CN101273139A - 产生l-氨基酸的细菌和用于产生l-氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

提供用于产生L－氨基酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养具有产生L－氨基酸的能力并且经修饰而将甘露糖PTS活性增强的肠杆菌科的微生物，在所述培养基或细胞中积累L－氨基酸，和从所述培养基或细胞中收集L－氨基酸。

Description

产生L-氨基酸的细菌和用于产生L-氨基酸的方法

技术领域

本发明涉及使用微生物产生L-氨基酸的方法，更具体地，涉及用于产生L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-谷氨酸等的方法。L-赖氨酸和L-苏氨酸通常用作动物饲料添加剂、保健食品成分、氨基酸浸剂(infusion)等，且L-谷氨酸通常用作调味品。因此，这些是工业上有用的L-氨基酸。

背景技术

在工业上采用发酵方法，使用短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)或埃希氏菌属(Escherichia)等的微生物生产L-氨基酸(EP0857784、0999267、1170358、JP11-192088A、WO00/53726、WO96/17930、WO03/04674)。野生型微生物、所述菌株的人工突变体和以通过重组DNA技术而将L-氨基酸生物合成酶的活性增强的方式修饰的微生物通常用于L-氨基酸的产生。

用于增强各种菌株产生L-氨基酸的能力的已知方法包括，修饰L-氨基酸的摄取(uptake)或输出(export)。例如，为了修饰摄取，通过缺失或减少细胞中的L-氨基酸摄取来增强产生L-氨基酸的能力。例如，一种方法是通过缺失gluABCD操纵子或该操纵子的一部分等来缺失或减少L-谷氨酸的摄取(EP1038970)。

用于修饰L-氨基酸输出的方法之一是缺失或减少L-氨基酸生物合成中间物的输出，而另一种方法是加强L-氨基酸的输出。对于前者，如果目标氨基酸是L-谷氨酸，已知方法是通过突变或破坏α-酮戊二酸通透酶基因，来减少L-谷氨酸生物合成中的中间物α-酮戊二酸的输出(WO01/005959)。

为了缺失或减少L-氨基酸生物合成中间物的输出，已经报道了过量表达L-氨基酸输出的方法，例如，使用将L-赖氨酸或L-精氨酸输出基因(LysE)(Journal of Molecular Microbiology Biotechnology(J Mol Microbiol Biotechnol)1999 Nov；1(2)：327-36)的表达增强的棒杆菌属微生物的细菌菌株来产生L-赖氨酸(WO97/23597)或L-精氨酸。另外，报道了使用埃希氏菌属的细菌产生L-氨基酸的方法，在所述细菌中表达rhtA、B和C基因(US6,303,348)或yfiK、yahN基因等(EP 1013765)。

除了如上所述修饰L-氨基酸生物合成途径和修饰L-氨基酸的摄取和输出，改进产生L-氨基酸能力的方法的其它实例是修饰摄取糖的能力。例如，磷酸烯醇丙酮酸：糖磷酸转移酶系统(在下文中也称作PTS：磷酸转移酶)是公知的摄取糖的转运体。另外，将PTS归类为非底物依赖性共有系统(commonsystem)EI(由ptsI编码)、HPr(由ptsH编码)，或底物特异性组分EII。葡萄糖特异性EII由ptsG和crr编码，其中crr基因与ptsH和ptsI一起是操纵子的一部分。用于产生L-氨基酸的一种已知方法使用将ptsG基因增强的埃希氏菌属(WO03/04670)，而另一种方法使用将ptsH、ptsI和crr基因增强的埃希氏菌属(WO03/04674)。

除了上述的葡萄糖PTS，已知manXYZ基因编码甘露糖特异性磷酸转移酶(PTS)(Molecular Microbiology(Molecular Microbiology)1998 27(2)，369-380)，但是尚未报道将编码甘露糖PTS的基因用于L-氨基酸的产生。

发明概述

本发明的目的是提供能够有效产生L-氨基酸的细菌菌株，并且提供使用所述细菌菌株产生L-氨基酸的方法。

为了解决上述问题，已经发现使用经修饰而增加甘露糖PTS活性的属于肠杆菌科(family Enterobacteriaceae)的微生物能够有效地产生L-氨基酸。

即，本发明如下：

本发明的目的是提供产生L-氨基酸的方法，所述方法包括：在培养基中培养肠杆菌科的微生物，所述微生物具有产生L-氨基酸的能力并且经修饰以使甘露糖PTS活性增强；和从所述培养基或微生物中收集L-氨基酸。

本发明的目的是提供上述方法，其中通过增加编码甘露糖PTS的manXYZ基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达调节序列，或它们的组合对所述微生物进行修饰以增强该基因的表达。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述manXYZ基因编码选自下组的蛋白质：

(A)选自下组的蛋白质：SEQ ID Nos.2、3、4的氨基酸序列，和它们的组合，

(B)选自下组的蛋白质：SEQ ID Nos.2、3、4的氨基酸序列和它们的组合，其中所述蛋白质包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有甘露糖PTS活性。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述manXYZ基因是选自下组的DNA：

(a)包含SEQ ID No.1的核苷酸号72至2767的核苷酸序列的DNA，

(b)在严紧条件下与SEQ ID No.1中核苷酸号72至2767的核苷酸序列的互补序列，或与能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有甘露糖PTS活性的蛋白质。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述微生物是埃希氏菌属或泛菌属(Pantoea)的细菌。

本发明的目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸和它们的组合。

附图简述

图1显示质粒pMW118-attL-Tc-attR的构建。

图2显示质粒pMW118-attL-Cm-attR的构建。

图3显示质粒pMW-intxis-ts的构建。

优选实施方式详述

在下文中，将对本发明进行详细说明。

<1>本发明的微生物

本发明的微生物是肠杆菌科的微生物，其具有产生L-氨基酸的能力，并且经修饰以增强甘露糖PTS活性。短语“产生L-氨基酸的能力”的意思是当在培养基中培养本发明的微生物时，在培养基或所述微生物的细胞中产生和引起L-氨基酸积累的能力。本发明的微生物可具有产生多种L-氨基酸的能力。所述微生物天然地具有产生L-氨基酸的能力，或可通过诱变或重组DNA技术进行修饰以赋予产生L-氨基酸的能力，例如下文所述的那些。

L-氨基酸的类型无具体限制。L-氨基酸的实例包括：碱性L-氨基酸例如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸(L-citrulline)；脂肪族L-氨基酸例如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羟基L-氨基酸例如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状L-氨基酸例如L-脯氨酸；芳族L-氨基酸例如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫L-氨基酸例如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；和酸性L-氨基酸例如L-谷氨酸、L-天冬氨酸；酸性L-氨基酸的酰胺例如L-谷氨酰胺、L-天冬酰胺等。本发明的微生物可具有产生两种或更多种氨基酸的能力。

<1-1>赋予产生L-氨基酸的能力

以下实例包括对赋予产生L-氨基酸能力的方法的描述，以及能够用于本发明的被赋予产生L-氨基酸能力的微生物的实例。本发明的微生物不限于这些，只要它们具有产生L-氨基酸的能力，则可以是任何微生物。

对用于本发明的微生物无具体限制，只要其属于肠杆菌科，例如埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、泛菌属、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)、摩根氏菌属(Morganella)等，并且其具有产生L-氨基酸的能力。具体地，可以使用属于如NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中分类的肠杆菌科的任何微生物(http://www.genome.ad.jp/dbget-bin/get_htext？Organisms+-e+L+A+-s+F+-f+F+A2_A#L2)。

作为能够被修饰的肠杆菌科的亲本菌株，特别期望使用属于埃希氏菌属、肠杆菌属或泛菌属的细菌。

对于用来获得本发明的细菌的埃希氏菌属细菌的亲本菌株不进行具体限制，但可以使用Neidhardt等所列的菌株(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichia coliand Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington，D.C.，1029表1)。一个实例是大肠杆菌。大肠杆菌的具体实例是大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等，其是源自K12的野生型菌株的原型(prototype)。

这些可以从例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection(地址：RO.Box 1549 Manassas，VA 20108，USA))获得。它们可以通过使用给予每个菌株的登录号来获得(参见http:/www.atcc.org)。所述登录号对应于每个细菌菌株，并且列于美国典型培养物保藏中心的目录。

肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。泛菌属细菌的实例是Pantoea ananatis。在近几年中，基于16S rRNA核苷酸序列分析，有时将成团肠杆菌重分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis和斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。对于本发明，可以使用归类在肠杆菌科中的任何细菌，无论属于肠杆菌属或泛菌属。菌株Pantoea ananatis AJ13355(FERM BP-6614)、AJ13356(FERMBP-6615)、AJ13601(FERM BP-7207)或它们的任何衍生物可用于通过基因工程方法培育Pantoea ananatis。在分离时，将这些菌株鉴定并且保藏为成团肠杆菌。如上所述，通过使用16S rRNA核苷酸序列的分析，已将这些细菌重分类为Pantoea ananatis。对于本发明，可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的任何细菌，只要所述细菌归类于肠杆菌科中。

下文将描述用于将产生L-氨基酸的能力赋予属于肠杆菌科的微生物的方法。

为了赋予产生L-氨基酸的能力，可以获得营养缺陷突变体、类似物抗性菌株或代谢调节突变体，或可以产生将L-氨基酸生物合成酶的表达增强的重组菌株。也可使用在棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或埃希氏菌属细菌的培育中常规使用的方法(参见“Amino Acid Fermentation”，Gakkai ShuppanCenter(Ltd.)，1st Edition，published May 30，1986，pp.77-100)。在本文中，在产生L-氨基酸的细菌的培育中，可赋予一种或多种性质，例如营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变。也可使用将一种或多种L-氨基酸生物合成酶的表达的增强。另外，可以将赋予性质与增强生物合成酶的活性组合进行，所述性质例如营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变。

具有产生L-氨基酸的能力的营养缺陷突变体菌株、L-氨基酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体菌株可如下获得：对亲本或野生型菌株施以常规突变处理，例如用X-射线或UV照射处理，或用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理；其后选择显示营养缺陷突变、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有产生L-氨基酸的能力的那些菌株。

L-赖氨酸类似物抗性菌株或代谢调节突变体的实例包括但不限于，大肠杆菌AJ11442菌株(FERM BP-1543、NRRL B-12185、JP56-18596A和美国专利No.4,346,170)、大肠杆菌VL611菌株(EP1016710A)等。也可以使用大肠杆菌WC196菌株(WO96/17930)作为产生L-赖氨酸的细菌。通过将AEC(S-(2-氨基乙基)-半胱氨酸)抗性赋予源自大肠杆菌K-12的W3110菌株来培育WC196菌株。将这种菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并且在1994年12月6日以登录号FERM P-14690保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(theNational Institute of Bioscience and Human-Technology of the Agency ofIndustrial Science and Technology)(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary，NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)；Chuo 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，并且根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)在1995年9月29日转为国际保藏，并给予登录号FERMBP-5252。

也可通过增加L-赖氨酸生物合成酶活性来构建产生L-赖氨酸的细菌。编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的实例是二氢吡啶二羧酸合酶基因(dapA)(EP0733710B)、天冬氨酸激酶基因(lysC)(EP 0733710、US5,932,453)、二氢吡啶二羧酸还原酶基因(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶基因(ddh)(WO96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(JP60-87788A)、天冬氨酸氨基转移酶基因(aspC)(JP6-102028A)、二氨基庚二酸差向异构酶基因(dapF)(WO00/56858)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)(WO00/61723)和二氨基庚二酸途径酶的其它基因；以及高乌头酸水合酶基因(JP2000-157276)和氨基己二酸途径酶的其它基因。这些基因的缩写在各自名称之后的括号内给出。

此外，已知野生型二氢吡啶二羧酸合酶(DDPS)和天冬氨酸激酶(AK)受到L-赖氨酸反馈抑制的阻抑；因此，当使用dapA和lysC时，优选分别使用编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的二氢吡啶二羧酸合酶和天冬氨酸激酶的突变基因(EP 0733710、US5,932,453)。

编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的突变二氢吡啶二羧酸合酶的DNA的实例包括编码具有以下氨基酸序列的DDPS的DNA，在所述氨基酸序列中用酪氨酸取代第118位的组氨酸残基(U.S.5,661,012和6,040,160)。另外，编码对L-赖氨酸反馈抑制有抗性的突变AK的DNA的实例包括编码具有以下氨基酸序列的AK的DNA，在所述氨基酸序列中用异亮氨酸取代352-苏氨酸残基(U.S.5,661,012和6,040,160)。这些突变DNA能够通过使用PCR的定点诱变等获得。

以下是通过将编码L-赖氨酸生物合成酶的基因引入宿主中来赋予产生L-赖氨酸的能力的实例。即，通过将编码L-赖氨酸生物合成基因的基因片段与在用于产生L-赖氨酸的宿主微生物中发挥功能的载体连接来制备重组DNA，所述载体优选是多拷贝型载体，并且使用这种重组DNA来转化所述宿主。通过所述转化，在宿主细胞中编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的拷贝数增加，使表达增强并且从而增加酶活性。

不具体指定编码L-赖氨酸生物合成酶的基因，只要它们能够在宿主微生物中表达。实例包括源自大肠杆菌的基因，和源自棒状杆菌型细菌的基因。由于大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)的全基因组序列已经确定，所以能够基于这些基因的核苷酸序列合成引物，并且使用PCR方法获得这些基因，在所述PCR方法中将微生物(例如大肠杆菌K12)的染色体DNA等用作模板。

为了克隆这些基因，可以使用在肠杆菌科中自主复制的质粒。实例包括pBR322、pTWV228(Takara Bio Inc.)、pMW119(Nippon Gene Co.，Ltd.)、pUC19、pSTV29(Takara Bio Inc.)、RSF1010(Gene vol.75(2)，pp.271-288，1989)等。此外，也可使用噬菌体DNA的载体。

为了将靶基因连接至上述载体，将载体用限制酶消化，所述限制酶与含有靶基因的DNA片段的末端匹配。通常用连接酶例如T4DNA连接酶进行连接。靶基因可分别存在于不同的载体上，或存在于相同的载体上。可以使用本领域技术人员已知的常规方法来消化和连接DNA，以及制备染色体DNA、进行PCR、制备质粒DNA、转化、确定用作引物的寡核苷酸等。这些方法在Sambrook，J.，and Russell，D.W.Molecular Cloning A Laboratory Manual/ThirdEdition.New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等中描述。可以使用达到充分转化效率的任何方法将如上所述制备的重组DNA引入微生物。实例包括电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43，197(1997))。使用电穿孔制备的质粒的实例是pCABD2，所述质粒含有dapA、dapB和LysC基因(WO01/53459)。

也可通过将靶基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA来实现增强编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达。可通过使用以多拷贝存在于所述染色体DNA上的序列作为同源重组中的靶来将靶基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA中。对这种以使用同源重组的基因取代为基础位点特异性地引入突变已有描述。已经描述使用线性DNA或含有温度敏感复制起点的质粒的方法(美国专利6,303,383和5,616,480)。可以使用存在于可转座元件末端的反向重复序列和重复DNA作为以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。可将L-赖氨酸生物合成基因与天然存在于染色体上的基因串联(in tandem)连接，或可将其引入染色体上的非必需区或引入如果缺失将使L-赖氨酸产率得到改进的基因区。

此外，如US5,595,889中披露，还可将靶基因定位于转座子上，其后转移所述转座子以将多拷贝引入染色体DNA。用任一方法，将转化体中靶基因的拷贝数增加，从而使L-赖氨酸生物合成的酶活性增加。

除了上述基因扩增外，可通过用较强的表达调节序列取代靶基因的表达调节序列(如启动子等)来实现L-赖氨酸生物合成酶活性的增加(参见JP 1-215280A)。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子和tet启动子都是公知的强启动子。使用这些启动子取代使靶基因的表达增加，由此增强酶活性。强启动子的实例和用于评估启动子强度的方法的实例在Goldstein等的文章等中描述(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)。

也可通过修饰在靶基因表达的调节中涉及的元件来实现L-赖氨酸生物合成酶活性的增加，所述元件例如操纵基因或阻抑物(repressor)(Hamilton et al，；J Bacteriol.1989 Sep；171(9)：4617-22)。如WO 00/18935中披露，能够在靶基因启动子的-35、-10区中引入几个碱基的取代以将其修饰和增强。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中，特别在起始密码子的紧邻上游序列中取代几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有强烈的影响。能够通过启动子探针载体和基因分析软件(例如GENETYX)等确定靶基因启动子的表达调节区等。例如，能够以与上述使用温度敏感质粒的基因取代相同的方式进行表达调节序列的取代。也可使用Red-驱动整合方法(Red-drivenintegration method)(WO2005/010175)。

此外，在本发明的产生L-赖氨酸的细菌中，可将下述酶的活性减少或缺失：催化从L-赖氨酸生物合成途径分支的L-赖氨酸之外的化合物产生的酶，或对L-赖氨酸的产生具有负效应的酶。这些酶包括高丝氨酸脱氢酶(thrA)、赖氨酸脱羧酶(cadA、lysC)和苹果酸酶(sfcA、b2463)。在WO 95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等中提供所述酶活性减少或缺陷的菌株。

为了在细胞中减少或缺失所述酶活性，可使用常规和已知的方法，对编码上述酶的基因进行诱变。这可以通过如下方法实现：例如，使用遗传重组来缺失在染色体上编码酶的基因，或修饰启动子或Shine-Dalgarno(SD)序列等表达调节序列。这也可通过如下方法实现：在染色体上编码酶的区中引入氨基酸取代(错义突变)或终止密码子(无义突变)，引入添加或缺失1-2个碱基的移码突变，或缺失基因的部分或完整区(Journal of Biological Chemistry272：8611-8617(1997)；Journal of Antimicrobial Chemotherapy 200 46，793-796；Biotechnol Prog 1999，15，58-64；J.Biological Chemistry vol 272 N0.13pp8611-8617)。同样，可通过如下方法将酶活性减少或缺失：构建缺失编码区的编码突变酶的基因，其后通过同源重组等用这种基因取代染色体上的野生型基因，或将转座子或IS元件引入所述基因。

可以使用以下方法通过遗传重组来引入使上述酶活性减少或缺失的突变。将含有靶基因的分离的DNA突变，以使所得突变基因不产生正常发挥功能的酶。随后，使用含有所述基因的DNA，将这种突变基因转化至属于肠杆菌科的微生物中，并且产生突变型基因与染色体上基因的重组。对于使用这种同源重组的基因取代，存在使用线性DNA的方法，例如称为“Red-驱动整合”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)，或将Red-驱动整合方法与λ噬菌体切除系统(λphage excisive system)组合的方法(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3，Interactions between integrase andexcisionase in the phageλexcisive nucleoprotein complex.Cho EH，Gumport RI，Gardner JF)(参见WO2005/010175)等；还存在使用含有温度敏感复制起点的质粒的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645、美国专利No.6,303,383或5,616,480)。这种如上所述使用同源重组通过基因取代位点特异性地引入突变也可使用在宿主中不具有复制能力的质粒进行。

上述用于增加L-赖氨酸生物合成中涉及的酶活性的方法和用于减少酶活性的方法同样可以用来培育其它产生L-氨基酸的细菌。以下将说明用来培育其它L-氨基酸细菌的方法。

作为本发明中使用的产生L-谷氨酸的细菌，存在例如属于肠杆菌科的微生物，所述微生物经修饰而将编码L-谷氨酸生物合成中涉及的酶的基因的表达增加。L-谷氨酸生物合成中涉及的酶包括谷氨酸脱氢酶(gdh)、谷氨酰胺合成酶(gltAB)、谷氨酸合酶(glnA)、异柠檬酸脱氢酶(icd)、乌头酸水合酶(acn)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pycA)、丙酮酸脱氢酶(pdhA)、丙酮酸激酶(pykA)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(pps)、烯醇化酶(eno)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、果糖二磷酸醛缩酶(fba)、磷酸果糖激酶(pfk)、葡糖磷酸异构酶(gpi)等。在这些酶之中，柠檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、谷氨酸脱氢酶和它们的组合是优选的，并且使用全部三种是更优选的。

使用上述方法修饰而将柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的属于肠杆菌科的微生物的实例在美国专利Nos.6,197,559和6,331,419、EP0999282、WO2006/051660中提供。

此外，还可以使用经修饰而将6-磷酸葡糖酸脱水酶或2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶中任一的活性增加或将二者的活性都增加的属于肠杆菌科的微生物(EP1352966B)。

可以使用的具有产生L-谷氨酸能力的肠杆菌科微生物包括下述细菌，在所述细菌中，将催化L-谷氨酸之外化合物的产生的酶活性减少或降低，而所述化合物的产生从L-谷氨酸的生物合成途径分支。催化从L-谷氨酸生物合成途径分支的除L-谷氨酸之外的化合物产生的酶的实例是2-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、异柠檬酸裂合酶(aceA)、乙酰羟酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvN)、甲酸乙酰转移酶(pflB)、乳酸脱氢酶(ldh)、谷氨酸脱羧酶(gadA)和1-吡咯啉脱氢酶(1-pyrroline dehydrogenase)(putA)等。在这些之中，特别优选减少或缺失2-酮戊二酸脱氢酶的活性。

用于在属于肠杆菌科的微生物中缺失或减少2-酮戊二酸脱氢酶活性的方法在美国专利5,573,945、美国专利No.6,197,559和美国专利No.6,331,419中描述。将2-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或减少的属于肠杆菌科的微生物的实例包括以下：

Pantoea ananatis AJ13601(FERM BP-7207)

植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)AJ13410菌株(FERM BP-6617)

大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)

等等。

AJ12949菌株是将α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的细菌菌株，并且在1993年12月28日以登录号FERM P-14039保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，并且根据布达佩斯条约在1994年11月11日转为国际保藏，并给予登录号FERMBP-4881。

本发明中优选使用的产生L-色氨酸的细菌是以下一种或多种酶的活性增强的细菌：即邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)或色氨酸合酶(trpAB)。由于邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶均受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，能够通过保留(retain)脱敏的突变酶来增加这些酶的活性(US5,618,716、US 6,180,373)。例如，通过将邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)和/或磷酸甘油酸脱氢酶基因(serA)突变以防止反馈抑制，再将所述突变基因引入属于肠杆菌科的微生物，从而可获得具有脱敏的酶的细菌。这种细菌的具体实例是大肠杆菌SV164，所述细菌保留脱敏的邻氨基苯甲酸合酶，并且用具有突变的serA的质粒pGH5转化所述细菌，所述突变的serA编码脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶(WO94/08301)。

用含有色氨酸操纵子的重组DNA转化的细菌也是优选的产生L-色氨酸的细菌。具体实例是用含有编码脱敏邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子(trpAB)转化的大肠杆菌(Japanese Patent Application Publication No.JP57-71397、Japanese Patent Application Publication No.JP 62-244382、美国专利No.4,371,614)。另外，在色氨酸操纵子中，能够通过增加编码色氨酸合酶的基因(trpBA)的表达来增强产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶含有分别由trpA和trpB编码的α和β亚基(WO2005/103275)。

产生L-色氨酸的细菌的实例是生长需要L-苯丙氨酸和L-酪氨酸的大肠杆菌AGX17(pGX44)[NRRLB-12263]，和保留包含色氨酸操纵子的质粒pGX50的AGX6(pGX50)aroP[NRRL B-12264](参见美国专利No.4,371,614)。

缺乏色氨酸操纵子抑制子(trpR)的菌株和具有突变trpT的菌株也是理想的产生L-色氨酸的细菌(美国专利No.4,371,614WO2005/056776)。

其它优选的产生L-色氨酸的细菌是结构性表达苹果酸合酶(aceB)、异柠檬酸裂合酶(aceA)和异柠檬酸脱氢酶/磷酸酶(icl)操纵子(ace操纵子)的细菌，或将所述操纵子的表达增强的细菌(WO2005/103275)。

L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-酪氨酸均为芳族氨基酸，并且共享生物合成系统。编码芳族氨基酸生物合成酶的基因的实例包括脱氧阿拉伯-庚酮糖酸磷酸合酶(deoxyarabino-heptulosonate phosphate synthase)(aroG)、3-脱氢奎宁酸合酶(aroB)、莽草酸脱水酶、莽草酸激酶(aroL)、5-烯醇丙酮酰莽草酸[-]3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate[-]3-phosphate synthase)(aroA)和分支酸合酶(chorismate synthase)(aroC)(European Patent Application Publication No.763127)。因此，通过将编码这些酶的基因多重拷贝(multi-copy)至质粒或基因组上，能够改进产生芳族氨基酸的能力。已知这些基因由酪氨酸抑制子(tyrR)调控，所以也可通过缺失tyrR基因来增加芳族氨基酸的生物合成酶活性(EP763127)。

产生L-苏氨酸的细菌优选是属于肠杆菌科的微生物，其中已将所述L-苏氨酸生物合成酶增强。编码L-苏氨酸生物合成酶的基因的实例包括天冬氨酸激酶III基因(lysC)、天冬氨酸半醛脱氢酶基因(asd)、编码thr操纵子的天冬氨酸激酶I基因(thrA)、高丝氨酸激酶基因(thrB)和苏氨酸合酶基因(thrC)。这些基因的缩写在它们的名称之后的括号内给出。可引入这些基因中的两种以上。可将L-苏氨酸生物合成基因引入已将苏氨酸降解阻抑的埃希氏菌属的细菌。已将苏氨酸降解阻抑的埃希氏菌属的细菌实例包括将苏氨酸脱氢酶活性缺失的TDH6菌株(Japanese Patent Application Publication No.2001-346578)等等。

某些L-苏氨酸生物合成酶的活性受产生的L-苏氨酸抑制。因此，为了构建产生L-苏氨酸的细菌，优选对L-苏氨酸生物合成酶进行修饰以使所述酶不受到L-苏氨酸的反馈抑制。上述thrA、thrB和thrC基因组成苏氨酸操纵子，所述操纵子以弱化子(attenuator)结构的形式存在。苏氨酸操纵子的表达受到培养中存在的异亮氨酸和苏氨酸的抑制，并且使表达减弱。可通过去除弱化区中的前导序列或弱化子来实现对苏氨酸操纵子的这种修饰(WO 02/26993；Biotechnology Letters Vol.24，No.21，November 2002；WO2005/049808)。

可将位于苏氨酸操纵子上的天然启动子用非天然启动子取代(WO98/04715)。或者，可构建苏氨酸操纵子而使苏氨酸生物合成中涉及的基因的表达受到λ噬菌体阻抑物和启动子的调控(EP0593792)。同样，为了防止L-苏氨酸的反馈抑制，也可通过选择α-氨基-β-羟基戊酸(AHV)抗性的细菌菌株来获得对埃希氏菌属细菌的修饰(JP45026708B)。

优选经修饰以防止L-苏氨酸的反馈抑制的苏氨酸操纵子在宿主中具有增加的拷贝数或连接至强启动子。除了使用质粒扩增所述基因的拷贝数，还可通过使用转座子、Mu噬菌体等将苏氨酸操纵子引入染色体上来增加基因的拷贝数。

对于天冬氨酸激酶III基因(lysC)，期望的是使用经修饰以防止这种L-赖氨酸的反馈抑制的基因。能够使用在美国专利No.5,932,453中描述的方法获得经修饰以防止反馈抑制的lysC基因。

除了L-苏氨酸生物合成酶，期望的是将糖酵解系统、TCA循环和呼吸链中涉及的基因、调控基因表达的基因和诱导糖摄取的基因增强。在L-苏氨酸产生中有效的这些基因的实例包括转氢酶基因(pntAB)(EP733712)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(ppc)(WO 95/06114)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)(EP877090)、棒状杆菌型细菌或芽孢杆菌属(Bacillus)细菌中的丙酮酸羧化酶基因(WO99/18228、EP1092776)。

还优选增强赋予对L-苏氨酸的抗性的基因和赋予对L-高丝氨酸的抗性的基因的表达，或赋予宿主L-苏氨酸抗性和L-高丝氨酸抗性。这些基因的实例是rhtA基因(Res Microbiol.2003 Mar；154(2)：123-35)、rhtB基因(EP0994190)、rhtC基因(EP1013765)和yfiK、yeaS基因(EP1016710)。对于赋予宿主L-苏氨酸抗性，参考European Patent Application Publication No.0994190、WO90/04636。

产生L-苏氨酸的细菌另外的实例是大肠杆菌VKPM B-3996菌株(美国专利No.5,175,107)。这种VKPM B-3996菌株在1987年11月19日以登录号VKPM B-3996保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(the Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM)，GNII Genetika。此外，VKPMB-3996菌株保留质粒pVIC40(WO90/04636)，所述质粒pVIC40通过将苏氨酸生物合成基因(苏氨酸操纵子：thrABC)插入包含链霉素抗性标记的广宿主(wide-host)载体质粒pAY32中而获得(Chistorerdov，A.Y.，Tsygankov，Y.D.，Plasmid，1986，16，161-167)。在这种pVIC40中，已将L-苏氨酸对苏氨酸操纵子中thrA编码的天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶I的反馈抑制脱敏。

进一步的实例是大肠杆菌B-5318菌株(参见European Patent No.0593792)。B-5318菌株在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(Russia，117545Moscow，1Dorozhny Proezd，1)。这种VKPM B-5318菌株是异亮氨酸非营养缺陷型菌株，并且保留重组质粒DNA，将所述重组质粒DNA构建成使苏氨酸生物合成中涉及的基因，即，将弱化子区和天然转录调节区缺失的苏氨酸操纵子置于λ噬菌体温度敏感CI阻抑物、PR启动子和λ噬菌体的Cro蛋白N末端的下游，并且苏氨酸生物合成中涉及的所述基因的表达由所述λ噬菌体阻抑物和启动子调控。

在本发明中使用的优选的L-组氨酸的实例包括：大肠杆菌FERM P-5038和5048菌株，其含有的载体中并入了L-组氨酸生物合成中涉及的基因信息(JP56-005099A)；引入了氨基酸输出基因Rht的细菌菌株(EP1016710)；对磺胺胍(sulfaguanidine)、D，L-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素具有抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，Russian Patent Publication No.2119536)等。

可使用表达L-组氨酸生物合成途径酶的编码基因的微生物来产生L-组氨酸。L-组氨酸生物合成酶的实例是ATP磷酸核糖转移酶(hisG)、磷酸核糖AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、磷酸组氨醇氨基转移酶基因(hisC)、组氨醇磷酸酶基因(hisB)和组氨醇脱氢酶基因(hisD)等。

优选的本发明产生L-半胱氨酸的细菌是将胱硫醚β-裂合酶活性减少的细菌(JP2003-169668)，和保留丝氨酸乙酰转移酶的埃希氏菌属细菌，所述丝氨酸乙酰转移酶具有减少的L-半胱氨酸反馈抑制(JP11-155571)。

优选的本发明产生L-脯氨酸的细菌包括大肠杆菌702(VKPM B-8011)，其对3，4-脱羟基脯氨酸和氮杂环丁烷-2-羧酸(azetidine-2-carboxylate)有抗性，和702ilvA(VKPM B-8012菌株)，其缺乏ilvA并且源自702(JP2002-300874A)。

产生L-苯丙氨酸的细菌的实例包括具有tyrA、tyrR缺陷的AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)，和具有扩增的编码苯丙氨酸输出蛋白的基因例如yddG和yedA的菌株。

产生L-精氨酸的细菌的实例包括对α-甲基甲硫氨酸、p-氟苯丙氨酸、D-精氨酸、精氨酸氧肟酸、S-(2-氨乙基)-半胱氨酸、α-甲基丝氨酸(α-methyleserine)、β-2-噻吩丙氨酸或磺胺胍等有抗性的大肠杆菌突变菌株(JP56-106598)。大肠杆菌237菌株是产生L-精氨酸的细菌，所述细菌具有对L-精氨酸的反馈抑制有抗性的突变体并且保留高活性的N-乙酰谷氨酸合酶，并且其也是优选的产生L-精氨酸的菌株(EP1170361B)。所述编号为VKPMB-7925的菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika，并且根据布达佩斯条约在2001年5月18日转为国际保藏。也可以使用大肠杆菌382菌株，其是237菌株的衍生物并且是产生L-精氨酸的细菌，所述细菌具有改进的乙酸同化能力(US6,841,365)。编号为VKPM B-7926的大肠杆菌382菌株在2000年4月10日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。

同样，作为具有产生L-精氨酸能力的微生物，可以使用具有改进的基因表达的微生物，所述基因编码L-精氨酸生物合成中涉及的酶。L-精氨酸生物合成酶的实例包括N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰-谷氨酰-磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸氨基转移酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF)、精氨琥珀酸合酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰磷酸合酶(carAB)，和它们的组合。在每种酶名称之后，在圆括号内提供编码该酶的基因的名称。期望的是使用N-乙酰谷氨酸合酶基因(argA)的突变，其中通过取代对应于野生型中位置15-19的氨基酸序列将L-精氨酸反馈抑制去除(EP EP1170361)。

可以使用的产生L-亮氨酸的细菌包括：大肠杆菌属的细菌，在所述细菌中将由ilvE基因编码的支链氨基酸氨基转移酶失活，并且将由tyrB基因编码的芳族氨基酸氨基转移酶的活性增强(EP1375655A)；大肠杆菌H-9068菌株(ATCC21530)，所述菌株对4-氮亮氨酸或5，5，5-三氟亮氨酸有抗性；大肠杆菌H-9070菌株(FERM BP-4704)；大肠杆菌H-9072菌株(FERM BP-4706)(美国专利No.5,744,331)；大肠杆菌菌株，在所述菌株中将L-亮氨酸对异丙基苹果酸合酶的反馈抑制脱敏(European Patent No.1067191)；大肠杆菌AJ11478菌株，所述菌株对β-2噻吩丙氨酸和β-羟亮氨酸有抗性(美国专利No.5,763,231)，等等。

产生L-异亮氨酸的细菌包括：6-二甲基氨基嘌呤抗性的大肠杆菌突变菌株(JP 5-304969A)、L-异亮氨酸氧肟酸抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)、硫代异亮氨酸抗性的(thiaisoleucine-resistant)大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)、DL-乙硫氨酸抗性的大肠杆菌突变菌株(JP5-130882A)和精氨酸氧肟酸抗性的突变菌株(JP5-130882A)，所述全部菌株均具有产生L-异亮氨酸的能力。埃希氏菌属的重组细菌的实例是以下细菌菌株，在所述菌株中将编码L-异亮氨酸生物合成酶苏氨酸脱氨基酶或乙酰羟酸合酶的基因的表达增加(JP2-458A、JP2-42988A、JP 8-47397A)，等等。

用于衍生本发明产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括但不限于，经修饰而过量表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利No.5,998,178)。期望的是将ilvGMEDA操纵子中弱化所需的区去除，从而使所述操纵子的表达不被L-缬氨酸弱化。此外，期望地将操纵子中的ilvA基因破坏，以使苏氨酸脱氨基酶活性减少。

用于衍生本发明产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括在氨基-酰基t-RNA合成酶中具有突变的突变体(美国专利No.5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，其在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970已经在1988年6月24日以登录号VKPM B-4411保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，117545 Moscow，1Dorozhny Proezd，1)。

此外，生长需要硫辛酸(lipoic acid)和/或缺乏H+-ATP酶的突变体也可用作亲本菌株(WO96/06926)。

在本发明中使用的产生L-氨基酸的细菌中，除编码天然生物合成酶的基因之外，可将糖摄取、糖代谢(糖酵解系统)和能量代谢中涉及的基因增强。

糖代谢中涉及的基因的实例是编码糖酵解酶或摄取糖的蛋白的基因，例如编码葡糖-6-磷酸异构酶的基因(pgi；WO01/02542)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps)、磷酸葡糖变位酶基因(pgm；WO03/04598)、果糖二磷酸醛缩酶基因(fba；WO03/04664)、丙酮酸激酶基因(pykF；WO03/008609)、转醛醇酶(transaldolase)基因(talB；WO03/008611)、延胡索酸酶基因(fum；WO01/02545)、磷酸烯醇丙酮酸合酶基因(pps；EP877090)、非-PTS蔗糖摄取系统基因(csc；EP149911)和蔗糖同化基因(scrAB操纵子；WO90/04636)。

能量代谢中涉及的基因的实例包括转氢酶基因(pntAB；美国专利No.5,830,716)和细胞色素bo型氧化酶基因(cyoABCD；EP1070376)。

<1-2>用于增加甘露糖PTS的活性的方法

能够通过修饰如上所述具有产生L-氨基酸的能力并且属于肠杆菌科的微生物，以增加甘露糖PTS的酶活性从而获得本发明的微生物。然而，可以在增加甘露糖PTS的酶活性的修饰之后赋予产生L-氨基酸的能力。本发明中的甘露糖PTS的意思是将糖摄取至细胞质中，而同时将磷酸烯醇丙酮酸(在下文中，称作PEP)中的磷酸基团转移至糖的活性。用于本文中时，糖的意思是甘露糖，但也可是葡萄糖、果糖或氨基糖。(Molecular Microbiology(1998)27(2)，369-380)。

能够通过使用Chen等的方法(Biochemistry 1998 37：8714-8723)体外测量磷酸化活性(EC 2.7.1.69)来确认甘露糖PTS的酶活性的增加。也能够通过与所述野生型或未经修饰的菌株比较mRNA的量来确认编码甘露糖PTS的基因表达与亲本菌株例如野生型菌株或未经修饰的菌株相比得到增强。Northern杂交和RT-PCR也可用来确认表达(Molecular Cloning(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor(USA)，2001))。只要酶活性与野生或未经修饰的菌株相比增加，则对酶活性的增加程度不进行限制，但是期望的是，例如是野生型或未经修饰的菌株的1.5或更多倍，优选2或更多倍，或更优选3或更多倍。如果靶蛋白量相对于未经修饰的或野生型菌株增加，则能够确认酶活性的增加。这能够通过例如使用抗体的Western印迹来检测(Molecular Cloning(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。

能够通过修饰编码甘露糖PTS的manX、manY和manZ基因的表达实现甘露糖PTS的酶活性的增加(稍后描述)。这可以是通过修饰表达调节区(包括启动子修饰)使内源manX、manY和manZ基因的表达增加；或这可以是通过引入含有manX、manY和manZ基因的质粒，通过扩增染色体上的manX、manY和manZ基因来增加拷贝数等，使外源manX、manY和manZ基因的表达增加。manX、manY和manZ形成操纵子结构(在下文中，称作“manXYZ操纵子”)；并且能够通过修饰man XYZ操纵子的表达调节序列以将其用更强的表达调节序列取代，和增加man XYZ操纵子的拷贝数，更有效地实现甘露糖PTS的酶活性的增加。

已经测定大肠杆菌的全基因组序列(Science 277：1453-1462(1997))，并且各基因的功能和Genbank登录号如下：

表1

基因	可替换的基因名	说明	EC No.	SEQ ID：DNA	SEQ ID：氨基酸	Genbank登录号
							manX	gptB、mpt、ptsL、ptsM、ptsX	PTS酶IIAB甘露糖特异性	EC：2.7.1.69	SEQID：No.172-1040	SEQID：No.2	NP_416331
manY	pel、ptsM、ptsP、ptsX	PTS体系，甘露糖特异性IIC组分		SEQID：No.11106-1903	SEQID：No.3	NP_416332
							manZ	gptB、mpt、ptsM、ptsX	PTS酶IID，甘露糖特异性		SEQID：No.11910-2767	SEQID：No.4	NP_416333

本发明的manX、manY和manZ基因是埃希氏菌属细菌的manX、manY和manZ基因和它们的同源物。例如，大肠杆菌的manX基因编码具有SEQ IDNo.2的氨基酸序列的蛋白质，manY基因编码具有SEQ ID No.3的氨基酸序列的蛋白质，而manZ基因编码具有SEQ ID No.4的氨基酸序列的蛋白质。源自大肠杆菌MG1655的manX、Y、Z基因在SEQ ID No.1中的编码区和Genbank登录号示于表1。

manX、manY和manZ基因的同源物是源自其它微生物的，与埃希氏菌属细菌的manX、manY和manZ基因在结构上具有高相似性的，当引入宿主时改进产生L-氨基酸的能力并且显示甘露糖PTS活性的基因。manX、manY和manZ同源物的实例是在Genbank登记的沙门氏菌属、志贺氏菌属(Shigella)和耶尔森氏菌属(Yersinia)的manX、manY和manZ基因。另外，基于与以上实例中提供的基因的同源性，可以从以下细菌中克隆这些manX、Y、Z基因：棒状杆菌型细菌，例如谷氨酸棒杆菌、乳发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)等；假单胞菌属的细菌(Pseudomonas)，例如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等；分枝杆菌属(Mycobacterium)的细菌，例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)等；和芽孢杆菌属的细菌。如图表1中所示，容许不同的基因名，只要它们与埃希氏菌属细菌的manXYZ高度同源。例如，可以使用合成的寡核苷酸SEQ ID Nos.5和6来克隆编码甘露糖PTS的基因。

本发明中使用的编码甘露糖PTS的基因不限于野生型基因，只要编码的甘露糖PTS蛋白的功能(即，甘露糖PTS活性)不受损，它们也可以是编码蛋白质的突变体或人工修饰的产物，所述蛋白质包含在SEQ ID No.2、3和4的氨基酸序列中的一个或多个位置含有一个或几个氨基酸取代、缺失、插入、添加等的序列。在本文中，术语“几个”随蛋白质立体结构中氨基酸残基的位置和类型而变化；具体地，几个的意思是1-20，优选地1-10，并且更优选地1-5。以上一个或几个氨基酸的取代、缺失、插入或添加是保持甘露糖PTS活性的保守突变。保守突变是在该突变中，如果取代位置是芳族氨基酸，则取代在Phe、Trp、Tyr之间相互发生；如果取代位置是疏水氨基酸，则在Leu、Ile、Val之间；如果是极性氨基酸，则在Gln、Asn之间；如果是碱性氨基酸，则在Lys、Arg、His之间；如果是酸性氨基酸，则在Asp、Glu之间；并且如果是具有羟基的氨基酸，则在Ser、Thr之间。常规的保守突变是保守取代。优选的保守取代还包括用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。上述氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等包括由于保留甘露糖PTS编码基因的微生物的种间差异或个体差异而天然存在的突变(突变体或变体)。能够通过如下方法获得这些基因：使用例如位点特异性突变方法来修饰SEQ ID No.1中显示的核苷酸序列，从而使编码的蛋白质中位点特异性的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加。

此外，编码甘露糖PTS的基因编码与SEQ No.2、3和4的氨基酸序列具有80％或以上，优选90％或以上，更优选95％或以上，甚至更优选97％或以上的同源性的蛋白质。由于基因的简并密码性质随引入所述基因的宿主而变化，用宿主更容易使用的密码子取代的基因是期望的。同样，只要编码甘露糖PTS的基因具有(carry)甘露糖PTS的功能，可以将所述基因的N末端或C末端延伸或去除。例如，延伸或去除的长度可以是50或更少，优选20或更少，更优选10或更少，并且甚至更优选5或更少的氨基酸残基。更具体地，可以使用编码以下蛋白质的基因，所述蛋白质具有从N末端延伸或去除50-5个氨基酸的SEQ ID No.2，3和4，和/或从C末端延伸或去除50-5个氨基酸的SEQ ID No.2，3和4。

同样，能够通过以下常规突变处理获得基因的变体。突变处理方法之一是使用羟胺等，将具有如SEQ ID No.1的核苷酸序列号72至2767中所示核苷酸序列的基因进行体外突变。另一种方法使用紫外线或突变处理中通常使用的突变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或甲磺酸乙酯(EthylMethyl Sulfonate)(EMS)来处理具有所述基因的微生物，例如，埃希氏菌属的细菌。这些基因是否编码具有甘露糖PTS活性的蛋白质能够通过如下方法确认：例如在适当的细胞中表达这些基因，并且研究摄取甘露糖的能力是否增加，或采用Chen等的方法研究体外磷酸化活性(Biochemistry 199837：8714-8723)。

编码甘露糖PTS的基因还可以是在严紧条件下与SEQ ID No.1中编号72至2767的核苷酸序列的互补核苷酸序列或与从这些序列制备的探针杂交的DNA。在本文中，术语“严紧条件”指形成所谓的特异性杂合体(hybrid)，并且不形成非特异性杂合体的条件。尽管难以以数字清楚地表述这些条件，但是可将这些条件例举为如下条件：在该条件下高度同源的DNA片段，例如，具有不少于80％、90％或95％同源性的DNA相互杂交，并且具有低于以上同源性的DNA不相互杂交。或者，严紧条件的示例是常规Southern杂交洗涤条件中的条件，所述条件为在相应于60℃、1xSSC、0.1％SDS，优选0.1xSSC、0.1％SDS，并且更优选68℃、0.1xSSC、0.1％SDS的温度和盐浓度，洗涤一次或优选2-3次。

含有SEQ ID No.1中编号72至2767的核苷酸序列或部分该序列的DNA也可用作探针。这种探针可以使用PCR制备，其中将含有SEQ ID No.1的核苷酸序列的DNA片段用作模板，并且将基于SEQ ID No.1的核苷酸序列制备的寡核苷酸用作引物。例如，当使用大约300bp长的DNA片段作为探针时，杂交洗涤条件是50℃、2xSSC和0.1％SDS。

能够通过使用例如增加细胞中上述甘露糖PTS编码基因拷贝数的遗传重组技术来进行增强甘露糖PTS编码基因表达的修饰。例如，将含有甘露糖PTS编码基因的DNA片段与在宿主微生物中发挥功能的载体(优选多拷贝型载体)连接，以制备重组DNA，其后将所述重组DNA引入该微生物以将其转化。

当使用大肠杆菌的manX、Y、Z基因时，能够使用PCR(PCR：聚合酶链式反应；参见White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185(1989))来获得它们，在所述PCR中大肠杆菌的染色体DNA是模板，并且基于SEQ ID No.1的核苷酸序列制备引物，例如，SEQ ID Nos.5和6中所示的引物。使用基于甘露糖PTS蛋白的序列信息制备引物的PCR，或使用基于上述序列信息制备探针的杂交方法，也可从那些微生物中已知的manX、Y和Z基因或其它种微生物中的manX、Y和Z基因，或从那些微生物的染色体DNA或染色体DNA文库获得属于肠杆菌科的其它微生物的甘露糖PTS编码基因。另外，可从DNA供体微生物制备染色体DNA。例如，可以使用Saito和Miura的方法等(参见H.Saito and K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Seibutsu KogakuJikkensho[Bioengineering Experiments]，edited by The Society of Biotechnology，Japan，pp.97-98，Baifukan，1992)。

其后，通过将通过PCR方法扩增的甘露糖PTS编码基因与能够在宿主微生物的细胞中发挥功能的载体DNA连接来制备重组DNA。能够在宿主微生物的细胞中发挥功能的载体是在所述宿主微生物的细胞中可自主复制的载体。在大肠杆菌的细胞中可自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG和pACYC可从Takara BioInc.获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW可从Nippon Gene Co.，Ltd.获得)、pSTV29(可从Takara Bio Inc.获得)等。

可将如上所述制备的重组DNA依照迄今已经报导的任何转化方法引入微生物。例如，一种方法是通过用氯化钙处理受体细菌来增加DNA的透过性，如关于大肠杆菌K-12所报导的(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。另一种方法是在从处于生长期的细胞制备感受态细胞之后引入DNA，如关于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)所报导的(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。同样，另一种方法是当已知宿主微生物与枯草芽孢杆菌、放线菌类(actinomycete)和酵母有关时，将其变为能够容易地摄取重组DNA的原生质体或原生质球状态，随后将所述重组DNA引入该DNA受体细菌中(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929(1978))。也可使用电脉冲方法转化棒状杆菌型细菌组(cornyneform groupof bacteria)(Sugimoto，et al.，Japanese Patent Application Publication No.Hei2-207791)。

能够通过将如上所述的甘露糖PTS编码基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA中来增加甘露糖PTS编码基因的拷贝数。使用以多拷贝存在于所述染色体DNA上的序列作为靶，通过同源重组将编码甘露糖PTS的基因的多拷贝引入微生物的染色体DNA。可以使用存在于可转座元件末端的反向重复序列和重复DNA作为所述以多拷贝存在于染色体DNA上的序列。同样，可以将这些基因与存在于染色体上的manXYZ操纵子串联连接，或可以将这些基因通过在染色体上的非必需基因上的复制(duplication)来并入。可以使用温度敏感载体或整合载体来引入这些基因。manX、manY和manZ形成操纵子结构(在下文中，称作“manXYZ操纵子”)，若将manXYZ操纵子的拷贝数增加则更加有效。

如JP2-109985A中所披露，可以将甘露糖PTS编码基因并入转座子，再将所述转座子转移以将多拷贝并入染色体DNA。能够通过使用甘露糖PTS编码基因的一部分作为探针进行Southern杂交来确认所述基因是否已经转移至染色体上。

除了上述的增加基因的拷贝数，还可通过使用WO00/18935中描述的方法来增强甘露糖PTS编码基因的表达，例如将染色体DNA或质粒上的manXYZ操纵子启动子等表达调节序列用更强的取代，使-35、-10区接近共有序列，扩增能够增强manXYZ操纵子表达的调节基因，和缺失或减弱将会减少manXYZ操纵子表达的调节基因。例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、araBA启动子、λ噬菌体PR启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、

启动子等是公知的强启动子。还可将碱基取代等引入manXYZ操纵子的启动子区和SD区以实现更强的启动子强度。

用于评估启动子强度的方法的实例和强启动子的实例在Goldstein等的文章(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中描述。另外，已知在核糖体结合位点(RBS)和起始密码子之间的间隔区中取代几个核苷酸，特别在起始密码子的紧邻上游的序列中取代几个核苷酸，对mRNA翻译效率具有强烈影响。可对这些进行修饰。可通过启动子搜索载体(promoter search vector)和基因分析软件如GENETYX等确定manXYZ操纵子的启动子等表达调节区。能够通过取代或修饰这些启动子来增强甘露糖PTS编码基因的表达。能够例如使用温度敏感质粒或Red-驱动整合方法来进行表达调节序列的取代(WO2005/010175)。

为了增加甘露糖PTS蛋白的活性，也可以将增加甘露糖PTS活性的突变引入manX、Y、Z基因。增加manX、Y、Z基因编码蛋白质的活性的突变实例包括增加manXYZ操纵子转录量的启动子序列的突变，和增加甘露糖PTS比活性的所述基因编码区内的突变。

<2>产生L-氨基酸的方法

本发明的用于产生L-氨基酸的方法包括在培养基中培养本发明的微生物，在所述培养基或微生物中产生和积累L-氨基酸，和从所述培养基或微生物中收集L-氨基酸。

在使用微生物的L-氨基酸的发酵和产生中通常使用的培养基可用于本发明。即，可以使用含有碳源、氮源、非有机离子和所需的其它有机组分的普通培养基。碳源包括糖，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等；醇，例如甘油、山梨糖醇(solbitol)等；有机酸，例如延胡索酸、柠檬酸、琥珀酸等。在这些中，优选使用葡萄糖作为碳源。氮源包括无机铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等；有机氮，例如大豆水解产物等；氨气；氨水等。期望的是有机微量营养物源含有适当量的营养缺陷物质(auxotrophicsubstance)，例如维生素B1、L-高丝氨酸等，或酵母提取物等。除这些之外，根据需要，可以添加小量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。

本发明中使用的培养基可以是天然的或合成的培养基，只要其含有碳源、氮源、无机离子和需要的其它有机微量营养物。

建议将培养在需氧条件下，在24℃-37℃的培养温度进行1-7天，培养期间的pH为5-9。可以使用无机或有机酸或碱物质和氨气等来调节pH。使用常规离子交换树脂方法、沉淀方法和其它已知方法的组合可从发酵液中收集L-氨基酸。

如果L-氨基酸积累在微生物的细胞内，可通过超声等将细胞破碎，随后通过离心分离去除以获得上清，使用离子交换树脂方法等可从所述上清中收集L-氨基酸。

还可使用适合于以沉淀产生L-谷氨酸的液体培养基，并且进行培养，在培养的同时将L-谷氨酸产生在培养基中。用于产生L-谷氨酸的条件包括，例如，pH为5.0-4.0，优选pH为4.5-4.0，更优选pH为4.3-4.0，并且甚至更优选pH为4.0。

在培养完成之后，可以使用任何已知的回收方法从培养液中收集L-谷氨酸。例如，可以在将细胞从培养液中去除之后使用浓缩结晶法收集L-谷氨酸，或通过离子交换层析等收集L-谷氨酸。当在产生L-谷氨酸的条件下进行培养时，也可通过离心分离、过滤等收集沉淀在培养液中的L-谷氨酸。在这种情况下，可以将溶解在培养液中的L-谷氨酸结晶之后再分离。

此外，可通过以下分离方法制备以本发明产生的发酵液为基础的动物饲料添加剂。可以使用L-氨基酸分离方法例如离心、过滤、倾析、絮凝或这些的组合来去除或减少生物质。

可以使用已知方法例如旋转蒸发器、薄层蒸发器、反渗透或纳米过滤(FR8613346B、US4,997,754、EP410005B，JP1073646B)来浓缩由本发明获得的培养液。

随后使用冷冻干燥、喷雾干燥、喷雾制粒(spray granulation)的方法，或产生作为动物饲料添加剂使用的优选为自由流动、细碎的粉末的任何其它方法处理浓缩的培养液。通过使用合适的压实或制粒方法，可将这种自由流动的细碎粉末转变成粗粒的、流动非常自由的、稳定并且基本上无尘的产品。总而言之，以这种方法将多于90％的水去除，以使动物饲料添加剂中的水浓度按重量计少于10％，优选少于5％。

所述饲料添加剂中的蛋白质含量按重量计可少于10％，优选少于5％，并且L-苏氨酸的浓度可多于50％，优选多于85％，更优选多于95％(US5,431,933、JP1214636B、US4,956,471、US4,777,051、US4946654、US5,840358、US6,238,714、US2005/0025878)。

上述分离步骤不必一定进行，而是可以按照在技术上有利的方式组合。

实施例：

下文是参考以下非限定性实施例对本发明更具体的说明。

参考实施例：

参考实施例1：构建产生L-赖氨酸的细菌

<1-1>构建破坏了编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因的菌株

首先，构建不产生赖氨酸脱羧酶的菌株。使用WO WO2005/010175中描述的Red-驱动整合方法和λ噬菌体切除系统(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3.Interactions between integrase and excisionase in the phageλexcisivenucleoprotein complex.Cho EH，Gumport RI，Gardner JF)来构建将赖氨酸脱羧酶基因破坏的菌株。

赖氨酸脱羧酶由cadA基因(Genbank登录号NP_418555.SEQ ID No.42)和ldcC基因(Genbank登录号NP_414728.SEQ ID No.44)编码(WO96/17930)。将WC196菌株用作亲本菌株。将WC196菌株命名为大肠杆菌AJ13069，并且在1994年12月6日以登录号FERM P-14690保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心；Chuo 6，1-1，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan))，并且根据布达佩斯条约在1995年9月29日转为国际保藏，并给予登录号FFRM BP-5252。

使用最初由Datsenko和Wanner开发的称为“Red-驱动整合”的万法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)和λ噬菌体切除系统(J.Bacteriol.2002 Sep；184(18)：5200-3)，将编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因缺失。根据“Red-驱动整合”方法，通过使用以源自靶基因的5’末端和抗生素抗性基因的3’末端的合成寡核苷酸引物获得的PCR产物，可以在单一的步骤中构建基因破坏的菌株。另外，通过λ噬菌体切除，可将整合入染色体中的抗生素抗性基因从菌株中去除。

(1)破坏cadA基因

将下文描述的pMW118-attL-Cm-attR质粒用作PCR模板。通过将λ噬菌体的attL和attR附着位点和抗生素抗性基因cat基因以attL-cat-attR的顺序插入pMW118(Takara Bio Inc.)来获得pMW118-attL-Cm-attR(参见WO2005/010175)。attL序列示于SEQ ID No.11，而attR序列示于SEQ ID No.12。使用SEQ ID Nos.46和47中所示合成寡核苷酸作为引物进行PCR，其中相应于attL和attR两个末端的序列位于所述引物的3’端，并且相应于靶基因cadA基因的一部分的序列位于所述引物的5’端。

用琼脂糖凝胶纯化扩增的PCR产物，其后通过电穿孔引入含有质粒pKD46的大肠杆菌WC196菌株，所述质粒具有温度敏感复制能力。质粒pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，pp.6640-6645)包含λ噬菌体DNA片段(2154碱基)，并且其包含编码λRed同源重组系统中Red重组酶的基因(γ、β和exo)，所述基因受阿拉伯糖诱导的ParaB启动子调控(GenBank/EMBL Accession No.J02459，31088th-3324lst)。

如下制备用于电穿孔的感受态细胞。将在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在30℃培养过夜的大肠杆菌WC196菌株在含有氨苄青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL SOB培养基中稀释100倍(MolecularCloning：Lab Manual 2^nd edition，Sambrook，J.，et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))。将稀释产物在30℃培养直到OD 600增长至大约0.6，之后将其浓缩100倍并用10％甘油洗涤三次准备电穿孔。

使用70μl感受态细胞和大约100ng PCR产物进行电穿孔。添加1mLSOC培养基(Molecular Cloning：Lab Manual 2^nd edition，Sambrook，J.，et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))并且在37℃培养2.5小时，其后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-琼脂平板培养基上在37℃培养，并且选择Cm抗性的重组体。接下来，为了去除pKD46质粒，将细胞在含有Cm的L-琼脂培养基上在42℃传代培养两次，检测所得菌落的氨苄青霉素抗性，并且获得了无pKD46的氨苄青霉素敏感性菌株。

使用PCR确认通过氯霉素抗性基因鉴定的突变体中cadA基因的缺失。将cadA缺陷型菌株命名为WC196ΔcadA::att-cat。

其后，为了去除引入cadA基因中的att-cat基因，使用在下文描述的辅助质粒pMW-intxis-ts。pMW-intxis-ts含有编码λ噬菌体整合酶(Int)的基因(SEQID No.13)和编码切除酶(Xis)的基因(SEQ ID No.15)，并且具有温度敏感复制能力。通过引入pMW-intxis-ts，识别染色体上的attL(SEQ ID No.11)和attR(SEQ ID No.12)，引起重组，并且将attL和attR之间的基因切除，只将attL或attR序列保留在染色体上。

使用常规方法制备如上所述获得的WC196ΔcadA::att-cat菌株的感受态细胞，并且用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，在含有50mg/L氨苄青霉素的L-琼脂平板培养基上在30℃培养，由此选择氨苄青霉素抗性菌株。其后，为了去除pMW-intxis-ts质粒，将转化体在L-琼脂培养基上在42℃传代培养，检测所得菌落的氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性，并且获得了将att-cat和pMW-intxis-ts去除的氯霉素和氨苄青霉素敏感性菌株。将这种菌株命名为WC196ΔcadA。

(2)在WC196ΔcadA菌株中缺失ldcC基因

按照上文描述的技术，使用具有SEQ ID Nos.48和49的序列的引物作为ldcC破坏引物将WC196ΔcadA菌株中的ldcC基因缺失。由此产生将cadA和ldcC两者都破坏的WC196ΔcadAΔldcC。

(3)制备PCR模板和辅助质粒

如下制备PCR模板pMW118-attL-Cm-attR和辅助质粒pMW-intxis-ts。

(3-1)pMW118-attL-Cm-attR

基于pMW118-attL-Cm-attR构建pMW118-attL-Tc-attR。制备以下四种DNA片段：

1)含有attL的BglII-EcoRI DNA片段(120bp)(SEQ ID No.11)，其通过PCR扩增相应于大肠杆菌W3350菌株(含有λ原噬菌体的ATCC31278)染色体的序列而获得，使用寡核苷酸P1和P2(SEQ ID Nos.17 & 18)作为引物(这些引物额外地含有BglII和EcoRI内切核酸酶的识别位点)，

2)含有attR的PstI-HindIII DNA片段(182bp)(SEQ ID No.12)，其通过PCR扩增相应于大肠杆菌W3350菌株(含有λ原噬菌体)染色体的序列而获得，使用寡核苷酸P3和P4(SEQ ID Nos.19 & 20)作为引物(这些引物额外地含有PstI和HindIII内切核酸酶的识别位点)，

3)pMW118-ter_rrnB的BglII-HindIII大片段(3916bp)：所述pMW118-ter_rrnB通过连接以下三个片段获得：

i)含有来自pMW118的AatII-EcoRIpol片段的大片段(2359bp)，通过如下获得：用EcoRI限制性内切核酸酶消化pMW118，将其用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，其后用AatII限制性内切核酸酶消化所述片段，

ii)含有氨苄青霉素抗性的(Ap^R)bla基因的pUC19的AatII-BglII小片段(1194bp)，通过如下获得：PCR扩增相应于pUC19质粒的序列，使用寡核苷酸P5和P6(SEQ ID Nos.21 & 22)作为引物(这些引物额外地含有AatII和BglII内切核酸酶的识别位点)，

iii)含有转录终止子ter_rrnB的小BglII-PstIpol片段(363bp)，通过如下获得：PCR扩增相应于大肠杆菌MG1655菌株的染色体的区域，使用寡核苷酸P7和P8(SEQ ID Nos.23 & 24)作为引物(这些引物额外地含有BglII和PstI内切核酸酶的识别位点)，

4)含有四环素抗性基因和转录终止子ter_thrL的pML-Tc-ter_thrL的小EcoRI-PstI片段(1388bp)(SEQ ID No.29)。如下获得pML-Tc-ter_thrL。

将pML-MSC(Mol Biol(Mosk).2005 Sep-Oct；39(5)：823-31；Biotechnologiya(Russian)No.5：3-20.))用XbaI和BamHI限制性内切核酸酶消化，并且将它的大片段(3342bp)与含有终止子ter_thrL的XbaI-BamHI片段(68bp)连接。所述XbaI-BamHI片段(68bp)相应于大肠杆菌MG1655的染色体，并且通过PCR扩增获得，使用寡核苷酸P9和P10(SEQ ID Nos.25 & 26)作为引物(这些引物额外地含有XbaI和BamHI内切核酸酶的识别位点)。将连接反应产物命名为质粒pML-ter_thrL。

将pML-ter_thrL用KpnI和XbaI限制性内切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，其后与含有四环素抗性基因的pBR322的小EcoRI-Van91I片段(1317bp)连接(将用EcoRI和Van91I限制性内切核酸酶消化的pBR322用DNA聚合酶I的Klenow片段处理)。将这种连接的产物命名为质粒pML-Tc-ter_thrL。

其后，通过连接大BamHI-XbaI片段(4413bp)、PA2启动子(T7噬菌体的原始启动子)、氯霉素抗性的(CmR)cat基因、含有转录终止子ter_thrL的人工BglII-XbaI DNA片段(1162bp)和attR构建了pMW 118-attL-Cm-attR。如下获得所述人工DNA片段(SEQ ID No.30)。

将pML-MSC(Mol Biol(Mosk).2005 Sep-Oct；39(5)：823-31；Biotechnologiya(Russian)No.5：3-20.))用KpnI和XbaI限制性内切核酸酶消化，并且与含有PA2启动子(T7噬菌体的早期启动子)的小KpnI-XbaI片段(120bp)连接。KpnI-XbaI片段用PCR通过扩增相应于T7噬菌体DNA的区域来获得，使用寡核苷酸P11和P12(SEQ ID Nos.27 & 28)作为引物(这些引物额外地含有KpnI和XbaI内切核酸酶的识别位点)。将所述连接的产物命名为质粒pML-PA2-MCS。

将XbaI位点从pML-PA2-MCS去除。将产物命名为质粒pML-PA2-MCS(XbaI-)。

将含有PA2启动子(T7噬菌体的原始启动子)和氯霉素抗性的(CmR)cat基因的pML-PA2-MCS(XbaI-)的小BglII-HindIII片段(928bp)与含有转录终止子ter_thrL和attR的pMW118-attL-Tc-attR的小HindIII-HindIII片段(234bp)连接。

使用寡核苷酸P9和P4(SEQ ID Nos.25 & 20)作为引物(这些引物含有HindIII和XbaI内切核酸酶的识别位点)，通过所述连接混合物的PCR扩增来获得目标人工DNA片段(1156bp)。

(3-2)pMW-intxis-ts

首先，基于λ噬菌体DNA(Fermentas)作为模板扩增了两个DNA片段。第一片段由λ噬菌体DNA基因组中的nt 37168-38046区(SEQ ID No.39)组成，并且含有cI阻抑物、Prm和Pr启动子，以及cro基因的前导序列。此片段使用寡核苷酸P1’和P2’(SEQ ID Nos.31 & 32)作为引物通过扩增获得。第二片段由λ噬菌体DNA基因组中的nt 27801-29100区(SEQ ID No.40)组成，其含有来自λ噬菌体DNA的xis-int基因。此片段使用寡核苷酸P3’和P4’(SEQ IDNos.33 & 34)作为引物通过PCR获得。全部所述引物含有适当的内切核酸酶识别位点。

第一PCR扩增片段含有cI阻抑物，将所述片段用ClaI限制性内切核酸酶消化，其后用EcoRI限制性内切核酸酶消化。

将第二PCR片段用EcoRI和PstI内切核酸酶消化。将质粒pMWPlaclacI-ts用BglII内切核酸酶消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理，其后用PstI限制性内切核酸酶消化。从琼脂糖凝胶中洗脱pMWPlaclacI-ts的载体片段，并且与切割的PCR扩增片段连接。

质粒pMWPlaclacI-ts是pMWPlaclacI的衍生物，含有以下部分：1)人工BglII-HindIII DNA片段，其含有PlacUV5启动子和在噬菌体T7基因10的RBS调控下的lacI基因；2)含有氨苄青霉素抗性的(ApR)基因的AatII-BglII片段，其通过PCR扩增相应于pUC19质粒的区域来获得，使用寡核苷酸P5’和P6’(SEQ ID Nos.35 & 36)作为引物(这些引物含有AatII和BglII内切核酸酶的识别位点)；3)AatII-HindIII片段，其含有重组质粒pMW118-ter_rrnB的AatII-PvuI片段。

如下构建所述质粒pMW118-ter_rrnB。使用含有适当的内切核酸酶识别位点的寡核苷酸P7’和P8’(SEQ ID Nos.37 & 38)作为引物，通过PCR扩增相应于大肠杆菌MG1655菌株的染色体的区域来获得含有终止子ter_rrnB的PstI-HindIII片段。在连接之前，将pMW118和ter_rrnB片段(SEQ ID No.41的互补链)分别用PvuI或PstI消化，用DNA聚合酶I的Klenow片段处理以将末端平端化，其后用AatII或HindIII内切核酸酶消化。在pMWPlaclacI-ts突变体的构建中，将质粒pMWPlaclacI的AatII-EcoRV片段用含有pSC101复制子的par、ori和repAts基因的质粒pMAN997的AatII-EcoRV片段取代(Applied and Environmental Microbiology，June 2005，p.3228-32)。

实施例1：构建用于增加甘露糖PTS活性的质粒

<1-1>构建用于manXYZ过量表达的质粒

已经测定大肠杆菌染色体(大肠杆菌K-12菌株)的全基因组序列(Science，277，1453-1474(1997))。基于manXYZ基因的核苷酸序列(Genbank登录号NP416331、416332、416333)，使用具有Sse8387I位点的SEQ ID No.5的合成寡核苷酸作为5’引物，和具有XbaI位点的SEQ ID No.6的合成寡核苷酸作为3’引物，使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，并且获得了含有manXYZ基因的基因片段。

将纯化的PCR产物与已经用Sse8387I(Takara Shuzo)和XbaI(NipponGene Co.，Ltd.)消化的载体pMW219连接，以构建用于manXYZ过量表达的质粒pM-manXYZ。这种质粒受lac启动子的调控，并且将manXYZ基因置于所述lac启动子的下游。将pM-manXYZ用Sse8387I和EcoRI消化，收集和纯化manXYZ基因片段，并且连接至已经用Sse8387I和EcoRI消化的载体pSTV29(Takara Shuzo)。以这种方法，构建了用于过量表达的质粒pS-manXYZ。

<1-2>构建用于ptsG过量表达的质粒

按照与上文所述manXYZ基因的相同方式，构建了用于表达ptsG(SEQID No.50)基因的质粒。使用含有HindIII位点的SEQ ID No.7的合成寡核苷酸作为5’引物，和含有XbaI位点的SEQ ID No.8的合成寡核苷酸作为3’引物，用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板进行PCR，并且将其用限制性内切核酸酶HindIII和XbaI处理，由此获得了含有ptsG的基因片段。将纯化的PCR产物与已经用HindIII和XbaI消化的载体pMW219连接，以构建用于扩增ptsG的质粒pM-ptsG。这种质粒受lac启动子的调控，并且将ptsG基因置于所述lac启动子的下游。按照与manXYZ相同的方式，将ptsG基因片段从pM-ptsG中切除，并且连接至载体pSTV29。构建了用于ptsG过量表达的质粒pS-ptsG。

实施例2：构建过量表达manXYZ基因的菌株和评估所述菌株的L-赖氨酸产生

作为产生L-赖氨酸的大肠杆菌菌株，将WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2)菌株用作亲本菌株，将含有dapA、dapB和lysC基因的产生Lys的质粒pCABD2(WO01/53459)引入参考实施例1中的WC196ΔldcCΔcadA菌株。

用实施例1中构建的manXYZ-扩增质粒pM-manXYZ和ptsG-扩增质粒pM-ptsG，和对照质粒pMW219转化WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2)菌株，获得了卡那霉素抗性菌株。在确认已将指定的质粒引入后，将引入了manXYZ过量表达质粒pM-manXYZ的菌株命名为WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-manXYZ)菌株；将引入了ptsG过量表达质粒pM-ptsG的菌株命名为WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-ptsG)菌株；并且将引入了对照质粒pMW219的菌株命名为WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pMW219)菌株。

将如上所述构建的菌株在含有25mg/L卡那霉素的L培养基中在37℃培养至最终成为OD600＝0.6。其后，将40％甘油溶液以与培养液相等的量添加至所述培养物并搅动，再吸取适量并且贮藏在-80℃。将其称为甘油原种(glycerol stock)。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100μL均匀地铺在含有25mg/L卡那霉素的L平板上，并且将其在37℃培养24小时。将平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi摇瓶中包含的具有25mg/L卡那霉素的20mL发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养24小时。培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的L-赖氨酸的量。

在第24小时存在的L-赖氨酸和OD示于表2。如表2所示，与未用manXYZ基因转化的WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pMW219)菌株相比，WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-manXYZ)菌株中积累了大量的L-赖氨酸。在产生赖氨酸的量上的改进还在与用ptsG基因转化的WC196ΔldcCΔcadA(pCABD2，pM-ptsG)菌株的比较中得到确认。这样的数据显示在L-赖氨酸的产生中manXYZ基因的过量表达比ptsG的过量表达更有效。

表2

培养期：24小时

用于L-赖氨酸产生的培养基：

葡萄糖                40g/L

硫酸铵                24g/L

磷酸二氢钾            1.0g/L

硫酸镁7-水合物        1.0g/L

硫酸亚铁4·7-水合物   0.01g/L

硫酸锰4·7-水合物     0.01g/L

酵母提取物            2.0g/L

碳酸钙                30g/L

用KOH调节至pH 7.0，并且在115℃灭菌10分钟。

将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O单独灭菌。

实施例3：manXYZ过量表达对产生L-谷氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

将产生L-谷氨酸的大肠杆菌菌株AJ12949菌株用作亲本菌株。AJ12949菌株具有减少的α-酮戊二酸脱氢酶活性，并且在1993年12月28日以登录号FERM P-14039保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(目前为，独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心；Chuo 6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566，Japan)，并且根据布达佩斯条约在1994年11月11日转为国际保藏，并给予登录号FERM BP-4881。

用实施例1中构建的manXYZ过量表达质粒pS-manXYZ，和对照质粒pSTV29转化AJ12949菌株，由此获得氯霉素抗性菌株。在确认已将指定的质粒引入之后，将引入了manXYZ过量表达质粒pS-manXYZ的菌株命名为AJ12949(pS-manXYZ)；并且将引入了对照质粒pSTV29的菌株命名为AJ12949(pSTV29)。

将AJ12949(pS-manXYZ)菌株和AJ12949(pSTV29)菌株在含有20mg/L氯霉素的L培养基中在37℃培养直至达到OD600＝0.6。此后，将40％甘油溶液以等于培养液的量添加至所述培养物并搅动，再吸取适量以获得甘油原种并且贮藏在-80℃。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100μL均匀地铺在含有20mg/L氯霉素的L平板中，并将其在37℃培养24小时。将获得的平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi摇瓶中包含的具有20mg/L氯霉素的20mL下述发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养40小时。培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(Sakura Seiki)测量培养基中积累的L-谷氨酸的量。

在第40小时的OD和已经积累的L-谷氨酸示于表3。如表3中所示，与未用manXYZ基因转化的AJ12949(pSTV29)菌株相比，在AJ12949(pS-manXYZ)菌株中积累了大量的L-谷氨酸。

表3

培养期：40小时

用于L-谷氨酸产生的培养基：

葡萄糖    40g/L

硫酸铵                20g/L

磷酸二氢钾            1.0g/L

硫酸镁7-水合物        1.0g/L

硫酸亚铁4·7-水合物   0.01/L

硫酸锰4·7-水合物     0.01g/L

酵母提取物            2.0g/L

碳酸钙                30g/L

用KOH调节至pH 7.0，并且在115℃灭菌10分钟。

将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O单独灭菌。另外，在培养物温度降至60℃或更低后，添加已用DISMIC-25cs 0.2mm滤器(ADVANTEC)灭菌的盐酸硫胺素溶液，以获得0.01g/L的终浓度。

实施例4：

甘露糖PTS过量表达对产生L-苏氨酸的埃希氏菌属细菌菌株的影响

作为用于产生L-苏氨酸的manXYZ过量表达的亲本菌株，可使用B-5318菌株。将B-5318菌株在1990年5月3日以登录号VKPM B-5318保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，GNII Genetika(Russia，117545Moscow，1 Dorozhny Proezd，1)。从B-5318构建manXYZ过量表达的菌株，所述构建可使用实施例1中描述的质粒进行。

用实施例1中使用的manXYZ过量表达质粒pS-manXYZ和对照质粒pSTV29转化B-5318菌株，并且获得了氯霉素抗性菌株。在确认了已将指定的质粒引入后，将含有manXYZ过量表达质粒manXYZ的菌株命名为B-5318(pS-manXYZ)；并且将含有对照质粒pSTV29的菌株命名为B-5318(pSTV29)。

将B-5318(pS-manXYZ)菌株和B-5318(pSTV29)菌株在含有20mg/L氯霉素的L培养基中在37℃培养至OD600＝0.6。此后，将等体积的40％甘油溶液添加至所述培养物并搅动，再吸取适量以获得甘油原种并且贮藏在-80℃。

在将这些菌株的甘油原种融化之后，将各100μL均匀地铺在含有20mg/L氯霉素的L平板中，并且将其在37℃培养24小时。将获得的平板上大约1/8的细胞接种至500mL Sakaguchi摇瓶中具有20mg/L氯霉素的20mL发酵培养基中，并且使用往复摇动培养装置在37℃培养40小时。培养之后，使用高效液相层析测量培养基中积累的L-苏氨酸的量。

在第40小时存在的L-苏氨酸和OD示于表4。如该表中所示，与未用manXYZ基因转化的B-5318(pSTV29)菌株相比，在B-5318(pS-manXYZ)菌株中积累了大量的L-苏氨酸。

表4

用于L-苏氨酸的产生的培养基：

葡萄糖            60g/L

硫酸铵            16g/L

硫酸二氢钾        0.7g/L

硫酸镁7-水合物    1.0g/L

硫酸亚铁7-水合物  0.01g/L

硫酸锰7-水合物    0.01g/L

酵母提取物        0.5g/L

盐酸硫胺素        0.2mg/L

L-异亮氨酸        0.05g/L

碳酸钙            30g/L

用KOH调节至pH 7.0，在115℃灭菌10分钟。

将葡萄糖和MgSO₄·7H₂O单独灭菌。通过在180℃干燥加热3小时将氢氧化钾灭菌。在培养物温度降低至60℃或更低之后，添加已用DISMIC-25cs0.2mm滤器(ADVANTEC)灭菌的盐酸硫胺素溶液以获得0.2mg/L的终浓度。

实施例5：

甘露糖PTS的增强对产生L-谷氨酸的泛菌属细菌菌株的影响

作为甘露糖PTS扩增的产生L-谷氨酸的菌株的亲本菌株，可使用Pantoeaananatis AJ13601菌株。所述Pantoea ananatis AJ13601菌株在1999年8月18日以登录号FERM P-17516保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology，Agency ofIndustrial Science and Technology，Ministry of Economy，Trade and Industry)(1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken 305-8566)，并且根据布达佩斯条约在2000年7月6日转为国际保藏，并获得登录号FERM BP-7207。使用实施例1中描述的质粒能够从产生L-谷氨酸的细菌构建manXYZ过量表达的菌株。

在L-谷氨酸产生培养基中培养甘露糖PTS过量表达的菌株，其后使用往复摇动培养设备进行培养。在培养之后，使用Biotech-analyzer AS210(SakuraSeiki)测量培养基中积累的L-谷氨酸的量以确认L-谷氨酸的积累是否增加。通过这种方法，能够获得具有改进的产生L-谷氨酸能力的甘露糖PTS过量表达的菌株。

序列表

<110>味之素株式会社(AJINOMOTO Co Inc)

<120>产生L-氨基酸的细菌和用于产生L-氨基酸的方法

<130>C-556

<150>JP2005279026

<151>2005-09-27

<150>US60/723937

<151>2005-10-06

<150>JP2005-360672

<151>2005-12-14

<160>51

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2770

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(72)..(1043)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1106)..(1906)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1910)..(2770)

<223>

<400>1

tcgattgtgg acgacgattc aaaaatacat ctggcacgtt gaggtgttaa cgataataaa     60

ggaggtagca a gtg acc att gct att gtt ata ggc aca cat ggt tgg gct     110

             Val Thr Ile Ala Ile Val Ile Gly Thr His Gly Trp Ala

             1               5                   10

gca gag cag ttg ctt aaa acg gca gaa atg ctg tta ggc gag cag gaa      158

Ala Glu Gln Leu Leu Lys Thr Ala Glu Met Leu Leu Gly Glu Gln Glu

    15                  20                  25

aac gtc ggc tgg atc gat ttc gtt cca ggt gaa aat gcc gaa acg ctg      206

Asn Val Gly Trp Ile Asp Phe Val Pro Gly Glu Asn Ala Glu Thr Leu

30                  35                  40                  45

att gaa aag tac aac gct cag ttg gca aaa ctc gac acc act aaa ggc      254

Ile Glu Lys Tyr Asn Ala Gln Leu Ala Lys Leu Asp Thr Thr Lys Gly

                50                  55                  60

gtg ctg ttt ctc gtt gat aca tgg gga ggc agc ccg ttc aat gct gcc      302

Val Leu Phe Leu Val Asp Thr Trp Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ala Ala

            65                  70                  75

agc cgc att gtc gtc gac aaa gag cat tat gaa gtc att gca ggc gtt      350

Ser Arg Ile Val Val Asp Lys Glu His Tyr Glu Val Ile Ala Gly Val

        80                  85                  90

aac att cca atg ctc gtg gaa acg tta atg gcc cgt gat gat gac cca      398

Asn Ile Pro Met Leu Val Glu Thr Leu Met Ala Arg Asp Asp Asp Pro

    95                  100                 105

agc ttt gat gaa ctg gtg gca ctg gca gta gaa aca ggc cgt gaa ggc      446

Ser Phe Asp Glu Leu Val Ala Leu Ala Val Glu Thr Gly Arg Glu Gly

110                 115                 120                 125

gtg aaa gca ctg aaa gcc aaa ccg gtt gaa aaa gcc gcg cca gca ccc      494

Val Lys Ala Leu Lys Ala Lys Pro Val Glu Lys Ala Ala Pro Ala Pro

                130                 135                 140

gct gcc gca gca cca aaa gcg gct cca act ccg gca aaa cca atg ggg    542

Ala Ala Ala Ala Pro Lys Ala Ala Pro Thr Pro Ala Lys Pro Met Gly

            145                 150                 155

cca aac gac tac atg gtt att ggc ctt gcg cgt atc gac gac cgt ctg    590

Pro Asn Asp Tyr Met Val Ile Gly Leu Ala Arg Ile Asp Asp Arg Leu

        160                 165                 170

att cac ggt cag gtc gcc acc cgc tgg acc aaa gaa acc aat gtc tcc    638

Ile His Gly Gln Val Ala Thr Arg Trp Thr Lys Glu Thr Asn Val Ser

    175                 180                 185

cgt att att gtt gtt agt gat gaa gtg gct gcg gat acc gtt cgt aag    686

Arg Ile Ile Val Val Ser Asp Glu Val Ala Ala Asp Thr Val Arg Lys

190                 195                 200                 205

aca ctg ctc acc cag gtt gca cct ccg ggc gta aca gca cac gta gtt    734

Thr Leu Leu Thr Gln Val Ala Pro Pro Gly Val Thr Ala His Val Val

                210                 215                 220

gat gtt gcc aaa atg att cgc gtc tac aac aac ccg aaa tat gct ggc    782

Asp Val Ala Lys Met Ile Arg Val Tyr Asn Asn Pro Lys Tyr Ala Gly

            225                 230                 235

gaa cgc gta atg ctg tta ttt acc aac cca aca gat gta gag cgt ctc    830

Glu Arg Val Met Leu Leu Phe Thr Asn Pro Thr Asp Val Glu Arg Leu

        240                 245                 250

gtt gaa ggc ggc gtg aaa atc acc tct gtt aac gtc ggt ggt atg gca    878

Val Glu Gly Gly Val Lys Ile Thr Ser Val Asn Val Gly Gly Met Ala

    255                 260                 265

ttc cgt cag ggt aaa acc cag gtg aat aac gcg gtt tcg gtt gat gaa    926

Phe Arg Gln Gly Lys Thr Gln Val Asn Asn Ala Val Ser Val Asp Glu

270                 275                 280                 285

aaa gat atc gag gcg ttc aag aaa ctg aat gcg cgc ggt att gag ctg    974

Lys Asp Ile Glu Ala Phe Lys Lys Leu Asn Ala Arg Gly Ile Glu Leu

                290                 295                 300

gaa gtc cgt aag gtt tcc acc gat ccg aaa ctg aaa atg atg gat ctg    1022

Glu Val Arg Lys Val Ser Thr Asp Pro Lys Leu Lys Met Met Asp Leu

            305                 310                 315

atc agc aaa atc gat aag taa cgtattgtgt tgattatcac tcagttttca       1073

Ile Ser Lys Ile Asp Lys

        320

cacttaagtc ttacgtaaac aggagaagta ca atg gag att acc act ctt caa    1126

                                    Met Glu Ile Thr Thr Leu Gln

                                        325                 330

att gtg ctg gta ttt atc gta gcc tgt atc gca ggt atg gga tca atc    1174

Ile Val Leu Val Phe Ile Val Ala Cys Ile Ala Gly Met Gly Ser Ile

                335                 340                 345

ctc gat gaa ttt cag ttt cac cgt ccg cta atc gcg tgt acc ctg gtg    1222

Leu Asp Glu Phe Gln Phe His Arg Pro Leu Ile Ala Cys Thr Leu Val

            350                 355                 360

ggt atc gtt ctt ggg gat atg aaa acc ggt att att atc ggt ggt acg    1270

Gly Ile Val Leu Gly Asp Met Lys Thr Gly Ile Ile Ile Gly Gly Thr

        365                 370                 375

ctg gaa atg atc gcg ctg ggc tgg atg aac atc ggt gct gca gtt gcg    1318

Leu Glu Met Ile Ala Leu Gly Trp Met Asn Ile Gly Ala Ala Val Ala

    380                 385                 390

cct gac gcc gct ctg gct tct atc att tct acc att ctg gtt atc gca    1366

Pro Asp Ala Ala Leu Ala Ser Ile Ile Ser Thr Ile Leu Val Ile Ala

395                 400                 405                 410

ggt cat cag agc att ggt gca ggt atc gca ctg gca atc cct ctg gcc    1414

Gly His Gln Ser Ile Gly Ala Gly Ile Ala Leu Ala Ile Pro Leu Ala

                415                 420                 425

gct gcg ggc cag gta ctg acc atc atc gtt cgt act att acc gtt gct    1462

Ala Ala Gly Gln Val Leu Thr Ile Ile Val Arg Thr Ile Thr Val Ala

            430                 435                 440

ttc cag cac gct gcg gat aag gct gct gat aac ggc aac ctg aca gcg    1510

Phe Gln His Ala Ala Asp Lys Ala Ala Asp Asn Gly Asn Leu Thr Ala

        445                 450                 455

att tcc tgg atc cac gtt tct tct ctg ttc ctg caa gca atg cgt gtg    1558

Ile Ser Trp Ile His Val Ser Ser Leu Phe Leu Gln Ala Met Arg Val

    460                 465                 470

gct att ccg gcc gtc atc gtt gcg ctg tct gtt ggt acc agc gaa gta    1606

Ala Ile Pro Ala Val Ile Val Ala Leu Ser Val Gly Thr Ser Glu Val

475                 480                 485                 490

cag aac atg ctg aat gcg att ccg gaa gtg gtg acc aat ggt ctg aat    1654

Gln Asn Met Leu Asn Ala Ile Pro Glu Val Val Thr Asn Gly Leu Asn

                495                 500                 505

atc gcc ggt ggc atg atc gtg gtg gtt ggt tat gcg atg gtt atc aac    1702

Ile Ala Gly Gly Met Ile Val Val Val Gly Tyr Ala Met Val Ile Asn

            510                 515                 520

atg atg cgt gct ggc tac ctg atg ccg ttc ttc tac ctc ggc ttc gta    1750

Met Met Arg Ala Gly Tyr Leu Met Pro Phe Phe Tyr Leu Gly Phe Val

        525                 530                 535

acc gca gca ttc acc aac ttt aac ctg gtt gct ctg ggt gtg att ggt    1798

Thr Ala Ala Phe Thr Asn Phe Asn Leu Val Ala Leu Gly Val Ile Gly

    540                 545                 550

act gtt atg gca gtg ctc tac atc caa ctt agc ccg aaa tac aac cgc    1846

Thr Val Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln Leu Ser Pro Lys Tyr Asn Arg

555                 560                 565                 570

gta gcc ggt gcg cct gct cag gca gct ggt aac aac gat ctc gat aac    1894

Val Ala Gly Ala Pro Ala Gln Ala Ala Gly Asn Asn Asp Leu Asp Asn

                575                 580                 585

gaa ctg gac taa cag gtg agc gaa atg gtt gat aca act caa act acc    1942

Glu Leu Asp         Val Ser Glu Met Val Asp Thr Thr Gln Thr Thr

                    590                 595                 600

acc gag aaa aaa ctc act caa agt gat att cgt ggc gtc ttc ctg cgt    1990

Thr Glu Lys Lys Leu Thr Gln Ser Asp Ile Arg Gly Val Phe Leu Arg

                605                 610                 615

tct aac ctc ttc cag ggt tca tgg aac ttc gaa cgt atg cag gca ctg    2038

Ser Asn Leu Phe Gln Gly Ser Trp Asn Phe Glu Arg Met Gln Ala Leu

            620                 625                 630

ggt ttc tgc ttc tct atg gta ccg gca att cgt cgc ctc tac cct gag    2086

Gly Phe Cys Phe Ser Met Val Pro Ala Ile Arg Arg Leu Tyr Pro Glu

        635                 640                 645

aac aac gaa gct cgt aaa caa gct att cgc cgt cac ctg gag ttc ttt    2134

Asn Asn Glu Ala Arg Lys Gln Ala Ile Arg Arg His Leu Glu Phe Phe

    650                 655                 660

aac acc cag ccg ttc gtg gct gcg ccg att ctc ggc gta acc ctg gcg    2182

Asn Thr Gln Pro Phe Val Ala Ala Pro Ile Leu Gly Val Thr Leu Ala

665                 670                 675                 680

ctg gaa gaa cag cgt gct aat ggc gca gag atc gac gac ggt gct atc    2230

Leu Glu Glu Gln Arg Ala Asn Gly Ala Glu Ile Asp Asp Gly Ala Ile

                685                 690                 695

aac ggt atc aaa gtc ggt ttg atg ggg cca ctg gct ggt gta ggc gac    2278

Asn Gly Ile Lys Val Gly Leu Met Gly Pro Leu Ala Gly Val Gly Asp

            700                 705                 710

ccg atc ttc tgg gga acc gta cgt ccg gta ttt gca gca ctg ggt gcc    2326

Pro Ile Phe Trp Gly Thr Val Arg Pro Val Phe Ala Ala Leu Gly Ala

        715                 720                 725

ggt atc gcg atg agc ggc agc ctg tta ggt ccg ctg ctg ttc ttc atc    2374

Gly Ile Ala Met Ser Gly Ser Leu Leu Gly Pro Leu Leu Phe Phe Ile

    730                 735                 740

ctg ttt aac ctg gtg cgt ctg gca acc cgt tac tac ggc gta gcg tat    2422

Leu Phe Asn Leu Val Arg Leu Ala Thr Arg Tyr Tyr Gly Val Ala Tyr

745                 750                 755                 760

ggt tac tcc aaa ggt atc gat atc gtt aaa gat atg ggt ggt ggc ttc    2470

Gly Tyr Ser Lys Gly Ile Asp Ile Val Lys Asp Met Gly Gly Gly Phe

                765                 770                 775

ctg caa aaa ctg acg gaa ggg gcg tct atc ctc ggc ctg ttt gtc atg    2518

Leu Gln Lys Leu Thr Glu Gly Ala Ser Ile Leu Gly Leu Phe Val Met

            780                 785                 790

ggg gca ttg gtt aac aag tgg aca cat gtc aac atc ccg ctg gtt gtc    2566

Gly Ala Leu Val Asn Lys Trp Thr His Val Asn Ile Pro Leu Val Val

        795                 800                 805

tct cgc att act gac cag acg ggc aaa gaa cac gtt act act gtc cag    2614

Ser Arg Ile Thr Asp Gln Thr Gly Lys Glu His Val Thr Thr Val Gln

    810                 815                 820

act att ctg gac cag tta atg cca ggc ctg gta cca ctg ctg ctg acc    2662

Thr Ile Leu Asp Gln Leu Met Pro Gly Leu Val Pro Leu Leu Leu Thr

825                 830                 835                 840

ttt gct tgt atg tgg cta ctg cgc aaa aaa gtt aac ccg ctg tgg atc    2710

Phe Ala Cys Met Trp Leu Leu Arg Lys Lys Val Asn Pro Leu Trp Ile

                845                 850                 855

atc gtt ggc ttc ttc gtc atc ggt atc gct ggt tac gct tgc ggc ctg    2758

Ile Val Gly Phe Phe Val Ile Gly Ile Ala Gly Tyr Ala Cys Gly Leu

            860                 865                 870

ctg gga ctg taa                                                    2770

Leu Gly Leu

        875

<210>2

<211>323

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Val Thr Ile Ala Ile Val Ile Gly Thr His Gly Trp Ala Ala Glu Gln

1               5                   10                  15

Leu Leu Lys Thr Ala Glu Met Leu Leu Gly Glu Gln Glu Ash Val Gly

            20                  25                  30

Trp Ile Asp Phe Val Pro Gly Glu Asn Ala Glu Thr Leu Ile Glu Lys

        35                  40                  45

Tyr Asn Ala Gln Leu Ala Lys Leu Asp Thr Thr Lys Gly Val Leu Phe

    50                  55                  60

Leu Val Asp Thr Trp Gly Gly Ser Pro Phe Asn Ala Ala Ser Arg Ile

65                  70                  75                  80

Val Val Asp Lys Glu His Tyr Glu Val Ile Ala Gly Val Asn Ile Pro

                85                  90                  95

Met Leu Val Glu Thr Leu Met Ala Arg Asp Asp Asp Pro Ser Phe Asp

            100                 105                 110

Glu Leu Val Ala Leu Ala Val Glu Thr Gly Arg Glu Gly Val Lys Ala

        115                 120                 125

Leu Lys Ala Lys Pro Val Glu Lys Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Ala

    130                 135                 140

Ala Pro Lys Ala Ala Pro Thr Pro Ala Lys Pro Met Gly Pro Asn Asp

145                 150                 155                 160

Tyr Met Val Ile Gly Leu Ala Arg Ile Asp Asp Arg Leu Ile His Gly

                165                 170                 175

Gln Val Ala Thr Arg Trp Thr Lys Glu Thr Asn Val Ser Arg Ile Ile

            180                 185                 190

Val Val Ser Asp Glu Val Ala Ala Asp Thr Val Arg Lys Thr Leu Leu

        195                 200                 205

Thr Gln Val Ala Pro Pro Gly Val Thr Ala His Val Val Asp Val Ala

    210                 215                 220

Lys Met Ile Arg Val Tyr Asn Asn Pro Lys Tyr Ala Gly Glu Arg Val

225                 230                 235                 240

Met Leu Leu Phe Thr Asn Pro Thr Asp Val Glu Arg Leu Val Glu Gly

                245                 250                 255

Gly Val Lys Ile Thr Ser Val Asn Val Gly Gly Met Ala Phe Arg Gln

            260                 265                 270

Gly Lys Thr Gln Val Asn Asn Ala Val Ser Val Asp Glu Lys Asp Ile

        275                 280                 285

Glu Ala Phe Lys Lys Leu Asn Ala Arg Gly Ile Glu Leu Glu Val Arg

    290                 295                 300

Lys Val Ser Thr Asp Pro Lys Leu Lys Met Met Asp Leu Ile Ser Lys

305                 310                 315                 320

Ile Asp Lys

<210>3

<211>266

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>3

Met Glu Ile Thr Thr Leu Gln Ile Val Leu Val Phe Ile Val Ala Cys

1               5                   10                  15

Ile Ala Gly Met Gly Ser Ile Leu Asp Glu Phe Gln Phe His Arg Pro

            20                  25                  30

Leu Ile Ala Cys Thr Leu Val Gly Ile Val Leu Gly Asp Met Lys Thr

        35                  40                  45

Gly Ile Ile Ile Gly Gly Thr Leu Glu Met Ile Ala Leu Gly Trp Met

    50                  55                  60

Asn Ile Gly Ala Ala Val Ala Pro Asp Ala Ala Leu Ala Ser Ile Ile

65                  70                  75                  80

Ser Thr Ile Leu Val Ile Ala Gly His Gln Ser Ile Gly Ala Gly Ile

                85                  90                  95

Ala Leu Ala Ile Pro Leu Ala Ala Ala Gly Gln Val Leu Thr Ile Ile

            100                 105                 110

Val Arg Thr Ile Thr Val Ala Phe Gln His Ala Ala Asp Lys Ala Ala

        115                 120                 125

Asp Asn Gly Asn Leu Thr Ala Ile Ser Trp Ile His Val Ser Ser Leu

    130                 135                 140

Phe Leu Gln Ala Met Arg Val Ala Ile Pro Ala Val Ile Val Ala Leu

145                 150                 155                 160

Ser Val Gly Thr Ser Glu Val Gln Asn Met Leu Asn Ala Ile Pro Glu

                165                 170                 175

Val Val Thr Asn Gly Leu Asn Ile Ala Gly Gly Met Ile Val Val Val

            180                 185                 190

Gly Tyr Ala Met Val Ile Asn Met Met Arg Ala Gly Tyr Leu Met Pro

       195                 200                 205

Phe Phe Tyr Leu Gly Phe Val Thr Ala Ala Phe Thr Asn Phe Asn Leu

    210                 215                 220

Val Ala Leu Gly Val Ile Gly Thr Val Met Ala Val Leu Tyr Ile Gln

225                 230                 235                 240

Leu Ser Pro Lys Tyr Asn Arg Val Ala Gly Ala Pro Ala Gln Ala Ala

                245                 250                 255

Gly Asn Asn Asp Leu Asp Asn Glu Leu Asp

            260                 265

<210>4

<211>286

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>4

Val Ser Glu Met Val Asp Thr Thr Gln Thr Thr Thr Glu Lys Lys Leu

1               5                   10                  15

Thr Gln Ser Asp Ile Arg Gly Val Phe Leu Arg Ser Asn Leu Phe Gln

            20                  25                  30

Gly Ser Trp Asn Phe Glu Arg Met Gln Ala Leu Gly Phe Cys Phe Ser

         35                  40                  45

Met Val Pro Ala Ile Arg Arg Leu Tyr Pro Glu Asn Asn Glu Ala Arg

    50                  55                  60

Lys Gln Ala Ile Arg Arg His Leu Glu Phe Phe Asn Thr Gln Pro Phe

65                  70                  75                  80

Val Ala Ala Pro Ile Leu Gly Val Thr Leu Ala Leu Glu Glu Gln Arg

                85                  90                  95

Ala Asn Gly Ala Glu Ile Asp Asp Gly Ala Ile Asn Gly Ile Lys Val

            100                 105                 110

Gly Leu Met Gly Pro Leu Ala Gly Val Gly Asp Pro Ile Phe Trp Gly

        115                 120                 125

Thr Val Arg Pro Val Phe Ala Ala Leu Gly Ala Gly Ile Ala Met Ser

    130                 135                 140

Gly Ser Leu Leu Gly Pro Leu Leu Phe Phe Ile Leu Phe Asn Leu Val

145                 150                 155                 160

Arg Leu Ala Thr Arg Tyr Tyr Gly Val Ala Tyr Gly Tyr Ser Lys Gly

                165                 170                 175

Ile Asp Ile Val Lys Asp Met Gly Gly Gly Phe Leu Gln Lys Leu Thr

            180                 185                 190

Glu Gly Ala Ser Ile Leu Gly Leu Phe Val Met Gly Ala Leu Val Asn

        195                 200                 205

Lys Trp Thr His Val Asn Ile Pro Leu Val Val Ser Arg Ile Thr Asp

    210                 215                 220

Gln Thr Gly Lys Glu His Val Thr Thr Val Gln Thr Ile Leu Asp Gln

225                 230                 235                 240

Leu Met Pro Gly Leu Val Pro Leu Leu Leu Thr Phe Ala Cys Met Trp

                245                 250                 255

Leu Leu Arg Lys Lys Val Asn Pro Leu Trp Ile Ile Val Gly Phe Phe

            260                 265                 270

Val Ile Gly Ile Ala Gly Tyr Ala Cys Gly Leu Leu Gly Leu

        275                 280                 285

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>

<400>5

acacaccctg caggaaagga ggtagcaagt gacc                                          34

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>

<400>6

tgtgtctaga aaaggaattg ccagcagggt                                               30

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>

<400>7

cacaaaagct tcatactcag gagcactctc a                                             31

<210>8

<211>31

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>

<400>8

gtgtgtctag aaactggcaa aatcgcgtgt a                                             31

<210>9

<211>101

<212>DNA

<213>lambda噬菌体

<400>9

cctgcttttt tatactaagt tggcattata aaaaagcatt gcttatcaat ttgttgcaac             60

gaacaggtca ctatcagtca aaataaaatc attatttgat t                                 101

<210>10

<211>172

<212>DNA

<213>lambda噬菌体

<400>10

gcgctaatgc tctgttacag gtcactaata ccatctaagt agttgattca tagtgactgc             60

atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata             120

ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt tatactaact tg                     172

<210>11

<211>120

<212>DNA

<213>lambda噬菌体

<400>11

agatcttgaa gcctgctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat tgcttatcaa    60

tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga tttcgaattc    120

<210>12

<211>184

<212>DNA

<213>lambda噬菌体

<400>12

ctgcagtctg ttacaggtca ctaataccat ctaagtagtt gattcatagt gactgcatat    60

gttgtgtttt acagtattat gtagtctgtt ttttatgcaa aatctaattt aatatattga    120

tatttatatc attttacgtt tctcgttcag cttttttata ctaacttgag cgtctagaaa    180

gctt                                                                 184

<210>13

<211>1071

<212>DNA

<213>lambda噬菌体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1071)

<400>13

atg gga aga agg cga agt cat gag cgc cgg gat tta ccc cct aac ctt    48

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1               5                   10                  15

tat ata aga aac aat gga tat tac tgc tac agg gac cca agg acg ggt    96

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

            20                  25                  30

aaa gag ttt gga tta ggc aga gac agg cga atc gca atc act gaa gct    144

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala

        35                  40                  45

ata cag gcc aac att gag tta ttt tca gga cac aaa cac aag cct ctg    192

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

    50                  55                  60

aca gcg aga atc aac agt gat aat tcc gtt acg tta cat tca tgg ctt    240

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65                  70                  75                  80

gat cgc tac gaa aaa atc ctg gcc agc aga gga atc aag cag aag aca    288

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

                85                  90                  95

ctc ata aat tac atg agc aaa att aaa gca ata agg agg ggt ctg cct    336

Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

            100                 105                 110

gat gct cca ctt gaa gac atc acc aca aaa gaa att gcg gca atg ctc    384

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

        115                 120                 125

aat gga tac ata gac gag ggc aag gcg gcg tca gcc aag tta atc aga    432

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

    130                 135                 140

tca aca ctg agc gat gca ttc cga gag gca ata gct gaa ggc cat ata    480

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145                 150                 155                 160

aca aca aac cat gtc gct gcc act cgc gca gca aaa tca gag gta agg    528

Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg

                165                 170                 175

aga tca aga ctt acg gct gac gaa tac ctg aaa att tat caa gca gca    576

Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

            180                 185                 190

gaa tca tca cea tgt tgg ctc aga ctt gca atg gaa ctg gct gtt gtt    624

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

        195                 200                 205

acc ggg caa cga gtt ggt gat tta tgc gaa atg aag tgg tct gat atc    672

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile

    210                 215                 220

gta gat gga tat ctt tat gtc gag caa agc aaa aca ggc gta aaa att    720

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225                 230                 235                 240

gcc atc cca aca gca ttg cat att gat gct ctc gga ata tca atg aag    768

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

                245                 250                 255

gaa aca ctt gat aaa tgc aaa gag att ctt ggc gga gaa acc ata att    816

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

            260                 265                 270

gca tct act cgt cgc gaa ccg ctt tca tcc ggc aca gta tca agg tat    864

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

        275                 280                 285

ttt atg cgc gca cga aaa gca tca ggt ctt tcc ttc gaa ggg gat ccg    912

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

    290                 295                 300

cct acc ttt cac gag ttg cgc agt ttg tct gca aga ctc tat gag aag    960

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys

305                 310                 315                 320

cag ata agc gat aag ttt gct caa cat ctt ctc ggg cat aag tcg gac    1008

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp

                325                 330                 335

acc atg gca tca cag tat cgt gat gac aga ggc agg gag tgg gac aaa    1056

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

            340                 345                 350

att gaa atc aaa taa                                                1071

Ile Glu Ile Lys

        355

<210>14

<211>356

<212>PRT

<213>lambda噬菌体

<400>14

Met Gly Arg Arg Arg Ser His Glu Arg Arg Asp Leu Pro Pro Asn Leu

1               5                   10                  15

Tyr Ile Arg Asn Asn Gly Tyr Tyr Cys Tyr Arg Asp Pro Arg Thr Gly

            20                  25                  30

Lys Glu Phe Gly Leu Gly Arg Asp Arg Arg Ile Ala Ile Thr Glu Ala

        35                  40                  45

Ile Gln Ala Asn Ile Glu Leu Phe Ser Gly His Lys His Lys Pro Leu

    50                  55                  60

Thr Ala Arg Ile Asn Ser Asp Asn Ser Val Thr Leu His Ser Trp Leu

65                  70                  75                  80

Asp Arg Tyr Glu Lys Ile Leu Ala Ser Arg Gly Ile Lys Gln Lys Thr

                85                  90                  95

Leu Ile Asn Tyr Met Ser Lys Ile Lys Ala Ile Arg Arg Gly Leu Pro

            100                 105                 110

Asp Ala Pro Leu Glu Asp Ile Thr Thr Lys Glu Ile Ala Ala Met Leu

        115                 120                 125

Asn Gly Tyr Ile Asp Glu Gly Lys Ala Ala Ser Ala Lys Leu Ile Arg

    130                 135                 140

Ser Thr Leu Ser Asp Ala Phe Arg Glu Ala Ile Ala Glu Gly His Ile

145                 150                 155                 160

Thr Thr Asn His Val Ala Ala Thr Arg Ala Ala Lys Ser Glu Val Arg

                165                 170                 175

Arg Ser Arg Leu Thr Ala Asp Glu Tyr Leu Lys Ile Tyr Gln Ala Ala

            180                 185                 190

Glu Ser Ser Pro Cys Trp Leu Arg Leu Ala Met Glu Leu Ala Val Val

        195                 200                 205

Thr Gly Gln Arg Val Gly Asp Leu Cys Glu Met Lys Trp Ser Asp Ile

    210                 215                 220

Val Asp Gly Tyr Leu Tyr Val Glu Gln Ser Lys Thr Gly Val Lys Ile

225                 230                 235                 240

Ala Ile Pro Thr Ala Leu His Ile Asp Ala Leu Gly Ile Ser Met Lys

                245                 250                 255

Glu Thr Leu Asp Lys Cys Lys Glu Ile Leu Gly Gly Glu Thr Ile Ile

            260                 265                 270

Ala Ser Thr Arg Arg Glu Pro Leu Ser Ser Gly Thr Val Ser Arg Tyr

        275                 280                 285

Phe Met Arg Ala Arg Lys Ala Ser Gly Leu Ser Phe Glu Gly Asp Pro

    290                 295                 300

Pro Thr Phe His Glu Leu Arg Ser Leu Ser Ala Arg Leu Tyr Glu Lys

305                 310                 315                 320

Gln Ile Ser Asp Lys Phe Ala Gln His Leu Leu Gly His Lys Ser Asp

                325                 330                 335

Thr Met Ala Ser Gln Tyr Arg Asp Asp Arg Gly Arg Glu Trp Asp Lys

            340                 345                 350

Ile Glu Ile Lys

        355

<210>15

<211>219

<212>DNA

<213>lambda噬菌体

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(219)

<400>15

atg tac ttg aca ctt cag gag tgg aac gca cgc cag cga cgt cca aga    48

Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg

1               5                   10                  15

agc ctt gaa aca gtt cgt cga tgg gtt cgg gaa tgc agg ata ttc cca    96

Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro

            20                  25                  30

cct ccg gtt aag gat gga aga gag tat ctg ttc cac gaa tca gcg gta    144

Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val

        35                  40                  45

aag gtt gac tta aat cga cca gta aca ggt ggc ctt ttg aag agg atc    192

Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile

    50                  55                  60

aga aat ggg aag aag gcg aag tca tga                                219

Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser

65                  70

<210>16

<211>72

<212>PRT

<213>lambda噬菌体

<400>16

Met Tyr Leu Thr Leu Gln Glu Trp Asn Ala Arg Gln Arg Arg Pro Arg

1               5                   10                  15

Ser Leu Glu Thr Val Arg Arg Trp Val Arg Glu Cys Arg Ile Phe Pro

            20                  25                  30

Pro Pro Val Lys Asp Gly Arg Glu Tyr Leu Phe His Glu Ser Ala Val

        35                  40                  45

Lys Val Asp Leu Asn Arg Pro Val Thr Gly Gly Leu Leu Lys Arg Ile

    50                  55                  60

Arg Asn Gly Lys Lys Ala Lys Ser

65                 70

<210>17

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P1

<400>17

ctagtaagat cttgaagcct gcttttttat actaagttgg                                    40

<210>18

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P2

<400>18

atgatcgaat tcgaaatcaa ataatgattt tattttgact g                                   41

<210>19

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P3

<400>19

atgccactgc agtctgttac aggtcactaa taccatctaa g                                  41

<210>20

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P4

<400>20

accgttaagc tttctagacg ctcaagttag tataaaaaag ctgaac                             46

<210>21

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P5

<400>21

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc                                      38

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P6

<400>22

taacagagat ctcgcgcaga aaaaaaggat ctcaaga                                       37

<210>23

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P7

<400>23

aacagagatc taagcttaga tcctttgcct ggcggcagta gcgcgg                             46

<210>24

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P8

<400>24

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa                                         35

<210>25

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P9

<400>25

agtaattcta gaaagcttaa cacagaaaaa agcccg                                        36

<210>26

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P10

<400>26

ctagtaggat ccctgcagtg gtcgaaaaaa aaagcccgca ctg                                43

<210>27

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P11

<400>27

atcgaggtac cagatctccg gataagtaga cagcctg                                       37

<210>28

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P12

<400>28

gaaggtctag agcgcccggt tgacgctgct ag                                            32

<210>29

<211>1388

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的DNA片段EcoRI-PstI，包含四环素抗性基因(pBR322的小EcoRI-Van91I片段)和转录终止子

ter_thrL

<400>29

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt    60

aaattgctaa cgcagtcagg caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct    120

cggcaccgtc accctggatg ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct    180

cttgcgggat atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct    240

atatgcgttg atgcaatttc tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg    300

ccgccgccca gtcctgctcg cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc    360

gaccacaccc gtcctgtgga tcctctacgc cggacgcatc gtggccggca tcaccggcgc    420

cacaggtgcg gttgctggcg cctatatcgc cgacatcacc gatggggaag atcgggctcg    480

ccacttcggg ctcatgagcg cttgtttcgg cgtgggtatg gtggcaggcc ccgtggccgg    540

gggactgttg ggcgccatct ccttgcatgc accattcctt gcggcggcgg tgctcaacgg    600

cctcaaccta ctactgggct gcttcctaat gcaggagtcg cataagggag agcgtcgacc    660

gatgcccttg agagccttca acccagtcag ctccttccgg tgggcgcggg gcatgactat    720

cgtcgccgca cttatgactg tcttctttat catgcaactc gtaggacagg tgccggcagc    780

gctctgggtc attttcggcg aggaccgctt tcgctggagc gcgacgatga tcggcctgtc    840

gcttgcggta ttcggaatct tgcacgccct cgctcaagcc ttcgtcactg gtcccgccac    900

caaacgtttc ggcgagaagc aggccattat cgccggcatg gcggccgacg cgctgggcta    960

cgtcttgctg gcgttcgcga cgcgaggctg gatggccttc cccattatga ttcttctcgc    1020

ttccggcggc atcgggatgc ccgcgttgca ggccatgctg tccaggcagg tagatgacga    1080

ccatcaggga cagcttcaag gatcgctcgc ggctcttacc agcctaactt cgatcactgg    1140

accgctgatc gtcacggcga tttatgccgc ctcggcgagc acatggaacg ggttggcatg    1200

gattgtaggc gccgccctat accttgtctg cctccccgcg ttgcgtcgcg gtgcatggag    1260

ccgggccacc tcgacctgaa tggaagccgg cggcacctcg ctaacggatt caccactcca    1320

actagaaagc ttaacacaga aaaaagcccg cacctgacag tgcgggcttt ttttttcgac    1380

cactgcag                                                             1388

<210>30

<211>1162

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>包含人工DNA片段的克隆的DNA片段，包含启动子PA2(噬菌体T7的早期启动子)、氯霉素抗性的cat基因(CmR)、转录终止子ter_thrL和attR

<400>30

agatctccgg ataagtagac agcctgataa gtcgcacgaa aaacaggtat tgacaacatg    60

aagtaacatg cagtaagata caaatcgcta ggtaacacta gcagcgtcaa ccgggcgctc    120

tagctagagc caagctagct tggccggatc cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa    180

tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc ccaatggcat cgtaaagaac    240

attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa ccagaccgtt cagctggata    300

ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa gttttatccg gcctttattc    360

acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg tatggcaatg aaagacggtg    420

agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt tttccatgag caaactgaaa    480

cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg gcagtttcta cacatatatt    540

cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt ccctaaaggg tttattgaga    600

atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac cagttttgat ttaaacgtgg    660

ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg caaatattat acgcaaggcg    720

acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc cgtctgtgat ggcttccatg    780

tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga gtggcagggc ggggcgtaat    840

ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc tacgcctgaa taagtgataa    900

taagcggatg aatggcagaa attcgtcgaa gcttaacaca gaaaaaagcc cgcacctgac    960

agtgcgggct ttttttttcg accactgcag tctgttacag gtcactaata ccatctaagt    1020

agttgattca tagtgactgc atatgttgtg ttttacagta ttatgtagtc tgttttttat    1080

gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta cgtttctcgt tcagcttttt    1140

tatactaact tgagcgtcta ga                                             1162

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P1’

<400>31

ctaatatcga tgaagattct tgctcaa                                        27

<210>32

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P2’

<400>32

gcgttgaatt ccatacaacc tccttagtac atgc                                34

<210>33

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P3’

<400>33

gtactagaat tcgtgtaatt gcggagactt tgcg                                          34

<210>34

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P4’

<400>34

aatagcctgc agttatttga tttcaatttt gtcccactcc c                                  41

<210>35

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P5’

<400>35

ttcttagacg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgc                                      38

<210>36

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P6’

<400>36

taacagagat ctagcgcaga aaaaaaggat ctcaaga                                       37

<210>37

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P7’

<400>37

ataaactgca gcaaaaagag tttgtagaaa cgcaa                                         35

<210>38

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸P8’

<400>38

aacagaagct ttttgcctgg cggcagtagc gcgg                                          34

<210>39

<211>879

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的DNA片段，包含cI阻抑物基因和启动子区

<400>39

tcgatgaaga ttcttgctca attgttatca gctatgcgcc gaccagaaca ccttgccgat    60

cagccaaacg tctcttcagg ccactgacta gcgataactt tccccacaac ggaacaactc    120

tcattgcatg ggatcattgg gtactgtggg tttagtggtt gtaaaaacac ctgaccgcta    180

tccctgatca gtttcttgaa ggtaaactca tcacccccaa gtctggctat gcagaaatca    240

cctggctcaa cagcctgctc agggtcaacg agaattaaca ttccgtcagg aaagcttggc    300

ttggagcctg ttggtgcggt catggaatta ccttcaacct caagccagaa tgcagaatca    360

ctggcttttt tggttgtgct tacccatctc tccgcatcac ctttggtaaa ggttctaagc    420

tcaggtgaga acatccctgc ctgaacatga gaaaaaacag ggtactcata ctcacttcta    480

agtgacggct gcatactaac cgcttcatac atctcgtaga tttctctggc gattgaaggg    540

ctaaattctt caacgctaac tttgagaatt tttgcaagca atgcggcgtt ataagcattt    600

aatgcattga tgccattaaa taaagcacca acgcctgact gccccatccc catcttgtct    660

gcgacagatt cctgggataa gccaagttca tttttctttt tttcataaat tgctttaagg    720

cgacgtgcgt cctcaagctg ctcttgtgtt aatggtttct tttttgtgct catacgttaa    780

atctatcacc gcaagggata aatatctaac accgtgcgtg ttgactattt tacctctggc    840

ggtgataatg gttgcatgta ctaaggaggt tgtatggaa                           879

<210>40

<211>1290

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>克隆的DNA片段，包含int-xis基因

<400>40

attatttgat ttcaattttg tcccactccc tgcctctgtc atcacgatac tgtgatgcca    60

tggtgtccga cttatgcccg agaagatgtt gagcaaactt atcgcttatc tgcttctcat    120

agagtcttgc agacaaactg cgcaactcgt gaaaggtagg cggatcccct tcgaaggaaa    180

gacctgatgc ttttcgtgcg cgcataaaat accttgatac tgtgccggat gaaagcggtt    240

cgcgacgagt agatgcaatt atggtttctc cgccaagaat ctctttgcat ttatcaagtg    300

tttccttcat tgatattccg agagcatcaa tatgcaatgc tgttgggatg gcaattttta    360

cgcctgtttt gctttgctcg acataaagat atccatctac gatatcagac cacttcattt    420

cgcataaatc accaactcgt tgcccggtaa caacagccag ttccattgca agtctgagcc    480

aacatggtga tgattctgct gcttgataaa ttttcaggta ttcgtcagcc gtaagtcttg    540

atctccttac ctctgatttt gctgcgcgag tggcagcgac atggtttgtt gttatatggc    600

cttcagctat tgcctctcgg aatgcatcgc tcagtgttga tctgattaac ttggctgacg    660

ccgccttgcc ctcgtctatg tatccattga gcattgccgc aatttctttt gtggtgatgt    720

cttcaagtgg agcatcaggc agacccctcc ttattgcttt aattttgctc atgtaattta    780

tgagtgtctt ctgcttgatt cctctgctgg ccaggatttt ttcgtagcga tcaagccatg    840

aatgtaacgt aacggaatta tcactgttga ttctcgctgt cagaggcttg tgtttgtgtc    900

ctgaaaataa ctcaatgttg gcctgtatag cttcagtgat tgcgattcgc ctgtctctgc    960

ctaatccaaa ctctttaccc gtccttgggt ccctgtagca gtaatatcca ttgtttctta    1020

tataaaggtt agggggtaaa tcccggcgct catgacttcg ccttcttccc atttctgatc    1080

ctcttcaaaa ggccacctgt tactggtcga tttaagtcaa cctttaccgc tgattcgtgg    1140

aacagatact ctcttccatc cttaaccgga ggtgggaata tcctgcattc ccgaacccat    1200

cgacgaactg tttcaaggct tcttggacgt cgctggcgtg cgttccactc ctgaagtgtc    1260

aagtacatcg caaagtctcc gcaattacac                                     1290

<210>41

<211>351

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ter_rrnB片段(补体)

<400>41

caaaaagagt ttgtagaaac gcaaaaaggc catccgtcag gatggccttc tgcttaattt    60

gatgcctggc agtttatggc gggcgtcctg cccgccaccc tccgggccgt tgcttcgcaa    120

cgttcaaatc cgctcccggc ggatttgtcc tactcaggag agcgttcacc gacaaacaac    180

agataaaacg aaaggcccag tctttcgact gagcctttcg ttttatttga tgcctggcag    240

ttccctactc tcgcatgggg agaccccaca ctaccatcgg cgctacggcg tttcacttct    300

gagttcggca tggggtcagg tgggaccacc gcgctactgc cgccaggcaa a

<210>42

<211>2148

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2148)

<223>

<400>42

atg aac gtt att gca ata ttg aat cac atg ggg gtt tat ttt aaa gaa    48

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1               5                   10                  15

gaa ccc atc cgt gaa ctt cat cgc gcg ctt gaa cgt ctg aac ttc cag    96

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

            20                  25                  30

att gtt tac ccg aac gac cgt gac gac tta tta aaa ctg atc gaa aac    144

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

        35                  40                  45

aat gcg cgt ctg tgc ggc gtt att ttt gac tgg gat aaa tat aat ctc    192

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

    50                  55                  60

gag ctg tgc gaa gaa att agc aaa atg aac gag aac ctg ccg ttg tac    240

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65                  70                  75                  80

gcg ttc gct aat acg tat tcc act ctc gat gta agc ctg aat gac ctg    288

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

cgt tta cag att agc ttc ttt gaa tat gcg ctg ggt gct gct gaa gat    336

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

            100                 105                 110

att gct aat aag atc aag cag acc act gac gaa tat atc aac act att    384

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

        115                 120                 125

ctg cct ccg ctg act aaa gca ctg ttt aaa tat gtt cgt gaa ggt aaa    432

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

    130                 135                 140

tat act ttc tgt act cct ggt cac atg ggc ggt act gca ttc cag aaa    480

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145                 150                 155                 160

agc ccg gta ggt agc ctg ttc tat gat ttc ttt ggt ccg aat acc atg    528

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

                165                 170                 175

aaa tct gat att tcc att tca gta tct gaa ctg ggt tct ctg ctg gat    576

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

            180                 185                 190

cac agt ggt cca cac aaa gaa gca gaa cag tat atc gct cgc gtc ttt    624

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

        195                 200                 205

aac gca gac cgc agc tac atg gtg acc aac ggt act tcc act gcg aac    672

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

    210                 215                 220

aaa att gtt ggt atg tac tct gct cca gca ggc agc acc att ctg att    720

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225                 230                 235                 240

gac cgt aac tgc cac aaa tcg ctg acc cac ctg atg atg atg agc gat    768

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

                245                 250                 255

gtt acg cca atc tat ttc cgc ccg acc cgt aac gct tac ggt att ctt    816

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

            260                 265                 270

ggt ggt atc cca cag agt gaa ttc cag cac gct acc att gct aag cgc    864

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

        275                 280                 285

gtg aaa gaa aca cca aac gca acc tgg ccg gta cat gct gta att acc    912

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

    290                 295                 300

aac tct acc tat gat ggt ctg ctg tac aac acc gac ttc atc aag aaa     960

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305                 310                 315                 320

aca ctg gat gtg aaa tcc atc cac ttt gac tcc gcg tgg gtg cct tac    1008

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

                325                 330                 335

acc aac ttc tca ccg att tac gaa ggt aaa tgc ggt atg agc ggt ggc    1056

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

            340                 345                 350

cgt gta gaa ggg aaa gtg att tac gaa acc cag tcc act cac aaa ctg    1104

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

        355                 360                 365

ctg gcg gcg ttc tct cag gct tcc atg atc cac gtt aaa ggt gac gta    1152

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

    370                 375                 380

aac gaa gaa acc ttt aac gaa gcc tac atg atg cac acc acc act tct    1200

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385                 390                 395                 400

ccg cac tac ggt atc gtg gcg tcc act gaa acc gct gcg gcg atg atg    1248

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

                405                 410                 415

aaa ggc aat gca ggt aag cgt ctg atc aac ggt tct att gaa cgt gcg    1296

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

            420                 425                 430

atc aaa ttc cgt aaa gag atc aaa cgt ctg aga acg gaa tct gat ggc    1344

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

        435                 440                 445

tgg ttc ttt gat gta tgg cag ccg gat cat atc gat acg act gaa tgc    1392

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

    450                 455                 460

tgg ccg ctg cgt tct gac agc acc tgg cac ggc ttc aaa aac atc gat    1440

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465                 470                 475                 480

aac gag cac atg tat ctt gac ccg atc aaa gtc acc ctg ctg act ccg    1488

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

                485                 490                 495

ggg atg gaa aaa gac ggc acc atg agc gac ttt ggt att ccg gcc agc    1536

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

            500                 505                 510

atc gtg gcg aaa tac ctc gac gaa cat ggc atc gtt gtt gag aaa acc    1584

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

        515                 520                 525

ggt ccg tat aac ctg ctg ttc ctg ttc agc atc ggt atc gat aag acc    1632

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

    530                 535                 540

aaa gca ctg agc ctg ctg cgt gct ctg act gac ttt aaa cgt gcg ttc    1680

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545                 550                 555                 560

gac ctg aac ctg cgt gtg aaa aac atg ctg ccg tct ctg tat cgt gaa    1728

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

                565                 570                 575

gat cct gaa ttc tat gaa aac atg cgt att cag gaa ctg gct cag aat    1776

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

            580                 585                 590

atc cac aaa ctg att gtt cac cac aat ctg ccg gat ctg atg tat cgc    1824

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

        595                 600                 605

gca ttt gaa gtg ctg ccg acg atg gta atg act ccg tat gct gca ttc    1872

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

    610                 615                 620

cag aaa gag ctg cac ggt atg acc gaa gaa gtt tac ctc gac gaa atg    1920

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625                 630                 635                 640

gta ggt cgt att aac gcc aat atg atc ctt ccg tac ccg ccg gga gtt    1968

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

                645                 650                 655

cct ctg gta atg ccg ggt gaa atg atc acc gaa gaa agc cgt ccg gtt    2016

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

            660                 665                 670

ctg gag ttc ctg cag atg ctg tgt gaa atc ggc gct cac tat ccg ggc     2064

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

        675                 680                 685

ttt gaa acc gat att cac ggt gca tac cgt cag gct gat ggc cgc tat     2112

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

    690                 695                 700

acc gtt aag gta ttg aaa gaa gaa agc aaa aaa taa                     2148

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705                 710                 715

<210>43

<211>715

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>43

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

            20                  25                  30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

        35                  40                  45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

    50                  55                  60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

                85                  90                  95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

            100                 105                 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

        115                 120                 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

    130                 135                 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145                 150                 155                 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

                165                 170                 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

            180                 185                 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

        195                 200                 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

    210                 215                 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225                 230                 235                 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

                245                 250                 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

            260                 265                 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

        275                 280                 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

    290                 295                 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

                325                 330                 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tvr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

            340                 345                 350

Arg Val Glu Gly Lys Val lle Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

        355                 360                 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

    370                 375                 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385                 390                 395                 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

                405                 410                 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

            420                 425                 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

        435                 440                 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

    450                 455                 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465                 470                 475                 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

                485                 490                 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

            500                 505                 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

        515                 520                 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

    530                 535                 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545                 550                 555                 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

                565                 570                 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

            580                 585                 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

        595                 600                 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

    610                 615                 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625                 630                 635                 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

                645                 650                 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

            660                 665                 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

        675                 680                 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

    690                 695                 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705                 710                 715

<210>44

<211>2142

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2142)

<223>

<400>44

atg aac atc att gcc att atg gga ccg cat ggc gtc ttt tat aaa gat    48

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1               5                   10                  15

gag ccc atc aaa gaa ctg gag tcg gcg ctg gtg gcg caa ggc ttt cag    96

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

            20                  25                  30

att atc tgg cca caa aac agc gtt gat ttg ctg aaa ttt atc gag cat    144

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

        35                  40                  45

aac cct cga att tgc ggc gtg att ttt gac tgg gat gag tac agt ctc    192

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

    50                  55                  60

gat tta tgt agc gat atc aat cag ctt aat gaa tat ctc ccg ctt tat    240

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65                  70                  75                  80

gcc ttc atc aac acc cac tcg acg atg gat gtc agc gtg cag gat atg    288

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

                85                  90                  95

cgg atg gcg ctc tgg ttt ttt gaa tat gcg ctg ggg cag gcg gaa gat    336

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

            100                 105                 110

atc gcc att cgt atg cgt cag tac acc gac gaa tat ctt gat aac att    384

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

        115                 120                 125

aca ccg ccg ttc acg aaa gcc ttg ttt acc tac gtc aaa gag cgg aag    432

Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

    130                 135                 140

tac acc ttt tgt acg ccg ggg cat atg ggc ggc acc gca tat caa aaa    480

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys

145                 150                 155                 160

agc ccg gtt ggc tgt ctg ttt tat gat ttt ttc ggc ggg aat act ctt    528

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

                165                 170                 175

aag gct gat gtc tct att tcg gtc acc gag ctt ggt tcg ttg ctc gac    576

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

            180                 185                 190

cac acc ggg cca cac ctg gaa gcg gaa gag tac atc gcg cgg act ttt    624

His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

        195                 200                 205

ggc gcg gaa cag agt tat atc gtt acc aac gga aca tcg acg tcg aac    672

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

    210                 215                 220

aaa att gtg ggt atg tac gcc gcg cca tcc ggc agt acg ctg ttg atc    720

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225                 230                 235                 240

gac cgc aat tgt cat aaa tcg ctg gcg cat ctg ttg atg atg aac gat    768

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

                245                 250                 255

gta gtg cca gtc tgg ctg aaa ccg acg cgt aat gcg ttg ggg att ctt    816

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

            260                 265                 270

ggt ggg atc ccg cgc cgt gaa ttt act cgc gac agc atc gaa gag aaa    864

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

        275                 280                 285

gtc gct gct acc acg caa gca caa tgg ccg gtt cat gcg gtg atc acc    912

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

    290                 295                 300

aac tcc acc tat gat ggc ttg ctc tac aac acc gac tgg atc aaa cag    960

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305                 310                 315                 320

acg ctg gat gtc ccg tcg att cac ttc gat tct gcc tgg gtg ccg tac    1008

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

                325                 330                 335

acc cat ttt cat ccg atc tac cag ggt aaa agt ggt atg agc ggc gag    1056

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

            340                 345                 350

cgt gtt gcg gga aaa gtg atc ttc gaa acg caa tcg acc cac aaa atg    1104

Arg Val Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

        355                 360                 365

ctg gcg gcg tta tcg cag gct tcg ctg atc cac att aaa ggc gag tat    1152

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

    370                 375                 380

gac gaa gag gcc ttt aac gaa gcc ttt atg atg cat acc acc acc tcg    1200

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385                 390                 395                 400

ccc agt tat ccc att gtt gct tcg gtt gag acg gcg gcg gcg atg ctg    1248

Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

                405                 410                 415

cgt ggt aat ccg ggc aaa cgg ctg att aac cgt tca gta gaa cga gct    1296

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

            420                 425                 430

ctg cat ttt cgc aaa gag gtc cag cgg ctg cgg gaa gag tct gac ggt    1344

Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

        435                 440                 445

tgg ttt ttc gat atc tgg caa ccg ccg cag gtg gat gaa gcc gaa tgc    1392

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

    450                 455                 460

tgg ccc gtt gcg cct ggc gaa cag tgg cac ggc ttt aac gat gcg gat    1440

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465                 470                 475                 480

gcc gat cat atg ttt ctc gat ccg gtt aaa gtc act att ttg aca ccg    1488

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

                485                 490                 495

ggg atg gac gag cag ggc aat atg agc gag gag ggg atc ccg gcg gcg    1536

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

            500                 505                 510

ctg gta gca aaa ttc ctc gac gaa cgt ggg atc gta gta gag aaa acc    1584

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

        515                 520                 525

ggc cct tat aac ctg ctg ttt ctc ttt agt att ggc atc gat aaa acc    1632

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

    530                 535                 540

aaa gca atg gga tta ttg cgt ggg ttg acg gaa ttc aaa cgc tct tac    1680

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545                 550                 555                 560

gat ctc aac ctg cgg atc aaa aat atg cta ccc gat ctc tat gca gaa    1728

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

                565                 570                 575

gat ccc gat ttc tac cgc aat atg cgt att cag gat ctg gca caa ggg    1776

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

            580                 585                 590

atc cat aag ctg att cgt aaa cac gat ctt ccc ggt ttg atg ttg cgg    1824

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

        595                 600                 605

gca ttc gat act ttg ccg gag atg atc atg acg cca cat cag gca tgg    1872

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

    610                 615                 620

caa cga caa att aaa ggc gaa gta gaa acc att gcg ctg gaa caa ctg    1920

Gln Arg Gln Ile Lys Gly Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625                 630                 635                 640

gtc ggt aga gta tcg gca aat atg atc ctg cct tat cca ccg ggc gta    1968

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

                645                 650                 655

ccg ctg ttg atg cct gga gaa atg ctg acc aaa gag agc cgc aca gta     2016

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

            660                 665                 670

ctc gat ttt cta ctg atg ctt tgt tcc gtc ggg caa cat tac ccc ggt     2064

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

        675                 680                 685

ttt gaa acg gat att cac ggc gcg aaa cag gac gaa gac ggc gtt tac     2112

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

    690                 695                 700

cgc gta cga gtc cta aaa atg gcg gga taa                             2142

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705                 710

<210>45

<211>713

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>45

Met Asn Ile Ile Ala Ile Met Gly Pro His Gly Val Phe Tyr Lys Asp

1               5                   10                  15

Glu Pro Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gln Gly Phe Gln

            20                  25                  30

Ile Ile Trp Pro Gln Asn Ser Val Asp Leu Leu Lys Phe Ile Glu His

        35                  40                  45

Asn Pro Arg Ile Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Glu Tyr Ser Leu

    50                  55                  60

Asp Leu Cys Ser Asp Ile Asn Gln Leu Asn Glu Tyr Leu Pro Leu Tyr

65                  70                  75                  80

Ala Phe Ile Asn Thr His Ser Thr Met Asp Val Ser Val Gln Asp Met

                85                  90                  95

Arg Met Ala Leu Trp Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Gln Ala Glu Asp

            100                 105                 110

Ile Ala Ile Arg Met Arg Gln Tyr Thr Asp Glu Tyr Leu Asp Asn Ile

        115                 120                 125

Thr Pro Pro Phe Thr Lys Ala Leu Phe Thr Tyr Val Lys Glu Arg Lys

    130                 135                 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Tyr Gln Lys

145                 150                 155                 160

Ser Pro Val Gly Cys Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Gly Asn Thr Leu

                165                 170                 175

Lys Ala Asp Val Ser Ile Ser Val Thr Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

            180                 185                 190

His Thr Gly Pro His Leu Glu Ala Glu Glu Tyr Ile Ala Arg Thr Phe

        195                 200                 205

Gly Ala Glu Gln Ser Tyr Ile Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ser Asn

    210                 215                 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ala Ala Pro Ser Gly Ser Thr Leu Leu Ile

225                 230                 235                 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Ala His Leu Leu Met Met Asn Asp

                245                 250                 255

Val Val Pro Val Trp Leu Lys Pro Thr Arg Asn Ala Leu Gly Ile Leu

            260                 265                 270

Gly Gly Ile Pro Arg Arg Glu Phe Thr Arg Asp Ser Ile Glu Glu Lys

        275                 280                 285

Val Ala Ala Thr Thr Gln Ala Gln Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

    290                 295                 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Trp Ile Lys Gln

305                 310                 315                 320

Thr Leu Asp Val Pro Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

                325                 330                 335

Thr His Phe His Pro Ile Tyr Gln Gly Lys Ser Gly Met Ser Gly Glu

            340                 345                 350

ArgVal Ala Gly Lys Val Ile Phe Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Met

       355                 360                 365

Leu Ala Ala Leu Ser Gln Ala Ser Leu Ile His Ile Lys Gly Glu Tyr

    370                 375                 380

Asp Glu Glu Ala Phe Asn Glu Ala Phe Met Met His Thr Thr Thr Ser

385                 390                 395                 400

Pro Ser Tyr Pro Ile Val Ala Ser Val Glu Thr Ala Ala Ala Met Leu

                405                 410                 415

Arg Gly Asn Pro Gly Lys Arg Leu Ile Asn Arg Ser Val Glu Arg Ala

            420                 425                 430

Leu His Phe Arg Lys Glu Val Gln Arg Leu Arg Glu Glu Ser Asp Gly

        435                 440                 445

Trp Phe Phe Asp Ile Trp Gln Pro Pro Gln Val Asp Glu Ala Glu Cys

    450                 455                 460

Trp Pro Val Ala Pro Gly Glu Gln Trp His Gly Phe Asn Asp Ala Asp

465                 470                 475                 480

Ala Asp His Met Phe Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Ile Leu Thr Pro

                485                 490                 495

Gly Met Asp Glu Gln Gly Asn Met Ser Glu Glu Gly Ile Pro Ala Ala

            500                 505                 510

Leu Val Ala Lys Phe Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

        515                 520                 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

    530                 535                 540

Lys Ala Met Gly Leu Leu Arg Gly Leu Thr Glu Phe Lys Arg Ser Tyr

545                 550                 555                 560

Asp Leu Asn Leu Arg Ile Lys Asn Met Leu Pro Asp Leu Tyr Ala Glu

                565                 570                 575

Asp Pro Asp Phe Tyr Arg Asn Met Arg Ile Gln Asp Leu Ala Gln Gly

            580                 585                 590

Ile His Lys Leu Ile Arg Lys His Asp Leu Pro Gly Leu Met Leu Arg

        595                 600                 605

Ala Phe Asp Thr Leu Pro Glu Met Ile Met Thr Pro His Gln Ala Trp

    610                 615                 620

Gln Arg Gln Ile Lys Glv Glu Val Glu Thr Ile Ala Leu Glu Gln Leu

625                 630                 635                 640

Val Gly Arg Val Ser Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

                645                 650                 655

Pro Leu Leu Met Pro Gly Glu Met Leu Thr Lys Glu Ser Arg Thr Val

             660                 665                 670

Leu Asp Phe Leu Leu Met Leu Cys Ser Val Gly Gln His Tyr Pro Gly

        675                 680                 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Lys Gln Asp Glu Asp Gly Val Tyr

    690                 695                 700

Arg Val Arg Val Leu Lys Met Ala Gly

705                 710

<210>46

<211>54

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>cadA-attL

<400>46

tttgctttct tctttcaata ccttaacggt atagcgtgaa gcctgctttt ttat                    54

<210>47

<211>54

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>cadA-attR

<400>47

agatatgact atgaacgtta ttgcaatatt gaatcacgct caagttagta taaa                    54

<210>48

<211>54

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>ldcC attL

<400>48

ggaggaacac at gaacatca ttgccattat gggacctgaa gcctgctttt ttat                   54

<210>49

<211>53

<212>DNA

<213>人工DNA

<220>

<223>ldcC-attR

<400>49

cgccattttt aggactcgta cgcggtaaac gccgtccgtc aagttagtat aaa                     53

<210>50

<211>1434

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1434)

<223>ptsG

<400>50

atg ttt aag aat gca ttt gct aac ctg caa aag gtc ggt aaa tcg ctg        48

Met Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Gln Lys Val Gly Lys Ser Leu

1               5                   10                  15

atg ctg ccg gta tcc gta ctg cct atc gca ggt att ctg ctg ggc gtc        96

Met Leu Pro Val Ser Val Leu Pro Ile Ala Gly Ile Leu Leu Gly Val

            20                  25                  30

ggt tcc gcg aat ttc agc tgg ctg ccc gcc gtt gta tcg cat gtt atg    144

Gly Ser Ala Asn Phe Ser Trp Leu Pro Ala Val Val Ser His Val Met

        35                  40                  45

gca gaa gca ggc ggt tcc gtc ttt gca aac atg cca ctg att ttt gcg    192

Ala Glu Ala Gly Gly Ser Val Phe Ala Asn Met Pro Leu Ile Phe Ala

    50                  55                  60

atc ggt gtc gcc ctc ggc ttt acc aat aac gat ggc gta tcc gcg ctg    240

Ile Gly Val Ala Leu Gly Phe Thr Asn Asn Asp Gly Val Ser Ala Leu

65                  70                  75                  80

gcc gca gtt gtt gcc tat ggc atc atg gtt aaa acc atg gcc gtg gtt    288

Ala Ala Val Val Ala Tyr Gly Ile Met Val Lys Thr Met Ala Val Val

                85                  90                  95

gcg cca ctg gta ctg cat tta cct gct gaa gaa atc gcc tct aaa cac    336

Ala Pro Leu Val Leu His Leu Pro Ala Glu Glu Ile Ala Ser Lys His

            100                 105                 110

ctg gcg gat act ggc gta ctc gga ggg att atc tcc ggt gcg atc gca    384

Leu Ala Asp Thr Gly Val Leu Gly Gly Ile Ile Ser Gly Ala Ile Ala

        115                 120                 125

gcg tac atg ttt aac cgt ttc tac cgt att aag ctg cct gag tat ctt    432

Ala Tyr Met Phe Asn Arg Phe Tyr Arg Ile Lys Leu Pro Glu Tyr Leu

    130                 135                 140

ggc ttc ttt gcc ggt aaa cgc ttt gtg ccg atc att tct ggc ctg gct    480

Gly Phe Phe Ala Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Ile Ser Gly Leu Ala

145                 150                 155                 160

gcc atc ttt act ggc gtt gtg ctg tcc ttc att tgg ccg ccg att ggt    528

Ala Ile Phe Thr Gly Val Val Leu Ser Phe Ile Trp Pro Pro Ile Gly

                165                 170                 175

tct gca atc cag acc ttc tct cag tgg gct gct tac cag aac ccg gta    576

Ser Ala Ile Gln Thr Phe Ser Gln Trp Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Val

            180                 185                 190

gtt gcg ttt ggc att tac ggt ttc atc gaa cgt tgc ctg gta ccg ttt    624

Val Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Phe Ile Glu Arg Cys Leu Val Pro Phe

        195                 200                 205

ggt ctg cac cac atc tgg aac gta cct ttc cag atg cag att ggt gaa    672

Gly Leu His His Ile Trp Asn Val Pro Phe Gln Met Gln Ile Gly Glu

    210                 215                 220

tac acc aac gca gca ggt cag gtt ttc cac ggc gac att ccg cgt tat    720

Tyr Thr Asn Ala Ala Gly Gln Val Phe His Gly Asp Ile Pro Arg Tyr

225                 230                 235                 240

atg gcg ggt gac ccg act gcg ggt aaa ctg tct ggt ggc ttc ctg ttc    768

Met Ala Gly Asp Pro Thr Ala Gly Lys Leu Ser Gly Gly Phe Leu Phe

                245                 250                 255

aaa atg tac ggt ctg cca gct gcc gca att gct atc tgg cac tct gct    816

Lys Met Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ile Trp His Ser Ala

            260                 265                 270

aaa cca gaa aac cgc gcg aaa gtg ggc ggt att atg atc tcc gcg gcg    864

Lys Pro Glu Asn Arg Ala Lys Val Gly Gly Ile Met Ile Ser Ala Ala

        275                 280                 285

ctg acc tcg ttc ctg acc ggt atc acc gag ccg atc gag ttc tcc ttc    912

Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Ile Glu Phe Ser Phe

    290                 295                 300

atg ttc gtt gcg ccg atc ctg tac atc atc cac gcg att ctg gca ggc    960

Met Phe Val Ala Pro Ile Leu Tyr Ile Ile His Ala Ile Leu Ala Gly

305                 310                 315                 320

ctg gca ttc cca atc tgt att ctt ctg ggg atg cgt gac ggt acg tcg    1008

Leu Ala Phe Pro Ile Cys Ile Leu Leu Gly Met Arg Asp Gly Thr Ser

                325                 330                 335

ttc tcg cac ggt ctg atc gac ttc atc gtt ctg tct ggt aac agc agc    1056

Phe Ser His Gly Leu Ile Asp Phe Ile Val Leu Ser Gly Asn Ser Ser

            340                 345                 350

aaa ctg tgg ctg ttc ccg atc gtc ggt atc ggt tat gcg att gtt tac    1104

Lys Leu Trp Leu Phe Pro Ile Val Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Val Tyr

        355                 360                 365

tac acc atc ttc cgc gtg ctg att aaa gca ctg gat ctg aaa acg ccg    1152

Tyr Thr Ile Phe Arg Val Leu Ile Lys Ala Leu Asp Leu Lys Thr Pro

    370                 375                 380

ggt cgt gaa gac gcg act gaa gat gca aaa gcg aca ggt acc agc gaa    1200

Gly Arg Glu Asp Ala Thr Glu Asp Ala Lys Ala Thr Gly Thr Ser Glu

385                 390                 395                 400

atg gca ccg gct ctg gtt gct gca ttt ggt ggt aaa gaa aac att act    1248

Met Ala Pro Ala Leu Val Ala Ala Phe Gly Gly Lys Glu Asn Ile Thr

                405                 410                 415

aac ctc gac gca tgt att acc cgt ctg cgc gtc agc gtt gct gat gtg    1296

Asn Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg Leu Arg Val Ser Val Ala Asp Val

            420                 425                 430

tct aaa gtg gat cag gcc ggc ctg aag aaa ctg ggc gca gcg ggc gta    1344

Ser Lys Val Asp Gln Ala Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala Ala Gly Val

        435                 440                 445

gtg gtt gct ggt tct ggt gtt cag gcg att ttc ggt act aaa tcc gat    1392

Val Val Ala Gly Ser Gly Val Gln Ala Ile Phe Gly Thr Lys Ser Asp

    450                 455                 460

aac ctg aaa acc gag atg gat gag tac atc cgt aac cac taa            1434

Asn Leu Lys Thr Glu Met Asp Glu Tyr Ile Arg Asn His

465                 470                 475

<210>51

<211>477

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>51

Met Phe Lys Asn Ala Phe Ala Asn Leu Gln Lys Val Gly Lys Ser Leu

1               5                   10                  15

Met Leu Pro Val Ser Val Leu Pro Ile Ala Gly Ile Leu Leu Gly Val

            20                  25                  30

Gly Ser Ala Asn Phe Ser Trp Leu Pro Ala Val Val Ser His Val Met

        35                  40                  45

Ala Glu Ala Gly Gly Ser Val Phe Ala Asn Met Pro Leu Ile Phe Ala

    50                  55                  60

Ile Gly Val Ala Leu Gly Phe Thr Asn Asn Asp Gly Val Ser Ala Leu

65                  70                  75                  80

Ala Ala Val Val Ala Tyr Gly Ile Met Val Lys Thr Met Ala Val Val

                85                  90                  95

Ala Pro Leu Val Leu His Leu Pro Ala Glu Glu Ile Ala Ser Lys His

            100                 105                 110

Leu Ala Asp Thr Gly Val Leu Gly Gly Ile Ile Ser Gly Ala Ile Ala

        115                 120                 125

Ala Tyr Met Phe Asn Arg Phe Tyr Arg Ile Lys Leu Pro Glu Tyr Leu

    130                 135                 140

Gly Phe Phe Ala Gly Lys Arg Phe Val Pro Ile Ile Ser Gly Leu Ala

145                 150                 155                 160

Ala Ile Phe Thr Gly Val Val Leu Ser Phe Ile Trp Pro Pro Ile Gly

                165                 170                 175

Ser Ala Ile Gln Thr Phe Ser Gln Trp Ala Ala Tyr Gln Asn Pro Val

            180                 185                 190

Val Ala Phe Gly Ile Tyr Gly Phe Ile Glu Arg Cys Leu Val Pro Phe

        195                 200                 205

Gly Leu His His Ile Trp Asn Val Pro Phe Gln Met Gln Ile Gly Glu

    210                 215                 220

Tyr Thr Asn Ala Ala Gly Gln Val Phe His Gly Asp Ile Pro Arg Tyr

225                 230                 235                 240

Met Ala Gly Asp Pro Thr Ala Gly Lys Leu Ser Gly Gly Phe Leu Phe

                245                 250                 255

Lys Met Tyr Gly Leu Pro Ala Ala Ala Ile Ala Ile Trp His Ser Ala

            260                 265                 270

Lys Pro Glu Asn Arg Ala Lys Val Gly Gly Ile Met Ile Ser Ala Ala

        275                 280                 285

Leu Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Thr Glu Pro Ile Glu Phe Ser Phe

    290                 295                 300

Met Phe Val Ala Pro Ile Leu Tyr Ile Ile His Ala Ile Leu Ala Gly

305                 310                 315                 320

Leu Ala Phe Pro Ile Cys Ile Leu Leu Gly Met Arg Asp Gly Thr Ser

                325                 330                 335

Phe Ser His Gly Leu Ile Asp Phe Ile Val Leu Ser Gly Asn Ser Ser

            340                 345                 350

Lys Leu Trp Leu Phe Pro Ile Val Gly Ile Gly Tyr Ala Ile Val Tyr

        355                 360                 365

Tyr Thr Ile Phe Arg Val Leu Ile Lys Ala Leu Asp Leu Lys Thr Pro

    370                 375                 380

Gly Arg Glu Asp Ala Thr Glu Asp Ala Lys Ala Thr Gly Thr Ser Glu

385                 390                 395                 400

Met Ala Pro Ala Leu Val Ala Ala Phe Gly Gly Lys Glu Asn Ile Thr

                405                 410                 415

Asn Leu Asp Ala Cys Ile Thr Arg Leu Arg Val Ser Val Ala Asp Val

            420                 425                 430

Ser Lys Val Asp Gln Ala Gly Leu Lys Lys Leu Gly Ala Ala Gly Val

       435                 440                 445

Val Val Ala Gly Ser Gly Val Gln Ala Ile Phe Gly Thr Lys Ser Asp

    450                 455                 460

Asn Leu Lys Thr Glu Met Asp Glu Tyr Ile Arg Asn His

465                 470                 475

Claims (6)

1. 用于产生L-氨基酸的方法，其包括：在培养基中培养肠杆菌科的微生物，所述微生物具有产生L-氨基酸的能力，并且经修饰而将甘露糖PTS活性增强；和从所述培养基或微生物中收集L-氨基酸。

2. 根据权利要求1的方法，其中通过增加编码甘露糖PTS的manXYZ基因的拷贝数，或修饰所述基因的表达调节序列，或它们的组合，来修饰所述微生物以增强该基因的表达。

3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述manXYZ基因编码选自下组的蛋白质：

(A)选自下组：SEQ ID Nos.2、3、4的氨基酸序列，和它们的组合，

(B)选自下组的蛋白质：SEQ ID Nos.2、3和4的氨基酸序列，所述蛋白质包含一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入、添加或倒位并且具有甘露糖PTS活性。

4. 根据权利要求1-3中任一项的方法，其中所述manXYZ基因是选自下组的DNA：

(a)包含SEQ ID No.1中核苷酸号72至2767的核苷酸序列的DNA，

(b)在严紧条件下，与SEQ ID NO.1中核苷酸号72至2767的核苷酸序列的互补序列或能够从所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，并且所述DNA编码具有甘露糖PTS活性的蛋白质。

5. 根据权利要求1-4中任一项的方法，其中所述微生物是埃希氏菌属或泛菌属的细菌。

6. 根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸和它们的组合。

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