pMW-evgAS的菌株命名为B5318/evgAS菌株；并且将引入ydeO-扩增质粒pMW-ydeO的菌株命名为B5318/ydeO菌株。

可以使用除VKPM B-5318之外的已知产生L-苏氨酸的细菌以相同的方式来扩增evgAS、ydeO和gadE基因。

将如上产生的菌株在含有50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在37℃培养直至OD600成为大约0.6。其后，将等体积的40％甘油溶液添加至培养液并且搅拌，再将适量分装并且贮藏在-80℃以制成甘油原种。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100mL均匀地铺在含有50mg/L氨苄青霉素的L平板上，并且将其在37℃培养24小时。将平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi烧瓶中具有50mg/L氨苄青霉素的20mL下述发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养48小时。培养之后，使用氨基酸分析仪L-8500(Hitachi)测量培养基中积累的L-苏氨酸的量。用于所述培养的培养基组成如下。

产生L-苏氨酸的培养基：

葡萄糖 40g/L

(NH₄)₂SO₄ 16g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

酵母提取物 2.0g/L

CaCO₃(Japanese Pharmacopoeia) 30g/L

用KOH调节至pH 7.0，在120℃高压灭菌20分钟。将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O混合并且单独灭菌。CaCO₃在干热灭菌之后添加。

在第48小时的OD600和L-苏氨酸积累示于表2。

表2：evgAS、ydeO和gadE扩增的影响

B5318/evgAS、B5318/ydeO和B5318/gadE是evgAS、ydeO和gadE基因扩增的菌株，与对照VKPM B-5318相比各自显示出L-苏氨酸积累的增加。

实施例4：构建产生L-赖氨酸的细菌

4-1.构建将编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因破坏的菌株

首先，构建不产生赖氨酸脱羧酶的菌株。赖氨酸脱羧酶同工酶(isozyme)由cadA基因(GenBank登录号NP_418555.SEQ ID NO：31)和ldcC基因(GenBank登录号NP_414728.SEQ ID NO：33)编码(参见WO96/17930)。WC196菌株(参见WO96/17930)是AEC S-(2-氨乙基)-半胱氨酸抗性菌株，将WC196菌株用作产生L-赖氨酸的大肠杆菌菌株的亲本菌株。

使用最初由Datsenko和Wanner开发的称为“Red-驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97.6640-6645(2000))，和λ噬菌体切除系统(J.Bacteriol.184.5200-5203(2002))来缺失编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因。根据“Red-驱动整合”方法，使用将5’末端设计为靶基因的一部分并且将3’末端设计为抗生素抗性基因的一部分的合成寡核苷酸作为引物获得PCR产物，使用所述PCR产物可以在单一的步骤中构建基因破坏的菌株。另外，结合λ噬菌体切除系统，能够将整合至基因破坏菌株中的抗生素抗性基因去除(JP2005-058227A)。

4-2.破坏cadA基因

使用质粒pMW118-attL-Cm-attR(WO2005/010175)作为PCR模板。pMW118-attL-Cm-attR是将attL和attR基因(λ噬菌体附着位点)和cat基因(抗生素抗性基因)以attL-cat-attR的顺序插入pMW118(Takara Bio Inc.)中的质粒。

使用SEQ ID NOS：35和36中所示合成寡核苷酸作为引物进行PCR，其中各个引物在3’端具有相应于attL和attR各个末端的序列，并且在5’末端具有相应于部分靶cadA基因的序列。

将PCR产物用琼脂糖凝胶纯化，其后通过电穿孔引入含有质粒pKD46的大肠杆菌WC196菌株，所述质粒具有温度敏感复制能力。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97.6640-6645(2000))含有总共2154碱基的λ噬菌体DNA片段，其包含编码λRed同源重组系统中Red重组酶的基因(γ、β和exo)，所述基因受阿拉伯糖诱导的ParaB启动子调控(GenBank/EMBL登录号J02459，31088th-33241st)。

如下制备用于电穿孔的感受态细胞。即，将在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在30℃培养过夜的大肠杆菌WC196菌株在含有氨苄青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL SOB培养基中稀释100倍(MolecularCloning：Lab Manual 2^nd edition，Sambrook，J.，et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))。将稀释的悬液在30℃通气培养(aerate)直到OD 600达到大约0.6，之后将悬液浓缩100倍并用10％甘油洗涤三次准备用于电穿孔。使用70μl感受态细胞和大约100ng PCR产物进行电穿孔。向电穿孔后的细胞添加1mL SOC培养基(Molecular Cloning：Lab Manual 2^nd edition，Sambrook，J.，et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，并且在37℃培养2.5小时，其后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-琼脂的平板培养基上在37℃培养，由此选择Cm抗性的重组体。接下来，为了去除pKD46质粒，将重组体在含有Cm的L-琼脂培养基上在42℃传代培养两次，测试所得菌落的氨苄青霉素抗性，并且获得了去除pKD46的氨苄青霉素敏感性菌株。

使用PCR确认通过氯霉素抗性基因鉴定的突变体中cadA基因的缺失。将得到的cadA缺陷型菌株命名为WC196ΔcadA::att-cat菌株。

其后，为了去除cadA基因中引入的att-cat基因，使用辅助质粒pMW-intxis-ts(WO2005/010175)。pMW-intxis-ts是含有编码λ噬菌体整合酶(integrase)(Int)的基因和编码切除酶(excisionase)(Xis)的基因的质粒。

使用常规方法制备如上所述获得的WC196ΔcadA::att-cat菌株的感受态细胞，并且用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，在含有50mg/L氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上在30℃培养，由此选择氨苄青霉素抗性菌株。

其后，为了去除pMW-intxis-ts质粒，将氨苄青霉素抗性转化体在L-琼脂培养基上在42℃传代培养两次，测试所得菌落的氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性，由此获得了将att-cat和pMW-intxis-ts去除的氯霉素和氨苄青霉素敏感性菌株。将这种菌株命名为WC196ΔcadA。

4-3.破坏WC196ΔcadA菌株中的ldcC基因

按照上文描述的技术，使用引物SEQ ID Nos.37和38作为ldcC破坏引物，将WC196ΔcadA菌株中的ldcC基因缺失。由此获得了将cadA，ldcC破坏的菌株WC196ΔcadAΔldcC。

实施例5：evgAS扩增对产生L-赖氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

5-1.在WC196ΔcadAΔldcC菌株中引入产生赖氨酸的质粒

按照常规方法，用产生赖氨酸的质粒pCAB1转化WC196ΔcadAΔldcC菌株，所述质粒pCAB1含有dapA、dapB和lysC基因(WO01/53459)，从而获得WC196ΔcadAΔldcC/pCAB1菌株(WC196LC/pCAB1)。

用实施例1中构建的evgAS扩增质粒pMW-evgAS转化WC196LC/pCAB1菌株，由此获得氨苄青霉素抗性菌株。在确认已将指定的质粒引入后，将引入了evgAS扩增质粒pMW-evgAS的菌株命名为WC196LC/pCAB1/evgAS菌株。

也可使用除WC196LC/pCAB1菌株之外的已知产生L-赖氨酸的细菌以相同的方式扩增evgAS。

将如上产生的菌株在含有25mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在37℃培养直至OD600成为大约0.6。其后，将等体积的40％甘油溶液添加至培养液并且搅拌，其后将适量分装并且贮藏在-80℃以制成甘油原种。

5-2.产生赖氨酸的培养

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100mL均匀地铺在含有50mg/L氨苄青霉素的L平板上，并且将平板在37℃培养24小时。将获得的平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi烧瓶中具有50mg/L氨苄青霉素的20mL发酵培养基中，并且使用往复摇动在37℃培养48小时。培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的L-赖氨酸的量。用于所述培养的培养基组成如下。

产生L-赖氨酸的培养基：

葡萄糖 40g/L

(NH₄)₂SO₄ 16g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

酵母提取物 2.0g/L

CaCO₃(Japanese Pharmacopoeia) 30g/L

在第48小时的OD600和L-赖氨酸积累示于表3。

表3：evgAS扩增对产生赖氨酸的细菌WC196LC/pCAB1的影响

WC196LC/pCAB1/evgAS是evgAS基因扩增的菌株，与对照WC196LC/pCAB1相比显示出L-赖氨酸积累的显著增加。

实施例6：gadE扩增对产生L-赖氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

6-1.构建将gadE基因增强的产生L-赖氨酸的菌株

将gadE基因片段从实施例1中构建的含有大肠杆菌W3110菌株gadE基因的质粒pMW-gadE中切除，并且将所述片段与用HindIII和BamHI消化的载体pUC18(Takara Shuzo)连接，由此构建gadE扩增质粒pUC-gadE。

用上述pUC-gadE转化WC196LC/pCAB1菌株，由此获得氨苄青霉素抗性菌株。在确认已经引入指定的质粒之后，将引入了gadE扩增质粒pUC-gadE的菌株命名为WC196LC/pCAB1/pUC-gadE菌株。

可以使用除WC196LC/pCAB1之外的已知产生L-赖氨酸的细菌以相同的方式来扩增evgAS、ydeO和gadE。也可以以evgAS、ydeO或gadE基因的任何组合来进行扩增。

将如上产生的菌株在含有25mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在37℃培养直至OD600达到大约0.6。其后，将等体积的40％甘油溶液添加至培养液并且搅拌，其后将适量分装并且贮藏在-80℃以制成甘油原种。

6-2.产生赖氨酸的培养

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100mL均匀地铺在含有25mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素的L平板上，并且将平板在37℃培养24小时。将获得的平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi烧瓶中具有25mg/L链霉素和50mg/L氨苄青霉素的下述20mL发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养48小时。培养之后，使用Biotech-analyzerAS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的L-赖氨酸的量。用于所述培养的培养基组成如下。

产生L-赖氨酸的培养基：

葡萄糖或果糖 40g/L

(NH₄)₂SO₄ 16g/L

KH₂PO₄ 1.0g/L

MgSO₄·7H₂O 1.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·7H₂O 0.01g/L

异亮氨酸 0.1g/L

酵母提取物 2.0g/L

CaCO₃(Japanese Pharmacopoeia)30g/L

在第48小时的OD600和积累的L-赖氨酸示于表4。

表4：在葡萄糖培养和果糖培养中gadE扩增对产生赖氨酸的细菌WC196LC/pCAB1的影响

在葡萄糖培养和果糖培养中，与对照WC196LC/pCAB1相比，gadE基因扩增的菌株WC196LC/pCAB1/pUCgadE均显示出L-赖氨酸积累的增加，特别在果糖培养中表现出L-赖氨酸积累的显著增加。

工业实用性

通过使用本发明的微生物，可以通过发酵有效地产生L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-色氨酸。

序列表说明

SEQ ID NO：1：用于扩增trp操纵子的引物

SEQ ID NO：2：用于扩增trp操纵子的引物

SEQ ID NO：3：用于扩增iclR基因的引物

SEQ ID NO：4：用于扩增iclR基因的引物

SEQ ID NO：5：iclR基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：6：由iclR基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：7：aceA基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：8：由aceA基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：9：aceB基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：10：由aceB基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：11：aceK基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：12：由aceK基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：13：trpA基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：14：由trpA基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：15：trpB基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：16：由trpB基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：17：用于扩增evgAS操纵子的引物

SEQ ID NO：18：用于扩增evgAS操纵子的引物

SEQ ID NO：19：用于扩增gadE基因的引物

SEQ ID NO：20：用于扩增gadE基因的引物

SEQ ID NO：21：用于扩增ydeO基因的引物

SEQ ID NO：22：用于扩增ydeO基因的引物

SEQ ID NO：23：evgA基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：24：EvgA的氨基酸序列

SEQ ID NO：25：evgS基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：26：EvgS的氨基酸序列

SEQ ID NO：27：gadE基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：28：GadE的氨基酸序列

SEQ ID NO：29：ydeO基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：30：YdeO的氨基酸序列

SEQ ID NO：31：cadA基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：32：由cadA基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：33：ldcC基因的核苷酸序列

SEQ ID NO：34：由ldcC基因编码的氨基酸的序列

SEQ ID NO：35：用于破坏cadA基因的PCR引物

SEQ ID NO：36：用于破坏cadA基因的PCR引物

SEQ ID NO：37：用于破坏ldc基因的PCR引物

SEQ ID NO：38：用于破坏ldc基因的PCR引物

序列表

<110>味之素株式会社(Ajinomoto Co.，Inc.)

<120>产生L-氨基酸的细菌和用于产生L-氨基酸的方法

<130>C557-C6193

<150>JP2005-279027

<151>2005-09-27

<150>US60/723936

<151>2005-10-06

<150>JP2006-213584

<151>2006-08-04

<160>38

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

gggttaattg tttttctgcg 20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

cgcatctcga ctgcacggtg 20

<210>3

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

gccgaattca agtgtgtgaa gtgtatg 27

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

gccaagcttc cgacacgctc aacccag 27

<210>5

<211>864

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(864)

<400>5

atg aaa atg att tcc acg ata cag aaa aaa gag act gtc atg gtc gca 48

Met Lys Met Ile Ser Thr Ile Gln Lys Lys Glu Thr Val Met Val Ala

1 5 10 15

ccc att ccc gcg aaa cgc ggc aga aaa ccc gcc gtt gcc acc gca cca 96

Pro Ile Pro Ala Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Val Ala Thr Ala Pro

20 25 30

gcg act gga cag gtt cag tct tta acg cgt ggc ctg aaa tta ctg gag 144

Ala Thr Gly Gln Val Gln Ser Leu Thr Arg Gly Leu Lys Leu Leu Glu

35 40 45

tgg att gcc gaa tcc aat ggc agt gtg gca ctc acg gaa ctg gcg caa 192

Trp Ile Ala Glu Ser Asn Gly Ser Val Ala Leu Thr Glu Leu Ala Gln

50 55 60

caa gcc ggg tta ccc aat tcc acg acc cac cgc ctg cta acc acg atg 240

Gln Ala Gly Leu Pro Asn Ser Thr Thr His Arg Leu Leu Thr Thr Met

65 70 75 80

caa cag cag ggt ttc gtg cgt cag gtt ggc gaa ctg gga cat tgg gca 288

Gln Gln Gln Gly Phe Val Arg Gln Val Gly Glu Leu Gly His Trp Ala

85 90 95

atc ggc gca cat gcc ttt atg gtc ggc agc agc ttt ctc cag agc cgt 336

Ile Gly Ala His Ala Phe Met Val Gly Ser Ser Phe Leu Gln Ser Arg

100 105 110

aat ttg tta gcg att gtt cac cct atc ctg cgc aat cta atg gaa gag 384

Asn Leu Leu Ala Ile Val His Pro Ile Leu Arg Asn Leu Met Glu Glu

115 120 125

tct ggc gaa acg gtc aat atg gcg gtg ctt gat caa agc gat cac gaa 432

Ser Gly Glu Thr Val Asn Met Ala Val Leu Asp Gln Ser Asp His Glu

130 135 140

gcg att att atc gac cag gta cag tgt acg cat ctg atg cga atg tcc 480

Ala Ile Ile Ile Asp Gln Val Gln Cys Thr His Leu Met Arg Met Ser

145 150 155 160

gcg cct atc ggc ggt aaa ttg ccg atg cac gct tcc ggt gcg ggt aaa 528

Ala Pro Ile Gly Gly Lys Leu Pro Met His Ala Ser Gly Ala Gly Lys

165 170 175

gcc ttt tta gcc caa ctg agc gaa gaa cag gtg acg aag ctg ctg cac 576

Ala Phe Leu Ala Gln Leu Ser Glu Glu Gln Val Thr Lys Leu Leu His

180 185 190

cgc aaa ggg tta cat gcc tat acc cac gca acg ctg gtg tct cct gtg 624

Arg Lys Gly Leu His Ala Tyr Thr His Ala Thr Leu Val Ser Pro Val

195 200 205

cat tta aaa gaa gat ctc gcc caa acg cgc aaa cgg ggt tat tca ttt 672

His Leu Lys Glu Asp Leu Ala Gln Thr Arg Lys Arg Gly Tyr Ser Phe

210 215 220

gac gat gag gaa cat gca ctg ggg cta cgt tgc ctt gca gcg tgt att 720

Asp Asp Glu Glu His Ala Leu Gly Leu Arg Cys Leu Ala Ala Cys Ile

225 230 235 240

ttc gat gag cac cgt gaa ccg ttt gcc gca att tct att tcc gga ccg 768

Phe Asp Glu His Arg Glu Pro Phe Ala Ala Ile Ser Ile Ser Gly Pro

245 250 255

att tca cgt att acc gat gac cgc gtg acc gag ttt ggc gcg atg gtg 816

Ile Ser Arg Ile Thr Asp Asp Arg Val Thr Glu Phe Gly Ala Met Val

260 265 270

att aaa gcg gcg aag gaa gtg acg ctg gcg tac ggt gga atg cgc tga 864

Ile Lys Ala Ala Lys Glu Val Thr Leu Ala Tyr Gly Gly Met Arg

275 280 285

<210>6

<211>287

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>6

Met Lys Met Ile Ser Thr Ile Gln Lys Lys Glu Thr Val Met Val Ala

1 5 10 15

Pro Ile Pro Ala Lys Arg Gly Arg Lys Pro Ala Val Ala Thr Ala Pro

20 25 30

Ala Thr Gly Gln Val Gln Ser Leu Thr Arg Gly Leu Lys Leu Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Ala Glu Ser Asn Gly Ser Val Ala Leu Thr Glu Leu Ala Gln

50 55 60

Gln Ala Gly Leu Pro Asn Ser Thr Thr His Arg Leu Leu Thr Thr Met

65 70 75 80

Gln Gln Gln Gly Phe Val Arg Gln Val Gly Glu Leu Gly His Trp Ala

85 90 95

Ile Gly Ala His Ala Phe Met Val Gly Ser Ser Phe Leu Gln Ser Arg

100 105 110

Asn Leu Leu Ala Ile Val His Pro Ile Leu Arg Asn Leu Met Glu Glu

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Ile Thr Asp Leu Gly Glu Gln Ile Val Ile Arg His Leu Tyr Ile Glu

405 410 415

cgg cgg atg gtg ccg ctc aat atc tgg ctg gaa caa gtg gaa ggt cag 1296

Arg Arg Met Val Pro Leu Asn Ile Trp Leu Glu Gln Val Glu Gly Gln

420 425 430

cag ttg cgc gac gcc att gaa gaa tac ggt aac gct att cgc cag ctt 1344

Gln Leu Arg Asp Ala Ile Glu Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Arg Gln Leu

435 440 445

gcc gct gct aac att ttc cct ggc gac atg ctg ttt aaa aac ttc ggt 1392

Ala Ala Ala Asn Ile Phe Pro Gly Asp Met Leu Phe Lys Asn Phe Gly

450 455 460

gtc acc cgt cac ggg cgt gtg gtt ttt tat gat tac gat gaa att tgc 1440

Val Thr Arg His Gly Arg Val Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Glu Ile Cys

465 470 475 480

tac atg acg gaa gtg aat ttc cgc gac atc ccg ccg ccg cgc tat ccg 1488

Tyr Met Thr Glu Val Asn Phe Arg Asp Ile Pro Pro Pro Arg Tyr Pro

485 490 495

gaa gac gaa ctt gcc agc gaa ccg tgg tac agc gtc tcg ccg ggc gat 1536

Glu Asp Glu Leu Ala Ser Glu Pro Trp Tyr Ser Val Ser Pro Gly Asp

500 505 510

gtt ttc ccg gaa gag ttt cgc cac tgg cta tgc gcc gac ccg cgt att 1584

Val Phe Pro Glu Glu Phe Arg His Trp Leu Cys Ala Asp Pro Arg Ile

515 520 525

ggt ccg ctg ttt gaa gag atg cac gcc gac ctg ttc cgc gct gat tac 1632

Gly Pro Leu Phe Glu Glu Met His Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Tyr

530 535 540

tgg cgc gca cta caa aac cgc ata cgt gaa ggg cat gtg gaa gat gtt 1680

Trp Arg Ala Leu Gln Asn Arg Ile Arg Glu Gly His Val Glu Asp Val

545 550 555 560

tat gcg tat cgg cgc agg caa aga ttt agc gta cgg tat ggg gag atg 1728

Tyr Ala Tyr Arg Arg Arg Gln Arg Phe Ser Val Arg Tyr Gly Glu Met

565 570 575

ctt ttt tga 1737

Leu Phe

<210>12

<211>578

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>12

Met Pro Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Ala Gln Thr Ile Leu Gln Gly

1 5 10 15

Phe Asp Ala Gln Tyr Gly Arg Phe Leu Glu Val Thr Ser Gly Ala Gln

20 25 30

Gln Arg Phe Glu Gln Ala Asp Trp His Ala Val Gln Gln Ala Met Lys

35 40 45

Asn Arg Ile His Leu Tyr Asp His His Val Gly Leu Val Val Glu Gln

50 55 60

Leu Arg Cys Ile Thr Asn Gly Gln Ser Thr Asp Ala Ala Phe Leu Leu

65 70 75 80

Arg Val Lys Glu His Tyr Thr Arg Leu Leu Pro Asp Tyr Pro Arg Phe

85 90 95

Glu Ile Ala Glu Ser Phe Phe Asn Ser Val Tyr Cys Arg Leu Phe Asp

100 105 110

His Arg Ser Leu Thr Pro Glu Arg Leu Phe Ile Phe Ser Ser Gln Pro

115 120 125

Glu Arg Arg Phe Arg Thr Ile Pro Arg Pro Leu Ala Lys Asp Phe His

130 135 140

Pro Asp His Gly Trp Glu Ser Leu Leu Met Arg Val Ile Ser Asp Leu

145 150 155 160

Pro Leu Arg Leu Arg Trp Gln Asn Lys Ser Arg Asp Ile His Tyr Ile

165 170 175

Ile Arg His Leu Thr Glu Thr Leu Gly Thr Asp Asn Leu Ala Glu Ser

180 185 190

His Leu Gln Val Ala Asn Glu Leu Phe Tyr Arg Asn Lys Ala Ala Trp

195 200 205

Leu Val Gly Lys Leu Ile Thr Pro Ser Gly Thr Leu Pro Phe Leu Leu

210 215 220

Pro Ile His Gln Thr Asp Asp Gly Glu Leu Phe Ile Asp Thr Cys Leu

225 230 235 240

Thr Thr Thr Ala Glu Ala Ser Ile Val Phe Gly Phe Ala Arg Ser Tyr

245 250 255

Phe Met Val Tyr Ala Pro Leu Pro Ala Ala Leu Val Glu Trp Leu Arg

260 265 270

Glu Ile Leu Pro Gly Lys Thr Thr Ala Glu Leu Tyr Met Ala Ile Gly

275 280 285

Cys Gln Lys His Ala Lys Thr Glu Ser Tyr Arg Glu Tyr Leu Val Tyr

290 295 300

Leu Gln Gly Cys Asn Glu Gln Phe Ile Glu Ala Pro Gly Ile Arg Gly

305 310 315 320

Met Val Met Leu Val Phe Thr Leu Pro Gly Phe Asp Arg Val Phe Lys

325 330 335

Val Ile Lys Asp Arg Phe Ala Pro Gln Lys Glu Met Ser Ala Ala His

340 345 350

Val Arg Ala Cys Tyr Gln Leu Val Lys Glu His Asp Arg Val Gly Arg

355 360 365

Met Ala Asp Thr Gln Glu Phe Glu Asn Phe Val Leu Glu Lys Arg His

370 375 380

Ile Ser Pro Ala Leu Met Glu Leu Leu Leu Gln Glu Ala Ala Glu Lys

385 390 395 400

Ile Thr Asp Leu Gly Glu Gln Ile Val Ile Arg His Leu Tyr Ile Glu

405 410 415

Arg Arg Met Val Pro Leu Asn Ile Trp Leu Glu Gln Val Glu Gly Gln

420 425 430

Gln Leu Arg Asp Ala Ile Glu Glu Tyr Gly Asn Ala Ile Arg Gln Leu

435 440 445

Ala Ala Ala Asn Ile Phe Pro Gly Asp Met Leu Phe Lys Asn Phe Gly

450 455 460

Val Thr Arg His Gly Arg Val Val Phe Tyr Asp Tyr Asp Glu Ile Cys

465 470 475 480

Tyr Met Thr Glu Val Asn Phe Arg Asp Ile Pro Pro Pro Arg Tyr Pro

485 490 495

Glu Asp Glu Leu Ala Ser Glu Pro Trp Tyr Ser Val Ser Pro Gly Asp

500 505 510

Val Phe Pro Glu Glu Phe Arg His Trp Leu Cys Ala Asp Pro Arg Ile

515 520 525

Gly Pro Leu Phe Glu Glu Met His Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Tyr

530 535 540

Trp Arg Ala Leu Gln Asn Arg Ile Arg Glu Gly His Val Glu Asp Val

545 550 555 560

Tyr Ala Tyr Arg Arg Arg Gln Arg Phe Ser Val Arg Tyr Gly Glu Met

565 570 575

Leu Phe

<210>13

<211>807

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(807)

<400>13

atg gaa cgc tac gaa tct ctg ttt gcc cag ttg aag gag cgc aaa gaa 48

Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys Glu

1 5 10 15

ggc gca ttc gtt cct ttc gtc acg ctc ggt gat ccg ggc att gag cag 96

Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile Glu Gln

20 25 30

tca ttg aaa att atc gat acg cta att gaa gcc ggt gct gac gcg ctg 144

Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu

35 40 45

gag tta ggt atc ccc ttc tcc gac cca ctg gcg gat ggc ccg acg att 192

Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Thr Ile

50 55 60

caa aac gcc act ctg cgc gcc ttt gcg gca ggt gtg act ccg gca caa 240

Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Gln

65 70 75 80

tgt ttt gaa atg ctg gca ctg att cgc cag aaa cac ccg acc att ccc 288

Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile Pro

85 90 95

att ggc ctg ttg atg tat gcc aat ctg gtg ttt aac aaa ggc att gat 336

Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu Val PheAsn Lys Gly Ile Asp

100 105 110

gag ttt tat gcc cag tgc gaa aaa gtc ggc gtc gat tcg gtg ctg gtt 384

Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val

115 120 125

gcc gat gtg cca gtt gaa gag tcc gcg ccc ttc cgc cag gcc gcg ttg 432

Ala Asp Val Pro Val Glu Glu Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu

130 135 140

cgt cat aat gtc gca cct atc ttc atc tgc ccg cca aat gcc gat gac 480

Arg His Asn Val Ala Pro Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp

145 150 155 160

gac ctg ctg cgc cag ata gcc tct tac ggt cgt ggt tac acc tat ttg 528

Asp Leu Leu Arg Gln Ile Ala Ser Tyr Gly Arg Gly Tyr Thr Tyr Leu

165 170 175

ctg tca cga gca ggc gtg acc ggc gca gaa aac cgc gcc gcg tta ccc 576

Leu Ser Arg Ala Gly Val Thr Gly Ala Glu Asn Arg Ala Ala Leu Pro

180 185 190

ctc aat cat ctg gtt gcg aag ctg aaa gag tac aac gct gca cct cca 624

Leu Asn His Leu Val Ala Lys Leu Lys Glu Tyr Asn Ala Ala Pro Pro

195 200 205

ttg cag gga ttt ggt att tcc gcc ccg gat cag gta aaa gca gcg att 672

Leu Gln Gly Phe Gly Ile Ser Ala Pro Asp Gln Val Lys Ala Ala Ile

210 215 220

gat gca gga gct gcg ggc gcg att tct ggt tcg gcc att gtt aaa atc 720

Asp Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ile Ser Gly Ser Ala Ile Val Lys Ile

225 230 235 240

atc gag caa cat att aat gag cca gag aaa atg ctg gcg gca ctg aaa 768

Ile Glu Gln His Ile Asn Glu Pro Glu Lys Met Leu Ala Ala Leu Lys

245 250 255

gtt ttt gta caa ccg atg aaa gcg gcg acg cgc agt taa 807

Val Phe Val Gln Pro Met Lys Ala Ala Thr Arg Ser

260 265

<210>14

<211>268

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>14

Met Glu Arg Tyr Glu Ser Leu Phe Ala Gln Leu Lys Glu Arg Lys Glu

1 5 10 15

Gly Ala Phe Val Pro Phe Val Thr Leu Gly Asp Pro Gly Ile Glu Gln

20 25 30

Ser Leu Lys Ile Ile Asp Thr Leu Ile Glu Ala Gly Ala Asp Ala Leu

35 40 45

Glu Leu Gly Ile Pro Phe Ser Asp Pro Leu Ala Asp Gly Pro Thr Ile

50 55 60

Gln Asn Ala Thr Leu Arg Ala Phe Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Gln

65 70 75 80

Cys Phe Glu Met Leu Ala Leu Ile Arg Gln Lys His Pro Thr Ile Pro

85 90 95

Ile Gly Leu Leu Met Tyr Ala Asn Leu Val Phe Asn Lys Gly Ile Asp

100 105 110

Glu Phe Tyr Ala Gln Cys Glu Lys Val Gly Val Asp Ser Val Leu Val

115 120 125

Ala Asp Val Pro Val Glu Glu Ser Ala Pro Phe Arg Gln Ala Ala Leu

130 135 140

Arg His Asn Val Ala Pro Ile Phe Ile Cys Pro Pro Asn Ala Asp Asp

145 150 155 160

Asp Leu Leu Arg Gln Ile Ala Ser Tyr Gly Arg Gly Tyr Thr Tyr Leu

165 170 175

Leu Ser Arg Ala Gly Val Thr Gly Ala Glu Asn Arg Ala Ala Leu Pro

180 185 190

Leu Asn His Leu Val Ala Lys Leu Lys Glu Tyr Asn Ala Ala Pro Pro

195 200 205

Leu Gln Gly Phe Gly Ile Ser Ala Pro Asp Gln Val Lys Ala Ala Ile

210 215 220

Asp Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ile Ser Gly Ser Ala Ile Val Lys Ile

225 230 235 240

Ile Glu Gln His Ile Asn Glu Pro Glu Lys Met Leu Ala Ala Leu Lys

245 250 255

Val Phe Val Gln Pro Met Lys Ala Ala Thr Arg Ser

260 265

<210>15

<211>1194

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1194)

<400>15

atg aca aca tta ctt aac ccc tat ttt ggt gag ttt ggc ggc atg tac 48

Met Thr Thr Leu Leu Asn Pro Tyr Phe Gly Glu Phe Gly Gly Met Tyr

1 5 10 15

gtg cca caa atc ctg atg cct gct ctg cgc cag ctg gaa gaa gct ttt 96

Val Pro Gln Ile Leu Met Pro Ala Leu Arg Gln Leu Glu Glu Ala Phe

20 25 30

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Val Ser Ala Gln Lys Asp Pro Glu Phe Gln Ala Gln Phe Asn Asp Leu

35 40 45

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Leu Lys Asn Tyr Ala Gly Arg Pro Thr Ala Leu Thr Lys Cys Gln Asn

50 55 60

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Ile Thr Ala Gly Thr Asn Thr Thr Leu Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu

65 70 75 80

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Leu His Gly Gly Ala His Lys Thr Asn Gln Val Leu Gly Gln Ala Leu

85 90 95

ctg gcg aag cgg atg ggt aaa acc gaa atc atc gcc gaa acc ggt gcc 336

Leu Ala Lys Arg Met Gly Lys Thr Glu Ile Ile Ala Glu Thr Gly Ala

100 105 110

ggt cag cat ggc gtg gcg tcg gcc ctt gcc agc gcc ctg ctc ggc ctg 384

Gly Gln His Gly Val Ala Ser Ala Leu Ala Ser Ala Leu Leu Gly Leu

115 120 125

aaa tgc cgt att tat atg ggt gcc aaa gac gtt gaa cgc cag tcg cct 432

Lys Cys Arg Ile Tyr Met Gly Ala Lys Asp Val Glu Arg Gln Ser Pro

130 135 140

aac gtt ttt cgt atg cgc tta atg ggt gcg gaa gtg atc ccg gtg cat 480

Asn Val Phe Arg Met Arg Leu Met Gly Ala Glu Val Ile Pro Val His

145 150 155 160

agc ggt tcc gcg acg ctg aaa gat gcc tgt aac gag gcg ctg cgc gac 528

Ser Gly Ser Ala Thr Leu Lys Asp Ala Cys Asn Glu Ala Leu Arg Asp

165 170 175

tgg tcc ggt agt tac gaa acc gcg cac tat atg ctg ggc acc gca gct 576

Trp Ser Gly Ser Tyr Glu Thr Ala His Tyr Met Leu Gly Thr Ala Ala

180 185 190

ggc ccg cat cct tat ccg acc att gtg cgt gag ttt cag cgg atg att 624

Gly Pro His Pro Tyr Pro Thr Ile Val Arg Glu Phe Gln Arg Met Ile

195 200 205

ggc gaa gaa acc aaa gcg cag att ctg gaa aga gaa ggt cgc ctg ccg 672

Gly Glu Glu Thr Lys Ala Gln Ile Leu Glu Arg Glu Gly Arg Leu Pro

210 215 220

gat gcc gtt atc gcc tgt gtt ggc ggc ggt tcg aat gcc atc ggc atg 720

Asp Ala Val Ile Ala Cys Val Gly Gly Gly Ser Asn Ala Ile Gly Met

225 230 235 240

ttt gct gat ttc atc aat gaa acc aac gtc ggc ctg att ggt gtg gag 768

Phe Ala Asp Phe Ile Asn Glu Thr Asn Val Gly Leu Ile Gly Val Glu

245 250 255

cca ggt ggt cac ggt atc gaa act ggc gag cac ggc gca ccg cta aaa 816

Pro Gly Gly His Gly Ile Glu Thr Gly Glu His Gly Ala Pro Leu Lys

260 265 270

cat ggt cgc gtg ggt atc tat ttc ggt atg aaa gcg ccg atg atg caa 864

His Gly Arg Val Gly Ile Tyr Phe Gly Met Lys Ala Pro Met Met Gln

275 280 285

acc gaa gac ggg cag att gaa gaa tct tac tcc atc tcc gcc gga ctg 912

Thr Glu Asp Gly Gln Ile Glu Glu Ser Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Leu

290 295 300

gat ttc ccg tct gtc ggc cca caa cac gcg tat ctt aac agc act gga 960

Asp Phe Pro Ser Val Gly Pro Gln His Ala Tyr Leu Asn Ser Thr Gly

305 310 315 320

cgc gct gat tac gtg tct att acc gat gat gaa gcc ctt gaa gcc ttc 1008

Arg Ala Asp Tyr Val Ser Ile Thr Asp Asp Glu Ala Leu Glu Ala Phe

325 330 335

aaa acg ctg tgc ctg cac gaa ggg atc atc ccg gcg ctg gaa tcc tcc 1056

Lys Thr Leu Cys Leu His Glu Gly Ile Ile Pro Ala Leu Glu Ser Ser

340 345 350

cac gcc ctg gcc cat gcg ttg aaa atg atg cgc gaa aac ccg gat aaa 1104

His Ala Leu Ala His Ala Leu Lys Met Met Arg Glu Asn Pro Asp Lys

355 360 365

gag cag cta ctg gtg gtt aac ctt tcc ggt cgc ggc gat aaa gac atc 1152

Glu Gln Leu Leu Val Val Asn Leu Ser Gly Arg Gly Asp Lys Asp Ile

370 375 380

ttc acc gtt cac gat att ttg aaa gca cga ggg gaa atc tga 1194

Phe Thr Val His Asp Ile Leu Lys Ala Arg Gly Glu Ile

385 390 395

<210>16

<211>397

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>16

Met Thr Thr Leu Leu Asn Pro Tyr Phe Gly Glu Phe Gly Gly Met Tyr

1 5 10 15

Val Pro Gln Ile Leu Met Pro Ala Leu Arg Gln Leu Glu Glu Ala Phe

20 25 30

Val Ser Ala Gln Lys Asp Pro Glu Phe Gln Ala Gln Phe Asn Asp Leu

35 40 45

Leu Lys Asn Tyr Ala Gly Arg Pro Thr Ala Leu Thr Lys Cys Gln Asn

50 55 60

Ile Thr Ala Gly Thr Asn Thr Thr Leu Tyr Leu Lys Arg Glu Asp Leu

65 70 75 80

Leu His Gly Gly Ala His Lys Thr Asn Gln Val Leu Gly Gln Ala Leu

85 90 95

Leu Ala Lys Arg Met Gly Lys Thr Glu Ile Ile Ala Glu Thr Gly Ala

100 105 110

Gly Gln His Gly Val Ala Ser Ala Leu Ala Ser Ala Leu Leu Gly Leu

115 120 125

Lys Cys Arg Ile Tyr Met Gly Ala Lys Asp Val Glu Arg Gln Ser Pro

130 135 140

Asn Val Phe Arg Met Arg Leu Met Gly Ala Glu Val Ile Pro Val His

145 150 155 160

Ser Gly Ser Ala Thr Leu Lys Asp Ala Cys Asn Glu Ala Leu Arg Asp

165 170 175

Trp Ser Gly Ser Tyr Glu Thr Ala His Tyr Met Leu Gly Thr Ala Ala

180 185 190

Gly Pro His Pro Tyr Pro Thr Ile Val Arg Glu Phe Gln Arg Met Ile

195 200 205

Gly Glu Glu Thr Lys Ala Gln Ile Leu Glu Arg Glu Gly Arg Leu Pro

210 215 220

Asp Ala Val Ile Ala Cys Val Gly Gly Gly Ser Asn Ala Ile Gly Met

225 230 235 240

Phe Ala Asp Phe Ile Asn Glu Thr Asn Val Gly Leu Ile Gly Val Glu

245 250 255

Pro Gly Gly His Gly Ile Glu Thr Gly Glu His Gly Ala Pro Leu Lys

260 265 270

His Gly Arg Val Gly Ile Tyr Phe Gly Met Lys Ala Pro Met Met Gln

275 280 285

Thr Glu Asp Gly Gln Ile Glu Glu Ser Tyr Ser Ile Ser Ala Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Pro Ser Val Gly Pro Gln His Ala Tyr Leu Asn Ser Thr Gly

305 310 315 320

Arg Ala Asp Tyr Val Ser Ile Thr Asp Asp Glu Ala Leu Glu Ala Phe

325 330 335

Lys Thr Leu Cys Leu His Glu Gly Ile Ile Pro Ala Leu Glu Ser Ser

340 345 350

His Ala Leu Ala His Ala Leu Lys Met Met Arg Glu Asn Pro Asp Lys

355 360 365

Glu Gln Leu Leu Val Val Asn Leu Ser Gly Arg Gly Asp Lys Asp Ile

370 375 380

Phe Thr Val His Asp Ile Leu Lys Ala Arg Gly Glu Ile

385 390 395

<210>17

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5’-引物-evgAS

<400>17

gggaattcac gcctgtagga ttagtaagaa gacttatagt gcca 44

<210>18

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>3’-引物-evgAS

<400>18

ggaagcttcc acatttgaac attgtgggag ccgctattta gtca 44

<210>19

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5’-引物-gadE

<400>19

ggggatccaa agtgaacaaa gagttccgta agcgttgatg ctat 44

<210>20

<211>44

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>3’-引物-gadE

<400>20

ggaagcttat gccagccatc aatttcagtt gcttatgtcc tgac 44

<210>21

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>5’-引物-ydeO

<400>21

ggaagcttaa cgcggggcag ggaatggctg ccccatttaa ttcttac 47

<210>22

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>3’-引物-ydeO

<400>22

gggaattcgc tgagtatttc agaaatgggt cgcattgcaa gagatc 46

<210>23

<211>615

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(615)

<400>23

atg aac gca ata att att gat gac cat cct ctt gct atc gca gca att 48

Met Asn Ala Ile Ile Ile Asp Asp His Pro Leu Ala Ile Ala Ala Ile

1 5 10 15

cgt aat tta ttg atc aaa aac gat att gaa atc tta gca gag ttg act 96

Arg Asn Leu Leu Ile Lys Asn Asp Ile Glu Ile Leu Ala Glu Leu Thr

20 25 30

gaa ggc gga agt gcc gtt cag cgg gtg gaa aca ctt aag cct gat atc 144

Glu Gly Gly Ser Ala Val Gln Arg Val Glu Thr Leu Lys Pro Asp Ile

35 40 45

gtc atc att gat gtc gat atc ccc gga gtt aac ggt atc cag gtg tta 192

Val Ile Ile Asp Val Asp Ile Pro Gly Val Asn Gly Ile Gln Val Leu

50 55 60

gaa acg ctg agg aag cgc caa tat agc gga att att att atc gtc tcc 240

Glu Thr Leu Arg Lys Arg Gln Tyr Ser Gly Ile Ile Ile Ile Val Ser

65 70 75 80

gct aaa aat gac cat ttt tac ggg aaa cat tgt gct gat gct ggc gct 288

Ala Lys Asn Asp His Phe Tyr Gly Lys His Cys Ala Asp Ala Gly Ala

85 90 95

aat ggt ttc gtg agt aaa aaa gaa ggc atg aac aat atc att gcg gct 336

Asn Gly Phe Val Ser Lys Lys Glu Gly Met Asn Asn Ile Ile Ala Ala

100 105 110

att gaa gct gca aaa aat ggc tac tgc tat ttc ccc ttc tct ctc aac 384

Ile Glu Ala Ala Lys Asn Gly Tyr Cys Tyr Phe Pro Phe Ser Leu Asn

115 120 125

cgg ttt gtt gga agt tta acg tcc gac cag caa aaa ctc gac tcc tta 432

Arg Phe Val Gly Ser Leu Thr Ser Asp Gln Gln Lys Leu Asp Ser Leu

130 135 140

tcg aaa caa gaa att agt gtc atg cgg tat att ctt gat ggc aag gat 480

Ser Lys Gln Glu Ile Ser Val Met Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Lys Asp

145 150 155 160

aat aat gac att gct gaa aaa atg ttc atc agc aac aaa act gtc agc 528

Asn Asn Asp Ile Ala Glu Lys Met Phe Ile Ser Asn Lys Thr Val Ser

165 170 175

act tat aaa agt cgc ctg atg gaa aaa tta gaa tgt aaa tca ctg atg 576

Thr Tyr Lys Ser Arg Leu Met Glu Lys Leu Glu Cys Lys Ser Leu Met

180 185 190

gat ctt tac aca ttc gca caa cgt aac aaa atc ggc taa 615

Asp Leu Tyr Thr Phe Ala Gln Arg Asn Lys Ile Gly

195 200

<210>24

<211>204

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>24

Met Asn Ala Ile Ile Ile Asp Asp His Pro Leu Ala Ile Ala Ala Ile

1 5 10 15

Arg Asn Leu Leu Ile Lys Asn Asp Ile Glu Ile Leu Ala Glu Leu Thr

20 25 30

Glu Gly Gly Ser Ala Val Gln Arg Val Glu Thr Leu Lys Pro Asp Ile

35 40 45

Val Ile Ile Asp Val Asp Ile Pro Gly Val Asn Gly Ile Gln Val Leu

50 55 60

Glu Thr Leu Arg Lys Arg Gln Tyr Ser Gly Ile Ile Ile Ile Val Ser

65 70 75 80

Ala Lys Asn Asp His Phe Tyr Gly Lys His Cys Ala Asp Ala Gly Ala

85 90 95

Asn Gly Phe Val Ser Lys Lys Glu Gly Met Asn Asn Ile Ile Ala Ala

100 105 110

Ile Glu Ala Ala Lys Asn Gly Tyr Cys Tyr Phe Pro Phe Ser Leu Asn

115 120 125

Arg Phe Val Gly Ser Leu Thr Ser Asp Gln Gln Lys Leu Asp Ser Leu

130 135 140

Ser Lys Gln Glu Ile Ser Val Met Arg Tyr Ile Leu Asp Gly Lys Asp

145 150 155 160

Asn Asn Asp Ile Ala Glu Lys Met Phe Ile Ser Asn Lys Thr Val Ser

165 170 175

Thr Tyr Lys Ser Arg Leu Met Glu Lys Leu Glu Cys Lys Ser Leu Met

180 185 190

Asp Leu Tyr Thr Phe Ala Gln Arg Asn Lys Ile Gly

195 200

<210>25

<211>3594

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(3594)

<400>25

atg aag ttt tta ccc tat att ttt ctt ctc tgt tgt ggt ctt tgg tcg 48

Met Lys Phe Leu Pro Tyr Ile Phe Leu Leu Cys Cys Gly Leu Trp Ser

1 5 10 15

acc ata agt ttc gca gac gaa gat tac atc gaa tat cgt ggc atc agt 96

Thr Ile Ser Phe Ala Asp Glu Asp Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ile Ser

20 25 30

agt aac aac cgt gtc aca ctt gat cca cta cgt ctg agc aac aag gaa 144

Ser Asn Asn Arg Val Thr Leu Asp Pro Leu Arg Leu Ser Asn Lys Glu

35 40 45

tta cgt tgg tta gcg agc aaa aaa aat ctt gtg att gca gta cat aag 192

Leu Arg Trp Leu Ala Ser Lys Lys Asn Leu Val Ile Ala Val His Lys

50 55 60

tcc caa acg gct acg ttg ttg cat acc gat tcg cag caa cgg gtt cgt 240

Ser Gln Thr Ala Thr Leu Leu His Thr Asp Ser Gln Gln Arg Val Arg

65 70 75 80

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Gly Ile Asn Ala Asp Tyr Leu Asn Leu Leu Lys Arg Ala Leu Asn Ile

85 90 95

aaa tta aca ctc cgg gaa tac gca gat cat caa aaa gca atg gac gcg 336

Lys Leu Thr Leu Arg Glu Tyr Ala Asp His Gln Lys Ala Met Asp Ala

100 105 110

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Leu Ala Glu Gly Glu Val Asp Ile Val Leu Ser His Leu Val Thr Ser

115 120 125

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Pro Pro Leu Asn Asn Asp Ile Ala Ala Thr Lys Pro Leu Ile Ile Thr

130 135 140

ttt ccg gcg ctg gta acc acc ctt cac gac tca atg cga ccg ctt acc 480

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145 150 155 160

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Ser Pro Lys Pro Val Asn Ile Ala Arg Val Ala Asn Tyr Pro Pro Asp

165 170 175

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180 185 190

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Asn Leu Tyr Gln Ala Leu Ala Ser Val Ser Ala Gly His Asn Asp Tyr

195 200 205

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Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Ser Met Ile Ser Arg Tyr Phe

210 215 220

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225 230 235 240

aat ttt ttc ttg acc aga aaa gaa tct gtc att ctt aat gaa gta ctc 768

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245 250 255

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Asn Arg Phe Val Asp Ala Leu Thr Asn Glu Val Arg Tyr Glu Val Ser

260 265 270

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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Asn Gly Ser Val Arg Gly Val Met Gly Asp Ile Leu Asn Ile Ile Thr

325 330 335

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Leu Gln Thr Gly Leu Asn Phe Ser Pro Ile Thr Val Ser His Asn Ile

340 345 350

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His Ala Gly Thr Gln Leu Ser Pro Gly Gly Trp Asp Ile Ile Pro Gly

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

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405 410 415

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Glu Leu His Ser Gln Leu Lys Glu Met Tyr Pro Glu Val Glu Trp Ile

420 425 430

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435 440 445

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Leu Asp Ala Leu Val Ala Thr Gln Leu Asn Ser Arg Tyr Met Ile Asp

450 455 460

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465 470 475 480

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Asn Ala Ser Leu Ser Phe Ala Phe Pro Arg Gly Glu Pro Glu Leu Lys

485 490 495

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500 505 510

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515 520 525

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530 535 540

tta tta gtt ggc agt agc ctt tta tgg gga ttc tac ctg tta cgc tca 1680

Leu Leu Val Gly Ser Ser Leu Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Leu Arg Ser

545 550 555 560

gtt cgt cgt cgt aaa gtc att cag ggt gat tta gaa aac caa ata tca 1728

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565 570 575

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Phe Arg Lys Ala Leu Ser Asp Ser Leu Pro Asn Pro Thr Tyr Val Val

580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

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Asp Ser Pro Phe Lys Asp Val Phe Ser Asn Ala His Glu Val Thr Ala

625 630 635 640

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645 650 655

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Asn Gly Ile Glu Lys Arg Cys Ile Asn His Trp His Thr Leu Cys Asn

660 665 670

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Leu Pro Ala Ser Asp Asn Ala Val Tyr Ile Cys Gly Trp Gln Asp Ile

675 680 685

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690 695 700

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Ala Ile Lys Ala Thr Val Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr Met Ser

705 710 715 720

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725 730 735

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Leu Ser Gly Ser Gly Leu Ser Lys Glu Gln Arg Val Glu Ala Ile Ser

740 745 750

ctt gcc tac gcc acc gga caa tca ctc ctc ggc tta att ggt gaa atc 2304

Leu Ala Tyr Ala Thr Gly Gln Ser Leu Leu Gly Leu Ile Gly Glu Ile

755 760 765

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Leu Asp Val Asp Lys Ile Glu Ser Gly Asn Tyr Gln Leu Gln Pro Gln

770 775 780

tgg gtc gat atc cct act tta gtc cag aac act tgt cac tct ttc ggt 2400

Trp Val Asp Ile Pro Thr Leu Val Gln Asn Thr Cys His Ser Phe Gly

785 790 795 800

gcg att gct gca agc aaa tcg atc gca tta agt tgc agc agt acg ttt 2448

Ala Ile Ala Ala Ser Lys Ser Ile Ala Leu Ser Cys Ser Ser Thr Phe

805 810 815

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820 825 830

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Leu Ser Asn Leu Leu Ser Asn Ala Leu Lys Phe Thr Thr Glu Gly Ala

835 840 845

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Val Lys Ile Thr Thr Ser Leu Gly His Ile Asp Asp Asn His Ala Val

850 855 860

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Ile Lys Met Thr Ile Met Asp Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gln Glu Glu

865 870 875 880

caa caa caa ctg ttt aaa cgc tac agc caa aca agt gca ggt cgt cag 2688

Gln Gln Gln Leu Phe Lys Arg Tyr Ser Gln Thr Ser Ala Gly Arg Gln

885 890 895

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900 905 910

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Asn Met Gln Gly Asp Leu Ser Leu Glu Ser His Pro Gly Ile Gly Thr

915 920 925

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Thr Phe Thr Ile Thr Ile Pro Val Glu Ile Ser Gln Gln Val Ala Thr

930 935 940

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945 950 955 960

ata tta atc gcg gat gat cat ccg acc aac agg cta tta ctc aaa cgc 2928

Ile Leu Ile Ala Asp Asp His Pro Thr Asn Arg Leu Leu Leu Lys Arg

965 970 975

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Gln Leu Asn Leu Leu Gly Tyr Asp Val Asp Glu Ala Thr Asp Gly Val

980 985 990

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Gln Ala Leu His Lys Val Ser Met Gln His Tyr Asp Leu Leu Ile Thr

995 1000 1005

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Asp Val Asn Met Pro Asn Met Asp Gly Phe Glu Leu Thr Arg Lys

1010 1015 1020

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Leu Arg Glu Gln Asn Ser Ser Leu Pro Ile Trp Gly Leu Thr Ala

1025 1030 1035

aac gca cag gct aac gaa cgt gaa aaa ggg tta agt tgc ggc atg 3159

Asn Ala Gln Ala Asn Glu Arg Glu Lys Gly Leu Ser Cys Gly Met

1040 1045 1050

aac tta tgt ttg ttc aaa ccg ttg acc ctg gat gta ctg aaa aca 3204

Asn Leu Cys Leu Phe Lys Pro Leu Thr Leu Asp Val Leu Lys Thr

1055 1060 1065

cat tta agt cag tta cac caa gtt gcg cat att gca cct cag tat 3249

His Leu Ser Gln Leu His Gln Val Ala His Ile Ala Pro Gln Tyr

1070 1075 1080

cgc cac ctt gat atc gaa gcc ctg aaa aat aat acg gcg aac gat 3294

Arg His Leu Asp Ile Glu Ala Leu Lys Asn Asn Thr Ala Asn Asp

1085 1090 1095

cta caa ctg atg cag gag att ctc atg act ttc cag cat gaa acg 3339

Leu Gln Leu Met Gln Glu Ile Leu Met Thr Phe Gln His Glu Thr

1100 1105 1110

cat aaa gat cta ccc gct gcg ttt caa gca cta gaa gct ggc gat 3384

His Lys Asp Leu Pro Ala Ala Phe Gln Ala Leu Glu Ala Gly Asp

1115 1120 1125

aac aga act ttc cat cag tgt att cat cgc atc cac ggt gcg gct 3429

Asn Arg Thr Phe His Gln Cys Ile His Arg Ile His Gly Ala Ala

1130 1135 1140

aac atc ctg aat ttg caa aag ttg att aat att agc cat cag tta 3474

Asn Ile Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ile Asn Ile Ser His Gln Leu

1145 1150 1155

gaa ata aca cct gtt tca gat gac agt aag cct gaa att ctt cag 3519

Glu Ile Thr Pro Val Ser Asp Asp Ser Lys Pro Glu Ile Leu Gln

1160 1165 1170

ttg ctg aac tct gta aaa gaa cac att gca gag ctg gac cag gag 3564

Leu Leu Asn Ser Val Lys Glu His Ile Ala Glu Leu Asp Gln Glu

1175 1180 1185

att gct gtt ttc tgt cag aaa aat gac taa 3594

Ile Ala Val Phe Cys Gln Lys Asn Asp

1190 1195

<210>26

<211>1197

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>26

Met Lys Phe Leu Pro Tyr Ile Phe Leu Leu Cys Cys Gly Leu Trp Ser

1 5 10 15

Thr Ile Ser Phe Ala Asp Glu Asp Tyr Ile Glu Tyr Arg Gly Ile Ser

20 25 30

Ser Asn Asn Arg Val Thr Leu Asp Pro Leu Arg Leu Ser Asn Lys Glu

35 40 45

Leu Arg Trp Leu Ala Ser Lys Lys Asn Leu Val Ile Ala Val His Lys

50 55 60

Ser Gln Thr Ala Thr Leu Leu His Thr Asp Ser Gln Gln Arg Val Arg

65 70 75 80

Gly Ile Asn Ala Asp Tyr Leu Asn Leu Leu Lys Arg Ala Leu Asn Ile

85 90 95

Lys Leu Thr Leu Arg Glu Tyr Ala Asp His Gln Lys Ala Met Asp Ala

100 105 110

Leu Ala Glu Gly Glu Val Asp Ile Val Leu Ser His Leu Val Thr Ser

115 120 125

Pro Pro Leu Asn Asn Asp Ile Ala Ala Thr Lys Pro Leu Ile Ile Thr

130 135 140

Phe Pro Ala Leu Val Thr Thr Leu His Asp Ser Met Arg Pro Leu Thr

145 150 155 160

Ser Pro Lys Pro Val Asn Ile Ala Arg Val Ala Asn Tyr Pro Pro Asp

165 170 175

Glu Val Ile His Gln Ser Phe Pro Lys Ala Thr Ile Ile Ser Phe Thr

180 185 190

Asn Leu Tyr Gln Ala Leu Ala Ser Val Ser Ala Gly His Asn Asp Tyr

195 200 205

Phe Ile Gly Ser Asn Ile Ile Thr Ser Ser Met Ile Ser Arg Tyr Phe

210 215 220

Thr His Ser Leu Asn Val Val Lys Tyr Tyr Asn Ser Pro Arg Gln Tyr

225 230 235 240

Asn Phe Phe Leu Thr Arg Lys Glu Ser Val Ile Leu Asn Glu Val Leu

245 250 255

Asn Arg Phe Val Asp Ala Leu Thr Asn Glu Val Arg Tyr Glu Val Ser

260 265 270

Gln Asn Trp Leu Asp Thr Gly Asn Leu Ala Phe Leu Asn Lys Pro Leu

275 280 285

Glu Leu Thr Glu His Glu Lys Gln Trp Ile Lys Gln His Pro Asn Leu

290 295 300

Lys Val Leu Glu Asn Pro Tyr Ser Pro Pro Tyr Ser Met Thr Asp Glu

305 310 315 320

Asn Gly Ser Val Arg Gly Val Met Gly Asp Ile Leu Asn Ile Ile Thr

325 330 335

Leu Gln Thr Gly Leu Asn Phe Ser Pro Ile Thr Val Ser His Asn Ile

340 345 350

His Ala Gly Thr Gln Leu Ser Pro Gly Gly Trp Asp Ile Ile Pro Gly

355 360 365

Ala Ile Tyr Ser Glu Asp Arg Glu Asn Asn Val Leu Phe Ala Glu Ala

370 375 380

Phe Ile Thr Thr Pro Tyr Val Phe Val Met Gln Lys Ala Pro Asp Ser

385 390 395 400

Glu Gln Thr Leu Lys Lys Gly Met Lys Val Ala Ile Pro Tyr Tyr Tyr

405 410 415

Glu Leu His Ser Gln Leu Lys Glu Met Tyr Pro Glu Val Glu Trp Ile

420 425 430

Gln Val Asp Asn Ala Ser Ala Ala Phe His Lys Val Lys Glu Gly Glu

435 440 445

Leu Asp Ala Leu Val Ala Thr Gln Leu Asn Ser Arg Tyr Met Ile Asp

450 455 460

His Tyr Tyr Pro Asn Glu Leu Tyr His Phe Leu Ile Pro Gly Val Pro

465 470 475 480

Asn Ala Ser Leu Ser Phe Ala Phe Pro Arg Gly Glu Pro Glu Leu Lys

485 490 495

Asp Ile Ile Asn Lys Ala Leu Asn Ala Ile Pro Pro Ser Glu Val Leu

500 505 510

Arg Leu Thr Glu Lys Trp Ile Lys Met Pro Asn Val Thr Ile Asp Thr

515 520 525

Trp Asp Leu Tyr Ser Glu Gln Phe Tyr Ile Val Thr Thr Leu Ser Val

530 535 540

Leu Leu Val Gly Ser Ser Leu Leu Trp Gly Phe Tyr Leu Leu Arg Ser

545 550 555 560

Val Arg Arg Arg Lys Val Ile Gln Gly Asp Leu Glu Asn Gln Ile Ser

565 570 575

Phe Arg Lys Ala Leu Ser Asp Ser Leu Pro Asn Pro Thr Tyr Val Val

580 585 590

Asn Trp Gln Gly Asn Val Ile Ser His Asn Ser Ala Phe Glu His Tyr

595 600 605

Phe Thr Ala Asp Tyr Tyr Lys Asn Ala Met Leu Pro Leu Glu Asn Ser

610 615 620

Asp Ser Pro Phe Lys Asp Val Phe Ser Asn Ala His Glu Val Thr Ala

625 630 635 640

Glu Thr Lys Glu Asn Arg Thr Ile Tyr Thr Gln Val Phe Glu Ile Asp

645 650 655

Asn Gly Ile Glu Lys Arg Cys Ile Asn His Trp His Thr Leu Cys Asn

660 665 670

Leu Pro Ala Ser Asp Asn Ala Val Tyr Ile Cys Gly Trp Gln Asp Ile

675 680 685

Thr Glu Thr Arg Asp Leu Ile Asn Ala Leu Glu Val Glu Lys Asn Lys

690 695 700

Ala Ile Lys Ala Thr Val Ala Lys Ser Gln Phe Leu Ala Thr Met Ser

705 710 715 720

His Glu Ile Arg Thr Pro Ile Ser Ser Ile Met Gly Phe Leu Glu Leu

725 730 735

Leu Ser Gly Ser Gly Leu Ser Lys Glu Gln Arg Val Glu Ala Ile Ser

740 745 750

Leu Ala Tyr Ala Thr Gly Gln Ser Leu Leu Gly Leu Ile Gly Glu Ile

755 760 765

Leu Asp Val Asp Lys Ile Glu Ser Gly Asn Tyr Gln Leu Gln Pro Gln

770 775 780

Trp Val Asp Ile Pro Thr Leu Val Gln Asn Thr Cys His Ser Phe Gly

785 790 795 800

Ala Ile Ala Ala Ser Lys Ser Ile Ala Leu Ser Cys Ser Ser Thr Phe

805 810 815

Pro Glu His Tyr Leu Val Lys Ile Asp Pro Gln Ala Phe Lys Gln Val

820 825 830

Leu Ser Asn Leu Leu Ser Asn Ala Leu Lys Phe Thr Thr Glu Gly Ala

835 840 845

Val Lys Ile Thr Thr Ser Leu Gly His Ile Asp Asp Asn His Ala Val

850 855 860

Ile Lys Met Thr Ile Met Asp Ser Gly Ser Gly Leu Ser Gln Glu Glu

865 870 875 880

Gln Gln Gln Leu Phe Lys Arg Tyr Ser Gln Thr Ser Ala Gly Arg Gln

885 890 895

Gln Thr Gly Ser Gly Leu Gly Leu Met Ile Cys Lys Glu Leu Ile Lys

900 905 910

Asn Met Gln Gly Asp Leu Ser Leu Glu Ser His Pro Gly Ile Gly Thr

915 920 925

Thr Phe Thr Ile Thr Ile Pro Val Glu Ile Ser Gln Gln Val Ala Thr

930 935 940

Val Glu Ala Lys Ala Glu Gln Pro Ile Thr Leu Pro Glu Lys Leu Ser

945 950 955 960

Ile Leu Ile Ala Asp Asp His Pro Thr Asn Arg Leu Leu Leu Lys Arg

965 970 975

Gln Leu Asn Leu Leu Gly Tyr Asp Val Asp Glu Ala Thr Asp Gly Val

980 985 990

Gln Ala Leu His Lys Val Ser Met Gln His Tyr Asp Leu Leu Ile Thr

995 1000 1005

Asp Val Asn Met Pro Asn Met Asp Gly Phe Glu Leu Thr Arg Lys

1010 1015 1020

Leu Arg Glu Gln Asn Ser Ser Leu Pro Ile Trp Gly Leu Thr Ala

1025 1030 1035

Asn Ala Gln Ala Asn Glu Arg Glu Lys Gly Leu Ser Cys Gly Met

1040 1045 1050

Asn Leu Cys Leu Phe Lys Pro Leu Thr Leu Asp Val Leu Lys Thr

1055 1060 1065

His Leu Ser Gln Leu His Gln Val Ala His Ile Ala Pro Gln Tyr

1070 1075 1080

Arg His Leu Asp Ile Glu Ala Leu Lys Asn Asn Thr Ala Asn Asp

1085 1090 1095

Leu Gln Leu Met Gln Glu Ile Leu Met Thr Phe Gln His Glu Thr

1100 1105 1110

His Lys Asp Leu Pro Ala Ala Phe Gln Ala Leu Glu Ala Gly Asp

1115 1120 1125

Asn Arg Thr Phe His Gln Cys Ile His Arg Ile His Gly Ala Ala

1130 1135 1140

Asn Ile Leu Asn Leu Gln Lys Leu Ile Asn Ile Ser His Gln Leu

1145 1150 1155

Glu Ile Thr Pro Val Ser Asp Asp Ser Lys Pro Glu Ile Leu Gln

1160 1165 1170

Leu Leu Asn Ser Val Lys Glu His Ile Ala Glu Leu Asp Gln Glu

1175 1180 1185

Ile Ala Val Phe Cys Gln Lys Asn Asp

1190 1195

<210>27

<211>528

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(528)

<400>27

atg att ttt ctc atg acg aaa gat tct ttt ctt tta cag ggc ttt tgg 48

Met Ile Phe Leu Met Thr Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gln Gly Phe Trp

1 5 10 15

cag ttg aaa gat aat cac gaa atg ata aaa atc aat tcc ctg tca gag 96

Gln Leu Lys Asp Asn His Glu Met Ile Lys Ile Asn Ser Leu Ser Glu

20 25 30

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35 40 45

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His Asn His Ile Leu Asp Glu Glu Ala Ile Lys Phe Leu Glu Lys Leu

50 55 60

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Asp Ala Glu Arg Ile Ile Val Leu Ala Pro Tyr His Ile Ser Lys Leu

65 70 75 80

aaa gct aaa gcg cct att tat ttt gtt agc cgc aaa gaa agt atc aaa 288

Lys Ala Lys Ala Pro Ile Tyr Phe Val Ser Arg Lys Glu Ser Ile Lys

85 90 95

aat ctt ctt gag att act tat ggt aaa cac ttg ccc cat aag aat tca 336

Asn Leu Leu Glu Ile Thr Tyr Gly Lys His Leu Pro His Lys Asn Ser

100 105 110

caa tta tgt ttt tca cat aat cag ttc aaa att atg caa ctg att ctg 384

Gln Leu Cys Phe Ser His Asn Gln Phe Lys Ile Met Gln Leu Ile Leu

115 120 125

aaa aat aaa aat gaa agc aat atc acg tcg acg ctc aat att tcg caa 432

Lys Asn Lys Asn Glu Ser Asn Ile Thr Ser Thr Leu Asn Ile Ser Gln

130 135 140

caa aca tta aag att cag aaa ttc aac att atg tac aag ctg aaa cta 480

Gln Thr Leu Lys Ile Gln Lys Phe Asn Ile Met Tyr Lys Leu Lys Leu

145 150 155 160

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Arg Arg Met Ser Asp Ile Val Thr Leu Gly Ile Thr Ser Tyr Phe

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<212>PRT

<213>大肠杆菌

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Met Ile Phe Leu Met Thr Lys Asp Ser Phe Leu Leu Gln Gly Phe Trp

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Gln Leu Lys Asp Asn His Glu Met Ile Lys Ile Asn Ser Leu Ser Glu

20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

Lys Ala Lys Ala Pro Ile Tyr Phe Val Ser Arg Lys Glu Ser Ile Lys

85 90 95

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100 105 110

Gln Leu Cys Phe Ser His Asn Gln Phe Lys Ile Met Gln Leu Ile Leu

115 120 125

Lys Asn Lys Asn Glu Ser Asn Ile Thr Ser Thr Leu Asn Ile Ser Gln

130 135 140

Gln Thr Leu Lys Ile Gln Lys Phe Asn Ile Met Tyr Lys Leu Lys Leu

145 150 155 160

Arg Arg Met Ser Asp Ile Val Thr Leu Gly Ile Thr Ser Tyr Phe

165 170 175

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<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

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<400>29

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1 5 10 15

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<210>30

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<212>PRT

<213>大肠杆菌

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Gly Met Asn Thr Gly Asn Thr Met Asn Ala Leu Ala Ile

245 250

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<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

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1 5 10 15

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20 25 30

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180 185 190

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195 200 205

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450 455 460

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530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

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Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

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610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

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675 680 685

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<210>33

<211>2142

<212>DNA

<213>大肠杆菌

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65 70 75 80

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85 90 95

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115 120 125

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Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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325 330 335

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Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365

ctg gcg gcg tta tcg cag gct tcg ctg atc cac att aaa ggc gag tat 1152

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380

gac gaa gag gcc ttt aac gaa gcc ttt atg atg cat acc acc acc tcg 1200

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

ccc agt tat ccc att gtt gct tcg gtt gag acg gcg gcg gcg atg ctg 1248

Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

405 410 415

cgt ggt aat ccg ggc aaa cgg ctg att aac cgt tca gta gaa cga gct 1296

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430

ctg cat ttt cgc aaa gag gtc cag cgg ctg cgg gaa gag tct gac ggt 1344

Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445

tgg ttt ttc gat atc tgg caa ccg ccg cag gtg gat gaa gcc gaa tgc 1392

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460

tgg ccc gtt gcg cct ggc gaa cag tgg cac ggc ttt aac gat gcg gat 1440

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465 470 475 480

gcc gat cat atg ttt ctc gat ccg gtt aaa gtc act att ttg aca ccg 1488

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

ggg atg gac gag cag ggc aat atg agc gag gag ggg atc ccg gcg gcg 1536

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

ctg gta gca aaa ttc ctc gac gaa cgt ggg atc gta gta gag aaa acc 1584

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

ggc cct tat aac ctg ctg ttt ctc ttt agt att ggc atc gat aaa acc 1632

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

aaa gca atg gga tta ttg cgt ggg ttg acg gaa ttc aaa cgc tct tac 1680

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545 550 555 560

gat ctc aac ctg cgg atc aaa aat atg cta ccc gat ctc tat gca gaa 1728

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575

gat ccc gat ttc tac cgc aat atg cgt att cag gat ctg gca caa ggg 1776

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590

atc cat aag ctg att cgt aaa cac gat ctt ccc ggt ttg atg ttg cgg 1824

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 600 605

gca ttc gat act ttg ccg gag atg atc atg acg cca cat cag gca tgg 1872

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620

caa cga caa att aaa ggc gaa gta gaa acc att gcg ctg gaa caa ctg 1920

Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

gtc ggt aga gta tcg gca aat atg atc ctg cct tat cca ccg ggc gta 1968

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

ccg ctg ttg atg cct gga gaa atg ctg acc aaa gag agc cgc aca gta 2016

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670

ctc gat ttt cta ctg atg ctt tgt tcc gtc ggg caa cat tac ccc ggt 2064

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685

ttt gaa acg gat att cac ggc gcg aaa cag gac gaa gac ggc gtt tac 2112

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700

cgc gta cga gtc cta aaa atg gcg gga taa 2142

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705 710

<210>34

<211>713

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>34

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1 5 10 15

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

20 25 30

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

35 40 45

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

50 55 60

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

85 90 95

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

115 120 125

Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

165 170 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

195 200 205

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

245 250 255

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

275 280 285

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

340 345 350

Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

355 360 365

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

370 375 380

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

405 410 415

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

420 425 430

Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465 470 475 480

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

500 505 510

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

565 570 575

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

595 600 605

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

610 615 620

Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625 630 635 640

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

660 665 670

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

690 695 700

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705 710

<210>35

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于cadA的5’-引物

<400>35

tttgctttct tctttcaata ccttaacggt atagcgtgaa gcctgctttt ttat 54

<210>36

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于cadA的3’-引物

<400>36

agatatgact atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacgct caagttagta taaa 54

<210>37

<211>54

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于ldc的5’-引物

<400>37

ggaggaacac atgaacatca ttgccattat gggacctgaa gcctgctttt ttat 54

<210>38

<211>53

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于ldc的3’-引物

<400>38

cgccattttt aggactcgta cgcggtaaac gccgtccgtc aagttagtat aaa 53

Claims

1. 用于产生L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养肠杆菌科的细菌，所述细菌具有产生L-氨基酸的能力，并且经修饰而将选自下组的基因的表达量增加：evgA基因、gadE基因或ydeO基因，和它们的组合，其中所述基因编码EvgAS双组分体系调节子中涉及的转录因子；和从培养基中收集L-氨基酸。

2. 根据权利要求1的方法，其中通过增加每种基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达调节序列来增加至少一种基因的表达。

3. 根据权利要求1或2的方法，其中通过修饰细菌以使编码传感激酶的evgS基因的表达增加来增加至少一种基因的表达。

4. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述evgA基因是选自下组的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：23的核苷酸序列的DNA，和

(b)在严紧条件下，与SEQ ID NO.23的核苷酸序列的互补核苷酸序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录因子活性的蛋白质。

5. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述gadE基因是选自下组的DNA：

(c)包含SEQ ID NO：27的核苷酸序列的DNA，和

(d)在严紧条件下，与SEQ ID NO.27的核苷酸序列的互补核苷酸序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录因子活性的蛋白质。

6. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述ydeO基因是选自下组的DNA：

(e)包含SEQ ID NO：29的核苷酸序列的DNA，和

(f)在严紧条件下，与SEQ ID NO.29的核苷酸序列的互补核苷酸序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有转录因子活性的蛋白质。

7. 根据权利要求1-3任一项的方法，其中所述evgS基因是选自下组的DNA：

(g)包含SEQ ID NO：25的核苷酸序列的DNA，和

(h)在严紧条件下，与SEQ ID NO.25的核苷酸序列的互补核苷酸序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有磷酸转移活性的蛋白质。

8. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述evgA基因编码选自下组的蛋白质：

(A)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的蛋白质，

(B)包含SEQ ID NO：24的氨基酸序列的蛋白质，但是其包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有转录因子活性。

9. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述gadE基因编码选自下组的蛋白质：

(C)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的蛋白质，

(D)包含SEQ ID NO：28的氨基酸序列的蛋白质，但是其包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有转录因子活性。

10. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述ydeO基因编码选自下组的蛋白质：

(E)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白质，

(F)包含SEQ ID NO：30的氨基酸序列的蛋白质，但是其包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有转录因子活性。

11. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述evgS基因编码选自下组的蛋白质：

(G)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的蛋白质，

(H)包含SEQ ID NO：26的氨基酸序列的蛋白质，但是其包括一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位，并且所述蛋白质具有磷酸转移活性。

12. 根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述细菌属于肠杆菌科并且选自下组：埃希氏菌属、肠杆菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属和沙雷氏菌属。

13. 根据权利要求1-12中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸和它们的组合。