CN112625985B - 一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸 - Google Patents

一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种高产β‑丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D‑泛酸及其构建方法，及其在共培养制备D‑泛酸中的应用。本发明通过利用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上panD、aspC，ppc基因的原有启动子以加强β‑丙氨酸的合成，并敲除基因pykA，pykF阻断PEP的消耗和改造大肠杆菌的葡萄糖摄取途径，加强非PTS转运系统而阻断PTS转运系统，积累合成的前体PEP；在此基础上引入异源的天冬氨酸脱羧酶基因panD,E.coli W3110的aspC以加强关键酶的酶活，增强β‑丙氨酸前体供给及转化，引入E.coli W3110的gdhA基因从而加强了辅酶NADP/DNAPH的循环再生，最终β‑丙氨酸的效价从0提高到2.48g/L。该菌株与之前的D‑泛酸生产菌株DPA21/pBCST3进行初步共培养体系的构建，进行了接种比例的优化，两个菌株接种比在1:1时，共培养菌株可以在同样的发酵培养基中生产3.08g/L的D‑泛酸。

Description

一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸
(一)技术领域
本发明涉及一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸及其构建方法，及其在共培养制备D-泛酸中的应用。
(二)背景技术
维生素B5，其性质偏酸并广泛存在于多种食物中，故又称为泛酸。泛酸存在两 种构型——D型和L型，在生物体内只有D型具有生物活性。它是辅酶A(CoA)和 酰基载体蛋白(ACP)合成的关键前体，CoA及ACP构成酰基转移酶的辅酶；但是 它只能在植物及微生物体内合成，而动物需要依靠外界摄取，因此D-泛酸及其衍生 物(D-泛酸钙和D-泛醇)在食品、医药、饲料、化妆品等领域有广泛的应用。由于 其在酸、碱、光和热等条件下不稳定，所以在储存、运输、商品交易和使用时多采 用更加稳定的形式——泛酸钙。
1933年，D-泛酸首次由R.J.Williams等人从肝脏中提取出来，并在1940年通 过化学方法成功合成得到。目前D-泛酸的生产方法主要有三种：化学法合成法、催 化合成法和微生物发酵合成法。化学法需要得到β-丙氨酸和DL-泛解酸内酯两种关键 中间体再用于D-泛酸的合成，其中β-丙氨酸主要通过丙烯腈法、丙烯酸法和琥珀酰 亚胺法合成得到，而DL-泛解酸内酯主要通过异丁醛-甲醛法、异丁醛-醛乙酸法和异 丁醛-三氯甲烷法得到；催化合成法可分为物理拆分法、化学拆分法、酶法拆分法； 这三种方法的共同点都是需得到前体D，L-泛酸内酯和β-丙氨酸；这两种方法在生产 前体的过程中极易产生对人体及环境污染，许多生产D-泛酸的厂家经常面临因环保 压力关停，因此人们开始重视对微生物发酵法合成D-泛酸方法的研究。
近年来，利用廉价的可再生原料通过微生物发酵生产高价值产品越来越受到关注。通过发酵制备D-泛酸的微生物有很多，比较常见的有大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌， 枯草芽孢杆菌，目前主要研究也是集中在上述菌株中。谷氨酸棒杆菌作为GRAS类菌 株，Christophe Chassagnole等人对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum ATCC13032)基因操作，首先在其基因组上敲除ilvA基因(编码苏氨酸脱氨酶)，然后 构建双质粒分别过表达ilvBN，ilvC，ilvD基因以及panB，panC基因，在外源添加β -丙氨酸经发酵发酵后得到8mM的D-泛酸，远不能满足工业应用。大肠杆菌作为模 式菌，具有生长速度快、遗传背景清晰等优点，具有丰富的基因编辑工具，并且可以 利用廉价的原料快速生长，可以作为一个良好的发酵平台，可用于重组大肠杆菌发酵 生产D-泛酸。
大肠杆菌中D-泛酸的合成大体分为三部分，一部分是泛解酸生物合成途径，首 先以丙酮酸为起点，两分子的丙酮酸在乙酰羟酸合酶(ilvBN，ilvGM，ilvIH编码) 的作用下形成一分子的乙酰乳酸；乙酰乳酸在乙酰乳酸还原异构酶(ilvC编码)，二 羟酸脱水酶(ilvD编码)催化下生成酮异戊酸，panB编码的酮异戊酸羟甲基转移酶 使用5，10-亚甲基四氢叶酸作为辅因子将酮异戊酸转化为酮泛解；随后，酮泛解酸通 过酮戊酸还原酶(panE编码)/乙酰乳酸还原异构酶(ilvC编码)还原成泛解酸；另 一部分是β-丙氨酸生物合成途径，从磷酸烯醇式丙酮酸出发供给草酰乙酸，由草酰 乙酸在天冬氨酸转氨酶(由aspC编码)作用下形成天冬氨酸，然后天冬氨酸在天冬 氨酸脱羧酶(panD编码)作用下脱去CO2生成β-丙氨酸；在生成前体泛解酸和β- 丙氨酸后，二者通过panC编码的泛酸合成酶催化ATP依赖性缩合反应，形成D-泛酸。
Miki Hiroshi等人在缬氨酸高产菌的基础上运用紫外诱变和亚硝基胍诱变技术与 特殊培养基筛选相结合选育得到高产D-泛解酸菌株，并过表达泛酸途径合成基因， 得到菌株E.coli FV5069/pFV31，在外源添加β-丙氨酸的情况下72h发酵后制备得到 65.4g/L的D-泛酸。2019年张博、张小明等人在利用大肠杆菌生产D-泛酸中，对大肠 杆菌进行系统代谢工程改造，以Escherichia coli W3110野生菌为出发菌株，通过主代 谢途径关键基因ilvG的修复，将羟甲基转移酶、酮酸还原异构酶和酮泛解酸还原酶、 泛酸合成酶的编码基因panB、ilvC、panE，panC的启动子替换为trc启动子，并对 缬氨酸-丙酮酸氨基转移酶的编码基因avtA、苏氨酸脱氨酶ilvA进行敲除以提高酮异 戊酸的积累，下调支链氨基酸氨基转移酶的编码基因ilvE、泛酸激酶coaA表达，在 结合pTrc99a质粒上过表达来自谷氨酸棒杆菌羟甲基转移酶、泛酸合成酶，通过发酵 条件的优化，D-泛酸的产量最终达到28.45g/L。
尽管通过诱变和基因编辑的手段获得重组菌株，并联系在质粒上过表达D-泛酸合成的相关基因，经发酵后D-泛酸有较高的提升；但这些发酵过程中需要添加不同 量的β-丙氨酸来提高D-泛酸的产量，这在发酵生产中是不经济的。为经济有效利用 微生物生产D-泛酸，可在菌体内调控泛解酸与β-丙氨酸的生成，继而合成D-泛酸； 但是这种调控非常复杂，由于二者前体——磷酸烯醇式丙酮酸与丙酮酸的相互转化和 重要作用，需要精细的分子元件来调控，泛解酸和β-丙氨酸通路平衡需要通过调节 二者模块中的通路基因的相对表达强度来实现。这需要在优化基因拷贝数、表达启动 子强度和核糖体结合位点等，这些都受到现有生物工程工具的限制，并且常常导致次 优的生物生产性能。随着生物发酵技术的发展和现在绿色发展理念的深入，以及多种 微生物菌株组成的工程微生物共培养物在微生物生物合成中的应用受到越来越多的 关注，我们设计通过共培养技术来控制泛解酸与β-丙氨酸相应通路模块共培养菌株 之间的比例来协调两通路的通量，经济有效的生产D-泛酸。
(三)发明内容
本发明的目的在于利用代谢工程和基因编辑技术，构建一株一株β-丙氨酸合成基因工程菌株，及其在共培养制备D-泛酸中的应用。
本发明采用的技术方案是：
一种高产β-丙氨酸的基因工程菌，按如下方法构建获得：
(1)以基因工程菌E.coli CCTCC NO：M 2018914为出发菌株，将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到工程菌E.coli W3110(DE3)， Trc-panD，记为ALA1；
(2)将工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD基因组中的aspC基因的启动子 替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC，记 为ALA2；
(3)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC基因组中ppc基因的启动子替 换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc， 记为ALA3；
(4)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc基因组中的pykA基因 敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA，记 为ALA4；
(5)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA基因组中的pykF基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF，记为ALA5；
(6)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF基因组中 的ptsG基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG，记为ALA6
(7)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG基 因组中的glk基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG/Trc-glk，记为ALA7；
(8)以质粒pET28a为载体，连接来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的panD基因得到新的质粒pET28a-panD，记为pD；
(9)以步骤(8)构建好的质粒pD为载体，继续连接来自得E.coli W3110的aspC 基因得到新的质粒pET28a-panDaspC，记为pDC；
(10)以步骤(9)构建好的质粒pDC为载体，继续连接来自得E.coli W3110 的gdhA基因得到新的质粒pET28a-panDaspCgdhA，记为pDCA；
(11)将步骤(10)构建好的质粒导入步骤(7)获得的菌株ALA7中，得到菌株 ALA7/pDCA，即为所述β-丙氨酸的基因工程菌。
所述Trc启动子序列如SEQ ID No.1所示，步骤(8)中所述panD基因序列如SEQ IDNo.2所示，步骤(9)中所述aspC基因序列如SEQ ID No.3所示，步骤(10)中 所述gdhA基因序列如SEQ ID No.4所示。
本发明通过(1)加强panD基因的表达以增强天冬氨酸向β-丙氨酸的转化，(2) 加强基因aspC，ppc的表达，用于增强磷酸烯醇式丙酮酸向天冬氨酸的转化用以积累 天冬氨酸底物池，(3)敲除pykA，pykF基因，阻断磷酸烯醇式丙酮酸形成丙酮酸的 通量，(4)敲除ptsG破坏葡萄糖PTS转运系统，加强glk基因的表达而加强葡萄糖 非PTS转运系统，阻止磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸(PYR)，加强了底 物池PEP的积累，(5)在质粒上引入异源的天冬氨酸脱羧酶基因panD加强关键酶 的酶活，(6)在质粒上引入基因aspC加强前体天冬氨酸的积累，(7)在质粒上引 入E.coli W3110的基因gdhA，加强辅酶NADP/DNAPH的循环再生，最终得到最优 的β-丙氨酸高产大肠杆菌基因工程菌株。
本发明还涉及构建所述的基因工程菌方法，所述方法包括：
(1)以基因工程菌E.coli CCTCC NO：M 2018914为出发菌株，应用CRISPR-Cas9 基因编辑技术将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到 工程菌E.coliW3110(DE3)，Trc-panD，记为ALA1；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD 基因组中的aspC基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110 (DE3)，Trc-panD/Trc-aspC，记为ALA2；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC基因组中ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc，记为ALA3；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc基因组中的pykA基因敲除，得到E.coli W3110 (DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA，记为ALA4；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA基因组中的pykF基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF，记为ALA5；
(6)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF基因组中的ptsG基因敲除，得到 E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG， 记为ALA6；
(7)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG基因组中的glk基因的启动 子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)， Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG/Trc-glk，记为ALA7；
(8)以质粒pET28a为载体，连接来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的panD基因得到新的质粒pET28a-panD，记为pD；
(9)以步骤(8)构建好的质粒pD为载体，继续连接来自得E.coli W3110的aspC 基因得到新的质粒pET28a-panDaspC，记为pDC；
(10)以步骤(9)构建好的质粒pDC为载体，继续连接来自得E.coli W3110的 gdhA基因得到新的质粒pET28a-panDaspCgdhA，记为pDCA；
(11)将步骤(10)构建好的质粒导入步骤(7)获得的菌株ALA7中，得到菌株 ALA7/pDCA，即为所述高产β-丙氨酸的基因工程菌。
所述Trc启动子序列如SEQ ID No.1所示，步骤(8)中所述panD基因序列如SEQ IDNo.2所示，步骤(9)中所述aspC基因序列如SEQ ID No.3所示，步骤(10)中 所述gdhA基因序列如SEQ ID No.4所示。
本发明还涉及所述的基因工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
具体的，所述应用为：将所述基因工程菌菌株接种至发酵培养基中(必要时加入硫酸卡那霉素(Kan)维持质粒存在)，30℃、150～200rpm条件下进行发酵培养 OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养至24～48h，发酵结束后 取发酵液上清分离纯化得到β-丙氨酸。
所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/L、(NH4)2SO4 16g/L、KH2PO4 0.8g/L、 MgSO40.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO3 12g/L，1ml/L微量金属盐溶液，溶剂为 去离子水；微量金属盐溶液组成为：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离子水。
通常，所述基因工程菌发酵前，先接种至LB培养基中，在温度37℃、转速200 rpm的摇床上过夜培养，然后以体积浓度5％接种量接种到发酵培养基中培养。
本发明还涉及所述的基因工程菌在与产D-泛酸菌株共培养发酵制备D-泛酸中的应用。可将D-泛酸合成基因工程菌株和本发明β-丙氨酸合成基因工程菌株进行共培 养，用于微生物发酵制备D-泛酸。
优选的，所述产D-泛酸菌株为大肠杆菌CCTCC NO：M 20191027。该菌株D- 泛酸效价可达6.33g/L，已在中国专利CN111100834A中公开。
优选的，共培养时所述高产β-丙氨酸的基因工程菌与所述产D-泛酸菌株接种比例为1:1。
本发明改造了大肠杆菌的葡萄糖摄取途径相关基因，采用CRISPR-Cas9基因编 辑技术将来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上panD、aspC基因的 原有启动子，增强了天冬氨酸底物池的积累并提高了天冬氨酸到β-丙氨酸的转换效 率。通过敲除pykA、pykF基因，阻断磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸而更多的转化 为草酰乙酸。通过敲除ptsG基因，并利用CRISPR-Cas9基因编辑技术将来源于 pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上glk基因的原有启动子，阻断了PTS 系统，增强非PTS系统对糖的摄取，避免其磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸的作用。 在质粒上引入异源的天冬氨酸脱羧酶基因panD和E.coli W3110天冬氨酸转氨酶基 因aspC可加强关键酶的酶活，增强β-丙氨酸前体供给及转化，引入来源于E.coli W3110的谷氨酸脱羧酶gdhA基因从而加强了辅酶NADP/DNAPH的循环再生。
本发明有益效果主要体现在：
本发明通过利用来源于pTrc99A的Trc启动子和RBS序列替换基因组上panD、aspC，ppc基因的原有启动子以加强β-丙氨酸的合成，并敲除基因pykA，pykF阻断 PEP的消耗和改造大肠杆菌的葡萄糖摄取途径，加强非PTS转运系统而阻断PTS转 运系统，积累合成的前体PEP；在此基础上引入异源的天冬氨酸脱羧酶基因panD，E. coli W3110的aspC以加强关键酶的酶活，增强β-丙氨酸前体供给及转化，引入E.coli W3110的gdhA基因从而加强了辅酶NADP/DNAPH的循环再生，最终β-丙氨酸的效 价从0提高到2.48g/L。在得到该β-丙氨酸基础生产菌株之后，与之前的D-泛酸生 产菌株DPA21/pBCST3进行初步共培养体系的构建，并进行了接种比例的优化，结果 显示两个菌株接种比在1:1时，共培养菌株可以在同样的发酵培养基中生产3.08g/L 的D-泛酸。
(四)附图说明
图1为β-丙氨酸代谢途径图和改造位点；
图2为ALA1的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图3为ALA2的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图4为ALA3的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图5为ALA3/pD的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图6为ALA3/pDC的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图8为ALA5/pDC的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图7为ALA4/pDC的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图9为ALA6/pDC的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图10为ALA7/pDC的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图11为ALA7/pDCA的OD600和β-丙氨酸效价变化；
图12为DPA21/pBCS:ALA7/pDCA在不同接种比例下的OD600和D-泛酸效价变 化。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
以下实施例中，所述硫酸卡那霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述盐酸壮 观霉素在培养基中终浓度为0.05mg/L，所述硫酸卡那霉素在培养基中终浓度为 0.05mg/L。
本发明所述亲本菌株E.coli W3110(DE3)来自中国典型培养物保藏中心，保藏 编号CCTCC NO：M 2018914，已在中国专利CN109868254A中公开。
菌株E.coliW3110来自耶鲁大学CGSC保藏中心(Coli Genetic Stock Center)，保藏日期1975年8月5日，保藏编号CGSC#4474，已在专利US 2009/0298135A1， US 2010/0248311A1中公开。
实施例1～13中使用的引物序列信息如表2所示：
表1：基因编辑涉及的基因及相应途径
Figure BDA0002816747360000081
表2：引物序列
Figure BDA0002816747360000082
Figure BDA0002816747360000091
Figure RE-GDA0002966313620000101
pT-X-F/R为pTatget质粒的突变引物，其中X为携带基因组的目的基因所含PAM 位点(NGG)前20bp序列；pTD-X P1/P2为目的基因的上游同源臂(约500bp)上 下游引物；pTD-XP3/P4为目的基因的下游同源臂(约500bp)上下游引物；X VF/VR 为目的基因的验证引物。
实施例1：HPLC法测定发酵液中D-泛酸含量
检测方法如下：
样品处理：取1ml发酵液离心取上清，将上清液用超纯水稀释合适倍数，保持 D-泛酸含量在0.05g/L到0.40g/L之间；
色谱条件：C18柱(250×4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)、检测波长：200nm、柱温：30℃、流速：0.9ml/min；
流动相：乙腈/水/磷酸：(50/949/1)；
数据采集时间：23min。
实施例2：HPLC法测定发酵液中β-丙氨酸含量
检测方法如下：
样品处理：取1ml发酵液离心取上清，将上清液用超纯水稀释合适倍数，保持β -丙氨酸含量在0.05g/L到0.50g/L之间；取100μL样品加入1.5mL EP管里，再加入 100μL的衍生化试剂(2，4-二硝基氟苯)和100μL的衍生缓冲液(0.5M NaHCO3)， 然后300μL体系在60℃金属浴中反应1h15min(400rpm)；反应结束后，在体系中 加入700μL的0.2M PB缓冲液，混匀，离心12-13min，有沉淀出现，取200μL上清 液于内衬管中，备用。
色谱条件：C18柱(250×4.6mm，particle size 5μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，CA，USA)、检测波长：360nm、柱温：40℃、流速：1ml/min；
流动相：流动相A：10mM KH2PO4；流动相B：乙腈：甲醇：水＝45:45:10，使 用0.20μm微孔水系滤膜过膜后超声除气泡；采用下述方式梯度洗脱进行检测：
Time(min) A％ B％ Flow rate(mL/min)
2.5 88 12 1
2.6 84 16 1
13 64 36 1
13.1 62 38 1
25 0 100 1
28 0 100 1
28.1 90 10 1
35 88 12 1
数据采集时间：35min。
实施例3：过表达panD基因的菌株ALA1的构建及摇瓶发酵
以基因工程菌E.coli W3110(DE3)(即CCTCC NO：M 2018914)为出发菌株， 使用CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术如图1(Yu Jiang et al.2015Multigene Editing inthe Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System.Applied EnvironmentalMicrobiology.81:2506-2514)，用来源于pTrc99A的Trc启动子(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，在基因组替换panD基因的天然启动子，以增强panD基因的表达强 度。
(1)构建pTarget-panD质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-trc-panD F/pT-trc-panD R为引物PCR扩增，得到的PCR产物经过Dpn I在 37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态中，盐酸壮观霉素(SD)平板 筛选，测序验证获得正确的pTarget-panD质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-panD质粒：以E.coli W3110(DE3)基因组为模版，trc-panD P1 与trc-panD P2为引物扩增获得donor DNA的上游同源臂(A)，trc-panD P3和 trc-panD P4为引物扩增获得donor DNA的下游同源臂(C)，胶回收纯化PCR片段 得到同源臂A和C；pTarget-panD质粒经过Xba I和Pst I在37℃保温8h，纯化试 剂盒回收DNA片段；按照
Figure BDA0002816747360000121
(One step clone kit，Vazyme Biotech，Nanjing， China)说明书将pTarget-panD质粒、同源臂A和C连接在一起，导入E.coli DH5α 化转感受态中，菌落PCR后筛选阳性克隆子，通过测序验证得到pTD-panD质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入E.coli W3110(DE3)化转感 受态中，挑取阳性克隆转接到含0.05mg/L硫酸卡那霉素的LB试管中，30℃过夜培 养；再以体积浓度1％的接种量接种到含50mL LB培养基的250mL摇瓶中，并加入 500μl 1mol/L的L-阿拉伯糖，150rpm、30℃培养至OD600 0.4～0.6；4000rpm，4℃ 离心10min收集细胞，制备电转化感受态，详细过程见(Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3ed Edition，99-102)的描述。
(4)取200ng pTD-panD质粒与100μl电击感受态细胞混合，转入预冷的2mm 电击杯中，冰浴1min左右，用电穿孔仪(MicroPluserTM，BIO-RAD)进行电击转 化，电击完成后立即加入预冷的1mL LB培养基并立即轻柔吸出，转移到1.5mL离 心管中，30℃复苏2～3h后涂布含0.05mg/L硫酸卡那霉素和0.05mg/L盐酸壮观霉 素的LB平板，37℃倒置培养14-18h，以panD VF和panD VR为验证引物进行菌落 PCR验证，若能成功克隆出一段750bp左右的片段，则证明该单菌落是E.coli W3110 (DE3)(Trc-panD)的阳性菌落，即编辑成功，得到新的菌株ALA1。
(5)质粒消除：挑取阳性单菌落接种到含1mM IPTG和0.05mg/L硫酸卡那霉 素的LB试管，30℃培养过夜，次日菌液划线于含0.05mg/L硫酸卡那霉素的LB平板， 30℃培养24h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L盐酸壮观霉素的LB平板，若在含0.05 mg/L盐酸壮观霉素的LB平板不能生长的单菌落证明其pTarget-panD质粒成功消除， 挑取pTarget-panD质粒成功消除的单菌落于LB试管，37℃培养过夜，次日菌液划 线于LB平板，42℃培养12h，挑取单菌落划线于含0.05mg/L硫酸卡那霉素的LB 平板，若不能在含0.05mg/L硫酸卡那霉素的LB平板生长的单菌落证明其pCas质粒 成功消除最终得到无质粒E.coli W3110(DE3)(Trc-panD)(简称ALA1)。
(6)将构建的ALA1菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接种到10mL 的LB培养基中，以野生型菌株E.coli W3110(DE3)为对照，37℃、200rpm培养用 作种子液；8～12h后，接种1mL种子液到装有20mL的MS培养基的500mL摇瓶 中，然后在30℃、150rpm培养发酵(若含有质粒需要诱导，则菌株生长到 OD600＝0.8～1.0时，添加终浓度为0.1mM的IPTG)，培养至48h；发酵结束后取1mL 发酵液测定OD600，取1mL发酵液，12000rpm室温离心2min，将发酵上清稀释10 倍，根据实施例2进行HPLC检测，OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图2所示。
由图可见，用Trc启动子替换基因组上panD基因的天然启动子，对细胞生长无 明显抑制作用，但能提高β-丙氨酸的产量，使得β-丙氨酸效价从0增加到0.128g/L， 这说明panD基因的过表达有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，溶剂为去离子水， pH值自然。
MS培养基：葡萄糖20g/L、硫酸铵16g/L、KH2PO4 0.8g/L、MgSO4 0.5g/L、 酵母提取物2g/L、β-丙氨酸2.5g/L、CaCO3 10g/L(单独灭菌)、1mL/L微量元素 溶液，溶剂为去离子水，pH值自然；微量元素溶液组成：10g/L CuCl2、10g/L FeSO4·7H2O、1g/L ZnSO4·7H2O、0.20g/L CuSO4、0.02g/L NiCl2·7H2O，溶剂为去离 子水。
实施例4：过表达aspC基因的菌株ALA2的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-aspC质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-trc-aspC F/pT-trc-aspC R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保 温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，盐酸壮观霉素平板筛选，测 序验证获得正确的pTarget-aspC质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-aspC质粒：以E.coli W3110基因组为模版，trc-aspC P1、trc-aspCP2、trc-aspC P3和trc-aspC P4为引物，构建步骤同实施例3(2)，得到pTD-aspC 质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例3获得的菌株ALA1 感受态中，菌株ALA1感受态制备方法同实施例3(3)。
(4)构建得到菌株ALA2阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例3(5)，获得无质粒菌株ALA2。
(6)将构建的菌株ALA2生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接 种到10mL的LB培养基中，以实施案例3构建的菌株ALA1为对照，按照实施例3 (6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图3所示。
由图可见，菌株ALA1基因组上继续过表达aspC基因对细胞生长无明显影响， 但β-丙氨酸效价从0.128g/L增加到0.232g/L，这说明aspC基因的加强可增强胞内β -丙氨酸前体天冬氨酸的合成途径，从而有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例5：过表达ppc基因的菌株ALA3的构建及摇瓶发酵
(1)构建pT-trc-ppc质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pT-trc-ppc F/pT-trc-ppc R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3 h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，盐酸壮观霉素平板筛选，测序验证获 得正确的pTarget-ppc质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-trc-ppc质粒：以E.coli W3110基因组为模版，trc-ppc P1、trc-ppcP2、trc-ppc P3和trc-ppc P4为引物，构建步骤同实施例3(2)，得到pTD-ppc质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例4获得的菌株ALA2 感受态中，菌株DPA11感受态制备方法同实施例3(3)。
(4)构建得到菌株ALA3阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例3(5)，获得无质粒菌株ALA3。
(6)将构建的菌株ALA3生产菌株从甘油管中划线到LB平板，挑取单菌落接 种到10mL的LB培养基中，以实施例4构建的菌株ALA2为对照，按照实施例3(6) 方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图4所示。
由图可见，菌株ALA2基因组上继续过表达ppc基因对细胞生长影响较低，但β -丙氨酸效价从0.232g/L增加到0.29g/L，这说明ppc基因的加强可增强胞内β-丙氨酸 前体天冬氨酸的合成途径，从而有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例6：质粒pD的构建及摇瓶发酵
(1)构建pD质粒框架：以pET28a质粒为模版，以pET28a F/pET28a R为引物 PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，经纯化后获得pD质粒框架， 用于后续一步克隆连接。
(2)构建panD目的片段：合成来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 的panD基因(序列如SEQ ID No.2所示)，以panD F/panD R为引物PCR扩增，经 纯化后获得panD目的基因，用于后续一步克隆连接。
(3)采用一步克隆试剂盒将pD质粒框架和panD目的片段连接，37℃反应1h 后导入E.coli DH5α化转感受态细胞中。
(4)挑选阳性菌落，经测序验证正确后接种于LB试管，37℃培养过夜后采用 质粒试剂盒提取质粒，获得pD质粒，转入菌株ALA3化转感受态中。
挑选阳性菌落ALA3/pD，并以实施例5构建的菌株ALA3为对照组，按照实施 例3(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图5 所示。
由图可见，菌株ALA3/pD相对于菌株ALA3细胞生长无明显差别，但β-丙氨酸 效价从0.29g/L增加到0.534g/L，这说明宿主菌内生panD不足以将天冬氨酸转化为β -丙氨酸，加强异源panD基因有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例7：质粒pDC的构建及摇瓶发酵
(1)构建pDC质粒框架：以pD质粒为模版，以pD F/pD R为引物PCR扩增， PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，经纯化后获得pDC质粒框架，用于后续一 步克隆连接。
(2)构建aspC目的片段：合成来自E.coli W3110的aspC基因(序列如SEQ ID No.3所示)，以aspC F/aspC R为引物PCR扩增，经纯化后获得aspC目的基因，用 于后续一步克隆连接。
(3)采用一步克隆试剂盒将pDC质粒框架和基因aspC目的片段连接，37℃反 应1h后导入E.coli DH5α化转感受态细胞中。
(4)挑选阳性菌落，经测序验证正确后接种于LB试管，37℃培养过夜后采用 质粒试剂盒提取质粒，获得pDC质粒，转入菌株ALA3化转感受态中。
挑选阳性菌落ALA3/pDC，并以实施例6构建的菌株ALA3/pD为对照组，按照 实施例3(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如 图6所示。
由图可见，菌株ALA3/pDC相对于菌株ALA3/pD细胞生长无明显差别，但β- 丙氨酸效价从0.534g/L增加到1.074g/L，这说明宿主菌内生aspC酶活不足，导致将 天冬氨酸转不足以积累，加强aspC基因的表达有利于天冬氨酸的转化，从而有利于 大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例8：pykA基因敲除菌株ALA4的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-pykA质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ΔpykA F/pTarget-ΔpykA R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃ 保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，盐酸壮观霉素平板筛选， 测序验证获得正确的pTarget-pykA质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-pykA质粒：以E.coli W3110基因组为模版，ΔpykA P1、ΔpykA P2、ΔpykA P3和ΔpykA P4为引物，构建步骤同实施例3(2)，得到pTD-pykA质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例5获得的菌株ALA3 感受态中，菌株ALA3感受态制备方法同实施例3(3)。
(4)构建得到菌株ALA4阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例3(5)，获得无质粒菌株ALA4。
(6)将构建的菌株ALA4生产菌株转入pDC质粒后得到菌株ALA4/pDC，并以 实施例7构建的菌株ALA3/pDC为对照组，按照实施例3(6)方法进行摇瓶测试和 检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图7所示。
由图可见，菌株ALA4基因组上敲除pykA基因对细胞生长有轻微促进作用，但 β-丙氨酸效价从1.073g/L增加到1.153g/L，这说明pykA基因的敲除可有效增强胞内 天冬氨酸前体磷酸烯醇式丙酮酸的积累，从而有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例9：pykF基因敲除菌株ALA5的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-pykF质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ΔpykF F/pTarget-ΔpykF R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在 37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，盐酸壮观霉素平板筛 选，测序验证获得正确的pTarget-pykF质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-pykF质粒：以E.coli W3110基因组为模版，ΔpykF P1、ΔpykF P2、ΔpykF P3和ΔpykF P4为引物，构建步骤同实施例3(2)，得到pTD-pykF质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施案例8获得的菌株ALA4 感受态中，菌株ALA4感受态制备方法同实施例3(3)。
(4)构建得到菌株ALA5阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例3(5)，获得无质粒菌株ALA5。
(6)将构建的菌株ALA5生产菌株转入pDC质粒后得到菌株ALA5/pDC，并以 实施例8构建的菌株ALA4/pDC为对照组，按照实施例3(6)方法进行摇瓶测试和 检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图8所示。
由图可见，菌株ALA4基因组上敲除pykF基因导致细胞生长抑制，但β-丙氨酸 效价从1.153g/L增加到1.318g/L，这说明pykF基因的敲除可继续有效增强胞内天冬 氨酸前体磷酸烯醇式丙酮酸的积累，从而有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例10：ptsG基因敲除菌株ALA5的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-ptsG质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模版，以pTarget-ΔptsG F/pTarget-ΔptsG R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在 37℃保温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，盐酸壮观霉素平板筛 选，测序验证获得正确的pTarget-ptsG质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-ptsG质粒：以E.coli W3110基因组为模版，ΔptsG P1、ΔptsG P2、ΔptsG P3和ΔptsG P4为引物，构建步骤同实施例3(2)，得到pTD-ptsG质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例9获得的菌株ALA5 感受态中，菌株ALA5感受态制备方法同实施例3(3)。
(4)构建得到菌株ALA6阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例3(5)，获得无质粒菌株ALA6。
(6)将构建的菌株ALA6生产菌株转入pDC质粒后得到菌株ALA6/pDC，并以 实施例9构建的菌株ALA5/pDC为对照组，按照实施例3(6)方法进行摇瓶测试和 检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含量如图9所示。
由图可见，菌株ALA5基因组上敲除ptsG基因对细胞生长有明显抑制作用，但 β-丙氨酸效价从1.318g/L增加到1.569g/L，这说明ptsG基因的敲除有利于大肠杆菌 D-泛酸的合成。
实施例11：基因组上过表达glk基因菌株ALA7的构建及摇瓶发酵
(1)构建pTarget-glk质粒：以pTarget F质粒(Addgene Plasmid#62226)为模 版，以pT-trc-glk F/pT-trc-glk F R为引物PCR扩增，PCR产物经过Dpn I在37℃保 温消化3h，再转化到E.coli DH5α化转感受态细胞中，盐酸壮观霉素平板筛选，测 序验证获得正确的pTarget-glk质粒，用于后续连接Donor DNA。
(2)构建pTD-glk质粒：以E.coli W3110基因组为模版，trc-glk P1、trc-glk P2、trc-glk P3和trc-glk P4为引物，构建步骤同实施例3(2)，得到pTD-glk质粒。
(3)将pCas质粒(Addgene Plasmid#62225)导入实施例10获得的菌株ALA6 感受态中，菌株ALA6感受态制备方法同实施例3(3)。
(4)构建得到菌株ALA7阳性菌落，构建方法同实施例3(4)。
(5)质粒消除：实施方法同实施例3(5)，获得无质粒菌株ALA7。
(6)将构建的菌株ALA7生产菌株转入pDC质粒后得到菌株ALA7/pDC，并以 实施例10构建的菌株ALA6/pDC为对照组，按照实施例3(6)方法进行摇瓶测试和 检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图10所示。
由图可见，菌株ALA6基因组上用Trc启动子替换glk基因天然启动子恢复部分 细胞生长，β-丙氨酸效价从1.569g/L增加到2.023g/L，这说明glk基因的过表达可有 效增强胞内葡萄糖的摄取，增强了糖酵解途径，明显促进了大肠杆菌β-丙氨酸的合 成。
实施例12：质粒pDCA的构建及摇瓶发酵
构建pDCA质粒框架：以pDC质粒为模版，以pDC F/pDC R为引物PCR扩增， PCR产物经过Dpn I在37℃保温消化3h，经纯化后获得pDCA质粒框架，用于后续 一步克隆连接。
构建gdhA目的片段:合成来自E.coli W3110的gdhA基因(序列如SEQ ID No.4 所示)，以gdhA F/gdhA R为引物PCR扩增，经纯化后获得gdhA目的基因，用于后 续一步克隆连接。
采用一步克隆试剂盒将pDCA质粒框架和gdhA目的片段连接，37℃反应1h后 导入E.coli DH5α化转感受态细胞中。
挑选阳性菌落，经测序验证正确后接种于LB试管，37℃培养过夜后采用质粒试 剂盒提取质粒，获得pDCA质粒，转入菌株ALA7化转感受态中。
挑选阳性菌落ALA7/pDCA，并以实施例11构建的菌株ALA7/pDC为对照组， 按照实施例3(6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的β-丙氨酸含 量如图11所示。
由图可见，菌株ALA7/pDCA相对于菌株ALA7/pDC细胞生长无明显差别，但β- 丙氨酸效价从2.023g/L增加到2.484g/L，这说明平衡宿主菌胞内NADPH/NADH的比 例将有利于大肠杆菌β-丙氨酸的合成。
实施例13：D-泛酸合成共培养体系构建及菌株发酵
(1)选取泛酸合成菌株(需外加β-丙氨酸)DPA21/pBCST3(保藏菌种号： CCTCC NO：M 20191027)，β-丙氨酸合成菌株ALA7/pDCA，按照DPA21/pBCST3： ALA7/pDCA＝3：1，2：1，1：1，1：2，1：3，1：5，1：10接种，并按照实施例3 (6)方法进行摇瓶测试和检测。OD600及发酵液上清中的D-泛酸含量如图12所示。
由图可见，菌株DPA21/pBCST3：ALA7/pDCA在不同比例下，D-泛酸效价在 1.221g/L到3.084g/L之间，其中接种比例在1：1时D-泛酸的效价最高为3.084g/L。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种高产β-丙氨酸的基因工程菌及共培养制备D-泛酸
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 74
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 1
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 2
<211> 411
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<400> 2
atgctgcgca ccatcctcgg aagtaagatt caccgagcca ctgtcactca agctgatcta 60
gattatgttg gctctgtaac catcgacgcc gacctggttc acgccgccgg attgatcgaa 120
ggcgaaaaag ttgccatcgt agacatcacc aacggcgctc gtctggaaac ttatgtcatt 180
gtgggcgacg ccggaacggg caatatttgc atcaatggtg ccgctgcaca ccttattaat 240
cctggcgatc ttgtgatcat catgagctac cttcaggcaa ctgatgcgga agccaaggcg 300
tatgagccaa agattgtgca cgtggacgcc gacaaccgca tcgttgcgct cggcaacgat 360
cttgcggaag cactacctgg atccgggctt ttgacgtcga gaagcattta g 411
<210> 3
<211> 1191
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60
cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120
ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180
accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240
ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300
ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360
aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420
ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480
gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540
tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600
tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660
ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720
gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780
gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840
gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900
gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960
atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020
atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080
ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140
acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191
<210> 4
<211> 1344
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 4
atggatcaga catattctct ggagtcattc ctcaaccatg tccaaaagcg cgacccgaat 60
caaaccgagt tcgcgcaagc cgttcgtgaa gtaatgacca cactctggcc ttttcttgaa 120
caaaatccaa aatatcgcca gatgtcatta ctggagcgtc tggttgaacc ggagcgcgtg 180
atccagtttc gcgtggtatg ggttgatgat cgcaaccaga tacaggtcaa ccgtgcatgg 240
cgtgtgcagt tcagctctgc catcggcccg tacaaaggcg gtatgcgctt ccatccgtca 300
gttaaccttt ccattctcaa attcctcggc tttgaacaaa ccttcaaaaa tgccctgact 360
actctgccga tgggcggtgg taaaggcggc agcgatttcg atccgaaagg aaaaagcgaa 420
ggtgaagtga tgcgtttttg ccaggcgctg atgactgaac tgtatcgcca cctgggcgcg 480
gataccgacg ttccggcagg tgatatcggg gttggtggtc gtgaagtcgg ctttatggcg 540
gggatgatga aaaagctctc caacaatacc gcctgcgtct tcaccggtaa gggcctttca 600
tttggcggca gtcttattcg cccggaagct accggctacg gtctggttta tttcacagaa 660
gcaatgctaa aacgccacgg tatgggtttt gaagggatgc gcgtttccgt ttctggctcc 720
ggcaacgtcg cccagtacgc tatcgaaaaa gcgatggaat ttggtgctcg tgtgatcact 780
gcgtcagact ccagcggcac tgtagttgat gaaagcggat tcacgaaaga gaaactggca 840
cgtcttatcg aaatcaaagc cagccgcgat ggtcgagtgg cagattacgc caaagaattt 900
ggtctggtct atctcgaagg ccaacagccg tggtctctac cggttgatat cgccctgcct 960
tgcgccaccc agaatgaact ggatgttgac gccgcgcatc agcttatcgc taatggcgtt 1020
aaagccgtcg ccgaaggggc aaatatgccg accaccatcg aagcgactga actgttccag 1080
caggcaggcg tactatttgc accgggtaaa gcggctaatg ctggtggcgt cgctacatcg 1140
ggcctggaaa tggcacaaaa cgctgcgcgc ctgggctgga aagccgagaa agttgacgca 1200
cgtttgcatc acatcatgct ggatatccac catgcctgtg ttgagcatgg tggtgaaggt 1260
gagcaaacca actacgtgca gggcgcgaac attgccggtt ttgtgaaggt tgccgatgcg 1320
atgctggcgc agggtgtgat ttaa 1344

Claims (8)

1.一种高产β-丙氨酸的基因工程菌，按如下方法构建获得：
(1)以基因工程菌E.coli CCTCC NO：M 2018914为出发菌株，将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD，记为ALA1；
(2)将工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD基因组中的aspC基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC，记为ALA2；
(3)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC基因组中ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc，记为ALA3；
(4)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc基因组中的pykA基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA，记为ALA4；
(5)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA基因组中的pykF基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF，记为ALA5；
(6)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF基因组中的ptsG基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG，记为ALA6；
(7)将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG基因组中的glk基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG/Trc-glk，记为ALA7；
(8)以质粒pET28a为载体，连接来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的panD基因得到新的质粒pET28a-panD，记为pD；
(9)以步骤(8)构建好的质粒pD为载体，继续连接来自E.coli W3110的aspC基因得到新的质粒pET28a-panDaspC，记为pDC；
(10)以步骤(9)构建好的质粒pDC为载体，继续连接来自得E.coli W3110的gdhA基因得到新的质粒pET28a-panDaspCgdhA，记为pDCA；
(11)将步骤(10)构建好的质粒导入步骤(7)获得的菌株ALA7中，得到菌株ALA7/pDCA，即为所述高产β-丙氨酸的基因工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述Trc启动子序列如SEQ ID No.1所示，所述panD基因序列如SEQ ID No.2所示，所述aspC基因序列如SEQ ID No.3所示，所述gdhA基因序列如SEQ ID No.4所示。
3.构建权利要求1所述的基因工程菌的方法，所述方法包括：
(1)以基因工程菌E.coli CCTCC NO：M 2018914为出发菌株，应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将其基因组中的panD基因的启动子替换为Trc启动子，得到工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD，记为ALA1；
(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将工程菌E.coli W3110(DE3)，Trc-panD基因组中的aspC基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC，记为ALA2；
(3)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC基因组中ppc基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc，记为ALA3；
(4)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc基因组中的pykA基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA，记为ALA4；
(5)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA基因组中的pykF基因敲除，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF，记为ALA5；
(6)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF基因组中的ptsG基因敲除，得到E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG，记为ALA6；
(7)应用CRISPR-Cas9基因编辑技术将E.coli W3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG基因组中的glk基因的启动子替换为Trc启动子，得到E.coliW3110(DE3)，Trc-panD/Trc-aspC/Trc-ppc/ΔpykA/ΔpykF/ΔptsG/Trc-glk，记为ALA7；
(8)以质粒pET28a为载体，连接来自Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的panD基因得到新的质粒pET28a-panD，记为pD；
(9)以步骤(8)构建好的质粒pD为载体，继续连接来自得E.coli W3110的aspC基因得到新的质粒pET28a-panDaspC，记为pDC；
(10)以步骤(9)构建好的质粒pDC为载体，继续连接来自得E.coli W3110的gdhA基因得到新的质粒pET28a-panDaspCgdhA，记为pDCA；
(11)将步骤(10)构建好的质粒导入步骤(7)获得的菌株ALA7中，得到菌株ALA7/pDCA，即为所述高产β-丙氨酸的基因工程菌。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述Trc启动子序列如SEQ ID No.1所示，所述panD基因序列如SEQ ID No.2所示，所述aspC基因序列如SEQ ID No.3所示，所述gdhA基因序列如SEQ ID No.4所示。
5.权利要求1或2所述的基因工程菌在微生物发酵制备β-丙氨酸中的应用。
6.权利要求1或2所述的基因工程菌在与产D-泛酸菌株共培养发酵制备D-泛酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述产D-泛酸菌株为大肠杆菌CCTCC NO：M20191027。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于共培养时所述高产β-丙氨酸的基因工程菌与所述产D-泛酸菌株接种比例为1:1。
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