CN110387344A

CN110387344A - 生产l-亮氨酸的重组菌、其构建方法及l-亮氨酸的生产方法

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Publication number: CN110387344A
Application number: CN201810367158.0A
Authority: CN
Inventors: 温廷益; 胡启跳; 张芸; 刘树文
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-04-23
Filing date: 2018-04-23
Publication date: 2019-10-29
Anticipated expiration: 2038-04-23
Also published as: CN110387344B

Abstract

本发明涉及生产L‑亮氨酸的重组菌、其构建方法及L‑亮氨酸的生产方法。本发明所述的重组菌相比于出发菌具有降低的乳酸脱氢酶的表达，同时具有降低的下述一种或多种酶的表达：磷酸烯醇式丙酮酸合酶,丙氨酸转氨酶和，丙酮酸羧化酶。本发明所述重组菌的L‑亮氨酸的合成效率显著提高，同时副产物异亮氨酸，丙氨酸和乳酸的积累减少，有利于发酵后期产物的分离纯化。

Description

生产L-亮氨酸的重组菌、其构建方法及L-亮氨酸的生产方法

技术领域

本发明总地涉及生物技术领域，具体涉及生产L-亮氨酸的重组菌、其构建方法及L-亮氨酸的生产方法。

背景技术

L-亮氨酸是人体九种必需氨基酸之一，具有重要的生理作用。L-亮氨酸主要在骨骼肌中进行分解代谢，是唯一在肝外代谢的支链氨基酸。支链氨基酸为L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-缬氨酸的统称。这三种支链氨基酸约占骨骸肌蛋白质中必需氨基酸的35％，是体内主要的供能氨基酸。当机体受到严重创伤时，肌肉蛋白质大量分解，支链氨基酸作为维持机体能量的主要来源而被大量消耗，人体逐渐消瘦。此时补充支链氨基酸，尤其是L-亮氨酸，能够减少肌肉消耗，减少负氮平衡。因其重要的生理功能，L-亮氨酸主要应用于医药行业，是构成临床常用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，还具有治疗小儿突发性高血糖症和头晕，维持危重病人的营养需求等重要作用。同时，L-亮氨酸在食品和饲料行业上也具有广泛的应用，如L-亮氨酸与其他氨基酸配制成氨基酸能量饮料和运动员饮料，可以减轻肌肉疲劳、提高运动员的耐性；添加L-亮氨酸的饲料应用于畜牧业，能够节省蛋白质饲料，提高饲料利用率。

由于L-亮氨酸具有广泛的用途，其需求量逐年增高。L-亮氨酸可以通过蛋白质水解提取法获得，但是这种生产方式因具有污染严重、收率低、成本高、产品质量差和不易大规模生产等缺点而被淘汰。微生物直接发酵法以其原料易获得、环境污染较小、生产成本低等优点成为目前国内外生产L-亮氨酸的主要方法。获得高产L-亮氨酸的生产菌株是微生物直接发酵法的关键。

目前L-亮氨酸的生产菌株主要通过对谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和大肠杆菌(Escherichia coli)诱变育种获得。但该类菌株遗传背景不清楚，且积累大量无益突变，导致其具有生长性能差、营养需求高等缺点，因此构建高产L-亮氨酸的基因工程菌株具有重要意义。

构建高产L-亮氨酸的基因工程菌株的报道有，专利CN201611248621.7中，常静等人以紫外线和亚硝基胍对谷氨酸棒杆菌进行诱变，，获得了能够大量产生L-亮氨酸的菌株，保藏编号为CGMCC NO.13408，该菌株能够实现发酵过程中L-亮氨酸的高效积累，亮氨酸产量为5.7g/L；CN201511020699中，刘立明等人通过硫酸二乙酯对黄色短杆菌诱变，得到突变株FMME289，亮氨酸产量达到35.0～38.5g/L；CN03143850.4中，M·M·库斯亚廷纳等人通过在大肠杆菌中敲除支链氨基酸转氨酶编码基因(ilvE)，过表达芳香族转氨酶编码基因(tyrB)，L-亮氨酸积累达2.7g/L。

在菌株中，L-亮氨酸合成途径与L-异亮氨酸,L-缬氨酸合成途径交错偶联。L-缬氨酸和L-异亮氨酸合成途径中，葡萄糖通过糖酵解生成丙酮酸，2分子丙酮酸或1分子丙酮酸和1分子α-酮丁酸在4个共用酶催化下分别形成L-缬氨酸与L-异亮氨酸。L-亮氨酸则是由L-缬氨酸转氨前的α-酮异戊酸再经4步酶促反应生成。作为L-亮氨酸合成途径中重要前体，丙酮酸供给充足才能保证L-亮氨酸的高效合成，因此，增强前体物丙酮酸供给对高产L-亮氨酸也是十分重要的。然而丙酮酸节点与糖酵解途径(EMP)、磷酸戊糖途径(PPP)和三羧酸循环(TCA)等代谢途径紧密联系，代谢网络错综复杂。在以丙酮酸为前体的竞争代谢途径中，对单个竞争途径的失活只会改变部分途径的流量，并不能显著增加L-亮氨酸的产量；对所有竞争途径同时失活，可能导致细胞中代谢网络不平衡，某些中间产物过度积累，因此也不能显著提高亮氨酸产量。

所以，目前已有方法对于丙酮酸代谢节点的流量调控作用，以及提高丙酮酸用于L-亮氨酸合成的供给作用都十分有限。

发明内容

本发明的目的在于通过针对性优化丙酮酸节点代谢流量，增强丙酮酸的供给，从而提高工程菌的L-亮氨酸产量。

本发明提供了一种生产L-亮氨酸的重组菌，其中，所述重组菌相比于出发菌具有降低的乳酸脱氢酶的表达，同时具有降低的下述一种或多种酶的表达：磷酸烯醇式丙酮酸合酶,丙氨酸转氨酶，丙酮酸羧化酶。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌相比于出发菌具有提高的α-异丙基苹果酸异构酶的表达。更优选地，所述重组菌具有至少两个拷贝的α-异丙基苹果酸异构酶编码基因，和/或所述重组菌的α-异丙基苹果酸异构酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导。再优选地，所述调控元件为强启动子。还优选地，所述强启动子为Ptuf启动子。

优选地，根据前述的重组菌，其中，所述重组菌相比于出发菌具有降低的L-亮氨酸合成基因阻遏蛋白的表达；所述重组菌相比于出发菌具有降低的苏氨酸脱氨酶的表达。

优选地，根据前述的重组菌，所述重组菌具有至少一个拷贝的α-异丙基苹果酸合成酶编码基因，所述α-异丙基苹果酸合成酶编码基因如SEQ ID NO.3所示。

更优选地，根据前述的重组菌，其中，所述降低酶的表达通过将所述出发菌中所述酶编码基因失活实现，或将所述重组菌的所述酶编码基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导。优选地，所述调控元件为启动子和/或核糖体结合位点。

再优选地，根据前述的重组菌，其中，其中所述出发菌为选自棒杆菌属、小杆菌属、短杆菌属中的一株细菌。优选地，所述棒杆菌属的细菌选自谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、有效棒杆菌Corynebacteriumefficiens、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum、嗜热产氨棒杆菌Corynebacteriumthermoaminogenes、产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes、百合棒杆菌Corynebacterium lilium、美棒杆菌Corynebacterium callunae和力士棒杆菌Corynebacterium herculis中的一株细菌；所述小杆菌属的细菌选自嗜氨小杆菌Microbacterium ammoniaphilum中的一株细菌；和所述短杆菌属的细菌选自黄色短杆菌Brevibacteriaceae flvum、乳酸发酵短杆菌Brevibacteriaceae lactofermentum和产氨短杆菌Brevibacteriaceae ammoniagenes中的一株细菌。

本发明还提供一种前述重组菌的构建方法，其中，包括如下步骤：

降低所述出发菌中乳酸脱氢酶的表达；

降低所述出发菌中下述一种或多种酶的表达：磷酸烯醇式丙酮酸合酶，丙氨酸转氨酶,丙酮酸羧化酶。

优选地，根前述重组菌的构建方法，其中，包括如下步骤：

提高所述出发菌中α-异丙基苹果酸异构酶的表达；

降低所述出发菌中L-亮氨酸合成基因阻遏蛋白的表达；

降低所述出发菌中苏氨酸脱氨酶的表达；

向出发菌中导入α-异丙基苹果酸异构酶编码基因或增加α-异丙基苹果酸异构酶编码基因的拷贝数，所述α-异丙基苹果酸异构酶编码基因如SEQ ID NO.3所示。

更优选地，根前述重组菌的构建方法，其中，

所述降低酶的表达通过以下任一方式实现：

(A)将所述出发菌中该酶编码基因失活，

(B)将所述出发菌中该酶编码基因的调控元件替换为低转录或低表达活性的调控元件，优选地，所述调控元件为启动子和/或核糖体结合位点；

所述提高酶的表达通过以下任一方式实现：

(C)增加所述出发菌中该酶编码基因的拷贝数；

(D)将所述出发菌中该酶编码基因的调控元件替换为高转录或高表达活性的调控元件，优选地，所述调控元件为启动子和/或核糖体结合位点。

本发明还提供一种L-亮氨酸的生产方法，其中，发酵前述任一重组菌或采用前述任一构建方法构建的重组菌，获得L-亮氨酸。

优选地，在所述发酵过程的重组菌生长期，向发酵体系中按照补料速率梯度流加异亮氨酸，所述补料速率梯度为0-6h，0g/L/h；6-14h，0～0.015g/L/h；14-20h 0.015～0.025g/L/h；20－25h，0.02-0.06g/L/h；25-35h，0.04-0.08g/L/h。优选地,所述补料速率梯度为0-10h，0g/L/h；10-14h，0.01g/L/h；14-18h，0.01584g/L/h；18-20.5h，0.02g/L/h；20.5-25h，0.04g/L/h；25-30h，0.06g/L/h。

本发明采用组合优化的方法，对多个竞争途径同时失活，最优化丙酮酸节点代谢流量，筛选到了最有利于L-亮氨酸合成的组合。

相比于其它方法，本发明能够显著提高菌株L-亮氨酸的合成效率，同时减少副产物异亮氨酸，丙氨酸和乳酸的积累，有利于发酵后期产物的分离纯化。

本发明所述的L-亮氨酸工程菌，发酵结束时的L-亮氨酸产量为0.1～30g/L。

附图说明

图1为质粒pWYE1703的示意图；

图2为质粒pWYE1704的示意图；

图3为质粒pWYE1702的示意图；

图4为质粒pWYE1707的示意图；

图5为质粒pWYE1718的示意图；

图6为质粒pWYE1705的示意图；

图7为质粒pWYE1719的示意图；

图8为质粒pWYE1720的示意图；

图9为实施例7中“一、高产_L-亮氨酸工程菌的摇瓶发酵”产L-亮氨酸的结果；

图10为实施例7CG757的发酵罐发酵时异亮氨酸梯度流加速度；

图11为实施例7CG757的发酵罐发酵过程曲线图，其中，OD为光密度。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

本发明所述的“出发菌”是指用于本发明基因改造策略的初始菌株。该菌株可以是天然存在的菌株，也可以是通过诱变或遗传工程改造等方式选育的菌株。为构建用于生产L-亮氨酸的工程菌，所述出发菌优选为可积累L-亮氨酸的菌株。具体可为下述通过遗传工程改造的CG739等。

本发明所述的失活指的是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果，包括但是不限于，定点突变、插入失活和/或敲除。

本发明所述的基因敲除、基因插入、启动子替换和定点突变的方法能够为通过载体携带改造靶基因的同源臂发生同源重组实现。

本发明所述的导入某基因或增加某基因的拷贝数可通过构建包含该基因的载体，再将载体导入出发菌中实现，或也可直接将某基因插入出发菌染色体上的合适位点实现。

本发明所述的低转录或低表达活性的调控元件，在本发明中没有特别限制，只要能够起到降低所启动基因的表达即可。

本发明所述的高转录或高表达活性的调控元件，在本发明中没有特别限制，只要能够起到提高所启动基因的表达即可。

本发明提及的方法中各步骤的执行顺序，除特别说明外，并不限于本文的文字所体现出来的顺序，也就是说，各个步骤的执行顺序是可以改变的，而且两个步骤之间根据需要可以插入其他步骤。

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032购自美国模式培养物集存库(http://www.atcc.org/，简称ATCC)，简称谷氨酸棒杆菌ATCC13032或C.glutamicumATCC13032。

谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA全序列的GenBank序列号(LOCUS)为BA000036，编号(ACCESSION)为BA000036AP005274-AP005283。

实施例中所用引物序列见引物序列表。下述实施例中的PCR产物均为采用相应引物扩增序列表中相应序列所得，本领域技术人员根据PCR原理可不付出创造性劳动且毫无疑义地确定PCR产物的具体序列。

实施例1：L-亮氨酸底盘工程菌CG739的构建

一、亮氨酸合成阻遏蛋白编码基因ltbR的失活和leuCD基因的增强表达

leuCD和leuB基因分别编码α-异丙基苹果酸异构酶和α-异丙基苹果酸脱氢酶，这两个酶分别催化_L-亮氨酸终端合成途径的第二步和第三步反应，增强这两个基因的表达能够提高_L-亮氨酸产量。然而，leuCD和leuB基因受到ltbR基因编码的L-亮氨酸合成阻遏蛋白的反馈阻遏。因此，失活ltbR基因，能够提高leuCD和leuB基因的表达，从而提高亮氨酸产量。在本实例中，通过敲除ltbR基因启动子达到失活该基因的目的。

在野生型谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组上，ltbR基因与leuCD基因相邻并反向排列。因此将两基因编码序列之间的序列替换为起始leuCD基因转录的强启动子P_tuf，同时缺失ltbR基因的启动子，使ltbR基因无法表达。

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ltbR基因及其上下游序列和P_tuf启动子序列分别设计引物。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增被替换启动子leuCD的上游同源臂；以P3和P4为引物扩增启动子P_tuf；以P5和P6为引物扩增被替换启动子leuCD的下游同源臂(序列1)。

其中，序列1自5’末端第1-500位核苷酸为被替换启动子leuCD的上游同源臂，序列1自5’末端第501-700位核苷酸为启动子P_tuf，序列1自5’末端第701-1200位核苷酸为被替换启动子leuCD的下游同源臂。

将上述三个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB(购自美国典型微生物保藏中心ATCC，货号87097)进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的三个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1356bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1703(pK18mobsacB-P_tuf::leuCD)(图1)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1703电转化至谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P9和P10为引物进行PCR扩增鉴定，得到1263bp的为重组菌，命名为CG733(WT-P_tuf::leuCD)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将谷氨酸棒杆菌野生型ATCC13032中的ltbR基因和leuCD编码序列间区域替换为leuCD方向的谷氨酸棒杆菌内源强启动子P_tuf，谷氨酸棒杆菌CG733(WT-P_tuf::leuCD)构建成功。

二、苏氨酸脱氨酶基因ilvA的敲除

如上所述，由于三种支链氨基酸合成途径交错偶联，亮氨酸合成途径上相关酶过表达时，也会触发其他两种氨基酸的过量合成，尤其是L-异亮氨酸。L-异亮氨酸合成前体为丙酮酸和α-酮丁酸，而α-酮丁酸主要来源为苏氨酸脱氨酶催化苏氨酸脱氨基。因此失活苏氨酸脱氨酶，能够减少副产物异亮氨酸的生成，同时减少前体丙酮酸消耗。本实例中通过苏氨酸脱氨酶编码基因ilvA达到失活苏氨酸脱氨酶的目的。

根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ilvA基因及其上下游序列序列分别设计引物。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P11和P12为引物PCR扩增被敲除基因ilvA的上游同源臂；以P13和P14为引物扩增被敲除基因ilvA的下游同源臂(序列2)。

其中，序列2自5’末端第1-500位核苷酸为被敲除基因ilvA的上游同源臂，序列2自5’末端第501-1811位核苷酸为ilvA基因，序列2自5’末端第1812-2311位核苷酸为被敲除基因ilvA的下游同源臂。

将上述两个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的两个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1129bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1704(pK18mobsacB-△ilvA)(图2)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1704电转化至CG733中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P15和P16为引物进行PCR扩增鉴定，得到1654bp的为重组菌，命名为CG735(WT-P_tuf::leuCD△ilvA)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG733中的ilvA基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG735(WT-P_tuf::leuCD△ilvA)构建成功。

三、L-亮氨酸底盘工程菌CG739的构建

α-异丙基苹果酸合成酶(编码基因leuA)催化L-缬氨酸前体α-酮异戊酸和乙酰辅酶A合成α-异丙基苹果酸，此步是L-亮氨酸终端合成途径的第一个酶。然而α-异丙基苹果酸合成酶受到L-亮氨酸的反馈抑制，因此解除L-亮氨酸对α-异丙基苹果酸合成酶的抑制能够提高L-亮氨酸合成的效率，从而提高L-亮氨酸产量。本实例中，通过在质粒上过表达序列3编码的突变型α-异丙基苹果酸合成酶来解除L-亮氨酸对其的反馈抑制。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，分别以P17/P18和P19/P20为引物PCR扩增leuA基因上下片段。采用叠延伸PCR技术(SOE)将两个片段连接，以扩增的leuA基因上下片段为模板，用P17和P20为引物进行PCR扩增，得到1881bp的PCR产物为定点突变后的leuA基因(序列3，leuA^fbr)。

其中，序列3是解除反馈抑制的α-异丙基苹果酸合成酶编码序列，具体为第1586位的G突变为A和第1595位的G突变为A。

将上述PCR产物经XbaI和EcoRI双酶切后，与经同样双酶切处理的谷氨酸棒杆菌-大肠杆菌穿梭表达质粒pXMJ19连接。连接产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含氯霉素(10μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P21和P22为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2049bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子液体培养并提取质粒。并测序，测序正确的质粒命名为pWYE1702(pXMJ19-leuA^fbr)。经测序验证，证实已将leuA基因的第1586位的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(G)替换为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)，将第1595位的鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(G)替换为腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)。构建成功的质粒命名为pWYE1702(pXMJ19-leuA^fbr)(图3)。

亮氨酸底盘工程菌CG739为将重组质粒pWYE1702转入工程菌CG735得到的菌，具体如下：

将质粒pWYE1702转化至上述构建的谷氨酸棒杆菌CG735中，以P21和P22为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2049bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，L-亮氨酸底盘工程菌CG739(WT-P_tuf::leuCD△ilvA/pXMJ19-leuA^fbr)构建成功。

实施例2：L-亮氨酸工程菌CG755和CG757的构建

充足的丙酮酸的供给是L-亮氨酸高效生物合成的保证，因此，增强前体物丙酮酸供给对高产L-亮氨酸至关重要。

然而丙酮酸节点与糖酵解途径、磷酸戊糖途径和三羧酸循环等代谢途径紧密联系，代谢网络错综复杂：大部分丙酮酸经丙酮酸脱氢酶复合体催化形成乙酰辅酶A进入三羧酸循环，提供能量。一部分丙酮酸由磷酸烯醇式丙酮酸合成酶(Pps)催化生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)，PEP与丙酮酸分别经磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶(Pyc)催化生成草酰乙酸，草酰乙酸再次进入三羧酸循环进行能量代谢。另一部分的丙酮酸则由乳酸脱氢酶(LdhA)催化生成乳酸，由丙氨酸转氨酶(AlaT)催化生成丙氨酸，或者由乙酰羟酸合成酶(AHAS)催化生成缬氨酸及亮氨酸。

为针对性优化丙酮酸节点代谢流量，增强丙酮酸供给，减少副产物乳酸的生成，分别单独失活磷酸烯醇式丙酮酸合酶和乳酸脱氢酶，以及同时失活两个酶。本实例中，具体通过敲除磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps和乳酸脱氢酶基因ldhA达到失活磷酸烯醇式丙酮酸合酶和乳酸脱氢酶目的。

一、磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因pps的敲除

如上所述，pps基因编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶，催化丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。为敲除pps基因，根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pps基因及其上下游序列序列分别设计引物。具体如下。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P23和P24为引物PCR扩增被敲除基因pps的上游同源臂；以P25和P26为引物扩增被敲除基因pps的下游同源臂(序列4)。

其中，序列4自5’末端第1-500位核苷酸为被敲除基因pps的上游同源臂，序列4自5’末端第501-1595位核苷酸为pps基因，序列4自5’末端第1596-2095位核苷酸为被敲除基因pps的下游同源臂。

将上述两个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的两个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1165bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1707(pK18mobsacB-△pps)(图4)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1707电转化至CG735中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P27和P28为引物进行PCR扩增鉴定，得到1656bp的为重组菌，命名为CG749(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG735中的pps基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG749(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps)构建成功。

二、乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除

如上所述，ldhA基因编码乳酸脱氢酶，催化丙酮酸生成乳酸。为敲除ldhA基因，根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ldhA基因及其上下游序列序列分别设计引物。具体如下。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P29和P30为引物PCR扩增ldhA的上游同源臂；以P31和P32为引物扩增ldhA的下游同源臂(序列5)。

其中，序列5自5’末端第1-704位核苷酸为被敲除基因ldhA的上游同源臂，序列5自5’末端第705-1649位核苷酸为ldhA基因，序列5自5’末端第1650-2375位核苷酸为被敲除基因ldhA的下游同源臂。

将上述两个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的两个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1595bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1718(pK18mobsacB-△ldhA)(图5)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1718电转化至CG749中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P33和P34为引物进行PCR扩增鉴定，得到2225bp的为重组菌，命名为CG751(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps△ldhA)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG749中的ldhA基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG751(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps△ldhA)构建成功。

三、L-亮氨酸工程菌CG755和CG757的构建

亮氨酸工程菌CG755和CG757为将重组质粒pWYE1702分别转入CG749和CG751得到的菌，具体如下：

将质粒pWYE1702分别转化至上述构建的谷氨酸棒杆菌CG749和CG751中，以P21和P22为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2049bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，_L-亮氨酸工程菌CG755(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps/pXMJ19-leuA^fbr)和CG757(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps△ldhA/pXMJ19-leuA^fbr)构建成功。

实施例3：L-亮氨酸工程菌CG756，CG758和CG760的构建

如前所述，为针对性优化丙酮酸节点代谢流量，增强丙酮酸供给，同时减少副产物乳酸和丙氨酸的生成，分别单独失活乳酸脱氢酶和丙氨酸转氨酶，以及同时失活两个酶。本实例中，具体通过敲除乳酸脱氢酶基因ldhA和丙氨酸转氨酶基因alaT达到失活乳酸脱氢酶和丙氨酸转氨酶目的。

一、乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除

将前述用于ldhA敲除的同源重组质粒pWYE1718电转化至CG735中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P33和P34为引物进行PCR扩增鉴定，得到2225bp的为重组菌，命名为CG750(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△ldhA)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG735中的ldhA基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG750(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△ldhA)构建成功。

二、丙氨酸转氨酶基因alaT的敲除

如前所述，alaT基因编码丙氨酸转氨酶，催化丙酮酸生成丙氨酸。为敲除丙氨酸转氨酶基因alaT，根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的alaT基因及其上下游序列序列分别设计引物。具体如下。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P35和P36为引物PCR扩增alaT的上游同源臂；以P37和P38为引物扩增alaT的下游同源臂(序列6)。

其中，序列6自5’末端第1-507位核苷酸为被敲除基因alaT的上游同源臂，序列6自5’末端第508-1821位核苷酸为alaT基因，序列6自5’末端第1822-2395位核苷酸为被敲除基因alaT的下游同源臂。

将上述两个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的两个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1247bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1705(pK18mobsacB-△alaT)(图6)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1705分别电转化至CG735和CG750中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P39和P40为引物进行PCR扩增鉴定，得到1695bp的为重组菌，分别命名为CG752(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△alaT)和CG754(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△ldhA△alaT)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG735和CG750中的ldhA基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG752(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△alaT)和CG754(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△ldhA△alaT)构建成功。

三、L-亮氨酸工程菌CG756，CG758和CG760的构建

亮氨酸工程菌CG756，CG758和CG760为将重组质粒pWYE1702分别转入CG750，CG752和CG754得到的菌，具体如下：

将质粒pWYE1702分别转化至上述构建的谷氨酸棒杆菌CG750，CG752和CG754中，以P21和P22为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2049bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，L-亮氨酸工程菌CG756(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△ldhA/pXMJ19-leuA^fbr)，CG758(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△alaT/pXMJ19-leuA^fbr)和CG760(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△ldhA△alaT/pXMJ19-leuA^fbr)构建成功。

实施例4：L-亮氨酸工程菌CG740和CG741的构建

如前所述，为针对性优化丙酮酸节点代谢流量，增强丙酮酸供给，分别单独失活丙酮酸羧化酶及同时失活乳酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶。本实例中，具体通过敲除丙酮酸羧化酶基因pyc和乳酸脱氢酶基因ldhA达到失活丙酮酸羧化酶和乳酸脱氢酶的目的。

一、丙酮酸羧化酶基因pyc的敲除

如上所述，pyc基因编码丙酮酸羧化酶，催化丙酮酸生成草酰乙酸。为敲除pyc基因,根据Genbank中谷氨酸棒杆菌ATCC13032的pyc基因及其上下游序列序列分别设计引物。具体如下。

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P41和P42为引物PCR扩增pyc的上游同源臂；以P43和P44为引物扩增pyc的下游同源臂(序列7)。

其中，序列7自5’末端第1-727位核苷酸为被敲除基因pyc的上游同源臂，序列7自5’末端第728-4150位核苷酸为pyc基因，序列7自5’末端第4151-4850位核苷酸为被敲除基因pyc的下游同源臂。

将上述两个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的两个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到1592bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1719(pK18mobsacB-△pyc)(图7)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1719电转化至CG735中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P45和P46为引物进行PCR扩增鉴定，得到2061bp的为重组菌，命名为CG736(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG735中的pyc基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG736(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc)构建成功。

二、乳酸脱氢酶基因ldhA的敲除

将前述用于ldhA敲除的同源重组质粒pWYE1718电转化至CG736中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P33和P34为引物进行PCR扩增鉴定，得到2225bp的为重组菌，命名为CG737(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc△ldhA)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG736中的ldhA基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG737(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc△ldhA)构建成功。

三、L-亮氨酸工程菌CG740和CG741的构建

亮氨酸工程菌CG740和CG741为将重组质粒pWYE1702分别转入工程菌CG736和CG737得到的菌，具体如下：

将质粒pWYE1702分别转化至上述构建的谷氨酸棒杆菌CG736和CG737中，以P21和P22为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2049bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，_L-亮氨酸底盘工程菌CG740(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc/pXMJ19-leuA^fbr)和CG741(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc△ldhA/pXMJ19-leuA^fbr)构建成功。

实施例5：L-亮氨酸工程菌CG742的构建

如前所述，为针对性优化丙酮酸节点代谢流量，增强丙酮酸供给，同时减少副产物乳酸和丙氨酸，同时失活乳酸脱氢酶，丙酮酸羧化酶和丙氨酸转氨酶。本实例中，具体通过敲除乳酸脱氢酶基因ldhA，丙酮酸羧化酶基因pyc和丙氨酸转氨酶基因alaT达到失活丙酮酸羧化酶、乳酸脱氢酶以及丙氨酸转氨酶的目的。

一、丙氨酸转氨酶基因alaT的敲除

将前述用于alaT敲除的同源重组质粒pWYE1705电转化至CG737中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P39和P40为引物进行PCR扩增鉴定，得到1695bp的为重组菌，命名为CG738(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc△ldhA△alaT)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将CG737中的alaT基因敲除，谷氨酸棒杆菌CG738(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc△ldhA△alaT)构建成功。

二、L-亮氨酸工程菌CG742的构建

亮氨酸工程菌CG742为将重组质粒pWYE1702转入工程菌CG738得到的菌，具体如下：

将质粒pWYE1702转化至上述构建的谷氨酸棒杆菌CG738中，以P21和P22为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到2049bp的为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒鉴定进一步确定过表达质粒成功转化至工程菌中，_L-亮氨酸底盘工程菌CG742(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pyc△ldhA△alaT/pXMJ19-leuA^fbr)构建成功。

实施例6：无质粒L-亮氨酸高产重组菌CG858的构建

构建重组质粒，将leuA^fbr启动子替换为谷氨酸棒杆菌内源性启动子P_tuf并将leuA^fbr整合至ldhA基因位点，具体操作如下：

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，以P47和P48为引物PCR扩增整合位点的上游同源臂；以P49和P50为引物扩增P_tuf启动子；以P51和P52为引物扩增整合位点的下游同源臂。以质粒pWYE1702为模板，以P53和P54为引物扩增leuA^fbr基因(序列8)。

其中，序列8自5’末端第1-704位核苷酸为整合位点的上游同源臂，序列8自5’末端第705-904位核苷酸为启动子P_tuf，序列8自5’末端第905-2755位核苷酸为leuA^fbr基因，序列8自5’末端第2756-3481位核苷酸为整合位点的下游同源臂。

将上述四个PCR产物进行纯化。以限制性内切酶HindIII和EcoRI对同源重组载体pK18mobsacB进行双酶切，得到长度为5668bp的片段，并对该片段进行纯化。将纯化后的四个PCR产物和双酶切质粒所得片段进行Gibson组装反应。将反应产物采用化学转化法转化至大肠杆菌DH5α，在含卡那霉素(25μg/mL)的LB平板上筛选转化子，转化子传代培养三代后，以P7和P8为引物，采用菌落PCR鉴定转化子，得到3637bp为阳性转化子，对鉴定正确的转化子提取质粒，并将质粒测序，测序正确的质粒命名为pWYE1720(pK18mobsacB-P_tuf-leuA^fbr)(图8)。

将序列测定正确的同源重组质粒pWYE1720电转化至CG751中，通过卡那霉素抗性正向筛选得到重组质粒整合至染色体上的菌落，通过蔗糖致死反向筛选，得到发生两次同源重组的阳性菌落。将阳性菌落以P33和P34为引物进行PCR扩增鉴定，得到4276bp的为重组菌，命名为CG858(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps△ldhA::P_tuf-leuA^fbr)。

经该重组菌提取基因组DNA进行测序，结果为证实已成功将P_tuf-leuA^fbr整合至CG751中的ldhA基因处，谷氨酸棒杆菌CG858(WT-P_tuf::leuCD△ilvA△pps△ldhA::P_tuf-leuA^fbr)构建成功。

实施例7：L-亮氨酸工程菌在生成L-亮氨酸中的应用

一、高产L-亮氨酸工程菌的摇瓶发酵

摇瓶发酵采用的发酵培养基成份如下(g/L)：葡萄糖40，(NH₄)₂SO₄ 20，Urea 5，KH₂PO₄ 1，K₂HPO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.25，3-吗啉丙磺酸42，CaCl₂ 0.01,FeSO₄·7H₂O 0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.001，CuSO₄ 0.0002，NiCl₂·6H₂O 0.00002，异亮氨酸0.2，生物素0.0002，pH 7.0-7.2，121℃高压灭菌20min。葡萄糖分开灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO₄·7H₂O分开灭菌，121℃高压灭菌20min。维生素，异亮氨酸和无机盐离子等采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

种子培养基成分如下(g/L)：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，生物素50μg，安琪酵母粉(FM802)10g/L，蛋白胨10g/L。

1、种子液的获得

将上述实施例一、实例二、实例三、实例四和实例五中制备的工程菌CG739，CG755，CG757，CG756，CG758,CG760，CG740，CG741和CG742分别接种到含有终浓度为10μg/ml氯霉素的种子培养基中；将实例六中制备的工程菌CG858接种到不含氯霉素的种子培养基中。种子液培养条件为培养温度30℃，摇床转速为220r/min，培养时间8h，得到种子液，OD₆₀₀可为20。

2、发酵

将带质粒的工程菌CG739，CG755，CG757，CG756，CG758,CG760，CG740，CG741和CG742种子液按照体积百分含量为3％接种到含有终浓度为10μg/ml氯霉素的发酵培养基(500mL挡板三角瓶装液量为30mL)中，并于发酵培养9h时加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行目的基因的诱导表达；不带质粒的工程菌CG858种子液按照体积百分含量为3％接种到不含氯霉素的发酵培养基中。30℃，220r/min，培养72h。间歇补加浓氨水控制发酵液的pH在7.0-7.2之间，根据残糖情况，补加浓度为600g/L的葡萄糖母液，控制发酵液残糖在5-10g/L。

收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。

3、检测L-亮氨酸含量

采用高效液相法，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯柱前衍生高效液相法)：取50μL上述上清液于2mL离心管中，加入200μL NaHCO₃水溶液(0.5mol/L，pH 9.0)和100μL 1％的2,4-二硝基氟苯-乙腈溶液(体积比)，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至25℃，加入650μL KH₂PO₄水溶液(0.01mol/L，pH 7.2±0.05，用NaOH水溶液调整pH，放置15min过滤后可进样，进样量为15μL。

所用色谱柱为C18柱(ZORBAX Eclipse XDB-C18，4.6*150mm，Agilent，USA)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相A为0.04mol/L KH₂PO₄水溶液(pH 7.2±0.05，用40g/LKOH水溶液调整pH)，流动相B为55％乙腈水溶液(体积比)，流动相流速为1mL/min，洗脱过程如下表1所示：

表1为洗脱过程

以野生型菌株C.glutamicum ATCC13032为对照。

结果如图9和表2所示。

表2摇瓶发酵实验中L-亮氨酸工程菌CG739，CG755，CG757，CG756，CG758,CG760，CG740，CG741，CG742和CG858的基因型，最大OD₆₀₀和L-亮氨酸产量

摇瓶发酵实验中，发酵72h，野生型菌株C.glutamicum ATCC13032未检测到L-亮氨酸的积累，底盘工程菌CG739的L-亮氨酸产量为6.35±0.70g/L。在此基础上，单独缺失pps基因的工程菌CG755的L-亮氨酸产量为7.69±0.45g/L，与底盘工程菌CG739相比提高了21％；单独缺失ldhA基因的工程菌CG756的L-亮氨酸产量为8.37±0.08g/L，与底盘工程菌CG739相比提高了32％；单独缺失alaT基因的工程菌CG758的L-亮氨酸产量为7.67±0.34g/L，与底盘工程菌CG739相比提高了21％；单独缺失pyc基因的工程菌CG740的L-亮氨酸产量为6.95±0.23g/L，与底盘工程菌CG739相比提高了9％。

缺失pps基因的同时缺失ldhA基因的工程菌CG757的L-亮氨酸产量为13.33±0.71g/L，较单独缺失pps基因的工程菌CG755产量提高了73％，与单独单独缺失ldhA基因的菌株CG756相比提高了59％，与底盘工程菌CG739相比提高了110％。

缺失alaT基因的同时缺失ldhA基因的工程菌CG760的L-亮氨酸产量为12.55±0.43g/L，较单独缺失alaT基因的工程菌CG758产量提高了64％，与单独单独缺失ldhA基因的菌株CG756相比提高了50％，与底盘工程菌CG739相比提高了98％。

缺失pyc基因的同时缺失ldhA基因的工程菌CG741的L-亮氨酸产量为9.92±0.61g/L，较单独缺失pyc基因的工程菌CG740产量提高了43％，与单独单独缺失ldhA基因的菌株CG756相比提高了19％，与底盘工程菌CG739相比提高了56％。

同时缺失pyc基因，ldhA基因和alaT基因的工程菌CG742的L-亮氨酸产量为10.06±0.28g/L，较单独缺失pyc基因的工程菌CG740产量提高了45％，与单独单独缺失ldhA基因的菌株CG756相比提高了20％，与单独单独缺失alaT基因的菌株CG758相比提高了31％，与底盘工程菌CG739相比提高了58％。

二、L-亮氨酸工程菌CG757的发酵罐发酵

种子培养基具体如下(g/L)：葡萄糖20g/L，硫酸铵5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.6g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，生物素50μg，安琪酵母粉(FM802)10g/L，蛋白胨10g/L。

发酵采用的发酵培养基成份如下(g/L)：葡萄糖40，(NH₄)₂SO₄ 20，Urea 5，KH₂PO₄1，K₂HPO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 0.25，CaCl₂ 0.01,FeSO₄·7H₂O0.01，MnSO₄·H₂O 0.01，ZnSO₄·7H₂O 0.001，CuSO₄ 0.0002，NiCl₂·6H₂O 0.00002，生物素0.0002，pH 7.0-7.2，121℃高压灭菌20min。葡萄糖分开灭菌，115℃高压灭菌15min。MgSO₄·7H₂O分开灭菌，121℃高压灭菌20min。维生素和无机盐离子等采用0.22μm无菌滤膜过滤除菌。

1、种子液的获得

将工程菌CG757接种到含有终浓度为10μg/ml氯霉素的种子培养基中，种子液培养条件为培养温度30℃，摇床转速为220r/min，培养时间8h，得到种子液，OD₆₀₀可为10－15。

2、发酵

将种子液按照体积百分含量为10％接种到含有终浓度10μg/ml氯霉素的发酵培养基中。

采用的发酵罐为7.5L发酵罐(BioFlo115，NBS)：内置定速可编程控泵，可以实现恒速补料。菌株生长期时(0－30h)梯度流加过滤除菌后的异亮氨酸，流加速度如图10，具体为0-10h，0g/L/h；10-14h，0.01g/L/h；14-18h，0.01584g/L/h；18-20.5h，0.02g/L/h；20.5-25h，0.04g/L/h；25-30h，0.06g/L/h。发酵过程中通过蠕动泵补加800g/L的葡萄糖，控制发酵体系中葡糖糖的浓度为5-10g/L。通过加热套和冷却水控制发酵温度维持在30℃；通入空气提供溶氧，转速与溶氧信号级联控制溶氧维持在30％；补加浓氨水调控pH，维持在6.9左右。发酵连续进行72h。当OD₆₀₀＝8－12时，加入IPTG(终浓度为0.1mmol/L)诱导重组质粒携带的基因表达。

收集发酵产物12000×g，离心5min，收集上清液。

3、检测L-亮氨酸含量

按照上述检测L-亮氨酸含量的方法检上清液中的L-亮氨酸含量，发酵过程中OD，残糖(RG)和L-亮氨酸产量结果如图11所示，可以看出，发酵57h，工程菌的L-亮氨酸产量为18.0g/L。

引物序列表

P1:CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCATCAAGCTCCTCGCGGGAA

P2:AGGGTAACGGCCAATGGGACAGCAAGAAATTATCGAG

P3:CTTGCTGTCCCATTGGCCGTTACCCTGCGAA

P4:CGGGGCTGGTCATTGTATGTCCTCCTGGACTTCG

P5:AGGAGGACATACAATGACCAGCCCCGTGGAG

P6:AGGAAACAGCTATGACATGATTACGTGCTCAACCTCTGAGGTACC

P7:ATGTGCTGCAAGGCGATTAA

P8:TATGCTTCCGGCTCGTATGT

P9:CCACGGACTCCGCTAA

P10:CAGTGGCAGGGTTTGA

P11:ACAGCTATGACATGATTACGAATTCCGCTGATTTCATCGTCATC

P12:TCAGCTATGTGGTTGACTAGTGTAATCTTC

P13:CTAGTCAACCACATAGCTGAAGGCCACC

P14:TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGAAGAATTCGGAGCCACC

P15:GGCGTGTATGGGAAGAAA

P16:GAACAGCAGGTGTTGAAGG

P17GCTCTAGAGCAAAGGAGGACAACCATGTCTCCTAACGATGC(Xba I)

P18CGGCCAGTGGGTCGTTGCCGTGGCCATCGACG

P19CGTCGATGGCCACGGCAACGACCCACTGGCCG

P20GGAATTCCTTAAACGCCGCCAGCCAGG(EcoR I)

P21CAATTAATCATCGGCTCGTA

P22ACCGCTTCTGCGTTCTGATT

P23:ACAGCTATGACATGATTACGAATTCCACGTTGATCTCCAATTG

P24:TGCGGTGGTTGGTGTCTCCTTATTTAATAAAGC

P25:AGGAGACACCAACCACCGCATCTTTTCG

P26:TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCAGTGGCTTGAATTCTAG

P27:GCCGCTATAAAGCACTCG

P28:CATATCCACGCCCTGAAC

P29:GACCTCGCCGGCGATCGTCTCCTTCGGTC

P30:TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTCGATCCCACTTCCTGATTTC

P31:ACAGCTATGACATGATTACGAATTCATCTTTGGCGCCTAGTTGGC

P32:AGACGATCGCCGGCGAGGTCCATGCTGA

P33:TGAATGACAAGATCCACCTGA

P34:TGCCGTTGGAGATGTAGG

P35:ACAGCTATGACATGATTACGAATTCAAGTAGCCTGGGTATTCGC

P36:CTAACAACTACCGCTCAATGTTGCCACTTTG

P37:CATTGAGCGGTAGTTGTTAGGATTCACCACGAATC

P38:TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCCCGAGTCATGCCGACATAC

P39:GAGGTATTTGATGCGGTAGT

P40:AAGCGTAATGATGGTGGTG

P41:GGTATTGGCGATCCGTTTGAAGACTGTTG

P42:TAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTCACTGCGTCCTAGTATC

P43:ACAGCTATGACATGATTACGAATTCGGAGACCAAGGCTCAAAGG

P44:TCAAACGGATCGCCAATACCGACACCGC

P45:CGGACGAGAAATCTACGG

P46:CGGTGGAAACAGCGAGCC

P47:AGGAAACAGCTATGACATGATTACGGCGATCGTCTCCTTCGGTC

P48:AGGGTAACGGCCATTTCGATCCCACTTCCTGATTTC

P49:AGTGGGATCGAAATGGCCGTTACCCTGCGAA

P50:CGTTAGGAGACATTGTATGTCCTCCTGGACTTCG

P51:TGGCGGCGTTTAAATCTTTGGCGCCTAGTTGGC

P52:CGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCACGGCGAGGTCCATGCTGA

P53:AGGAGGACATACAATGTCTCCTAACGATGCATTCATC

P54:AGGCGCCAAAGATTTAAACGCCGCCAGCCAG

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 生产L-亮氨酸的重组菌、其构建方法及L-亮氨酸的生产方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (501)..(700)

<223> Ptuf

<400> 1

tcaagctcct cgcgggaaaa gacgctggca gaggggatgg ggaggtaggc ggcaaaaacg 60

cgcgctgctg accctgcatt taaaggcatg cgagtgccca cgggaaccac gttttttagc 120

ccggagctgg gctcttggct ggccacacac gtgcgggtgg tgccggtgag gcgataaagc 180

tgaacggatt cgccggtgcg ctccataagg tcggccataa ttggtacggc cgtatcgatg 240

agggtgtcag cgccgcgtgc acccaatgag gcaagccgtg cgccgatggt ccatctatta 300

tcgcgggagc gtgccaacat gccgtgtacc tcaagcgctg aggcgaggcg gtgggctgta 360

gccctgggca gatcggtggc agctgcgagc tctgccaacg atcgaggctg ttctgcgatg 420

acattgagga ttaatacagt gcggtctaaa accttaatac cgctctcggt ggagtcctcg 480

ataatttctt gctgtcccat tggccgttac cctgcgaatg tccacagggt agctggtagt 540

ttgaaaatca acgccgttgc ccttaggatt cagtaactgg cacattttgt aatgcgctag 600

atctgtgtgc tcagtcttcc aggctgctta tcacagtgaa agcaaaacca attcgtggct 660

gcgaaagtcg tagccaccac gaagtccagg aggacataca atgaccagcc ccgtggagaa 720

cagcacctca actgagaagc tgaccctggc agagaaggtg tggcgcgacc atgtcgtgtc 780

caagggagaa aacggcgagc ccgacctcct ctacatcgac ctgcagctgc tgcatgaagt 840

gacctcacca caggcatttg acggcctgcg catgaccggc cgtaaactgc gccacccaga 900

actgcacctg gccaccgaag accacaacgt gccaaccgaa ggcatcaaga ctggctcact 960

gctggaaatc aacgacaaga tttcccgcct gcaggtatct actctgcgcg acaactgtga 1020

agaattcggc gtgcgcctgc acccaatggg tgatgtccga cagggcatcg tgcacaccgt 1080

cggcccacag ctcggcgcaa cccagccagg catgaccatt gtgtgcggtg actcccacac 1140

ctccacccac ggtgcttttg gctccatggc attcggcatc ggtacctcag aggttgagca 1200

<210> 2

<211> 2311

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221> gene

<222> (501)..(1811)

<223> ilvA

<400> 2

cgctgatttc atcgtcatca tcgctggtgt ctttgccgga ggagctcaag cttggggccg 60

caggaatgtc gccattgctg agcattgagc tgccttcaga gctgcctggc caggtttcgt 120

ttccatcgac tggatttcca tcatcatcaa ggatctgtga tgaggtgatg ttgtctgaga 180

gctgtgtcag tgcgtcagag gactgagcct gggcaactgg agtgaacacg gacaatgcca 240

cagcgcttgc tgtaacaagg gtcaaagtac ttcgacgcaa agacaaaact tttctcctgg 300

caataaatat gcggatttac tatggaaaca agatagaaga ttggatagcg aaagctatcc 360

tcaactcgtg gaaagtgtag tgccacaacc acagtattgg ctagaaaaca atctatagca 420

ttgttctaca aagagcttgt tggaaataaa acctatgcca aagtaggtgc aattctagga 480

gaagattaca ctagtcaacc atgagtgaaa catacgtgtc tgagaaaagt ccaggagtga 540

tggctagcgg agcggagctg attcgtgccg ccgacattca aacggcgcag gcacgaattt 600

cctccgtcat tgcaccaact ccattgcagt attgccctcg tctttctgag gaaaccggag 660

cggaaatcta ccttaagcgt gaggatctgc aggatgttcg ttcctacaag atccgcggtg 720

cgctgaactc tggagcgcag ctcacccaag agcagcgcga tgcaggtatc gttgccgcat 780

ctgcaggtaa ccatgcccag ggcgtggcct atgtgtgcaa gtccttgggc gttcagggac 840

gcatctatgt tcctgtgcag actccaaagc aaaagcgtga ccgcatcatg gttcacggcg 900

gagagtttgt ctccttggtg gtcactggca ataacttcga cgaagcatcg gctgcagcgc 960

atgaagatgc agagcgcacc ggcgcaacgc tgatcgagcc tttcgatgct cgcaacaccg 1020

tcatcggtca gggcaccgtg gctgctgaga tcttgtcgca gctgacttcc atgggcaaga 1080

gtgcagatca cgtgatggtt ccagtcggcg gtggcggact tcttgcaggt gtggtcagct 1140

acatggctga tatggcacct cgcactgcga tcgttggtat cgaaccagcg ggagcagcat 1200

ccatgcaggc tgcattgcac aatggtggac caatcacttt ggagactgtt gatccctttg 1260

tggacggcgc agcagtcaaa cgtgtcggag atctcaacta caccatcgtg gagaagaacc 1320

agggtcgcgt gcacatgatg agcgcgaccg agggcgctgt gtgtactgag atgctcgatc 1380

tttaccaaaa cgaaggcatc atcgcggagc ctgctggcgc gctgtctatc gctgggttga 1440

aggaaatgtc ctttgcacct ggttctgtcg tggtgtgcat catctctggt ggcaacaacg 1500

atgtgctgcg ttatgcggaa atcgctgagc gctccttggt gcaccgcggt ttgaagcact 1560

acttcttggt gaacttcccg caaaagcctg gtcagttgcg tcacttcctg gaagatatcc 1620

tgggaccgga tgatgacatc acgctgtttg agtacctcaa gcgcaacaac cgtgagaccg 1680

gtactgcgtt ggtgggtatt cacttgagtg aagcatcagg attggattct ttgctggaac 1740

gtatggagga atcggcaatt gattcccgtc gcctcgagcc gggcacccct gagtacgaat 1800

acttgaccta aacatagctg aaggccacct caatcgaggt ggcctttttc tagtttcggg 1860

tcaggatcgc aaagccccac ggctgaaggg ttgtggaggt gtcggtgacg gtgggggaag 1920

tgaagctgta aatcagctcg ccgccaagcg ggacggtgat ggtgtcgtcg gagaaattcg 1980

ccagaattcg gccgcgacca ttggccatcg atagccagtt ctcgccgtgc tcaacctcga 2040

gtgtgagcaa gtttggttgg gagaagccca aggtgtgccg caggtgcaac agctgcttgt 2100

aagcgtcgtt gatgcggcgc tgctccgcag tgaactccca atcgagtttg gaggaggtga 2160

aggtggattc cagctcgggg gaggggatgt cgtcggcgtt ccagccaagg cgtgcgaatt 2220

cccgtttgcg gccctcggag gttaggcggt tgagctcggg gtcggtgtgg gagcaaaaga 2280

aggcgaatgg ggtggtggct ccgaattctt c 2311

<210> 3

<211> 1851

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1851)

<223> leuAfbr

<400> 3

atgtctccta acgatgcatt catctccgca cctgccaaga tcgaaacccc agttgggcct 60

cgcaacgaag gccagccagc atggaataag cagcgtggct cctcaatgcc agttaaccgc 120

tacatgcctt tcgaggttga ggtagaagat atttctctgc cggaccgcac ttggccagat 180

aaaaaaatca ccgttgcacc tcagtggtgt gctgttgacc tgcgtgacgg caaccaggct 240

ctgattgatc cgatgtctcc tgagcgtaag cgccgcatgt ttgagctgct ggttcagatg 300

ggcttcaaag aaatcgaggt cggtttccct tcagcttccc agactgattt tgatttcgtt 360

cgtgagatca tcgaaaaggg catgatccct gacgatgtca ccattcaggt tctggttcag 420

gctcgtgagc acctgattcg ccgtactttt gaagcttgcg aaggcgcaaa aaacgttatc 480

gtgcacttct acaactccac ctccatcctg cagcgcaacg tggtgttccg catggacaag 540

gtgcaggtga agaagctggc taccgatgcc gctgaactaa tcaagaccat cgctcaggat 600

tacccagaca ccaactggcg ctggcagtac tcccctgagt ccttcaccgg cactgaggtt 660

gagtacgcca aggaagttgt ggacgcagtt gttgaggtca tggatccaac tcctgagaac 720

ccaatgatca tcaacctgcc ttccaccgtt gagatgatca cccctaacgt ttacgcagac 780

tccattgaat ggatgcaccg caatctaaac cgtcgtgatt ccattatcct gtccctgcac 840

ccgcacaatg accgtggcac cggcgttggc gcagctgagc tgggctacat ggctggcgct 900

gaccgcatcg aaggctgcct gttcggcaac ggcgagcgca ccggcaacgt ctgcctggtc 960

accctggcac tgaacatgct gacccagggc gttgaccctc agctggactt caccgatata 1020

cgccagatcc gcagcaccgt tgaatactgc aaccagctgc gcgttcctga gcgccaccca 1080

tacggcggtg acctggtctt caccgctttc tccggttccc accaggacgc tgtgaacaag 1140

ggtctggacg ccatggctgc caaggttcag ccaggtgcta gctccactga agtttcttgg 1200

gagcagctgc gcgacaccga atgggaggtt ccttacctgc ctatcgatcc aaaggatgtc 1260

ggtcgcgact acgaggctgt tatccgcgtg aactcccagt ccggcaaggg cggcgttgct 1320

tacatcatga agaccgatca cggtctgcag atccctcgct ccatgcaggt tgagttctcc 1380

accgttgtcc agaacgtcac cgacgctgag ggcggcgagg tcaactccaa ggcaatgtgg 1440

gatatcttcg ccaccgagta cctggagcgc accgcaccag ttgagcagat cgcgctgcgc 1500

gtcgagaacg ctcagaccga aaacgaggat gcatccatca ccgccgagct catccacaac 1560

ggcaaggacg tcaccgtcga tggccacggc aacgacccac tggccgctta cgccaacgcg 1620

ctggagaagc tgggcatcga cgttgagatc caggaataca accagcacgc ccgcacctcg 1680

ggcgacgatg cagaagcagc cgcctacgtg ctggctgagg tcaacggccg caaggtctgg 1740

ggcgtcggca tcgctggctc catcacctac gcttcgctga aggcagtgac ctccgccgta 1800

aaccgcgcgc tggacgtcaa ccacgaggca gtcctggctg gcggcgttta a 1851

<210> 4

<211> 2095

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221> gene

<222> (501)..(1595)

<223> pps

<400> 4

ccacgttgat ctccaattgt ttccgagttc tcctcgatca tccagagcag tggcaagcca 60

ttctagagaa tccaaaactg attcctgcgg cagtggatga ggtcttgcgg tactccggct 120

cgatcgtggg gtggcgtcga aaagcattaa aagacaccga gatcggcggc gttgccatta 180

aggaaggcga tggtgttctg ctgctcatgg gttccgcgaa ccgcgatgaa gctcgctttg 240

aaaatggcga ggaattcgat atcagccgcg ctaatgcgcg cgagcacctg tcttttggtt 300

tcggcatcca ctattgccta ggaaacatgc tggccaaact tcaagccaag atctgtctcg 360

aggaagtcac caggcttgtt ccttccctgc acttggttgc ggacaaagct atcgggttcc 420

gggagaacct ctccttccgc gtccccactt ctgttcccgt gacttggaac gcttaacgct 480

ttattaaata aggagacacc atgaccaaca gtttgaacat cccgtttgtc cagcgcttcg 540

atgaaggcct ggatcctgtt ctagaagtac tcggtggcaa gggcgcttca ctagtcacca 600

tgacagatgc tggaatgccc gttccacctg gatttgtggt cactactgcc agctttgatg 660

aattcatccg tgaagcaggg gttgctgaac acatcgataa attcctaaac gatctcgatg 720

cagaagatgt taaggaagtg gatcgagttt ctgcgatcat ccgcgatgag ctgtgcagtc 780

ttgacgttcc agagaatgct cgtttcgcag tgcaccaggc ttatcgcgat ctcatggaac 840

gatgcggtgg cgacgtcccg gttgctgtcc ggtcatcggc cactgccgaa gatctgcccg 900

atgcttcctt cgcagggcaa caggacacct atctgtggca agtcggtttg agcgctgtca 960

ctgaacacat ccgtaaatgc tgggcttcgc tgttcacttc ccgtgccatt atctaccgtc 1020

tgaaaaacaa catccccaat gagggcctct ccatggcggt agttgttcaa aaaatggtca 1080

actctcgtgt cgcaggcgtg gcaatcacta tgaatccttc caacggcgac cgctcgaaga 1140

tcaccatcga ttcctcatgg ggtgttggtg aaatggtggt ctcaggtgaa gtgacaccag 1200

acaatatctt gctggacaag atcacgctgc aggttgtctc cgaacacatt ggaagcaaac 1260

acgctgaact catccccgat gccaccagtg gaagcctcgt ggaaaagccc gttgatgaag 1320

aacgcgcaaa ccgccgcagt ctgactgatg aggaaatgct cgctgtggca caaatggcta 1380

agcgtgcaga aaaacactac aagtgcccac aagatatcga atgggcgctg gacgctgatc 1440

tgccagatgg agaaaacctt ctgttattgc aatcccgccc ggaaactatc cactccaacg 1500

gtgtgaagaa ggaaacccca actccgcagg ctgccaaaac cataggcacc ttcgatttca 1560

gctcaatcac cgtcgcaatg accggcacga agtaaaacca ccgcatcttt tcgtcgaaaa 1620

gcatctaaaa ggagtttgac catggctaat aaatctttcc ccaagccctc cgatcttcca 1680

gtgcccaagg gcgctgaagg ttgggaagat ctgtacccgt actacctcgt tttccaagac 1740

aagctcatgg atcaagagaa tgagaaattc tggttctgcg attcacagca ctggccaact 1800

gtgttcaagc cttttgaaac tatcggtggt gaattcgctg taaagtgcct cggccaatac 1860

aacgctcggc atttgatgat cccgaatgcc aatggcatcg agttccgcgt gcatctggga 1920

tacctctata tgtcccctat tccagtgcct gaagatcaga ttgcggaacg cgtccccatg 1980

ttccaggaac gcatcacgca ctacttccaa aactgggagc caatgctggc aaattggaag 2040

gagcgagtat taggaaccat caatgagctg gaatctctag aattcaagcc actgc 2095

<210> 5

<211> 2375

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221> gene

<222> (705)..(1649)

<223> ldhA

<400> 5

gcgatcgtct ccttcggtcc aaaattcttc tgcccaatca gccggatttg ggtgcgatgc 60

ctgatcaatc ccacaaccgt ggtggtcaac gtgatggcac cagttgcgat gtgggtggcg 120

ttgtaaattt tcctggatac ccgccggttg gttctgggga ggatcgagtg gattcccgtc 180

gctgccgcat gccccaccgc ttgtaaaaca gccaggttag cagccgtaac ccaccacggt 240

ttcggcaaca atgacggcga gagagcccac cacattgcga tttccgctcc gataaagcca 300

gcgcccatat ttgcagggag gattcgcctg cggtttggcg acattcggat ccccggaact 360

agctctgcaa tgacctgcgc gccgagggag gcgaggtggg tggcaggttt tagtgcgggt 420

ttaagcgttg ccaggcgagt ggtgagcaga gacgctagtc tggggagcga aaccatattg 480

agtcatcttg gcagagcatg cacaattctg cagggcatag gttggttttg ctcgatttac 540

aatgtgattt tttcaacaaa aataacactt ggtctgacca cattttcgga cataatcggg 600

cataattaaa ggtgtaacaa aggaatccgg gcacaagctc ttgctgattt tctgagctgc 660

tttgtgggtt gtccggttag ggaaatcagg aagtgggatc gaaaatgaaa gaaaccgtcg 720

gtaacaagat tgtcctcatt ggcgcaggag atgttggagt tgcatacgca tacgcactga 780

tcaaccaggg catggcagat caccttgcga tcatcgacat cgatgaaaag aaactcgaag 840

gcaacgtcat ggacttaaac catggtgttg tgtgggccga ttcccgcacc cgcgtcacca 900

agggcaccta cgctgactgc gaagacgcag ccatggttgt catttgtgcc ggcgcagccc 960

aaaagccagg cgagacccgc ctccagctgg tggacaaaaa cgtcaagatt atgaaatcca 1020

tcgtcggcga tgtcatggac agcggattcg acggcatctt cctcgtggcg tccaacccag 1080

tggatatcct gacctacgca gtgtggaaat tctccggctt ggaatggaac cgcgtgatcg 1140

gctccggaac tgtcctggac tccgctcgat tccgctacat gctgggcgaa ctctacgaag 1200

tggcaccaag ctccgtccac gcctacatca tcggcgaaca cggcgacact gaacttccag 1260

tcctgtcctc cgcgaccatc gcaggcgtat cgcttagccg aatgctggac aaagacccag 1320

agcttgaggg ccgtctagag aaaattttcg aagacacccg cgacgctgcc tatcacatta 1380

tcgacgccaa gggctccact tcctacggca tcggcatggg tcttgctcgc atcacccgcg 1440

caatcctgca gaaccaagac gttgcagtcc cagtctctgc actgctccac ggtgaatacg 1500

gtgaggaaga catctacatc ggcaccccag ctgtggtgaa ccgccgaggc atccgccgcg 1560

ttgtcgaact agaaatcacc gaccacgaga tggaacgctt caagcattcc gcaaataccc 1620

tgcgcgaaat tcagaagcag ttcttctaaa tctttggcgc ctagttggcg acgcaagtgt 1680

ttcattggaa cacttgcgct gccaactttt tggtttacgg gcacaatgaa actgttggat 1740

ggaatttaga gtgtttgtag cttaaggagc tcaaatgaat gagtttgacc aggacattct 1800

ccaggagatc aagactgaac tcgacgagtt aattctagaa cttgatgagg tgacacaaac 1860

tcacagcgag gccatcgggc aggtctcccc aacccattac gttggtgccc gcaacctcat 1920

gcattacgcg catcttcgca ccaaagacct ccgtggcctg cagcaacgcc tctcctctgt 1980

gggagctacc cgcttgacta ccaccgaacc agcagtgcag gcccgcctca aggccgcccg 2040

caatgttatc ggagctttcg caggtgaagg cccactttat ccaccctcag atgtcgtcga 2100

tgccttcgaa gatgccgatg agattctcga cgagcacgcc gaaattctcc ttggcgaacc 2160

cctaccggat actccatcct gcatcatggt caccctgccc accgaagccg ccaccgacat 2220

tgaacttgtc cgtggcttcg ccaaaagcgg catgaatcta gctcgcatca actgtgcaca 2280

cgacgatgaa accgtctgga agcagatgat cgacaacgtc cacaccgttg cagaagaagt 2340

tggccgggaa atccgcgtca gcatggacct cgccg 2375

<210> 6

<211> 2395

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221> gene

<222> (508)..(1821)

<223> alaT

<400> 6

aagtagcctg ggtattcgcc acggacgtga atattgccga aggcatagtc ctcgtgggac 60

ttttgctggg cggtaagttg atcgcgtggg tccggggtaa tgccataacg aggaacggca 120

ataatcatgc aaccgatctg gttttgtggg tcgatctcat gagcaatctt agttgccaaa 180

gcacttgcta ctcaatcatg gtaaacagcc tggtcgcagt ccttcacgat tcaaactttg 240

ccttccgcta cgccttccac ctgatcatca tagaagacgg tgaagtaaca gcagccggag 300

atcccacaga gatcgtcact gcgggactga tcgaagaagt ctacaacgtc aaagcctgtg 360

catcccagac cccgtgaaca gcaaaccgat gatcgtgcca ctggaaagat cttaggcagc 420

cgtgggatta caccctttta gagctagaac agtaaaaatt cacccaatag ctttcaacta 480

cgcacacaaa gtggcaacat tgagcgggtg actacagaca agcgcaaaac ctctaagacc 540

accgacaccg ccaacaaggc tgtgggcgcg gatcaggcag cgcgtcccac tcggcgaaca 600

actcgccgca tcttcgatca gtcggagaag atgaaggacg tgctgtacga gatccgtggc 660

ccggtggccg cggaggcgga acgcatggag cttgatgggc ataacatctt aaagctcaac 720

acgggaaatc cagccgtgtt cggattcgat gcccccgacg tgattatgcg tgacatgatc 780

gccaaccttc caacttccca agggtattcc acctccaaag gcattattcc ggcccggcga 840

gcagtggtca cccgctacga agttgtgccc ggattccccc acttcgatgt tgatgatgtg 900

ttcttaggca acggtgtctc agaactaatc accatgacca cccaagcact cctcaacgac 960

ggcgatgaag ttcttatccc cgcaccggac tacccactgt ggactgccgc aacctccctg 1020

gctggtggta agcctgtgca ctacctctgt gatgaggaag atgactggaa cccatccatc 1080

gaagacatca agtccaaaat ctcagagaaa accaaagcta ttgtggtgat caaccccaac 1140

aaccccacgg gagctgtcta cccgcgccgg gtgttggaac aaatcgtcga gattgcacgc 1200

gagcatgacc tgctgatttt ggccgatgaa atctacgacc gcattctcta cgatgatgcc 1260

gagcacatca gcctggcaac ccttgcacca gatctccttt gcatcacata caacggtcta 1320

tccaaggcat accgcgtcgc aggataccga gctggctgga tggtattgac tggaccaaag 1380

caatacgcac gtggatttat tgagggcctc gaactcctcg caggcactcg actctgccca 1440

aatgtcccag ctcagcacgc tattcaggta gctctcggtg gacgccagtc catctacgac 1500

ctcactggcg aacacggccg actcctggaa cagcgcaaca tggcatggac gaaactcaac 1560

gaaatcccag gtgtcagctg tgtgaaacca atgggagctc tatacgcgtt ccccaagctc 1620

gaccccaacg tgtacgaaat ccacgacgac acccaactca tgctggatct tctccgtgcc 1680

gagaaaatcc tcatggttca gggcactggc ttcaactggc cacatcacga tcacttccga 1740

gtggtcaccc tgccatgggc atcccagttg gaaaacgcaa ttgagcgcct gggtaacttc 1800

ctgtccactt acaagcagta gtagttgtta ggattcacca cgaatctcag gatttttgag 1860

attcgtggtg aatttttgcg ttttccagtc aggctcctgc aactttcgga ccgatttcag 1920

aggggcggag ctggtttgtg gtggatcctt gaaatggaac ctcgcaggaa gctttcagga 1980

agaccaagtt gggcctaggg gtggcgggat tgcaaaaatc cgtccccggt tcgccatgaa 2040

atgctgattt tgatcgaatc tttgcgctaa ctgtagggcg ggttcagggg gtgaatgcac 2100

cacgagcaac ccgaagggtg cgaagtgggc attcgtagaa caatcccaga ggaaagccgt 2160

acggctttcc tcgacatgat caatcaaggt atgtcaggtc ttgctgcgtc tacagcggtc 2220

ggggtcagtg aattcaccgg gcgaaagtgg gcgaaggccg ccggggtgaa actgacccgc 2280

ggcccgcgag gtggcaatgc ttttgacacc gccgagaaac ttgagattgc agccagcatg 2340

ctagagaaag gatgcctacc ccgagaaatc ggcgagtatg tcggcatgac tcggg 2395

<210> 7

<211> 4850

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221> gene

<222> (728)..(4150)

<223> pyc

<400> 7

atccgtttga agactgttgc caccgcagtg tttacccgcc cagagatcgc agcagtaggt 60

atcacccatg cacaagttga ttccggcgaa gtgtctgctc gcgtgattgt gcttcctttg 120

gctactaacc cacgcgccaa gatgcgttcc ctgcgccacg gttttgtgaa gctgttctgc 180

cgccgtaact ctggcctgat catcggtggt gtcgtggtgg caccgaccgc gtctgagctg 240

atcctaccga tcgctgtggc agtgaccaac cgtctgacag ttgctgatct ggctgatacc 300

ttcgcggtgt acccatcatt gtcaggttcg attactgaag cagcacgtca gctggttcaa 360

catgatgatc taggctaatt tttctgagtc ttagattttg agaaaaccca ggattgcttt 420

gtgcactcct gggttttcac tttgttaagc agttttgggg aaaagtgcaa agtttgcaaa 480

gtttagaaat attttaagag gtaagatgtc tgcaggtgga agcgtttaaa tgcgttaaac 540

ttggccaaat gtggcaacct ttgcaaggtg aaaaactggg gcggggttag atcctggggg 600

gtttatttca ttcactttgg cttgaagtcg tgcaggtcag gggagtgttg cccgaaaaca 660

ttgagaggaa aacaaaaacc gatgtttgat tgggggaatc gggggttacg atactaggac 720

gcagtgagtg tcgactcaca catcttcaac gcttccagca ttcaaaaaga tcttggtagc 780

aaaccgcggc gaaatcgcgg tccgtgcttt ccgtgcagca ctcgaaaccg gtgcagccac 840

ggtagctatt tacccccgtg aagatcgggg atcattccac cgctcttttg cttctgaagc 900

tgtccgcatt ggtaccgaag gctcaccagt caaggcgtac ctggacatcg atgaaattat 960

cggtgcagct aaaaaagtta aagcagatgc catttacccg ggatacggct tcctgtctga 1020

aaatgcccag cttgcccgcg agtgtgcgga aaacggcatt acttttattg gcccaacccc 1080

agaggttctt gatctcaccg gtgataagtc tcgcgcggta accgccgcga agaaggctgg 1140

tctgccagtt ttggcggaat ccaccccgag caaaaacatc gatgagatcg ttaaaagcgc 1200

tgaaggccag acttacccca tctttgtgaa ggcagttgcc ggtggtggcg gacgcggtat 1260

gcgttttgtt gcttcacctg atgagcttcg caaattagca acagaagcat ctcgtgaagc 1320

tgaagcggct ttcggcgatg gcgcggtata tgtcgaacgt gctgtgatta accctcagca 1380

tattgaagtg cagatccttg gcgatcacac tggagaagtt gtacaccttt atgaacgtga 1440

ctgctcactg cagcgtcgtc accaaaaagt tgtcgaaatt gcgccagcac agcatttgga 1500

tccagaactg cgtgatcgca tttgtgcgga tgcagtaaag ttctgccgct ccattggtta 1560

ccagggcgcg ggaaccgtgg aattcttggt cgatgaaaag ggcaaccacg tcttcatcga 1620

aatgaaccca cgtatccagg ttgagcacac cgtgactgaa gaagtcaccg aggtggacct 1680

ggtgaaggcg cagatgcgct tggctgctgg tgcaaccttg aaggaattgg gtctgaccca 1740

agataagatc aagacccacg gtgcagcact gcagtgccgc atcaccacgg aagatccaaa 1800

caacggcttc cgcccagata ccggaactat caccgcgtac cgctcaccag gcggagctgg 1860

cgttcgtctt gacggtgcag ctcagctcgg tggcgaaatc accgcacact ttgactccat 1920

gctggtgaaa atgacctgcc gtggttccga ctttgaaact gctgttgctc gtgcacagcg 1980

cgcgttggct gagttcaccg tgtctggtgt tgcaaccaac attggtttct tgcgtgcgtt 2040

gctgcgggaa gaggacttca cttccaagcg catcgccacc ggattcattg ccgatcaccc 2100

gcacctcctt caggctccac ctgctgatga tgagcaggga cgcatcctgg attacttggc 2160

agatgtcacc gtgaacaagc ctcatggtgt gcgtccaaag gatgttgcag ctcctatcga 2220

taagctgcct aacatcaagg atctgccact gccacgcggt tcccgtgacc gcctgaagca 2280

gcttggccca gccgcgtttg ctcgtgatct ccgtgagcag gacgcactgg cagttactga 2340

taccaccttc cgcgatgcac accagtcttt gcttgcgacc cgagtccgct cattcgcact 2400

gaagcctgcg gcagaggccg tcgcaaagct gactcctgag cttttgtccg tggaggcctg 2460

gggcggcgcg acctacgatg tggcgatgcg tttcctcttt gaggatccgt gggacaggct 2520

cgacgagctg cgcgaggcga tgccgaatgt aaacattcag atgctgcttc gcggccgcaa 2580

caccgtggga tacaccccgt acccagactc cgtctgccgc gcgtttgtta aggaagctgc 2640

cagctccggc gtggacatct tccgcatctt cgacgcgctt aacgacgtct cccagatgcg 2700

tccagcaatc gacgcagtcc tggagaccaa caccgcggta gccgaggtgg ctatggctta 2760

ttctggtgat ctctctgatc caaatgaaaa gctctacacc ctggattact acctaaagat 2820

ggcagaggag atcgtcaagt ctggcgctca catcttggcc attaaggata tggctggtct 2880

gcttcgccca gctgcggtaa ccaagctggt caccgcactg cgccgtgaat tcgatctgcc 2940

agtgcacgtg cacacccacg acactgcggg tggccagctg gcaacctact ttgctgcagc 3000

tcaagctggt gcagatgctg ttgacggtgc ttccgcacca ctgtctggca ccacctccca 3060

gccatccctg tctgccattg ttgctgcatt cgcgcacacc cgtcgcgata ccggtttgag 3120

cctcgaggct gtttctgacc tcgagccgta ctgggaagca gtgcgcggac tgtacctgcc 3180

atttgagtct ggaaccccag gcccaaccgg tcgcgtctac cgccacgaaa tcccaggcgg 3240

acagttgtcc aacctgcgtg cacaggccac cgcactgggc cttgcggatc gtttcgaact 3300

catcgaagac aactacgcag ccgttaatga gatgctggga cgcccaacca aggtcacccc 3360

atcctccaag gttgttggcg acctcgcact ccacctcgtt ggtgcgggtg tggatccagc 3420

agactttgct gccgatccac aaaagtacga catcccagac tctgtcatcg cgttcctgcg 3480

cggcgagctt ggtaaccctc caggtggctg gccagagcca ctgcgcaccc gcgcactgga 3540

aggccgctcc gaaggcaagg cacctctgac ggaagttcct gaggaagagc aggcgcacct 3600

cgacgctgat gattccaagg aacgtcgcaa tagcctcaac cgcctgctgt tcccgaagcc 3660

aaccgaagag ttcctcgagc accgtcgccg cttcggcaac acctctgcgc tggatgatcg 3720

tgaattcttc tacggcctgg tcgaaggccg cgagactttg atccgcctgc cagatgtgcg 3780

caccccactg cttgttcgcc tggatgcgat ctctgagcca gacgataagg gtatgcgcaa 3840

tgttgtggcc aacgtcaacg gccagatccg cccaatgcgt gtgcgtgacc gctccgttga 3900

gtctgtcacc gcaaccgcag aaaaggcaga ttcctccaac aagggccatg ttgctgcacc 3960

attcgctggt gttgtcaccg tgactgttgc tgaaggtgat gaggtcaagg ctggagatgc 4020

agtcgcaatc atcgaggcta tgaagatgga agcaacaatc actgcttctg ttgacggcaa 4080

aatcgatcgc gttgtggttc ctgctgcaac gaaggtggaa ggtggcgact tgatcgtcgt 4140

cgtttcctaa ggagaccaag gctcaaaggg aatccatgcc gtcttggttt aatactgcac 4200

ccgtctaatg aaaatcatta ctattaggtg tcatgatgga ccatgcacac gattcctgct 4260

caccaactct gcgccgtgat ttggaggtca ctggccagct ccaacctgag aaagctgtcg 4320

atttagcagc gccgcacgaa gggaaggttg ccaatataac gaaggtgacc tcctcaaata 4380

tggagcacac catcacgcag gcctcaaaag ctaaggaggt ggtggtgctc attggtcact 4440

ccctgctgcc cacatttcag gatttggaaa aagacattct gcactttcag gcaggtaata 4500

aagggcgatt ttctgtagcg attgttgatc ctgatcgcag tgcagatgtg gttgccagat 4560

ttaggccaaa acagattccg gtggcatacg tggtgaaaga tggcgccagc attgcggagt 4620

tcaactcgct caacaaggag ccggttgcac aatggcttga tcattttgtg tcgcgggaaa 4680

cgatccccaa tgaaaaagag ggggacgtcg ataagcaaat agacccgcgc ctgtggcggg 4740

cagcggaatt ggtgaacgcc ggtgattttc gcgcggcgtt ggcgttgtat gagcagttgc 4800

cgcaggatgc gacggtgaag cgggcgcacg cggcggtgtc ggtattggcg 4850

<210> 8

<211> 3481

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> promoter

<222> (705)..(904)

<223> Ptuf

<220>

<221> gene

<222> (905)..(2755)

<223> leuAfbr

<400> 8

gcgatcgtct ccttcggtcc aaaattcttc tgcccaatca gccggatttg ggtgcgatgc 60

ctgatcaatc ccacaaccgt ggtggtcaac gtgatggcac cagttgcgat gtgggtggcg 120

ttgtaaattt tcctggatac ccgccggttg gttctgggga ggatcgagtg gattcccgtc 180

gctgccgcat gccccaccgc ttgtaaaaca gccaggttag cagccgtaac ccaccacggt 240

ttcggcaaca atgacggcga gagagcccac cacattgcga tttccgctcc gataaagcca 300

gcgcccatat ttgcagggag gattcgcctg cggtttggcg acattcggat ccccggaact 360

agctctgcaa tgacctgcgc gccgagggag gcgaggtggg tggcaggttt tagtgcgggt 420

ttaagcgttg ccaggcgagt ggtgagcaga gacgctagtc tggggagcga aaccatattg 480

agtcatcttg gcagagcatg cacaattctg cagggcatag gttggttttg ctcgatttac 540

aatgtgattt tttcaacaaa aataacactt ggtctgacca cattttcgga cataatcggg 600

cataattaaa ggtgtaacaa aggaatccgg gcacaagctc ttgctgattt tctgagctgc 660

tttgtgggtt gtccggttag ggaaatcagg aagtgggatc gaaatggccg ttaccctgcg 720

aatgtccaca gggtagctgg tagtttgaaa atcaacgccg ttgcccttag gattcagtaa 780

ctggcacatt ttgtaatgcg ctagatctgt gtgctcagtc ttccaggctg cttatcacag 840

tgaaagcaaa accaattcgt ggctgcgaaa gtcgtagcca ccacgaagtc caggaggaca 900

tacaatgtct cctaacgatg cattcatctc cgcacctgcc aagatcgaaa ccccagttgg 960

gcctcgcaac gaaggccagc cagcatggaa taagcagcgt ggctcctcaa tgccagttaa 1020

ccgctacatg cctttcgagg ttgaggtaga agatatttct ctgccggacc gcacttggcc 1080

agataaaaaa atcaccgttg cacctcagtg gtgtgctgtt gacctgcgtg acggcaacca 1140

ggctctgatt gatccgatgt ctcctgagcg taagcgccgc atgtttgagc tgctggttca 1200

gatgggcttc aaagaaatcg aggtcggttt cccttcagct tcccagactg attttgattt 1260

cgttcgtgag atcatcgaaa agggcatgat ccctgacgat gtcaccattc aggttctggt 1320

tcaggctcgt gagcacctga ttcgccgtac ttttgaagct tgcgaaggcg caaaaaacgt 1380

tatcgtgcac ttctacaact ccacctccat cctgcagcgc aacgtggtgt tccgcatgga 1440

caaggtgcag gtgaagaagc tggctaccga tgccgctgaa ctaatcaaga ccatcgctca 1500

ggattaccca gacaccaact ggcgctggca gtactcccct gagtccttca ccggcactga 1560

ggttgagtac gccaaggaag ttgtggacgc agttgttgag gtcatggatc caactcctga 1620

gaacccaatg atcatcaacc tgccttccac cgttgagatg atcaccccta acgtttacgc 1680

agactccatt gaatggatgc accgcaatct aaaccgtcgt gattccatta tcctgtccct 1740

gcacccgcac aatgaccgtg gcaccggcgt tggcgcagct gagctgggct acatggctgg 1800

cgctgaccgc atcgaaggct gcctgttcgg caacggcgag cgcaccggca acgtctgcct 1860

ggtcaccctg gcactgaaca tgctgaccca gggcgttgac cctcagctgg acttcaccga 1920

tatacgccag atccgcagca ccgttgaata ctgcaaccag ctgcgcgttc ctgagcgcca 1980

cccatacggc ggtgacctgg tcttcaccgc tttctccggt tcccaccagg acgctgtgaa 2040

caagggtctg gacgccatgg ctgccaaggt tcagccaggt gctagctcca ctgaagtttc 2100

ttgggagcag ctgcgcgaca ccgaatggga ggttccttac ctgcctatcg atccaaagga 2160

tgtcggtcgc gactacgagg ctgttatccg cgtgaactcc cagtccggca agggcggcgt 2220

tgcttacatc atgaagaccg atcacggtct gcagatccct cgctccatgc aggttgagtt 2280

ctccaccgtt gtccagaacg tcaccgacgc tgagggcggc gaggtcaact ccaaggcaat 2340

gtgggatatc ttcgccaccg agtacctgga gcgcaccgca ccagttgagc agatcgcgct 2400

gcgcgtcgag aacgctcaga ccgaaaacga ggatgcatcc atcaccgccg agctcatcca 2460

caacggcaag gacgtcaccg tcgatggcca cggcaacgac ccactggccg cttacgccaa 2520

cgcgctggag aagctgggca tcgacgttga gatccaggaa tacaaccagc acgcccgcac 2580

ctcgggcgac gatgcagaag cagccgccta cgtgctggct gaggtcaacg gccgcaaggt 2640

ctggggcgtc ggcatcgctg gctccatcac ctacgcttcg ctgaaggcag tgacctccgc 2700

cgtaaaccgc gcgctggacg tcaaccacga ggcagtcctg gctggcggcg tttaaatctt 2760

tggcgcctag ttggcgacgc aagtgtttca ttggaacact tgcgctgcca actttttggt 2820

ttacgggcac aatgaaactg ttggatggaa tttagagtgt ttgtagctta aggagctcaa 2880

atgaatgagt ttgaccagga cattctccag gagatcaaga ctgaactcga cgagttaatt 2940

ctagaacttg atgaggtgac acaaactcac agcgaggcca tcgggcaggt ctccccaacc 3000

cattacgttg gtgcccgcaa cctcatgcat tacgcgcatc ttcgcaccaa agacctccgt 3060

ggcctgcagc aacgcctctc ctctgtggga gctacccgct tgactaccac cgaaccagca 3120

gtgcaggccc gcctcaaggc cgcccgcaat gttatcggag ctttcgcagg tgaaggccca 3180

ctttatccac cctcagatgt cgtcgatgcc ttcgaagatg ccgatgagat tctcgacgag 3240

cacgccgaaa ttctccttgg cgaaccccta ccggatactc catcctgcat catggtcacc 3300

ctgcccaccg aagccgccac cgacattgaa cttgtccgtg gcttcgccaa aagcggcatg 3360

aatctagctc gcatcaactg tgcacacgac gatgaaaccg tctggaagca gatgatcgac 3420

aacgtccaca ccgttgcaga agaagttggc cgggaaatcc gcgtcagcat ggacctcgcc 3480

g 3481

Claims

1.一种生产L-亮氨酸的重组菌，其特征在于，所述重组菌相比于出发菌具有降低的乳酸脱氢酶的表达，同时具有降低的下述一种或多种酶的表达：磷酸烯醇式丙酮酸合酶,丙氨酸转氨酶，丙酮酸羧化酶。

2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌相比于出发菌具有提高的α-异丙基苹果酸异构酶的表达；

优选地，所述重组菌具有至少两个拷贝的α-异丙基苹果酸异构酶编码基因，和/或所述重组菌的α-异丙基苹果酸异构酶编码基因的表达以高转录或高表达活性的调控元件介导；

更优选地，所述调控元件为强启动子；

再优选地，所述强启动子为Ptuf启动子。

3.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，

所述重组菌相比于出发菌具有降低的L-亮氨酸合成基因阻遏蛋白的表达；

所述重组菌相比于出发菌具有降低的苏氨酸脱氨酶的表达。

4.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌具有至少一个拷贝的α-异丙基苹果酸合成酶编码基因，所述α-异丙基苹果酸合成酶编码基因如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于，所述降低酶的表达通过将所述出发菌中所述酶编码基因失活实现，或将所述重组菌的所述酶编码基因的表达以低转录或低表达活性的调控元件介导，

优选地，所述调控元件为启动子和/或核糖体结合位点。

6.根据权利要求1-4中任一所述的重组菌，其特征在于，其中所述出发菌为选自棒杆菌属、小杆菌属、短杆菌属中的一株细菌，

优选地，所述棒杆菌属的细菌选自谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum、北京棒杆菌Corynebacterium pekinense、有效棒杆菌Corynebacterium efficiens、钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum、嗜热产氨棒杆菌Corynebacterium thermoaminogenes、产氨棒杆菌Corynebacterium aminogenes、百合棒杆菌Corynebacterium lilium、美棒杆菌Corynebacterium callunae和力士棒杆菌Corynebacterium herculis中的一株细菌；

所述小杆菌属的细菌选自嗜氨小杆菌Microbacterium ammoniaphilum中的一株细菌；和

所述短杆菌属的细菌选自黄色短杆菌Brevibacteriaceae flvum、乳酸发酵短杆菌Brevibacteriaceae lactofermentum和产氨短杆菌Brevibacteriaceae ammoniagenes中的一株细菌。

7.一种权利要求1-6任一所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

降低所述出发菌中乳酸脱氢酶的表达；

8.根据权利要求7所述重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

提高所述出发菌中α-异丙基苹果酸异构酶的表达；

降低所述出发菌中L-亮氨酸合成基因阻遏蛋白的表达；

降低所述出发菌中苏氨酸脱氨酶的表达；

9.根据权利要求7或8所述重组菌的构建方法，其特征在于，

所述降低酶的表达通过以下任一方式实现：

(A)将所述出发菌中该酶编码基因失活，

所述提高酶的表达通过以下任一方式实现：

(C)增加所述出发菌中该酶编码基因的拷贝数；

10.一种L-亮氨酸的生产方法，其特征在于，发酵权利要求1-6任一所述重组菌或采用权利要求7-9任一构建方法构建的重组菌，获得L-亮氨酸；

优选地，在所述发酵过程的重组菌生长期，向发酵体系中按照补料速率梯度流加异亮氨酸，所述补料速率梯度为0-6h，0g/L/h；6-14h，0～0.015g/L/h；14-20h 0.015～0.025g/L/h；20－25h，0.02-0.06g/L/h；25-35h，0.04-0.08g/L/h；

更优选地,所述补料速率梯度为0-10h，0g/L/h；10-14h，0.01g/L/h；14-18h，0.01584g/L/h；18-20.5h，0.02g/L/h；20.5-25h，0.04g/L/h；25-30h，0.06g/L/h。